專利名稱：淫羊藿苷在制備治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及淫羊藿苷在制備治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松癥是老年醫(yī)學(xué)的熱門課題，隨著世界人口的老化，患骨質(zhì)疏松的人群在逐年增多，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)目前65歲以上的老年人已達(dá)1.2億，而患有骨質(zhì)疏松的患者在這些人群中約占90％，因此防治骨質(zhì)疏松是保證人民生活質(zhì)量的一個(gè)十分迫切的研究課題。
產(chǎn)生骨質(zhì)疏松的根本原因就是骨吸收與骨形成作用失衡，大量的骨吸收使骨量減少、質(zhì)量下降。目前所用治療骨質(zhì)疏松癥的療法(如維生素D、激素替代、二膦酸類藥物)都只能防止骨被吸收而不能促使骨形成。雌激素替代療法，因其具有潛在的致癌危險(xiǎn)性及不良反應(yīng)，故臨床應(yīng)用受到限制；甲狀旁腺激素雖能刺激骨形成，但缺點(diǎn)之一是必須注射給藥；氟化物可通過刺激成骨細(xì)胞的活動(dòng)起作用，但常常引起嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)、骨礦化不良、髖關(guān)節(jié)骨折和椎體骨折的頻率增加等；降鈣素可以短期改善骨質(zhì)疏松患者的疼痛，但在預(yù)防密質(zhì)骨的丟失和髖部骨折效果不好。
中藥淫羊藿是傳統(tǒng)的補(bǔ)腎壯陽藥，《本草綱要》中有“補(bǔ)命門，益精氣，堅(jiān)筋骨”之說。淫羊藿很早即被應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松癥的復(fù)方中藥中，但其抗骨質(zhì)疏松作用直到近年來才引起人們的高度重視，并開展了大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用研究。李青南等用去睪丸法造成SD大鼠的骨質(zhì)疏松癥模型，然后給模型大鼠灌服淫羊藿水煎提取液，每周6次。持續(xù)7周后發(fā)現(xiàn)，灌藥組脛骨近端骨小梁的骨吸收率明顯降低，骨形成率和礦化沉積率則明顯增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該藥具有促進(jìn)骨髓細(xì)胞DNA合成的作用，見李青南，吳鐵，謝華，等.中草藥，1993年，第12期。淫羊藿富含黃酮類化合物，已被證明是淫羊藿藥理作用的主要有效成分。季暉等在維A酸結(jié)合低鈣飼料誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松模型及去卵巢結(jié)合低鈣飼料誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松模型上分別驗(yàn)證淫羊藿總黃酮的抗骨質(zhì)疏松作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淫羊藿總黃酮能明顯提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨表觀面密度和骨密度，降低骨小梁吸收表面百分率和形成表面百分率，升高骨小梁體積百分率(TBV％)，并有提高骨Ca、骨P的趨勢(shì)，見季暉，劉康，龔曉健，等.淫羊藿總黃酮對(duì)摘除卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的防治作用.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2001年，第1期及季暉，劉康，李紹平，等.淫羊藿總黃酮對(duì)維A酸誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松癥的防治作用.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000年，第3期。
雖然淫羊藿及淫羊藿總黃酮的抗骨質(zhì)疏松作用已得到醫(yī)藥界的廣泛認(rèn)同，但由于科研能力所限及資金、技術(shù)壁壘等原因，淫羊藿及淫羊藿總黃酮中真正起作用的是何種成分，至今尚未有結(jié)論。盡管中國(guó)專利公開文本CN1282584A中公開了淫羊藿苷具有預(yù)防或治療性功能障礙和血管收縮的作用，但關(guān)于淫羊藿苷具有預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松的作用未見報(bào)道，鑒于此，本發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)研究，驚奇地發(fā)現(xiàn)淫羊藿總黃酮中具有治療骨質(zhì)疏松作用的成分是淫羊藿苷，即淫羊藿苷具有預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松的醫(yī)藥用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了淫羊藿苷在制備治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了含有淫羊藿苷的治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物。
