專利名稱：復(fù)方蒜氨酸粉針劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用藥品，是一種復(fù)方蒜氨酸粉針劑，其特別適用于靜注或靜滴，其具有防治心腦血管病、抗腫瘤、抗真菌及抗病毒的作用。
背景技術(shù)：
大蒜又名胡蒜，為百合科蔥屬植物蒜(Allium sativum L.)的地下鱗莖，是歷史悠久的藥食兩用植物，大量研究證明，其具有降血脂、抗血栓、殺菌、抗癌等作用。但是目前國內(nèi)外市場的鮮蒜或粗制劑(蒜粉片或蒜油膠囊等)蒜氨酸及蒜酶的含量低，因而其療效較弱，造成沒有在臨床上應(yīng)用。
一、本申請的發(fā)明人已經(jīng)提出了“從大蒜中提取蒜氨酸的方法”的中國專利申請，其專利申請?zhí)枮?0101244.4，其公開號為CN1273969A。
二、本申請的發(fā)明人已經(jīng)完成了“從鮮蒜中提取蒜氨酸生產(chǎn)工藝”的發(fā)明，該發(fā)明已經(jīng)提出了中國專利申請，其專利申請?zhí)枮?3100420.2。
三、本申請的發(fā)明人已經(jīng)完成了“從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝”的發(fā)明，該發(fā)明已經(jīng)提出了中國專利申請，其專利申請?zhí)枮?3100419.9。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種復(fù)方蒜氨酸粉針劑，其特別適用于靜注或靜滴，其具有防治心腦血管病、抗腫瘤、抗真菌及抗病毒的作用。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣來實現(xiàn)的一種復(fù)方蒜氨酸粉針劑，其含有蒜氨酸和蒜酶，其蒜氨酸與蒜酶的重量配比為2.5比1.0至0.7比1.0，還含有抑制劑，該抑制劑的含量為蒜氨酸和蒜酶總重量的0.6至1.5％，該抑制劑為氯化鈉。
上述蒜氨酸與蒜酶的重量配比還可為2.0比1.0至0.7比1.0。
上述復(fù)方蒜氨酸粉針劑充氮氣密封后在-4℃至4℃下保存。
本發(fā)明復(fù)方蒜氨酸粉針劑特別適用于靜注或靜滴，具有穩(wěn)定和安全的特點，并具有以下藥效1、由于具有抗血栓作用和降血脂作用，因而具有防治心腦血管病作用；2、具有抗腫瘤作用；3、具有抗真菌及抗病毒的作用。


附圖1為UV214nm的色譜圖，附圖2為質(zhì)譜總離子流色譜圖(MS TIC)，附圖3為tR＝3.336minESI(+)，60V質(zhì)譜圖，附圖4為tR＝2.436minESI(-)，60V質(zhì)譜圖，附圖5為tR＝10.308minESI(+)，60V質(zhì)譜圖，附圖6為蒜酶催化蒜氨酸反應(yīng)時程曲線。
附圖7為“從鮮蒜中提取蒜氨酸生產(chǎn)工藝”專利申請文件中的實施例所得產(chǎn)品的紅外吸收光譜圖；附圖8為“從鮮蒜中提取蒜氨酸生產(chǎn)工藝”專利申請文件中的標準對照品(蒜氨酸)的紅外吸收光譜圖；附圖9為“從鮮蒜中提取蒜氨酸生產(chǎn)工藝”專利申請文件中的實施例所得蒜氨酸高效液相色譜分析(即HPLC)圖譜(1-Alliin、2-乙酰苯胺)。
附圖10為“從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝”專利申請文件中的蒜酶(A、B)、標準蛋白(C，3mg/mL)電泳圖；附圖11為“從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝”專利申請文件中的底物(蒜氨酸)和反應(yīng)產(chǎn)物(丙酮酸、大蒜辣素)高效液相色譜分析(即HPLC)色譜圖；附圖12為“從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝”專利申請文件中的蒜酶催化蒜氨酸反應(yīng)動力學(xué)曲線。
具體實施例方式
