專利名稱：順式藁本內(nèi)酯的提取方法及其藥用用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥用植物中的順式藁本內(nèi)酯的提取方法，尤其是川芎中的順式藁本內(nèi)酯的提取方法，以及順式藁本內(nèi)酯的藥用用途。
背景技術：
順式藁本內(nèi)酯的結構及物理性質結構式 分子式及分子量C12H14O2190，不飽和度為6。
化學名(10Z)-3-亞丁基-4，5-二氫苯酞英文化學名(10Z)-3-butylidene-4，5-dihydrophthalide英文名ligustilide性狀描述微黃色帶香味的油狀物，沸點168～169℃/6mmHg。可溶于正己烷、環(huán)己烷、石油醚、乙醚、醋酸乙酯、甲醇等。
藁本內(nèi)酯提取及應用的現(xiàn)狀藁本內(nèi)酯具有兩個同分異構體，一個是順式，一個是反式。這兩種同分異構體在天然植物中的存在具有選擇性，從而決定了分別含有順式和反式的天然藥物具有不同的藥用用途。如川芎中的藁本內(nèi)酯主要以順式存在，而當歸中的藁本內(nèi)酯主要以反式存在，川芎為活血藥的代表，當歸為補血藥的代表。目前，對藁本內(nèi)酯進行的藥理學研究，其藁本內(nèi)酯主要從當歸中提取而得，藥理學研究主要集中在平喘、解痙、鎮(zhèn)靜、抑制平滑肌細胞增殖、抑菌等方面，而從川芎中提取的順式藁本內(nèi)酯，有關藥理學的研究還未見報道。由于川芎中獲取的順式藁本內(nèi)酯的藥理學研究的缺乏，以致于誤認為兩種不同物質的藥理作用是相同的。
目前，當歸中的藁本內(nèi)酯的提取方法有藥材(當歸)粉碎，正己烷冷浸提取，減壓濃縮，得提取物，將提取物溶于乙醚中，5％NaOH液萃取，乙醚層水洗，脫水，回收，得中性油，桂膠柱層析，以氯仿洗脫，收集相應部分即得藁本內(nèi)酯。[陸蘊如，中藥化學，學苑出版社，1995；337]藥材(當歸)粉碎，以石油醚(60-90℃)加熱回流提取三次，每次4小時，合并提取液，減壓回收溶劑，浸膏置冰箱冷凍一晝夜，將析出的固體與液體分開，油液拌以適量粗孔硅膠，室溫涼干，低溫干燥。粗孔桂膠用濕法裝柱后，樣品置層析柱頂端，以冷凍過的石油醚快速沖洗，除去揮發(fā)油等低極性組分，以石油醚-乙醚洗脫，此部分減壓回收溶劑后得橙黃色油狀物，將此粗品再拌以硅膠，以石油醚-乙酸乙酯洗脫。重復分離兩次，得一淡黃色油狀物，即藁本內(nèi)酯。[陶靜儀，等，當歸成分藁本內(nèi)酯平喘作用的實驗研究，藥學學報，1984，19(8)561-565。
川芎中的順式藁本內(nèi)酯的提取方法有如下報道將藥材(川芎)粉碎，用80℃熱水浸泡20小時，過濾，濾液用苯提取三次，苯提取后水層，乙酸乙酯提取物經(jīng)硅膠柱層析，苯-乙酸乙酯洗脫出組分3，經(jīng)硅膠柱層析，苯-乙酸乙酯(2∶3)洗脫，分割成7個組分，其中組分2經(jīng)制備薄層層析，正己烷-乙醚(4∶1)展開得藁本內(nèi)酯。[王普善，等。中藥川芎的化學成分研究-五種內(nèi)酯類化合物，中草藥，1985，16(3)137]上述方法在提取和分離順式藁本內(nèi)酯的過程中不僅大量使用了毒性很大的苯，而且所采用的分離手段只適用于實驗室研究，無法進行工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術存在的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種順式藁本內(nèi)酯的提取方法，該方法采用低毒、低成本的有機溶劑結合高剪切技術的方法來提取、分離藥材中的順式藁本內(nèi)酯的，所得產(chǎn)物收率高，產(chǎn)物純度在90％以上，而且提取工藝簡單可靠，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的另一目的在于提供順式藁本內(nèi)酯在制備治療和預防與微循環(huán)障礙有關的疾病的藥物中的應用。