本發(fā)明所述的淫羊藿苷在治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的醫(yī)藥用途是通過對(duì)淫羊藿總黃酮及淫羊藿苷在治療骨質(zhì)疏松作用上進(jìn)行對(duì)比研究而得出的。
本發(fā)明人通過下列試驗(yàn)證實(shí)了淫羊藿苷具有治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的作用，但并不限于此試驗(yàn)。試驗(yàn)所用的“淫羊藿總黃酮”主要包括朝藿定A、hexandraside A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷，其中淫羊藿苷含量為20％；“淫羊藿苷”含淫羊藿苷90％。分別按文獻(xiàn)王昌利，宋小妹，武新華，等.淫羊藿總黃酮提取分離工藝研究.中成藥，1996年，第5期和辛鐘成，Euy Kyung Kim，田貞姬，等.淫羊藿苷對(duì)陰莖海綿體的松弛效應(yīng)及其作用機(jī)制.科學(xué)通報(bào)，2001年，第6期中所述方法提取分離制備。
通過試驗(yàn)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可提高骨質(zhì)疏松大鼠自主活動(dòng)能力，股骨、脛骨最大負(fù)荷和結(jié)構(gòu)強(qiáng)度；增加股骨和椎骨骨密度，改善骨指數(shù)和股骨灰分指數(shù)?！耙蜣杰铡焙汀耙蜣娇傸S酮”劑量按純淫羊藿苷量計(jì)算，劑量相等時(shí)(如“淫羊藿苷”20mg/kg與“淫羊藿總黃酮”90mg/kg；“淫羊藿苷”40mg/kg與“淫羊藿總黃酮”180mg/kg)，對(duì)骨質(zhì)疏松的治療作用基本相同。由此證明了淫羊藿苷是淫羊藿總黃酮中治療骨質(zhì)疏松的有效成分。
淫羊藿苷分子式C33H40O15，分子量676.67，熔點(diǎn)225～230℃，化學(xué)結(jié)構(gòu)式 淫羊藿苷用于治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松時(shí)，其劑量為10mg～1000mg，優(yōu)選為100mg～500mg。
本發(fā)明所述的淫羊藿苷在用于治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松疾病時(shí)，可以單獨(dú)使用或以含有淫羊藿苷的藥物組合物的形式使用。
本發(fā)明提供的藥物組合物可按本領(lǐng)域已知方法制備并可以通過口服、舌下、經(jīng)皮、肌肉或皮下、皮膚粘膜、尿道、陰道或靜脈等途徑給藥?？诜苿┛梢灾瞥扇缙瑒⒛z囊、顆粒劑、口嚼劑、丸劑、懸浮液、溶液等，非腸道給藥制劑可以制成注射液、凍干粉針等劑型，局部給藥可以制成如霜?jiǎng)?、軟膏劑、貼劑、噴霧劑等。但并不限于此。
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)例1淫羊藿苷對(duì)維甲酸所致雌性大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療作用1.材料淫羊藿總黃酮(含淫羊藿苷20％)，按文獻(xiàn)王昌利，宋小妹，武新華，等.淫羊藿總黃酮提取分離工藝研究.中成藥，1996年第5期制備。
淫羊藿苷(含淫羊藿苷90％)按文獻(xiàn)辛鐘成，Euy Kyung Kim，等.淫羊藿苷對(duì)陰莖海綿體的松弛效應(yīng)及其作用機(jī)制.科學(xué)通報(bào)，2001年第6期中所述方法提取分離制備。
維甲酸膠囊，重慶華邦制藥公司生產(chǎn)，批號(hào)990701；低鈣飼料，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所生產(chǎn)。
普通級(jí)Wistar大鼠，雌性，3～4月齡，體重150～210g，由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。合格證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)字200106005號(hào)。
SX-2.5-10型馬福爐(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司生產(chǎn))；BP210S型電子分析天平(德國(guó)sartorius公司生產(chǎn))；QDR-4000型雙能線骨密度測(cè)定儀(美國(guó)HOLOGIC公司生產(chǎn))；CSS-1101C電子萬能試驗(yàn)機(jī)(長(zhǎng)春試驗(yàn)機(jī)研究所生產(chǎn))。
2.方法2.1大鼠骨質(zhì)疏松模型的制備、動(dòng)物分組及用藥取健康3～4月齡雌性大鼠，隨機(jī)分為6組正常對(duì)照組，骨質(zhì)疏松模型組，淫羊藿苷小劑量組(20mg/kg)，淫羊藿苷大劑量組(40mg/kg)，淫羊藿總黃酮小劑量組(90mg/kg)，淫羊藿總黃酮大劑量組(180mg/kg)。除正常對(duì)照組外，各組大鼠均以維甲酸70mg/kg劑量灌胃給藥，1次/日，連續(xù)三周。造模三周后，停服維甲酸，各組動(dòng)物分別按上述藥物劑量灌胃給藥。1次/日，連續(xù)給藥一個(gè)月。正常對(duì)照組和骨質(zhì)疏松模型組給予與給藥組等容量的生理鹽水(10ml/kg)。飼養(yǎng)室溫度22℃～25℃，濕度50％～70％，喂以低鈣飼料(含鈣量＜0.3％)，自由飲水。
