專利名稱：重組人干擾素用于預(yù)防嚴重性急性呼吸道綜合征的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組的細胞因子重組人干擾素用于預(yù)防嚴重性急性呼吸道綜合征(recombinant human interferon，rhIFN)的新治療適應(yīng)癥。實驗發(fā)現(xiàn)rhIFN可以明顯地在體外抑制SARS病毒引起的細胞病變，這提示rhIFN可以作為用于預(yù)防SARS的新藥。
根據(jù)干擾素(interferons，IFNs)的定義，干擾素是一類至少在同種細胞上有廣譜抗病毒、抗細胞分裂、免疫調(diào)節(jié)活性和在不同途徑上影響細胞的代謝、生長和分化的蛋白質(zhì)，其活性的發(fā)揮需新合成RNA和蛋白質(zhì)。它是一類重要的細胞素。經(jīng)近30多年的臨床研究和應(yīng)用，說明它是一種重要的廣譜抗病毒、抗腫瘤治療藥物。
迄今所知，人干擾素存在多個型別干擾素-α，β，δ，γ，ε，κ，λ，τ，和ω等型別，它們的主要特點和可能的臨床應(yīng)用見表1.
表1 9種型別干擾素的主要特點和其臨床應(yīng)用或可能的臨床用途一覽表干擾素型別 主要特點 臨床應(yīng)用和可能的臨床用途干擾素-α 屬I型干擾素；約有23個 世界上批準用于治療病毒病變種。較詳細研究的有約和惡性腫瘤的主要干擾素-α13種亞型。分子量為有干擾素-α1b，α2b，α2a.，約19-26kDa，由156-166個 有40種治療適應(yīng)癥。
氨基酸組成。115-151之間為保守序列。基因集中在9p22.受體位于21q22.1.
干擾素-β 屬I型干擾素；主要由成纖 美國FDA批準治療多發(fā)性維細胞所產(chǎn)生，為糖蛋白， 硬化。
166個氨基酸。Cys31/141之間的二硫鍵對其生物學活性的發(fā)揮是必需的。
在DNA水平上與干擾素α有30％的同源性。干擾素α和干擾素-β結(jié)合于同一干擾素受體。
干擾素-γ 屬II型干擾素；由T細胞 FDA批準治療慢性淋巴肉芽和NK細胞刺激所產(chǎn)生。
腫；我國FDA批準治療類風二聚體蛋白質(zhì)。有2處糖 濕性關(guān)節(jié)炎。
基位點。143個氨基酸，無二硫鍵。對酸不穩(wěn)定。與干擾素α和β無明顯的同源性?；蛟?2q24.1.受體為于6和21對染色體。
干擾素-ω 屬I型干擾素；是人白細 1型丙型肝炎？胞干擾素的自然成分。又稱為干擾素-αII1。與干擾素-α的其它成員高度同源，與之相關(guān)的是牛滋養(yǎng)層蛋白質(zhì)TP-1。
干擾素ω結(jié)合于與干擾素-α和β同樣的細胞受體。
干擾素-τ TP-1屬1型干擾素，172 可能成為潛在的抗腫瘤藥個氨基酸與IFN-ω相關(guān)。 物，而無一般干擾素的毒性反芻動物滋養(yǎng)層在植床 作用。
以前幾天分泌多種形式 可以預(yù)防實驗性變態(tài)反應(yīng)性的IFN-τ。在識別母體和 腦脊髓炎；還能預(yù)防實驗性建立孕體上起有重要作 腦脊髓炎超級抗原的重新激用。在周圍血淋巴細胞 活。
中，抗HIV的能力比干擾素-α強35倍，在導(dǎo)源于單核細胞的巨噬細胞中比干擾素-α強100倍。
干擾素-δ 屬I型干擾素，豬孕體的滋？養(yǎng)外胚葉與干擾素-γ共同表達，149個氨基酸。
干擾素-λ(1-3) 包括干擾素-λ-1，2和？3，也各稱為IL-29，IL-28A和IL-28B。
基因位于第19對染色體。
其受體由2個亞單位組成CRF2-12(干擾素-λR1)和CRF2-4(IL-10R2)。干擾素-λ-1，2和3均通過同一組受體系統(tǒng)進行信號傳遞。
干擾素-κ 屬I型干擾素；207個氨基 皮膚是機體最外圍的防御器酸，N端27個氨基酸是信 官，干擾素-κ的基因可在上號肽，與1型干擾素的其 皮角化細胞組成性表達，可它成員有約30％的同源 能與其功能密切相關(guān)。
性。與肝素可密切結(jié)合。
在靜止期的樹突狀細胞和單核細胞可表達干擾素-κmRNA。與干擾素-α和干擾素-β一樣使用同一受體。
人干擾素-ε屬I型干擾素。189個氨動脈硬化癥？基酸，N端21個氨基酸為信號肽。3個Cys，位于53，163和175。其中有一個Cys是不參與形成二硫鍵的。基因在9p21.2-21.3有2個N糖基化位點，74和83位。在許多成人組織中組成性地表達目前，研究較多并用于臨床治療的有α，β，γ；其它型別干擾素是否有臨床應(yīng)用價值尚在研究之中。