本發(fā)明的上述目的是這樣實現(xiàn)的一種順式藁本內(nèi)酯的提取方法，該方法包括如下步驟1.預處理及粉碎步驟將待提取的藥材進行去雜質、清洗后，粉碎成細粉。
2.高剪切提取步驟在提取罐中加入提取溶劑乙醇、乙酸乙酯或石油醚中的任意之一或任意組合，在高剪切儀器的運轉下，于提取罐中連續(xù)加入粉碎的藥材，在提取溫度下進行提取，達到提取時間后提取完成。
3.分離、純化步驟收集提取液，棄去殘渣，減壓回收提取液中的溶劑，液體剩余物直接上樣于硅膠柱，用洗脫劑洗脫，洗脫劑為乙酸乙酯和石油醚的混合物。收集第二色帶，減壓回收洗脫液中的溶劑，剩余物采用同樣的硅膠柱層析的方法多次純化，直至純度達到90％以上。將最后一次柱層析的洗脫液減壓回收溶劑后，剩余物用分子蒸餾法脫去殘余溶劑，即得產(chǎn)物順式藁本內(nèi)酯。
本發(fā)明的提取方法具體實施于藥材川芎中的順式藁本內(nèi)酯的提取，因為川芎中的順式藁本內(nèi)酯含量高，提取到的產(chǎn)物順式藁本內(nèi)酯的收率高，當然，本提取方法也可用于其它藥材的順式藁本內(nèi)酯有效成分的提取，諸如當歸等。
采用本發(fā)明的提取方法進行提取時，首先需要將待提取藥材進行預處理及粉碎，即將藥材去雜質、清洗后，粉碎成細粉，細粉粒徑為0.1-1mm。一般情況下，粒度越小越有利于縮短提取時間和提高提取收率。需要注意的是，由于有效成分順式藁本內(nèi)酯的不穩(wěn)定性，粉碎后的藥材需盡早進行提取，最遲不能超過一天。
其次，在提取罐中加入提取溶劑，提取溶劑的用量與待提取藥材的用量的質量比主要由待提取藥材中的有效成分含量的高低決定，即藥材中藁本內(nèi)酯含量越高，提取溶劑量就越大，通常質量比為3∶1-15∶1。在高剪切儀器的運轉下，于提取罐中連續(xù)加入粉碎的藥材。在提取過程中，高剪切儀器的轉速從2000/分逐漸升高至20000/分。在提取過程中，提取溶劑與待提取藥材的混合體系的溫度即提取溫度隨提取時間和提取環(huán)境溫度的改變而不盡相同。提取過程中提取溫度從室溫不斷上升，但必須控制使其不超過60℃。如果在提取過程中，提取溫度上升至60℃，則需停止提取工作，關閉高剪切儀，待溫度下降以后，再繼續(xù)進行提取。通常提取溫度在20℃-60℃的范圍內(nèi)。所需的提取時間主要由被提取藥材粉碎程度和藥材中的有效成分含量的高低決定，藥材中的順式藁本內(nèi)酯含量高，提取時間就長；藥材粉碎得越細，提取時間就越短，提取時間通常為0.5-3小時。
最后，待提取完成后，收集提取液，棄去殘渣，控制溫度在20℃-60℃之間，減壓回收提取液中的溶劑，液體剩余物直接上樣于硅膠(200-400目)柱，將硅膠柱裝置避光放置，用洗脫劑石油醚和乙酸乙酯的混合物進行洗脫。洗脫劑石油醚和乙酸乙酯的比例必須視待分離的混合物中的雜質及其含量的多少而確定。雜質多，雜質含量高，該比例值就高，其比例的范圍為100∶0-4∶1。收集第二色帶，減壓回收洗脫液中的溶劑，溫度控制在20℃-60℃。采用同樣的硅膠柱層析的方法多次分離、純化，直至順式藁本內(nèi)酯的純度達到90％以上。將最后一次柱層析的洗脫液減壓回收溶劑后，液體剩余物用分子蒸餾法脫去殘余溶劑，分子蒸餾的溫度為20-40℃，真空度在脫溶劑的過程中從10-6逐漸上升，最高升至500Pa(分子蒸餾的真空度取決于設備本身，但不能高于500Pa)，最后得到產(chǎn)物順式藁本內(nèi)酯，純化后的產(chǎn)物——順式藁本內(nèi)酯必須在-10℃以下避光儲藏。