2.2大鼠活動(dòng)能力的測(cè)定末次給藥24h后，取大鼠置于實(shí)驗(yàn)盒中，記錄5min內(nèi)大鼠自主活動(dòng)次數(shù)。
2.3大鼠骨密度測(cè)定末次給藥24h后以10％水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，置于QDR-4000型雙能線骨密度測(cè)定儀探頭下，仰位固定于檢測(cè)臺(tái)上，頭與身體呈直線，線球管對(duì)準(zhǔn)身體縱軸中點(diǎn)，選擇大鼠骨質(zhì)疏松敏感區(qū)域單側(cè)(左側(cè))股骨中點(diǎn)(F50)的皮質(zhì)骨和第三腰椎骨測(cè)定骨密度。
2.4大鼠骨指數(shù)、骨礦成分(骨Ca、P)的測(cè)定末次給藥24h后，取大鼠右側(cè)股骨于120℃烘箱中干燥2h，電子天平測(cè)定骨重量(W)、游標(biāo)卡尺測(cè)定骨長(zhǎng)(L)、骨直徑(D)，計(jì)算表觀線密度(W/L)，表觀面密度(W/LD)。將上述股骨置于800℃馬福爐中灰化8h，使骨呈白色粉末狀，稱灰重(Wash)，其灰重即為無機(jī)物質(zhì)重量。用等離子光量計(jì)測(cè)定骨灰中鈣、磷等元素的含量，并計(jì)算骨灰分的灰分表觀線密度(Wash/L)及灰分表觀面密度(Wash/LD)。
2.5大鼠骨生物力學(xué)的測(cè)定末次給藥24h后，左側(cè)股骨、脛骨剔除肌肉和周圍組織，放入液體石蠟中7天之內(nèi)測(cè)定其生物力學(xué)特征，用電子萬能試驗(yàn)機(jī)做三點(diǎn)折斷試驗(yàn)，參數(shù)為標(biāo)定1/50，加載速度6mm/min，最大負(fù)荷200牛頓(N)，跨距20mm，描記負(fù)荷—變形曲線，計(jì)算最大負(fù)荷及結(jié)構(gòu)強(qiáng)度(引起1mm變形需要的負(fù)荷，相當(dāng)于曲線上的斜率)。
3結(jié)果3.1淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠自主活動(dòng)次數(shù)的影響由表1可見，與正常組相比，模型組大鼠自主活動(dòng)次數(shù)顯著下降；淫羊藿苷大小劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠自主活動(dòng)次數(shù)，效果與相當(dāng)劑量(按淫羊藿苷計(jì))的淫羊藿總黃酮基本相同。表1淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠自主活動(dòng)次數(shù)的影響(n＝10，X±s)組別 劑量(mg/kg) 自主活動(dòng)次數(shù)正常組NS 214.8±36.7模型組NS 115.4±29.3**淫羊藿苷大40 191.6±21.8ΔΔ淫羊藿苷小20 159.5±31.0Δ淫羊藿總黃酮大180 180.8±32.4Δ淫羊藿總黃酮小90 161.2±34.1Δ**P＜0.01 VS正常組；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型組3.2淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響由表2可見，與正常組相比模型組大鼠股骨密度和椎骨密度顯著下降，淫羊藿苷大小劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨密度和椎骨密度，效果與相當(dāng)劑量(按淫羊藿苷計(jì))的淫羊藿總黃酮基本相同。
表2淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響(n＝10，X±s)組別 劑量(mg/kg) 股骨密度(g/cm2) 椎骨密度(g/cm2)正常組NS 0.77±0.08 0.75±0.03模型組NS 0.52±0.06**0.50±0.05**淫羊藿苷大40 0.70±0.02ΔΔ0.68±0.02ΔΔ淫羊藿苷小20 0.61±0.04Δ0.62±0.03Δ淫羊藿總黃酮大1800.72±0.03ΔΔ0.69±0.02ΔΔ淫羊藿總黃酮小90 0.63±0.07Δ0.64±0.06Δ**P＜0.01 VS正常組；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型組3.3淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨指數(shù)的影響由表3可見，與正常組相比模型組大鼠股骨重量、長(zhǎng)度、表觀線密度、表觀面密度均明顯下降，淫羊藿苷大小劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨密度和椎骨密度，效果與相當(dāng)劑量(按淫羊藿苷計(jì))的淫羊藿總黃酮基本相同。