迄今所知，人、小鼠、牛、馬等哺乳動物的干擾素至少有α、β、γ等三個型別。IFN-α和IFN-β稱為I型干擾素；IFN-ω和IFN-τ等也屬于I型；IFN-γ為II型干擾素。曾有一種IFN-β2已定名為IL-6，不屬于干擾素。在歷史上曾有白細胞干擾素，成纖維細胞干擾素，免疫干擾素等名稱，現(xiàn)已不采用。
1986年美國FDA首先同時批準基因工程干擾素-α2a(Roche公司)和干擾素-α2b(Schering公司)投放市場；基因工程干擾素-β、γ也相繼于1990年、1993年獲準投放市場。目前有60多個國家批準干擾素治療約40多種疾病。
國內(nèi)由中國預(yù)防醫(yī)學科學院病毒學研究所、衛(wèi)生部上海生物制品研究所、衛(wèi)生部長春生物制品研究所和中國藥品生物制品檢定所等單位共同研制并開發(fā)的人α1b型、α2a型，α2b型，γ型基因工程干擾素已經(jīng)我國藥品監(jiān)督管理局批準投放市場，它是我國經(jīng)國家正式批準的第一批基因工程高技術(shù)藥物，其中人基因工程干擾素-α1b系我國首創(chuàng)，與國外同類產(chǎn)品比較，具有副作用低的優(yōu)點。但是，國際上干擾素的許多適應(yīng)癥是使用干擾素α2b型獲得的。
從2002年11月起在我國廣東省流行一種“非典型性肺炎”，在短短數(shù)個月時間內(nèi)，流行到全球，統(tǒng)稱為嚴重性急性呼吸道綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)，受到世界各國的關(guān)注。其原始病原主要是人類冠狀病毒的一個新變種。因此，冠狀病毒受到廣大醫(yī)務(wù)人員和病毒學家的重視。
SARS病毒的傳播方式原來認為是由咳嗽和打涕引起的飛沫傳播為主，但是，根據(jù)其流行規(guī)律，以及發(fā)現(xiàn)患者糞便中存在的病毒量高于血液，因此，可能與動物冠狀病毒感染一樣，除呼吸到外，還可糞-口傳播，通過患者排泄物的污染，手的直接觸等。WHO估計SARS的死亡率約為4％，死亡病例常伴有其它病情，如糖尿病或心臟病，或機體的免疫功能下降。約有90％的病例在感染后1周內(nèi)恢復(fù)。這與西尼羅河病毒感染類似。目前尚無特效藥物治療，也無疫苗可以預(yù)防。
干擾素噴霧劑個體防護預(yù)防是目前首選可實現(xiàn)的方法，其科學根據(jù)如下1、SARS病毒屬新型冠狀病毒，是(+)鏈RNA病毒，許多(+)鏈RNA病毒成員對干擾素均十分敏感，如鼻病毒，本實驗室曾在細胞培養(yǎng)上大量進行過干擾素治療鼻病毒14型和39型的研究工作，證明了干擾素對這一(+)鏈RNA鼻病毒的敏感性。
2、在英國貓腹膜炎冠狀病毒的網(wǎng)頁上，曾建議用干擾素治療和控制貓冠狀病毒。而貓冠狀病毒的抗體可以在細胞培養(yǎng)上抑制SARS病毒的生長。
http//www.dr-addie.com/3、Pei et al.(2001)報道用雞干擾素I型可以抑制和治療雞支氣管炎冠狀病毒及其引起的感染。而雞支氣管炎冠狀病毒的抗血清也可以在細胞培養(yǎng)上抑制SARS病毒的生長。
Pei et al.(2001)Chicken interferon type I inhibits infectious bronchitis virusreplication and associated respiratory illness.J Interferon Cytokine Res.21(12)1071-1077.
4、病毒唑(Ribavirin)對新分離的冠狀病毒效果有限其中CDC的MMWR指出病毒唑在體外試驗中對新分離的冠狀病毒無抑制作用。Lancet關(guān)于香港大學找到冠狀病毒的報道也指出病毒唑在相當部分重癥病人中效果不佳。
5、Aurisicchio et al.(2000)報道嗜肝性2型干擾素可以保護鼠肝炎病毒(一種冠狀病毒)的感染。
Aurisicchio et al.(2000)Liver-specific alpha 2 interferon gene expression resultsin protection from induced hepatitis.J Virol.74(10)4816-4823.
6、在試管內(nèi)和機體內(nèi)干擾素可以抑制豬產(chǎn)毒性呼吸道綜合征病毒(一種冠狀病毒)感染。Buddaert et al.(1998)In vivo and in vitro interferon(IFN)studies with the porcinereproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV).Adv Exp Med Biol.440461-467.