本發(fā)明不受下述實施例的限制，可根據(jù)上述本發(fā)明的技術(shù)方案和實際情況來確定具體的實施方式。
實施例1，該復(fù)方蒜氨酸粉針劑，其含有蒜氨酸和蒜酶，并且蒜氨酸與蒜酶的重量配比為2.5比1.0，其還含有抑制劑，該抑制劑的含量為蒜氨酸和蒜酶總重量的0.6％或1.0％或1.5％，該抑制劑為氯化鈉；經(jīng)實驗測定該復(fù)方蒜氨酸粉針劑的蒜氨酸轉(zhuǎn)化率為76.2。
實施例2，該復(fù)方蒜氨酸粉針劑，其含有蒜氨酸和蒜酶，并且蒜氨酸與蒜酶的重量配比為2.0比1.0，其還含有抑制劑，該抑制劑的含量為蒜氨酸和蒜酶總重量的0.6％或1.0％或1.5％，該抑制劑為氯化鈉；經(jīng)實驗測定該復(fù)方蒜氨酸粉針劑的蒜氨酸轉(zhuǎn)化率為92.8。
實施例3，該復(fù)方蒜氨酸粉針劑，其含有蒜氨酸和蒜酶，并且蒜氨酸與蒜酶的重量配比為0.9比1.0，其還含有抑制劑，該抑制劑的含量為蒜氨酸和蒜酶總重量的0.6％或1.0％或1.5％，該抑制劑為氯化鈉；經(jīng)實驗測定該復(fù)方蒜氨酸粉針劑的蒜氨酸轉(zhuǎn)化率為95.1。
實施例4，該復(fù)方蒜氨酸粉針劑，其含有蒜氨酸和蒜酶，并且蒜氨酸與蒜酶的重量配比為0.7比1.0，其還含有抑制劑，該抑制劑的含量為蒜氨酸和蒜酶總重量的0.6％或1.0％或1.5％，該抑制劑為氯化鈉；經(jīng)實驗測定該復(fù)方蒜氨酸粉針劑的蒜氨酸轉(zhuǎn)化率為97.4。
在實施例1至4中所述的復(fù)方蒜氨酸粉針劑的蒜氨酸轉(zhuǎn)化率實驗測定方法為首先將復(fù)方蒜氨酸粉針劑中的蒜氨酸和蒜酶與適量水混合，超聲30秒、在35℃水浴保溫15分種；其次吸取反應(yīng)2毫升，并加甲醇3毫升，混勻；然后用微孔濾膜(0.45μm)過濾，濾液HPLC進樣得到色譜圖，計算出蒜氨酸減少量，從而計算出蒜氨酸轉(zhuǎn)化率。
本發(fā)明復(fù)方蒜氨酸粉針劑經(jīng)過穩(wěn)定性加速試驗證明該復(fù)方蒜氨酸粉針劑對濕度和溫度敏感，在包裝條件下干燥、4℃以下可保存24個月，蒜氨酸含量、蒜酶活力及大蒜辣素釋放量的變化均小于10％。
將上述實施例的復(fù)方蒜氨酸粉針劑加水溶解制成1‰溶液，35℃水浴反應(yīng)5min。吸取2.00ml，加3.00ml甲醇，混勻。0.45μm微孔濾膜過濾。色譜條件Agilent1100-LC/MSD系統(tǒng)，NoVa-PaKC184.6mm×150mm，4μm柱；柱溫35℃；流動相∶甲醇-水(2∶3)，流率0.5ml/min，檢測UV-214nm。進樣5μl。質(zhì)譜條件離子化方式ESI(+)及ESI(-)，掃描范圍50-250m/z，干燥N2流速10L/min，溫度350℃，霧化氣壓2.07×105Pa，毛細管電壓3000V，碎裂器電壓60V。色譜圖(圖1)及質(zhì)譜總離子流(MS-TIC)色譜圖(圖2)。兩種色譜峰都得到三個強峰。
tR＝3.336min峰分子量為177的組峰[M+H]+m/z＝178.0及[M+Na]+m/z＝200.0(圖3)，推斷為蒜氨酸。
tR＝2.436min峰(圖4)。分子離子峰分別為[M-H]+m/z＝87，[2M+Na]+m/z＝196.9，推斷該物質(zhì)為丙酮酸，分子量為88。
tR＝10.308min峰[M+H]+m/z＝163.1，[2M+Na]+m/z＝184.9，推斷該物質(zhì)為大蒜辣素分子量為162(圖5)。
因此，確認蒜氨酸轉(zhuǎn)化為大蒜辣素(Allicin)及丙酮酸(Pyruvic acid)等化合物。
采用高效液相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)(HPLC)測定蒜氨酸酶解反應(yīng)產(chǎn)生大蒜辣素(Allicin)及丙酮酸(Pyruvic acid)等化合物。其動力學(xué)反應(yīng)時程曲線(圖6)顯示0-5分鐘，催化反應(yīng)呈現(xiàn)一級反應(yīng)。5-25分鐘，反應(yīng)呈現(xiàn)混合級反應(yīng)，25分-13小時(hr)接近零級反應(yīng)。5分鐘以內(nèi)為酶促反應(yīng)初速度，到25分鐘達到最大反應(yīng)速度。大蒜辣素濃度隨時間而增加，15分鐘至13小時(hr)濃度達到穩(wěn)定。因此，本發(fā)明復(fù)方蒜氨酸粉針劑特別適用于靜注或靜滴。