表3淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨灰分指數(shù)的影響(n＝10，X±s)組別 劑量 骨灰重量(g)灰分表觀線密 灰分表觀面密度(mg/kg) 度(g/cm)(g/cm2)正常組NS0.36±0.03 0.10±0.00 0.26±0.01模型組NS0.22±0.02**0.06±0.00**0.20±0.01**淫羊藿苷大400.33±0.03ΔΔ0.08±0.01ΔΔ0.24±0.01ΔΔ淫羊藿苷小200.26±0.03Δ0.07±0.02Δ0.23±0.01Δ淫羊藿總黃酮大180 0.34±0.05ΔΔ0.08±0.01ΔΔ0.24±0.01ΔΔ淫羊藿總黃酮小900.27±0.03Δ0.07±0.01Δ0.23±0.02Δ**P＜0.01 VS正常組；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型組3.4淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨礦成分含量的影響由表4可見，與正常組相比模型組大鼠股骨Ca、P含量顯著降低，淫羊藿苷大小劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨Ca、P含量，效果與相當(dāng)劑量(按淫羊藿苷計(jì))的淫羊藿總黃酮基本相同。
表4淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨灰分指數(shù)的影響(n＝10，X±s)組別 劑量 鈣(mg/g) 磷(mg/g)(mg/kg)正常組NS34.39±2.13 15.44±0.75模型組NS21.41±2.51**9.62±0.56**淫羊藿苷大4030.36±3.52ΔΔ13.28±1.54ΔΔ淫羊藿苷小2026.45±3.22Δ12.67±1.21Δ淫羊藿總黃酮大180 31.33±3.64ΔΔ13.62±1.10ΔΔ淫羊藿總黃酮小9027.69±3.58Δ12.36±1.38Δ**P＜0.01 VS正常組；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型組
3.5淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨、脛骨生物力學(xué)的測(cè)定由表5可見，與正常組相比模型組大鼠股骨和脛骨的最大負(fù)荷、結(jié)構(gòu)強(qiáng)度顯著降低，淫羊藿苷大小劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨和脛骨的最大負(fù)荷、結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，效果與相當(dāng)劑量(按淫羊藿苷計(jì))的淫羊藿總黃酮基本相同。
表5淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨、脛骨生物力學(xué)的影響(n＝10，X±s)組別 劑量 股骨最大負(fù)荷 股骨結(jié)構(gòu)強(qiáng)度 脛骨最大負(fù)荷脛骨結(jié)構(gòu)強(qiáng)度(mg/kg)(N) (N/mm) (N) (N/mm)正常組 NS 108.5±5.7357.6±22.2 71.8±12.8 511.3±134.9模型組 NS 71.6±8.7**250.7±18.9**48.2±13.1**369.6±86.5**淫羊藿苷大 40 98.7±6.4ΔΔ315.4±26.9ΔΔ67.2±10.4ΔΔ464.8±65.3**淫羊藿苷小 20 83.6±9.6Δ278.6±25.7Δ61.8±10.6Δ449.6±74.4Δ淫羊藿總黃酮大 180 101.5±6.2ΔΔ318.6±33.4ΔΔ68.6±15.3ΔΔ473.6±101.9ΔΔ淫羊藿總黃酮小 90 85.6±9.1Δ281.7±35.9Δ62.8±14.9Δ452.9±80.5Δ**P＜0.01 VS正常組；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型組4結(jié)論以上試驗(yàn)結(jié)果表明，給予骨質(zhì)疏松大鼠等劑量的淫羊藿苷(含20％淫羊藿苷的淫羊藿總黃酮90mg/kg、180mg/kg或含淫羊藿苷90％的淫羊藿苷20mg/kg、40mg/kg)，對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松的治療作用基本相同，即淫羊藿總黃酮治療骨質(zhì)疏松的有效成分是淫羊藿苷。
試驗(yàn)例2淫羊藿苷對(duì)切除睪丸所致大鼠腎虛骨質(zhì)疏松癥的治療作用1.材料淫羊藿總黃酮(含淫羊藿苷20％)，按文獻(xiàn)王昌利，宋小妹，武新華，等.淫羊藿總黃酮提取分離工藝研究.中成藥，1996年，第5期制備。
淫羊藿苷(含淫羊藿苷90％)按文獻(xiàn)辛鐘成，Euy Kyung Kim，等.淫羊藿苷對(duì)陰莖海綿體的松弛效應(yīng)及其作用機(jī)制.科學(xué)通報(bào)，2001年，第6期中所述方法提取分離制備。
維甲酸膠囊，重慶華邦制藥公司生產(chǎn)，批號(hào)990701；低鈣飼料，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所生產(chǎn)。
普通級(jí)Wistar大鼠，雄性，3～4月齡，體重150～210g，由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。合格證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)字200106005號(hào)。
SX-2.5-10型馬福爐(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司生產(chǎn))；BP210S型電子分析天平(德國(guó)sartorius公司生產(chǎn))；QDR-4000型雙能線骨密度測(cè)定儀(美國(guó)HOLOGIC公司生產(chǎn))；CSS-1101C電子萬能試驗(yàn)機(jī)(長(zhǎng)春試驗(yàn)機(jī)研究所生產(chǎn))。