本發(fā)明提供的提取方法與現(xiàn)有技術的提取方法相比，提取溶劑和洗脫溶劑的毒性低、安全性高，溶劑用量大幅度降低，產(chǎn)物收率高，適合于大工業(yè)生產(chǎn)；所得產(chǎn)物順式藁本內(nèi)酯不含殘留溶劑，產(chǎn)物純度高，達到我國《藥品注冊管理辦法》中規(guī)定的一類中藥新藥的純度要求。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)順式藁本內(nèi)酯有治療和預防與微循環(huán)障礙有關的疾病的作用。藥理試驗的結果表明該化合物具有以下藥理作用1、顯示良好的改善微循環(huán)作用，對高分子右旋糖酐所致急性微循環(huán)障礙模型的影響如下對血液流速流態(tài)的影響表現(xiàn)為3.0、1.5、0.75mg/kg三個劑量組均能明顯改善血液流動狀態(tài)(P＜0.01)，使血液流態(tài)粒緩流改善為線粒流和粒流；微血管造影法顯示各劑量組均能增加血流速度，縮小耳眼循環(huán)時間(P＜0.01)。此外，微血管造影法顯示出還可明顯減少微血管滲漏，降低微血管通透性(P＜0.01)，進而阻止水腫的發(fā)生。順式藁本內(nèi)酯各劑量組血液鮮紅程度強于模型組，與正常組相似。因此可用于微循環(huán)障礙疾病的治療和預防，包括休克、糖尿病并發(fā)癥、心肺功能障礙、腦功能障礙及多臟器衰竭等的治療和預防。
2、順式藁本內(nèi)酯具有顯著降低內(nèi)毒素休克小鼠死亡率的作用，其作用強度強于地塞米松。其最大特點是可有效避免由于大劑量內(nèi)毒素所致循環(huán)障礙，主要表現(xiàn)在可維持小鼠體溫正常，而模型組和地塞米松組動物體溫急劇下降。藁本內(nèi)酯組死亡率為30％，地塞米松組死亡率為60％，模型組死亡率為80％。
3、順式藁本內(nèi)酯具有顯著的對抗油酸所致大鼠呼吸窘迫綜合征的作用，具體表現(xiàn)為顯著降低肺水腫、肺瘀血，改善呼吸功能及減慢心率的作用。
4、順式藁本內(nèi)酯具有顯著的對抗心絞痛、心肌梗死的作用。
以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細闡述。
具體實施例方式
實施例1將川芎藥材100Kg粉碎成細粉，粒徑為0.1-1mm。在提取罐中加入1500kg的95％乙醇，啟動高剪切儀，于提取罐中連續(xù)加入藥粉進行提取，高剪切儀的轉速從2000/分逐漸上升至20000/分，提取溫度從室溫20℃逐漸升高，控制其在60℃以下，提取時間為3小時。收集提取液，于60℃減壓回收溶劑，剩余物直接上樣于硅膠(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(98∶2)洗脫，收集第二色帶，于40℃減壓回收洗脫液中的溶劑，剩余物用上述硅膠柱層析方法反復分離、純化3次，將最后一次柱層析的洗脫液減壓回收溶劑后，剩余物用分子蒸餾法脫去溶劑，分子蒸餾的溫度為40℃，真空度在脫溶劑的過程中從10-6逐漸升至10Pa，脫去殘余溶劑后得到順式藁本內(nèi)酯0.98kg，收率為0.98％，純度為93.2％。
實施例2將川芎藥材115Kg粉碎成細粉0.1-1mm，在提取罐中裝入800kg乙酸乙酯，啟動高剪切儀，于提取罐中連續(xù)加入藥粉進行提取，高剪切儀的轉速從2000/分逐漸上升至20000/分，提取溫度為20℃-60℃，提取時間為1.5小時，收集提取液，于50℃減壓回收溶劑，剩余物直接上樣于硅膠(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(9∶1)洗脫，收集第二色帶，于50℃減壓回收洗脫液中的溶劑，剩余物用上述硅膠柱層析方法反復分離、純化2次，將最后一次柱層析的洗脫液減壓回收溶劑后，剩余物用分子蒸餾法脫去溶劑，分子蒸餾的溫度為40℃，真空度在脫溶劑的過程中從10-6逐漸升至100Pa，脫去殘余溶劑后得到順式藁本內(nèi)酯1.18kg，收率為1.03％，純度為92.82％。