本發(fā)明復(fù)方蒜氨酸粉針劑的藥效學(xué)試驗1、抗血栓作用《中國科學(xué)院上海藥物研究所國家新藥篩選中心化合物生物活性測試報告》篩選模型血小板聚集測定法。結(jié)果“復(fù)方蒜氨酸”濃度25、50、75μg/ml時平均聚集抑制率為12、23、49％。
新疆藥物研究所的抗血栓作用試驗結(jié)果表明“蒜氨酸”、“蒜酶”及“復(fù)方蒜氨酸”經(jīng)口服或靜脈給藥，各劑量組(大、中、小劑量分別為25.0、6.25、1.56mg/Kg)對大鼠體外“血栓形成”均有不同程度抑制作用。抑制率在20.0～55.0％；而且隨劑量的增加其抑制作用呈明顯增強趨勢；同時各劑量組與N.S比較，差異均具統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01。其中股靜脈注射給藥比口服對血栓抑制作用強。蒜酶靜脈給藥其小劑量血栓形成作用抑制率為54.0％。口服給藥其中劑量血栓形成抑制率為54.92％。
2、降血脂作用新疆藥物研究所的抗血栓作用試驗結(jié)果表明“蒜氨酸”、“蒜酶”及“復(fù)方蒜氨酸”經(jīng)口服或靜脈給藥，大中小三個劑量組(分別為3.12、6.25、12.5mg/Kg)均可以明顯降低血清中膽固醇(Cho)、甘油三酯(TRI)的水平。同時各劑量組對高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)也有調(diào)節(jié)作用。但只有“復(fù)方蒜氨酸”各劑量組對大鼠血清HDL水平及其中、小劑量組對大鼠血清LDL水平的影響與高血脂模型組比較差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。
3、抗腫瘤作用《中國科學(xué)院上海藥物研究所國家新藥篩選中心化合物測試報告》抗腫瘤生物活性體外篩選試驗供試品“蒜氨酸”、“蒜酶”及“復(fù)方蒜氨酸(蒜氨酸+蒜酶)”。篩選方法磺酰羅丹明蛋白染色法、四氮唑鹽還原法。作用時間48～72小時。結(jié)果顯示“復(fù)方蒜氨酸”及“蒜酶”對A-549人腺肺癌細胞及P-388小鼠白血病細胞有體外抗腫瘤作用。而“復(fù)方蒜氨酸”對P-388小鼠白血病細胞有強效。
4、抗真菌作用中國科學(xué)院上海藥物研究所國家新藥篩選中心化合物生物活性(抗真菌)測試報告微量液體稀釋法測定復(fù)方蒜氨酸對白色假絲酵母菌的最低抑菌濃度(MIC)≤20μg/ml。判斷為有效。
新疆藥物研究所“蒜氨酸”、“蒜酶”及“復(fù)方蒜氨酸”體外抗真菌試驗結(jié)果表明蒜氨酸具有較明顯的抗白色念珠菌作用，其最低抑菌濃度(MIC)、半數(shù)抑菌濃度(MIC50)及90％抑菌濃度(MBC90)分別為1000μg/ml、250μg/ml、500μg/ml；復(fù)方蒜氨酸對各受試菌株都有不同程度的抑菌、殺菌作用；但蒜酶未見抗真菌作用。
新疆藥物研究所“蒜氨酸”、“蒜酶”及“復(fù)方蒜氨酸”體內(nèi)抗真菌試驗結(jié)果表明蒜氨酸具有明顯的抗白色念珠菌作用，對該菌感染小鼠的半數(shù)有效量(ED50)為31.98mg/Kg；復(fù)方蒜氨酸抗白色念珠菌ED50為81.26mg/Kg。
5、抗病毒作用中國科學(xué)院上海藥物研究所國家新藥篩選中心進行抗病毒藥效學(xué)研究測試，篩選結(jié)果為陽性。
下面描述蒜氨酸和蒜酶的來源一、本發(fā)明中所用的蒜氨酸可以是市場出售的，也可采用用本專利申請的發(fā)明人提出的、專利申請?zhí)枮?0101244.4的、發(fā)明名稱為“從大蒜中提取蒜氨酸的方法”的發(fā)明所得的蒜氨酸，還可采用用本專利申請的發(fā)明人發(fā)明的、專利申請?zhí)枮?3100420.2的、發(fā)明名稱為“從鮮蒜中提取蒜氨酸生產(chǎn)工藝”的發(fā)明所得的蒜氨酸。