2.方法2.1大鼠骨質(zhì)疏松模型的制備、動(dòng)物分組及用藥動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組，骨質(zhì)疏松模型組，淫羊藿苷小劑量組(20mg/kg)，淫羊藿苷大劑量組(40mg/kg)，淫羊藿總黃酮小劑量組(90mg/kg)，淫羊藿總黃酮大劑量組(180mg/kg)。大鼠水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，仰位固定，碘酒消毒陰囊部，沿陰囊正中縱行切開一小口，分開切口，卵圓形睪丸即露出，絲線結(jié)扎，在結(jié)扎線與睪丸之間剪下睪丸，縫合切口，用75％酒精棉球消毒。假手術(shù)組動(dòng)物用同法剝離出睪丸，但不摘除，放回縫合。手術(shù)三周后各組動(dòng)物分別按上述藥物劑量灌胃給藥。1次/日，連續(xù)給藥一個(gè)月。正常對(duì)照組和骨質(zhì)疏松模型組給予與給藥組等容量的生理鹽水(10ml/kg)。飼養(yǎng)室溫度22℃～25℃，濕度50％～70％，喂以低鈣飼料(含鈣量＜0.3％)，自由飲水。
2.2大鼠活動(dòng)能力的測(cè)定末次給藥24h后，取大鼠置于實(shí)驗(yàn)盒中，記錄5min內(nèi)大鼠自主活動(dòng)次數(shù)。
2.3大鼠骨密度測(cè)定末次給藥24h后以10％水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，置于QDR-4000型雙能線骨密度測(cè)定儀探頭下，仰位固定于檢測(cè)臺(tái)上，頭與身體呈直線，線球管對(duì)準(zhǔn)身體縱軸中點(diǎn)，選擇大鼠骨質(zhì)疏松敏感區(qū)域單側(cè)(左側(cè))股骨中點(diǎn)(F50)的皮質(zhì)骨和第三腰椎骨測(cè)定骨密度。
2.4大鼠骨指數(shù)、骨礦成分(骨Ca、P)的測(cè)定末次給藥24h后，取大鼠右側(cè)股骨于120℃烘箱中干燥2h，電子天平測(cè)定骨重量(W)、游標(biāo)卡尺測(cè)定骨長(zhǎng)(L)、骨直徑(D)，計(jì)算表觀線密度(W/L)，表觀面密度(W/LD)。將上述股骨置于800℃馬福爐中灰化8h，使骨呈白色粉末狀，稱灰重(Wash)，其灰重即為無機(jī)物質(zhì)重量。用等離子光量計(jì)測(cè)定骨灰中鈣、磷等元素的含量，并計(jì)算骨灰分的灰分表觀線密度(Wash/L)及灰分表觀面密度(Wash/LD)。
2.5大鼠骨生物力學(xué)的測(cè)定末次給藥24h后，左側(cè)股骨、脛骨剔除肌肉和周圍組織，放入液體石蠟中7天之內(nèi)測(cè)定其生物力學(xué)特征，用電子萬能試驗(yàn)機(jī)做三點(diǎn)折斷試驗(yàn)，參數(shù)為標(biāo)定1/50，加載速度6mm/min，最大負(fù)荷200牛頓(N)，跨距20mm，描記負(fù)荷—變形曲線，計(jì)算最大負(fù)荷及結(jié)構(gòu)強(qiáng)度(引起1mm變形需要的負(fù)荷，相當(dāng)于曲線上的斜率)。
3.結(jié)果3.1淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠自主活動(dòng)次數(shù)的影響由表1可見，與正常組相比，模型組大鼠自主活動(dòng)次數(shù)顯著下降；淫羊藿苷大小劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠自主活動(dòng)次數(shù)，效果與相當(dāng)劑量(按淫羊藿苷計(jì))的淫羊藿總黃酮基本相同。
表1淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠自主活動(dòng)次數(shù)的影響(n＝10，X±s)組別 劑量(mg/kg) 自主活動(dòng)次數(shù)正常組NS232.5±32.7模型組NS126.1±35.4**淫羊藿苷大40205.0±34.6ΔΔ淫羊藿苷小20167.5±33.5Δ淫羊藿總黃酮大180 215.8±32.6ΔΔ淫羊藿總黃酮小90168.2±38.1Δ**P＜0.01 VS正常組；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型組3.2淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響由表2可見，與正常組相比模型組大鼠股骨密度和椎骨密度顯著下降，淫羊藿苷大小劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨密度和椎骨密度，效果與相當(dāng)劑量(按淫羊藿苷計(jì))的淫羊藿總黃酮基本相同。