實施例3將川芎藥材110Kg粉碎成細粉0.1-1mm，在提取罐中裝入330kg石油醚，啟動高剪切儀，于提取罐中連續(xù)加入藥粉進行提取，高剪切儀的轉速從2000/分逐漸上升至20000/分，提取溫度控制在20-60℃之間，提取時間為0.5小時，收集提取液，于20℃減壓回收溶劑，剩余物直接上樣于硅膠(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(4∶1)洗脫，收集第二色帶，于50℃減壓回收洗脫液中的溶劑，剩余物同法反復純化2次，將最后一次柱層析的洗脫液減壓回收溶劑后，剩余物用分子蒸餾法脫去溶劑，分子蒸餾的溫度為40℃，真空度在脫溶劑的過程中從10-6逐漸升至500Pa，脫去殘余溶劑后得到順式藁本內(nèi)酯1.02kg，收率為0.93％，純度為92.82％。
實施例4將川芎藥材90 Kg粉碎成細粉，粒徑為0.1-1mm。在提取罐中加入450kg的石油醚和乙酸乙酯的混合物，其比例為石油醚∶乙酸乙酯＝3∶2，啟動高剪切儀，于提取罐中連續(xù)加入藥粉進行提取，高剪切儀的轉速從2000/分逐漸上升至20000/分，控制提取溫度在20-60℃，提取時間為40分鐘。收集提取液，于40℃減壓回收溶劑，剩余物直接上樣于硅膠(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(99∶1)洗脫，收集第二色帶，于40℃減壓回收洗脫液中的溶劑，剩余物用上述硅膠柱層析方法反復分離、純化2次，將最后一次柱層析的洗脫液減壓回收溶劑后，剩余物用分子蒸餾法脫去溶劑，分子蒸餾的溫度為20℃，真空度在脫溶劑的過程中從10-6逐漸升至10Pa，脫去殘余溶劑后得到順式藁本內(nèi)酯0.81kg，收率為90％，純度為95.4％。
實施例5將川芎藥材105Kg粉碎成細粉，粒徑為0.1-1mm。在提取罐中加入840kg的乙醇和石油醚混合物，其比例為乙醇∶石油醚＝5∶1，啟動高剪切儀，于提取罐中連續(xù)加入藥粉進行提取，高剪切儀的轉速從2000/分逐漸上升至20000/分，控制提取溫度在20-60℃，提取時間為1小時。收集提取液，于45℃減壓回收溶劑，剩余物直接上樣于硅膠(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(95∶5)洗脫，收集第二色帶，于45℃減壓回收洗脫液中的溶劑，剩余物用上述硅膠柱層析方法反復分離、純化3次，將最后一次柱層析的洗脫液減壓回收溶劑后，剩余物用分子蒸餾法脫去溶劑，分子蒸餾的溫度為35℃，真空度在脫溶劑的過程中從10-6逐漸升至500Pa，脫去殘余溶劑后得到順式藁本內(nèi)酯1.02kg，收率為0.97％，純度為94.27％。
實施例6將川芎藥材30Kg粉碎成細粉，粒徑為0.1-1mm。在提取罐中加入180kg的乙醇和石油醚混合物，其比例為乙醇∶石油醚＝3∶1，啟動高剪切儀，于提取罐中連續(xù)加入藥粉進行提取，高剪切儀的轉速從2000/分逐漸上升至20000/分，控制提取溫度在20-60℃，提取時間為1小時。收集提取液，于50℃減壓回收溶劑，剩余物直接上樣于硅膠(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(9∶1)洗脫，收集第二色帶，于45℃減壓回收洗脫液中的溶劑，剩余物用上述硅膠柱層析方法反復分離、純化3次，將最后一次柱層析的洗脫液減壓回收溶劑后，剩余物用分子蒸餾法脫去溶劑，分子蒸餾的溫度為45℃，真空度在脫溶劑的過程中從10-6逐漸升至10Pa，脫去殘余溶劑后得到順式藁本內(nèi)酯0.26kg，收率為0.86％，純度為96.45％。
實施例7將川芎藥材42Kg粉碎成細粉，粒徑為0.1-1mm。在提取罐中加入210kg的石油醚，啟動高剪切儀，于提取罐中連續(xù)加入藥粉進行提取，高剪切儀的轉速從2000/分逐漸上升至20000/分，控制提取溫度在20-60℃，提取時間為1小時。收集提取液，于45℃減壓回收溶劑，剩余物直接上樣于硅膠(200-400目)柱，用石油醚洗脫，收集第二色帶，于45℃減壓回收洗脫液中的溶劑，剩余物用上述硅膠柱層析方法反復分離、純化2次，將最后一次柱層析的洗脫液減壓回收溶劑后，剩余物用分子蒸餾法脫去溶劑，分子蒸餾的溫度為40℃，真空度在脫溶劑的過程中從10-6逐漸升至300Pa，脫去殘余溶劑后得到順式藁本內(nèi)酯0.37kg，收率為0.88％，純度為94.23％。