專利申請?zhí)枮?3100420.2的、發(fā)明名稱為“從鮮蒜中提取蒜氨酸生產(chǎn)工藝”的發(fā)明，其技術(shù)方案是這樣來實現(xiàn)的一種從鮮蒜中提取蒜氨酸生產(chǎn)工藝，按以下步驟進行第一步進行預(yù)處理將蒜瓣進行微波殺酶處理，使蒜瓣從白色變成半透明狀為止；第二步進行有機物提取將微波處理后的蒜瓣磨成100至200目的蒜漿，并加入乙醇，用乙醇比重計控制蒜漿乙醇濃度為40％至70％，攪拌2至10小時，分離得到提取液，并減壓濃縮提取液；第三步用陽離子交換樹脂吸附濃縮提取液中的蒜氨酸將濃縮提取液通過陽離子交換樹脂吸附柱；第四步用氨水解吸蒜氨酸用2.0至0.4摩爾氨水洗脫陽離子交換樹脂吸附柱，收集pH值為5.0至9.0范圍內(nèi)的洗脫液；第五步得到結(jié)晶的蒜氨酸減壓濃縮洗脫液，按濃縮洗脫液體積的20％至35％加入乙醇，并用鹽酸或氨水調(diào)節(jié)PH值為5.5至6.5范圍內(nèi)，室溫靜置24至60小時，析出結(jié)晶的蒜氨酸。
在上述預(yù)處理中可將蒜瓣置于微波中2至5分鐘。
上述微波頻率可為2540±50MHz，輸出微波功率可為20KW。
在上述減壓濃縮中，減壓濃縮可采用多效減壓薄膜濃縮方法進行，末端出口溫度控制在40℃至60℃范圍內(nèi)或70℃至90℃范圍內(nèi)，濃縮后的液體體積與原料鮮蒜的重量之比控制在0.8至1.2或0.4至0.6或1/45至1/55的范圍內(nèi)。
在濃縮提取液中加入1至6％的澄清劑并攪拌均勻，在溫度為-5℃至5℃范圍內(nèi)，放置5至20小時后得到上清液，并對上清液進行減壓濃縮后通過陽離子交換樹脂吸附柱，其中澄清劑為果汁澄清劑。
在陽離子交換樹脂吸附柱飽和后，可先用蒸餾水對吸附柱進行沖洗，并沖洗至流出液呈Molish反應(yīng)陰性或蒸餾水用量為蒜瓣重量的0.5至1.5倍，然后再用氨水洗脫陽離子交換樹脂吸附柱。
將上述結(jié)晶的蒜氨酸經(jīng)過60℃至80℃范圍內(nèi)的減壓干燥至含水量低于2.9％后，用氮氣或惰性氣體進行密閉保存。
上述分離所用設(shè)備可采用冷凍密閉式漿渣自分離磨漿機或離心摔干機或低溫管式離心分離機；或/和，上述陽離子交換樹脂吸附柱可采用苯乙烯基強酸性陽離子交換樹脂吸附柱或732型強酸陽離子交換樹脂吸附柱或850型強酸陽離子交換樹脂吸附柱或800型大孔型強酸陽樹脂吸附柱。
上述有關(guān)蒜氨酸的發(fā)明適宜于以鮮蒜為原料批量化生產(chǎn)藥用蒜氨酸。用上述有關(guān)蒜氨酸的發(fā)明所得產(chǎn)品經(jīng)熔點測定、與標準對照品作紫外光譜與紅外光譜對照，各項指標確認產(chǎn)品為蒜氨酸。經(jīng)高效液相色譜分析，上述有關(guān)蒜氨酸的發(fā)明所得蒜氨酸產(chǎn)品收率為1.0‰±10％，含蒜氨酸為91.2±2％。
上述有關(guān)蒜氨酸的發(fā)明不受下述實施例的限制，可根據(jù)上述有關(guān)蒜氨酸的發(fā)明的技術(shù)方案和實際情況來確定具體的實施方式。
上述有關(guān)蒜氨酸的發(fā)明的實施例，按下述步驟進行第一步進行預(yù)處理將蒜瓣進行微波殺酶處理，使蒜瓣從白色變成半透明狀為止；最好將蒜瓣置于微波中2分鐘或3.5分鐘或5分鐘，并且微波頻率最好為2540±50MHz，輸出微波功率最好為20KW。在進行微波殺酶處理之前，最好將蒜瓣脫膜洗凈瀝干。