表2淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響(n＝10，X±s)組別 劑量(mg/kg) 股骨密度(g/cm2) 椎骨密度(g/cm2)正常組NS 0.78±0.02 0.75±0.02模型組NS 0.53±0.07**0.49±0.05**淫羊藿苷大40 0.71±0.03ΔΔ0.67±0.02ΔΔ淫羊藿苷小20 0.62±0.04Δ0.61±0.03Δ淫羊藿總黃酮大1800.75±0.03ΔΔ0.68±0.02ΔΔ淫羊藿總黃酮小90 0.63±0.07Δ0.61±0.05Δ**P＜0.01 VS正常組；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型組3.3淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨指數(shù)的影響由表3可見，與正常組相比模型組大鼠股骨重量、長(zhǎng)度、表觀線密度、表觀面密度均明顯下降，淫羊藿苷大小劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨密度和椎骨密度，效果與相當(dāng)劑量(按淫羊藿苷計(jì))的淫羊藿總黃酮基本相同。
表3淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨灰分指數(shù)的影響(n＝10，X±s)組別 劑量 骨灰重量(g) 灰分表觀線密度灰分表觀面密度(mg/kg) (g/cm)(g/cm2)正常組NS 0.36±0.02 0.14±0.00 0.25±0.01模型組NS 0.24±0.02**0.08±0.01**0.21±0.01**淫羊藿苷大40 0.33±0.03ΔΔ0.11±0.01ΔΔ0.24±0.01ΔΔ淫羊藿苷小20 0.28±0.03Δ0.09±0.02Δ0.23±0.01Δ淫羊藿總黃酮大1800.34±0.05ΔΔ0.11±0.03ΔΔ0.24±0.01ΔΔ淫羊藿總黃酮小90 0.28±0.03Δ0.09±0.01Δ0.23±0.02Δ**P＜0.01 VS正常組；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型組3.4淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨礦成分含量的影響由表4可見，與正常組相比模型組大鼠股骨Ca、P含量顯著降低，淫羊藿苷大小劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨Ca、P含量，效果與相當(dāng)劑量(按淫羊藿苷計(jì))的淫羊藿總黃酮基本相同。
表4淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨灰分指數(shù)的影響(n＝10，X±s)組別 劑量(mg/kg) 鈣(mg/g) 磷(mg/g)正常組NS 34.66±3.51 14.64±1.35模型組NS 22.37±2.63**9.31±0.87**淫羊藿苷大40 31.38±3.58ΔΔ13.16±1.45ΔΔ淫羊藿苷小20 27.82±3.55Δ12.58±1.07Δ淫羊藿總黃酮大18032.36±3.73ΔΔ13.39±1.13ΔΔ淫羊藿總黃酮小90 28.65±3.22Δ12.64±1.32Δ**P＜0.01 VS正常組；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型組3.5淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨、脛骨生物力學(xué)的測(cè)定由表5可見，與正常組相比模型組大鼠股骨和脛骨的最大負(fù)荷、結(jié)構(gòu)強(qiáng)度顯著降低，淫羊藿苷大小劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨和脛骨的最大負(fù)荷、結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，效果與相當(dāng)劑量(按淫羊藿苷計(jì))的淫羊藿總黃酮基本相同。
表5淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨、脛骨生物力學(xué)的影響(n＝10，X±s)組別劑量 股骨最大負(fù)荷 股骨結(jié)構(gòu)強(qiáng)度 脛骨最大負(fù)荷 脛骨結(jié)構(gòu)強(qiáng)度(mg/kg) (N) (N/mm) (N) (N/mm)正常組 NS 118.8±7.5 367.6±22.8 79.2±8.9 648.9±138.8模型組 NS 87.4±19.6**255.8±16.3**53.2±13.2**468±108.2**淫羊藿苷大 40 102.2±9.3ΔΔ311.2±25.4ΔΔ73.6±10.5ΔΔ588.4±84.7ΔΔ淫羊藿苷小 20 99.6±15.1Δ279.4±26.1Δ64.7±10.2Δ509.6±94.3Δ淫羊藿總黃酮大 180 102.3±7.9ΔΔ317.2±34.5ΔΔ75.2±15.4ΔΔ582.6±123.9ΔΔ淫羊藿總黃酮小 90 97.6±9.1Δ283.3±34.8Δ66.5±14.1Δ512.9±91.2Δ**P＜0.01 VS正常組；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型組4結(jié)論以上試驗(yàn)結(jié)果表明，給予骨質(zhì)疏松大鼠等劑量的淫羊藿苷(含20％淫羊藿苷的淫羊藿總黃酮90mg/kg、180mg/kg或含淫羊藿苷90％的淫羊藿苷20mg/kg、40mg/kg)，對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松的治療作用基本相同，即淫羊藿總黃酮治療骨質(zhì)疏松的有效成分是淫羊藿苷。