實施例8順式藁本內(nèi)酯對內(nèi)毒素休克小鼠的保護作用。
昆明種小鼠，18±2g，100只，分為5組，分別為模型組、順式藁本內(nèi)酯小劑量(BT-L)組、順式藁本內(nèi)酯中劑量(BT-M)組、順式藁本內(nèi)酯大劑量(BT-H)組和地塞米松組，其中BT表示順式藁本內(nèi)酯，以上各表示方式同樣適用于以下各實施例。
各組動物復制小鼠內(nèi)毒素休克模型后，順式藁本內(nèi)酯各組灌胃給藥，地塞米松組腹腔注射給藥，觀察24小時小鼠的存活率，及動物一般情況和活動狀態(tài)。結果見表1。
表1 順式藁本內(nèi)酯對內(nèi)毒素體克小鼠死亡率的影響組別 劑量(mg/kg)動物數(shù)死亡數(shù)模型組 - 2017BT-H 10(ig) 206BT-M 5(ig) 2010BT-L 2.5(ig)2014地塞米松 10(ip) 2012由表1可知，該模型是成功的。模型組和地塞米松組動物表現(xiàn)為周身發(fā)冷，唇色發(fā)紫，而各BT組動物體溫正常，唇色與給藥前無顯著性變化。試驗結果表明順式藁本內(nèi)酯具有顯著降低內(nèi)毒素休克小鼠死亡率的作用。
實施例9順式藁本內(nèi)酯對高分子右旋糖酐所致急性家兔微循環(huán)障礙模型的影響研究將受試新西蘭家兔(體重2.0-2.5kg)，按體重隨機分為6組，每組10只。包括①正常對照組(NS)；②模型組(CONTROL)；③BT-H組；④BT-M組；⑤BT-L組；⑥陽性藥-腦得生組(NDSH)。
建立模型后，將對照組和模型組給等體積生理鹽水，其它組灌胃給藥，1小時后，觀察記錄給藥后微循環(huán)情況。
①血液流態(tài)流速的觀察根據(jù)田牛血流速度分級測定法測定。其方法為根據(jù)血流運動形式，將流速分成七級(1)線流 (2)線粒流 (3)粒線流 (4)粒流 (5)粒緩流 (6)粒擺流 (7)停滯。
試驗結果通過計算機運用SAS軟件進行RIDIT分析，測定結果見表2。
表2 對DEXTRAN T500所致急性家兔微循環(huán)障礙的流態(tài)流速分級的影響組別 動物劑量流態(tài)流速分級顯著性(只)mg/kg 線流 線粒流 粒流 粒緩流NS 9 - 8 10 0 -CONTROL9 - 0 02 7 ★★BT-H 9 3 0 44 1 **BT-M 10 1.50 36 1 **BT-L 10 0.75 0 36 1 **NDSH 10 3270 26 2 **注給藥組與模型組相比，**表示P＜0.01。
模型組與對照組相比，★★表示P＜0.01。
由表2可知，模型組與正常組相比，軟腦膜微血管內(nèi)血流速度明顯減慢，由正常的線流、粒線流變?yōu)榱Ａ骰蛄＞徚?P＜0.01)；順式藁本內(nèi)酯各劑量組和腦得生組給藥1小時后，與模型組相比，均能明顯改善血流流態(tài)(P＜0.01)，順式藁本內(nèi)酯隨著劑量的增加，藥效有增強的趨勢。
②對紅細胞聚集的影響按田牛的三級分類法觀察記錄。其方法分為以下三級(1)紅細胞輕度聚集 (2)紅細胞中度聚集 (3)紅細胞重度聚集。
試驗結果通過計算機運用SAS軟件進行RIDIT分析，測定結果見表3。
表3 對DEXTRAN T500所致急性家兔微循環(huán)障礙紅細胞聚集的影響組別 動物劑量mg/kg紅細胞聚集分級 顯著性(只) 無 輕中重NS9 -9 1 0 0-CONTROL 9 -0 0 8 1★★BT-H 9 3.0 0 4 5 0**BT-M 10 1.5 0 3 6 1**BT-L 10 0.75 0 2 7 1**NDSH 10 327 0 3 6 1**注與模型組相比，**表示P＜0.01。