第二步進行有機物提取將微波處理后的蒜瓣磨成100至200目的蒜漿，并加入乙醇或酒精，用乙醇比重計控制蒜漿乙醇濃度為40％至70％，攪拌反應(yīng)2至10小時，分離得到提取液，并減壓濃縮提取液。最好重量復(fù)提取3次或5次。減壓濃縮最好采用多效減壓薄膜濃縮方法進行，末端出口溫度控制在40℃至60℃范圍內(nèi)，回收的溶劑即乙醇可重復(fù)使用，濃縮后的提取液體積與原料鮮蒜的重量之比控制在0.8至1.2的范圍內(nèi)。在用陽離子交換樹脂吸附柱進行吸附之前，最好在濃縮提取液中加入1％或3％或6％的澄清劑并攪拌均勻，在溫度為-5℃至5℃范圍內(nèi)，放置5小時或10小時或20小時后得到上清液，并對上清液進行減壓濃縮后通過陽離子交換樹脂吸附柱進行吸附，其中澄清劑為市場上出售的果汁澄清劑，如可選用市場上出售的漢杰牌101型果汁澄清劑，上清液進行減壓濃縮后的體積與原料鮮蒜的重量之比控制在0.4至0.6的范圍內(nèi)，末端出口溫度控制在40℃至60℃范圍內(nèi)，回收的溶劑即乙醇可重復(fù)使用。
第三步用陽離子交換樹脂吸附濃縮提取液中的蒜氨酸將濃縮提取液或濃縮上清液通過陽離子交換樹脂吸附柱。在陽離子交換樹脂吸附柱飽和后，最好先用蒸餾水對吸附柱進行沖洗，并沖洗至流出液呈Molish反應(yīng)陰性或蒸餾水用量為蒜瓣重量的0.5倍或1.5倍，然后再進行下步即用氨水解吸蒜氨酸。
第四步用氨水解吸蒜氨酸用2.0至0.4摩爾范圍內(nèi)的氨水洗脫陽離子交換樹脂吸附柱，收集pH值為5.0至9.0范圍內(nèi)的洗脫液；第五步得到結(jié)晶的蒜氨酸減壓濃縮洗脫液，其中減壓濃縮或/和溶劑回收最好采用多效薄膜濃縮方法進行，末端出口溫度控制在70℃或90℃或70至90℃范圍內(nèi)，，濃縮后的液體體積與原料鮮蒜的重量之比控制在1/45至1/55的范圍內(nèi)，回收的溶劑即氨水可重復(fù)使用，然后按濃縮洗脫液體積的20％或35％加入乙醇，并用鹽酸或氨水調(diào)節(jié)PH值為5.5至6.5范圍內(nèi)，室溫靜置24小時或50小時或60小時，析出結(jié)晶的蒜氨酸。最好將結(jié)晶的蒜氨酸經(jīng)過60℃至80℃范圍內(nèi)的減壓干燥至含水量低于2.9％后，用氮氣或惰性氣體進行密閉保存。
在上述實施例中分離所用設(shè)備最好采用冷凍密閉式漿渣自分離磨漿機或離心摔干機或低溫管式離心分離機；陽離子交換樹脂吸附柱可采用苯乙烯基強酸性陽離子交換樹脂吸附柱或732型強酸陽離子交換樹脂吸附柱或850型強酸陽離子交換樹脂吸附柱或800型大孔型強酸陽樹脂吸附柱。
下面是對上述實施例所得產(chǎn)品即蒜氨酸的確認
標準對照品Alliin-S(Indofine Chemical Company Inc.USA，純度99.5％，批號97112003)1、性狀上述蒜氨酸產(chǎn)品為白色結(jié)晶性粉末。極易溶于水。不溶于乙醇、氯仿。顯微鏡下觀察為無色針狀結(jié)晶。聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳計算等電點為pH＝5.7-6.2。與標準對照品相符。
2、熔點按照中國藥典2000版二部附錄VI C熔點測定法第一法測定熔點，標準對照品熔點為164-166℃(分解)。上述產(chǎn)品熔點為162-165℃(分解)。上述蒜氨酸產(chǎn)品熔點提前2℃，熔距稍有擴大，顯示產(chǎn)品純度不及標準對照品。
3、紫外吸收光譜確認上述產(chǎn)品為蒜氨酸，估算產(chǎn)品蒜氨酸含量相當(dāng)標準對照品93.7％蒜氨酸標準對照品(Alliin-S)以甲醇為溶劑制成42μg/ml的溶液，稀釋7倍。用S-50型紫外分光光度計(上海棱光)測得紫外光譜，在226±1nm處有最大吸收。吸收度為0.380，E1％226±1nm＝90.5。上述產(chǎn)品(Alliin-D)以甲醇為溶劑制成40μg/ml溶液，稀釋7倍，在同一臺儀器同樣條件下測定紫外光譜，在226±1nm處有最大吸收。吸收度為0.339。E1％226±1nm＝84.8兩者紫外吸收光譜相同。以E1％226±1nm(Alliin-D)及E1％226±1nm(Alliin-S)計算蒜氨酸含量。84.8/90.5×100＝93.7，上述產(chǎn)品含蒜氨酸相當(dāng)標準對照品的93.7％。