試驗(yàn)例3不同劑量淫羊藿苷對(duì)維甲酸所致雌性大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療作用1.材料淫羊藿苷(含淫羊藿苷90％)按文獻(xiàn)辛鐘成，Euy Kyung Kim，田貞姬，等.淫羊藿苷對(duì)陰莖海綿體的松弛效應(yīng)及其作用機(jī)制.科學(xué)通報(bào)，2001年，第6期中所述方法提取分離制備。
維甲酸膠囊，重慶華邦制藥公司生產(chǎn)，批號(hào)990701；低鈣飼料，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所生產(chǎn)。
普通級(jí)Wistar大鼠，雌性，3～4月齡，體重150～210g，由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。合格證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)字200106005號(hào)。
SX-2.5-10型馬福爐(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司生產(chǎn))；BP210S型電子分析天平(德國(guó)sartorius公司生產(chǎn))；QDR-4000型雙能線骨密度測(cè)定儀(美國(guó)HOLOGIC公司生產(chǎn))；CSS-1101C電子萬能試驗(yàn)機(jī)(長(zhǎng)春試驗(yàn)機(jī)研究所生產(chǎn))。
2.方法2.1大鼠骨質(zhì)疏松模型的制備、動(dòng)物分組及用藥取健康3～4月齡雌性大鼠，隨機(jī)分為5組正常對(duì)照組，骨質(zhì)疏松模型組，淫羊藿苷大劑量組(20mg/kg)，淫羊藿苷中劑量組(10mg/kg)，淫羊藿苷小劑量組(5mg/kg)。除正常對(duì)照組外，各組大鼠均以維甲酸70mg/kg劑量灌胃給藥，1次/日，連續(xù)三周。造模三周后，停服維甲酸，各組動(dòng)物分別按上述藥物劑量灌胃給藥。1次/日，連續(xù)給藥一個(gè)月。正常對(duì)照組和骨質(zhì)疏松模型組給予與給藥組等容量的生理鹽水(10ml/kg)。飼養(yǎng)室溫度22℃～25℃，濕度50％～70％，喂以低鈣飼料(含鈣量＜0.3％)，自由飲水。
2.2大鼠骨密度測(cè)定末次給藥24h后以10％水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，置于QDR-4000型雙能線骨密度測(cè)定儀探頭下，仰位固定于檢測(cè)臺(tái)上，頭與身體呈直線，線球管對(duì)準(zhǔn)身體縱軸中點(diǎn)，選擇大鼠骨質(zhì)疏松敏感區(qū)域單側(cè)(左側(cè))股骨中點(diǎn)(F50)的皮質(zhì)骨和第三腰椎骨測(cè)定骨密度。
2.3大鼠骨生物力學(xué)的測(cè)定末次給藥24h后，左側(cè)股骨、脛骨剔除肌肉和周圍組織，放入液體石蠟中7天之內(nèi)測(cè)定其生物力學(xué)特征，用電子萬能試驗(yàn)機(jī)做三點(diǎn)折斷試驗(yàn)，參數(shù)為標(biāo)定1/50，加載速度6mm/min，最大負(fù)荷200牛頓(N)，跨距20mm，描記負(fù)荷—變形曲線，計(jì)算最大負(fù)荷及結(jié)構(gòu)強(qiáng)度(引起1mm變形需要的負(fù)荷，相當(dāng)于曲線上的斜率)。
3結(jié)果3.1淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響由表1可見，與正常組相比模型組大鼠股骨密度和椎骨密度顯著下降，淫羊藿苷大、中劑量均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨密度和椎骨密度，而淫羊藿苷小劑量(5mg/kg)對(duì)此無明顯影響。
表1淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響(n＝10，X±s)組別 劑量(mg/kg) 股骨密度(g/cm2) 椎骨密度(g/cm2)正常對(duì)照組 NS 0.81±0.02 0.79±0.02模型對(duì)照組 NS 0.51±0.07**0.47±0.05**淫羊藿苷大 20 0.76±0.03ΔΔ0.71±0.02ΔΔ淫羊藿苷中 10 0.64±0.04Δ0.63±0.03Δ淫羊藿苷小 5 0.54±0.07 0.51±0.05**P＜0.01 VS正常組；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型組
3.2淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨、脛骨生物力學(xué)的測(cè)定由表2可見，與正常組相比模型組大鼠股骨和脛骨的最大負(fù)荷、結(jié)構(gòu)強(qiáng)度顯著降低，淫羊藿苷大、中劑量均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨和脛骨的最大負(fù)荷、結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，而淫羊藿苷小劑量(5mg/kg)對(duì)此無明顯影響。