模型組與對照組相比，★★表示P＜0.01。
由表3可知，模型組微血管內(nèi)紅細胞出現(xiàn)中度聚集，個別出現(xiàn)重度聚集，與生理鹽水對照組相比，紅細胞聚集明顯(P＜0.01)；順式藁本內(nèi)酯各劑量組和腦得生組給藥1小時后，均能改善紅細胞聚集(P＜0.01)。腦得生片對紅細胞聚集的影響與順式藁本內(nèi)酯中劑量組相當。
③血液流速測定以微血管造影法測定耳-眼循環(huán)時間表示表4 對DEXTRAN T500所致急性家兔微循環(huán)障礙血液流速的影響(x±s)組別動物只劑量 耳眼循環(huán)時間(s)mg/kgNS 9 -5.90±0.42CONTROL9 -8.30±0.62★★BT-H 9 3.0 6.84±0.48**BT-M 10 1.5 7.51±0.44**BT-L 10 0.75 6.06±0.43**NDSH 10 327 7.22±0.85**注與模型組相比，**表示P＜0.01。
模型組與對照組相比，★★表示P＜0.01。
由表4可知，與對照組比，模型組靜注高分子右旋糖酐后，耳眼循環(huán)時間明顯延長(P＜0.01)；順式藁本內(nèi)酯各劑量組和腦得生組給藥1小時后，均能明顯縮短耳眼循環(huán)時間(P＜0.01)，藁本內(nèi)酯各組間差異不顯著。
④微血管通透性改變的觀察——以微血管造影法來顯示將已觀察耳眼循環(huán)時間的動物，采用微循環(huán)觀察儀觀察微血管內(nèi)外熒光物質的變化。參照上海醫(yī)科大學病理生理教研室的分級方法，將熒光物質滲出分為四級(1)滲出不明顯(-)(2)輕度滲出(+)(3)中度滲出(++)(4)重度滲出(+++)試驗結果通過計算機運用SAS軟件進行RIDIT分析，測定結果見表5。
表5 對DEXTRAN T500所致急性家兔微循環(huán)障礙微血管通透性的影響(x±s)組別 動物 劑量 通透性分級 顯著性(只) mg/kg - + +++++NS 9- 8 1 0 0 -CONTROL9- 0 0 2 7 ★★BT-H 93.0 0 3 5 1 **BT-M 10 1.503 6 1 1 **BT-L 10 0.750 2 7 1 **NDSH 10 327 0 2 6 2 **注與模型組相比，**表示P＜0.01。
模型組與對照組相比，★★表示P＜0.01。
由表5可知，與對照組相比，模型組靜注高分子右旋糖酐后，家兔微血管外熒光物質明顯增多(P＜0.01)；順式藁本內(nèi)酯各劑量組和腦得生組給藥1小時后，均能明顯減少軟腦膜微血管外熒光物質(P＜0.01)，各劑量組差異不顯著。
⑤微血管形態(tài)觀察通過對各組動物進行顯微攝像觀察，順式藁本內(nèi)酯各劑量組對紅細胞聚集、血色、血液流動狀態(tài)、微血管周圍滲漏及毛細血管中紅細胞的灌注情況均有明顯的改善作用，而腦得生片除其血色無改善外，其余指標基本與順式藁本內(nèi)酯相同。同時，藁本內(nèi)酯各劑量組血液鮮紅程度強于模型組，與正常組相似。
實施例10順式藁本內(nèi)酯對油酸所致大鼠呼吸窘迫綜合征的保護作用將實驗動物-SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、油酸致傷組、油酸致傷+BT-H、油酸致傷+BT-M、油酸致傷+BT-L、油酸致傷+地塞米松六個組，致傷組按0.15ml/kg尾靜脈緩慢注入，正常對照組注入等量生理鹽水。注射后立即給予相應藥物。觀察各組動物一般表現(xiàn)，呼吸頻率、幅度，于注射油酸6小時后，開胸取肺，進行病理學觀察。
試驗結果①呼吸頻率與一般狀態(tài)動物注射油酸后逐漸發(fā)生呼吸急促，口唇紫紺。順式藁本內(nèi)酯使動物處于較為安靜的狀態(tài)，呼吸頻率趨于正常，口唇紫紺現(xiàn)象明顯減輕。