4、紅外吸收光譜蒜氨酸標準對照品及上述產(chǎn)品在EQUINOX55，BRUKER紅外分光光度計-ATR附件測定紅外吸收光譜。上述產(chǎn)品圖譜(附圖7)與標準對照品圖譜(附圖8)相一致。但是在1533、1526cm-1等處出現(xiàn)弱小峰。在指紋區(qū)的1050-1430cm-1區(qū)段有細微差異。說明產(chǎn)品含少量雜質(zhì)。
5、結(jié)論根據(jù)性狀考查、熔點測定、紫外吸收光譜及紅外吸收光譜分析得到的結(jié)果判斷并確認實施例所得產(chǎn)品為蒜氨酸。
下面對上述實施例所得產(chǎn)品測定其蒜氨酸的含量用高效液相色譜分析(即HPLC)測定本實施例所得產(chǎn)品中蒜氨酸含量。
1、供試液配制蒜氨酸標準對照品及實施例所得產(chǎn)品分別加內(nèi)標(乙酰苯胺)，用流動相配置成供試液。(含量蒜氨酸約100.0μg/ml、乙酰苯胺10.0μg/ml)。
2、色譜條件安捷倫1100高效液相色譜儀，ZORBAX SB-C18柱(4.6×250mm，5.0μm)；流動相∶甲醇-水(60∶40)；流速0.8ml/min；檢測波長214nm；柱溫37℃。內(nèi)標乙酰苯胺。供試液進樣量10μl。得到色譜圖(附圖9)、保留時間蒜氨酸3.07分鐘、乙酰苯胺5.12分鐘。分離度(R)＝14.6，理論塔板數(shù)(n)＝7.4×103片。
3、線性和回歸方程進樣量在0.5-3.0μg范圍內(nèi)，以峰面積對濃度作圖得回歸方程Y＝10.3X-9.8，r＝0.9993。
日內(nèi)精密度RSD＝1.88％(n＝5)。日間精密度RSD＝2.65％(n＝5)。
4、實施例所得三批產(chǎn)品的含量實施例所得三批產(chǎn)品(批號A、B、C)，經(jīng)高效液相色譜分析(即HPLC)，三批產(chǎn)品收率為1.0‰±10％，含蒜氨酸91.2±2％。
5、雜質(zhì)檢查三批產(chǎn)品按照中國藥典2000版二部附錄氯化物、鐵鹽、硫酸鹽、銨鹽低于、水分、灰分檢查的方法檢驗。結(jié)果為氯化物、鐵鹽、硫酸鹽低于0.01％。銨鹽低于0.02％。水分2.2-2.6％?；曳?.07-0.11％。
上述附圖7為上述實施例所得產(chǎn)品的紅外吸收光譜圖；上述附圖8為上述標準對照品的紅外吸收光譜圖；上述附圖9為上述蒜氨酸高效液相色譜分析(即HPLC)圖譜(1-Alliin、2-乙酰苯胺)。
二、本發(fā)明中所用的蒜酶可以是市場出售的，也可采用用本專利申請的發(fā)明人提出的、專利申請?zhí)枮?3100419.9的、發(fā)明名稱為“從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝”的發(fā)明所得的蒜氨酸。
專利申請?zhí)枮?3100419.9的、發(fā)明名稱為“從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝”的發(fā)明，其技術(shù)方案是這樣來實現(xiàn)的一種從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝，按以下步驟進行第一步加蒜酶提取液打漿分離出清液先將蒜瓣溫度控制在-5℃至5℃范圍內(nèi)，并控制溫度在-5℃至5℃范圍內(nèi)，加入蒜酶提取液并磨成100至200目的蒜漿，蒜酶提取液的加入量為蒜瓣重量的0.8至1.2倍，并進一步分離出第一清液；第二步分步沉淀得到蒜酶控制溫度在-5℃至5℃范圍內(nèi)，在攪拌下將硫酸銨加入第一清液中，使其全部溶解并用硫酸銨比重計控制硫酸銨濃度在20％至30％重量體積百分比濃度范圍內(nèi)，然后分離出第二清液；在攪拌下將硫酸銨加入第二清液中，使其全部溶解并用硫酸銨比重計控制硫酸銨濃度在40％至50％重量體積百分比濃度范圍內(nèi)，然后分離出第一糊狀沉淀物；將第一糊狀沉淀物裝入聚氨酯袋，于流動的-5℃至5℃范圍內(nèi)的冰水透析槽中透析30小時至50小時，然后用磷酸調(diào)節(jié)等電點pH到4.9后分離出第二糊狀沉淀物即糊狀蒜酶。