表2淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨、脛骨生物力學(xué)的影響(n＝10，X±s)組別劑量 股骨最大負(fù)荷 股骨結(jié)構(gòu)強(qiáng)度 脛骨最大負(fù)荷脛骨結(jié)構(gòu)強(qiáng)度(mg/kg) (N) (N/mm) (N)(N/mm)正常對(duì)照組 NS 119.8±7.7 373.6±22.8 81.3±8.5 653.2±133.1模型對(duì)照組 NS 67.4±19.3**205.7±16.3**41.2±12.2**447±99.2**淫羊藿苷大 20 103.2±18.3ΔΔ321.2±25.5ΔΔ76.6±12.3ΔΔ581.4±86.7ΔΔ淫羊藿苷中 10 89.6±15.1Δ265.4±29.1Δ62.7±10.2Δ498.6±94.5Δ淫羊藿苷小 573.6±12.3 231.3±34.81 51.2±14.8 459.9±128.2**P＜0.01 VS正常組；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型組試驗(yàn)例4淫羊藿苷急性毒性試驗(yàn)1材料淫羊藿苷(含淫羊藿苷90％)按文獻(xiàn)辛鐘成，Euy Kyung Kim，田貞姬，等.淫羊藿苷對(duì)陰莖海綿體的松弛效應(yīng)及其作用機(jī)制?？茖W(xué)通報(bào)，2001年，第6期中所述方法提取分離制備。
清潔級(jí)昆明系小鼠，18～22g，由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。合格證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)字200106003號(hào)。飼料由中國(guó)藥品生物制品鑒定檢驗(yàn)所提供。按SOP要求檢疫一周，剔除不合格動(dòng)物。試驗(yàn)室與飼養(yǎng)室條件一致。室溫18～25℃，濕度40～60％，過濾送風(fēng)，光照12小時(shí)。自由攝食和飲水，每日更換飲水瓶一次。
2方法2.1劑量設(shè)計(jì)動(dòng)物藥效試驗(yàn)顯示大鼠口服10mg/kg即有明顯的抗骨質(zhì)疏松的作用。淫羊藿苷能夠配制的可供灌胃用的混懸液為100mg/ml，小鼠灌胃給藥的最大允許體積為1ml/只，故設(shè)計(jì)給藥劑量為小鼠5.0g/kg，每日給藥1次。
2.2分組、給藥取健康小鼠40只，雌雄各半。隨機(jī)分為生理鹽水組和淫羊藿苷組，每組20只。稱重后，按5.0g/kg的劑量、1ml/20g的給藥體積灌胃，對(duì)照組灌胃等體積生理鹽水。給藥后密切觀察小鼠的毒性反應(yīng)和死亡情況；4小時(shí)后，改為每天觀察一次，連續(xù)14天。每周測(cè)量體重1次。
3結(jié)果灌胃給予淫羊藿苷后，小鼠活動(dòng)未見異常。4小時(shí)內(nèi)，未見耳朵、眼瞼、四足等部位顏色的改變，尿液顏色未見明顯異常。14天內(nèi)，小鼠毛色光亮，飲食、活動(dòng)以及體重都與對(duì)照組無顯著差異(表1)。
表1小鼠口服5.0g/kg淫羊藿苷體重的變化(X±s)；動(dòng)物體重(g)組別性別數(shù)量 試驗(yàn)前第7天 第14天淫羊藿 ♀ 10 18.58±0.65 25.45±1.07 28.2±1.53苷組♂ 10 18.86±0.52 29.15±0.81 34.57±1.80生理鹽 ♀ 10 18.52±0.63 26.04±2.19 29.38±3.19水組♂ 10 18.59±0.82 29.27±1.77 34.87±1.9權(quán)利要求
1.淫羊藿苷在制備治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于淫羊藿苷的使用劑量范圍為10mg～1000mg。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于淫羊藿苷的使用劑量?jī)?yōu)選為100mg～500mg。
4.含有淫羊藿苷的用于治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松的藥物組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，該組合物可以通過口服、舌下、經(jīng)皮、經(jīng)肌肉或皮下、皮膚粘膜、尿道、陰道或靜脈途徑給藥。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的藥物組合物，其特征在于組合物可以以片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、懸浮液、溶液、糖漿、注射劑、霜?jiǎng)?、軟膏、噴霧劑、口嚼劑或貼劑等形式存在。
全文摘要
本發(fā)明提供了淫羊藿苷在制備治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松藥物中的新用途，該用途的使用劑量為100－1000mg。本發(fā)明還提供了用于骨質(zhì)疏松癥的含淫羊藿苷的藥物組合物，該組合物可以口服、經(jīng)皮、舌下、皮下或靜脈等多種途徑給藥。
文檔編號(hào)A61K31/7048GK1539427SQ0312791
公開日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2003年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月23日
發(fā)明者田京偉, 傅風(fēng)華, 王振華, 徐本明, 劉珂 申請(qǐng)人:山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司