②病理學觀察油酸損傷組，肺體膨大，表面呈暗紅色充血水腫狀，見彌散大片狀出血瘀斑，切面見多量紅色泡沫狀液體溢出；順式藁本內(nèi)酯各劑量組肺體積較小，表觀為紅褐色，充血程度較輕，散在點狀出血和小片瘀血斑，切面僅見少量粉紅色泡沫樣液體溢出。地塞米松的瘀血狀改善不如順式藁本內(nèi)酯組。
③肺系數(shù)和肺濕/干重比值油酸損傷組肺系數(shù)和肺濕重/干重比值顯著增加；而順式藁本內(nèi)酯保護系數(shù)和肺濕重/干重比值均比油酸組顯著降低，提示肺水腫被緩解。結果見表6。
表6 順式藁本內(nèi)酯對油酸所致大鼠肺損傷的影響(x±s)

☆☆與空白組比較；★★與模型組比較。
權利要求
1.一種順式藁本內(nèi)酯的提取方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)預處理及粉碎步驟將待提取的藥材進行去雜質、清洗后，粉碎成細粉；(2)高剪切提取步驟在提取罐中加入提取溶劑乙醇、乙酸乙酯或石油醚中的任意之一或任意組合，在高剪切儀器的運轉下，于提取罐中連續(xù)加入粉碎的藥材，在提取溫度下進行提取，達到提取時間后提取完成；(3)分離、純化步驟收集提取液，棄去殘渣，減壓回收提取液中的溶劑，液體剩余物直接上樣于硅膠柱，用洗脫劑洗脫，洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯的混合物，收集第二色帶，減壓回收洗脫液中的溶劑，剩余物采用同樣的硅膠柱層析的方法多次分離、純化，直至純度達到90％以上。將最后一次柱層析的洗脫液減壓回收溶劑后，剩余物用分子蒸餾法脫去殘余溶劑，即得產(chǎn)物順式藁本內(nèi)酯。
2.如權利要求1所述的順式藁本內(nèi)酯的提取方法，其特征在于，其中所述的藥材為川芎。
3.如權利要求1所述的順式藁本內(nèi)酯的提取方法，其特征在于，步驟(1)中的藥材粉碎的細粉粒徑為0.1至1mm。
4.如權利要求1所述的順式藁本內(nèi)酯的提取方法，其特征在于，步驟(2)中提取溶劑的用量與待提取藥材的用量的質量比為3∶1-15∶1。
5.如權利要求1所述的順式藁本內(nèi)酯的提取方法，其特征在于，步驟(2)中的高剪切儀器的轉速從轉速2000/分逐漸上升到最大轉速20000/分，提取溫度為20℃-60℃，提取時間為0.5-3小時。
6.如權利要求1所述的順式藁本內(nèi)酯的提取方法，其特征在于，步驟(3)中所述的洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯＝100∶0-4∶1，硅膠柱所用的硅膠為200-400目，減壓回收溶劑的溫度為20℃-60℃。
7.如權利要求1所述的藥用植物中順式藁本內(nèi)酯的提取方法，其特征在于，步驟(3)中所述的分子蒸餾的真空度為10-6-500Pa，溫度為20-40℃。
8.順式藁本內(nèi)酯在制備治療和預防與微循環(huán)障礙有關的疾病的藥物中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述疾病為休克、糖尿病并發(fā)癥、心肺功能障礙、腦功能障礙、多臟器衰竭、呼吸窘迫綜合癥、心絞痛、心肌梗死。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種天然順式藁本內(nèi)酯的提取、分離方法，其步驟包括預處理及粉碎步驟、高剪切提取步驟和分離、純化步驟。該方法毒性低、使用安全，產(chǎn)物收率高、純度高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明還提供了用上述提取方法獲得的順式藁本內(nèi)酯在制備治療和預防與微循環(huán)障礙有關的疾病的藥物中的應用。
文檔編號A61K36/236GK1552702SQ0312399
公開日2004年12月8日 申請日期2003年6月3日 優(yōu)先權日2003年6月3日
發(fā)明者劉俊, 魏玉平, 王永富, 鄧穎杰, 俊 劉 申請人:北京九龍制藥廠