上述提取液可為含有絡(luò)合劑、抗氧劑、緩沖劑及丙三醇的水溶液。
上述絡(luò)合劑可為乙二胺四乙酸二鈉；上述抗氧劑可為巰基丙醇；上述緩沖劑可為磷酸鹽。
蒜酶提取液可為在磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中加入按緩沖液體積加入0.1％至0.3％的二乙胺四乙酸二鈉、0.02％至0.06％的巰基乙醇，0.3％至1.0％的氯化鈉、5％至15％的丙三醇。
在上述生產(chǎn)工藝中，可將第二糊狀沉淀物放入冷凍干燥機進行干燥，使水分含量低于2.0％，得到凍干蒜酶，然后用氮氣或惰性氣體進行密閉保存。
上述分離所用設(shè)備可采用冷凍密閉式漿渣自分離磨漿機或離心摔干機或低溫管式離心分離機。
上述有關(guān)蒜酶的發(fā)明適宜于以鮮蒜為原料批量化生產(chǎn)藥用蒜酶。上述有關(guān)蒜酶的發(fā)明所得蒜酶產(chǎn)品經(jīng)過SDS-凝膠電泳證明其具有較高的純度。依據(jù)與標準蛋白(C分子量14400～97400)比移值計算其蒜酶產(chǎn)品單聚體分子量為67000道爾頓。米氏常數(shù)Km為3.6mmol/L。其產(chǎn)品平均活力為765U/g。
上述有關(guān)蒜酶的發(fā)明不受下述實施例的限制，可根據(jù)上述有關(guān)蒜酶的發(fā)明的技術(shù)方案和實際情況來確定具體的實施方式。
實施例，按下述步驟進行第一步加蒜酶提取液打漿分離出清液先將蒜瓣溫度控制在-5℃至5℃范圍內(nèi)，并控制溫度在-5℃至5℃范圍內(nèi)，加入蒜酶提取液并磨成100至200目的蒜漿，蒜酶提取液的加入量為蒜瓣重量的0.8倍或1.2倍，并進一步分離出第一清液；
第二步分步沉淀得到蒜酶控制溫度在-5℃至5℃范圍內(nèi)，在攪拌下將硫酸銨加入第一清液中，使其全部溶解并用硫酸銨比重計控制硫酸銨濃度在20％至30％重量體積百分比濃度范圍內(nèi)，然后分離出第二清液；在攪拌下將硫酸銨加入第二清液中，使其全部溶解并用硫酸銨比重計控制硫酸銨濃度在40％至50％重量體積百分比濃度范圍內(nèi)，然后分離出第一糊狀沉淀物；將第一糊狀沉淀物裝入聚氨酯袋，于流動的-5℃至5℃范圍內(nèi)的冰水透析槽中透析30小時至50小時，然后用磷酸調(diào)節(jié)等電點pH到4.9后分離出第二糊狀沉淀物即糊狀蒜酶；將第二糊狀沉淀物放入冷凍干燥機進行干燥，使水分含量低于2.0％，得到凍干蒜酶，然后用氮氣或惰性氣體進行密閉保存。
在上述實施例中提取液為含有絡(luò)合劑、抗氧劑、緩沖劑及丙三醇的水溶液；絡(luò)合劑可為乙二胺四乙酸二鈉；抗氧劑可為巰基丙醇；緩沖劑可為磷酸鹽；蒜酶提取液最好為在磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中加入按緩沖液體積加入0.1％或0.3％的二乙胺四乙酸二鈉、0.02％或0.06％的巰基乙醇，0.3％或1.0％的氯化鈉、5％或15％的丙三醇。
分離所用設(shè)備采用冷凍密閉式漿渣自分離磨漿機或離心摔干機或低溫管式離心分離機。
下面是對上述實施例所得產(chǎn)品即蒜酶的確認(一)、SDS凝膠電泳測定蒜酶產(chǎn)品純度及分子量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)條件采用10％分離膠，4.5％濃縮膠制板。點樣量20μL。CC型垂直電泳槽，甘油-三羥甲基胺基甲烷-HCl-十二烷基磺酸鈉緩沖液。電壓20mA電泳展開，考馬斯亮藍染色。結(jié)果顯示一根條帶。依據(jù)與標準蛋白(C分子量14400～97400)比移值得回歸方程Y＝-1.7297X+5.6399(r＝0.97)。
計算蒜酶樣品(批號A011105、B020120)單聚體分子量為67000道爾頓。如附圖10所示。