7、分離到新冠狀病毒的細胞系Vero E6(及FRhk-4)在產(chǎn)生干擾素方面有缺損的，所以易于分離并產(chǎn)生病變。
Emeny JM，Morgan MJ.(1979)Regulation of the interferon systemevidence thatVero cells have a genetic defect in interferon production.J Gen Virol43(1)247-252。
其它的對老年人，免疫水平下降者要進行免疫加強治療(干擾素本身也有此作用)。因為冠狀病毒感染時會破壞機體的免疫系統(tǒng)。免疫加強劑有多種，包括預(yù)防動物冠狀毒感染時使用的維生素A，E，C等，胸腺素，白介素-2等。
本發(fā)明已經(jīng)證明北京遠策藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的重組人干擾素α2b以及其它類型的干擾素在細胞培養(yǎng)上可以抑制SARS病毒的繁殖。
本發(fā)明采用經(jīng)典的干擾素活性測定方法，采用SARS病毒-RDa細胞(人橫紋肌瘤細胞株)系統(tǒng)。將生長在10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基的RDa細胞按1×105/ml接種96孔細胞培養(yǎng)板，每孔體積100μl，過夜培養(yǎng)后加入100μl系列稀釋的干擾素a2b(北京遠策藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的重組人干擾素α2b)、a1b(北京金迪克生物技術(shù)研究所研制)、β(北京金迪克生物技術(shù)研究所研制)、ω(北京金迪克生物技術(shù)研究所研制)(各三個平行孔)，作用12小時后棄培養(yǎng)液，重新加入用含2％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋的50×TCID50的SARS病毒150μl(中國疾控中心病毒病所分離何培養(yǎng))，24小時后觀察病變，待病毒對照完全病變后，目測記錄抑制50％細胞病變(CPE)的干擾素的最小量，結(jié)果證實重組人干擾素a2b、a1b、β在RDa細胞培養(yǎng)上對SARS病毒(冠9株)有較為明顯的抑制作用、重組人干擾素ω抑制作用較小(結(jié)果見說明書附

圖1)。
說明書附圖1圖面說明重組人干擾素a2b、a1b、β、ω在RDa細胞培養(yǎng)上對SARS病毒(冠9株)的抑制試驗，重組人干擾素a2b、a1b、β、ω抑制SARS病毒引起50％RDa細胞病變的用量分別為每毫升0.28納克、7納克、9納克和39納克。
實施例1不同濃度的重組人干擾素α2b、a1b、β噴霧劑用于鼻腔和鼻咽部用藥防治SARS病毒或其突變體，本品的主要成份重組人干擾素、人血白蛋白，甘露醇，其有效成分為重組人干擾素。
實施例2不同濃度的重組人干擾素α2b、a1b、β滴鼻劑用于鼻腔和鼻咽部用藥防治SARS病毒或其突變體，本品的主要成份重組人干擾素、人血白蛋白，甘露醇，其有效成分為重組人干擾素。
實施例3不同濃度的重組人干擾素α2b、a1b、β栓劑用于陰道、直腸用藥防治SARS病毒或其突變體，本品的主要成份重組人干擾素、人血白蛋白，甘露醇，其有效成分為重組人干擾素。
實施例4不同濃度的重組人干擾素α2b、a1b、β口服劑型(包括口腔劑型)用于消化道用藥防治SARS病毒或其突變體，本品的主要成份重組人干擾素、人血白蛋白，甘露醇，其有效成分為重組人干擾素。
實施例5不同濃度的重組人干擾素α2b、a1b、β注射劑型(包括水針劑和粉針劑)用于靜脈、腹腔、肌肉給藥防治SARS病毒或其突變體，本品的主要成份重組人干擾素、人血白蛋白，甘露醇，其有效成分為重組人干擾素。
權(quán)利要求
1.重組人I型干擾素用于預(yù)防由冠狀病毒及其突變體引起的嚴重急性呼吸道綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)。其特征在于所用I型干擾素為重組人干擾素α1b、α2b和β干擾素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，預(yù)防由冠狀病毒及其突變體引起的SARS的I型干擾素可以制成任何制劑形式，如噴霧劑、滴鼻劑、栓劑、口服劑、注射劑等，其特征在于無論采用何種劑型，其有效抗SARS病毒成份為I型干擾素。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗病毒的細胞因子——重組人干擾素(recombinant human interferon)的新治療適應(yīng)征，發(fā)現(xiàn)重組人干擾素α 1b、α 2b和β干擾素可以在體外抑制SARS病毒的繁殖，從而提示重組人干擾素α 1b、α 2b和β干擾素可用于由冠狀病毒及其突變體引起的SARS的預(yù)防，為保障生命健康提供有效的手段。
文檔編號A61K38/38GK1535724SQ0312222
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月23日
發(fā)明者候云德 申請人:北京金迪克生物技術(shù)研究所, 北京遠策藥業(yè)有限責任公司