(二)、蒜酶活力效價建立HPLC同時測定底物蒜氨酸、產(chǎn)物大蒜辣素及丙酮酸的方法。如附圖11所示。蒜酶產(chǎn)品0.100g，純化水超聲30秒使溶解，制成1.00mg/ml供試液。以蒜氨酸(Indofine Chemical Company，Inc.USA含量99.5％。)作標準對照品。Hypersil-BDS-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5um)，柱溫35℃，流動相甲醇-水(3∶2)，流率0.8ml/min，214nm檢測。進樣量10μl測定。以相鄰的蒜氨酸和丙酮酸色譜峰計算產(chǎn)品(蒜酶)的活力效價。實施例所得五批蒜酶產(chǎn)品催化活力平均為765U/g。
1蒜酶活力單位(U)＝每分鐘裂解1μmol蒜氨酸(底物)需要的酶量(Ω)。五批蒜酶產(chǎn)品平均蒜酶活力為765U/g。
(三)、酶促反應(yīng)動力學(xué)曲線和參數(shù)蒜酶產(chǎn)品加底物(蒜氨酸)分別配成試液。超聲混合30秒，35℃水浴保溫。分別于5、15、25min，及1、3、5、7、9、11、13hr吸取反應(yīng)液適量，加甲醇混勻。過0.45μm濾膜，HPLC進樣10μl，得到色譜圖。計算蒜氨酸、丙酮酸及大蒜辣素含量。繪制酶促反應(yīng)曲線，如附圖12所示。
顯示蒜酶的特性反應(yīng)曲線5分鐘以內(nèi)為酶促反應(yīng)初速度(呈現(xiàn)一級反應(yīng)S+E→P。其速度方程為-d[S]/dt＝k1[S])；25分鐘達到最大反應(yīng)速度(呈現(xiàn)混合級反應(yīng)E+SES→E+P。)。大蒜辣素隨時間濃度增加，15分鐘至13hr其濃度基本穩(wěn)定(25分-13hr接近零級反應(yīng))。
催化裂解反應(yīng)符合米氏方程1/V＝0.129/[S]+0.0358。
回歸方程Y＝35.78+0.129X(r＝0.996)最大反應(yīng)速度Vmax＝27.9mol·min-1·mg-1米氏常數(shù)Km＝3.6mmol/L。
上述附圖10為蒜酶(A、B)、標準蛋白(C，3mg/mL)電泳圖；上述附圖11為底物(蒜氨酸)和反應(yīng)產(chǎn)物(丙酮酸、大蒜辣素)高效液相色譜分析(即HPLC)色譜圖；上述附圖12為蒜酶催化蒜氨酸反應(yīng)動力學(xué)曲線。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)方蒜氨酸粉針劑，其特征在于含有蒜氨酸和蒜酶，其蒜氨酸與蒜酶的重量配比為2.5比1.0至0.7比1.0，還含有抑制劑，該抑制劑的含量為蒜氨酸和蒜酶總重量的0.6至1.5％，該抑制劑為氯化鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方蒜氨酸粉針劑，其特征在于蒜氨酸與蒜酶的重量配比為2.0比1.0至0.7比1.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的復(fù)方蒜氨酸粉針劑，其特征在于該復(fù)方蒜氨酸粉針劑充氮氣密封后在-4℃至4℃下保存。
全文摘要
一種復(fù)方蒜氨酸粉針劑，其含有蒜氨酸和蒜酶，其蒜氨酸與蒜酶的重量配比為2.5比1.0至0.7比1.0，還含有抑制劑，該抑制劑的含量為蒜氨酸和蒜酶總重量的0.6至1.5％，該抑制劑為氯化鈉。上述蒜氨酸與蒜酶的重量配比還可為2.0比1.0至0.7比1.0。上述復(fù)方蒜氨酸粉針劑充氮氣密封后在－4至4℃下保存。本發(fā)明復(fù)方蒜氨酸粉針劑特別適用于靜注或靜滴，具有穩(wěn)定和安全的特點，并具有以下藥效1、由于具有抗血栓作用和降血脂作用，因而具有防治心腦血管病作用；2、具有抗腫瘤作用；3、具有抗真菌及抗病毒的作用。
文檔編號A61P9/00GK1491722SQ0312385
公開日2004年4月28日 申請日期2003年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月3日
發(fā)明者陳堅, 常軍民, 李新霞, 陳 堅 申請人:陳堅, 陳 堅