專利名稱：二咖啡?？崴嵫苌锛邦愃莆镌谥委煿跔畈《靖腥居嘘P(guān)疾病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二咖啡酰奎尼酸衍生物及類似物在治療冠狀病毒感染有關(guān)疾病中的新用途，新的二咖啡酰奎尼酸衍生物及類似物、含二咖啡酰奎寧酸或新的二咖啡?？崴嵫苌锛邦愃莆锏乃幬锝M合物。
背景技術(shù)：
自2002年11月我國廣東發(fā)現(xiàn)非典型肺炎以來，至2003年5月5日，世界上已有30個國家和地區(qū)，6583人發(fā)病，461人死亡。至2003年5月6日，我國有4409人發(fā)病，214人死亡。2003年2月由WHO將這種肺炎定義為重癥急性呼吸綜合癥(severe acuterespiratory syndrome，SARS)。美國CDC、加拿大、香港、德國和我國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的科學(xué)家分別用Vero E6和恒河猴胎細胞從不同器官和標本中分離出了冠狀病毒樣顆粒，說明該病毒與SARS的關(guān)系。由于越南河內(nèi)WHO辦公室的醫(yī)生和流行病專家Urbani博士在2月28日檢查河內(nèi)不明原因肺炎患者時受到感染而病逝，因此，Ksiazek等建議將此病毒命名為UrbaniSARS相關(guān)冠狀病毒(Urbani SARS related coronavirus)。已知病毒唑(利巴韋林)和更昔洛韋等核苷類藥物對冠狀病毒有抑制作用，但目前還沒有特效抗冠狀病毒藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一類新的抗冠狀病毒藥物，其具有優(yōu)良的療效且毒副作用很低。
本發(fā)明人經(jīng)廣泛深入地研究，出人意料地發(fā)現(xiàn)二咖啡?？崴嵫苌锛邦愃莆飳跔畈《居酗@著的抑制作用。本發(fā)明其于上述發(fā)現(xiàn)得以完成。
本發(fā)明第一個目的涉及式1(若存在對映體時，包括兩對映體)的二咖啡酰奎寧酸衍生物及類似物在制備用于治療冠狀病毒感染有關(guān)疾病的藥物中的用途， 式1其中Q1為一價鍵，或CH2、CHOH、CH2CH2、CH2CHOH、CHOHCH2、CHCOOH、CH2CH2CHOH、CHOHCH2CH2、CH2CHOHCH2、CH2CHOHCHOH、CHOHCHOHCH2；Q2和Q3可分別為H或合在一起表示CH2CH2、CH2CHOH、CHOHCH2、CH2CH2CHOH、CHOHCH2CH2、CH2CHOHCH2、CH2CHOHCHOH、CHOHCHOHCH2、CH2COH(COOH)CH2、CH2CH2COH(COOH)CH2、CH2COH(COOH)CH2CH2，從而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
X1為O、NH、CH2或CHCOOH
X2為O、NH、CH2或CHCOOH；Y1、Y2、Y3和Y4各為一價鍵、O或NH；當(dāng)Y1、Y2、Y3和Y4各為一價鍵時，R1、R2、R3、R4為CH2COOH、CH2CH2COOH、CH2H2CH2COOH等；當(dāng)Y1、Y2、Y3和Y4各為O或NH時，R1、R2、R3、R4為H、CH3、CH3CO、CH3CH2CO、CH3CH2CH2CO等；Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10為H、Cl、Br或I；Z1和Z2為H，COOH、COOM，其中M表示H、C1-6烷基、芐基或堿金屬及堿土金屬(如Li、Na、K、Mg、Ca、Ba)等；本發(fā)明的再一目的涉及的含式1化合物的藥物組合物，該藥物組合物對冠狀病毒有顯著的抑制作用。根據(jù)本發(fā)明，該藥物組合物中可加有各種藥用賦形劑、添加劑及載體。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的式1化合物或含式1化合物的藥物組合物可用于治療與冠狀病毒有關(guān)的各種疾病，尤其是非典型肺炎(重癥急性呼吸綜合癥，SARS)。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的藥物組合物可按本領(lǐng)域已知方法配成腸道或非腸道給藥的制劑，如片劑、膠囊、顆粒劑、注射劑、噴霧劑、滴鼻劑等。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的式1化合物，主要來自菊科、忍冬科等多種植物，如旋覆花、金銀花、吊子銀花Lonicera similis Hemsl.、葵花子、茵陳、菊花Chrysanthemum morifolium、灑神菊Baccharis gaudichaudiana DC.、茼蒿Chrysanthemum coronarium L.、狹葉紫錐花Echinaceaangustifolia roots、菜薊、燈盞花、紫菀Asterscaber Thunb.、蜂膠、山萵苣Lactuca indica、冬青屬植物Ilex brevicuspis、冬青屬Ilex paraguariensis、苦丁茶Iilex cornutaLindle、yacon(Smallanthus sonchifolius).、咖啡豆、甘薯葉Ipomoea batatas L.、甘薯Bixa orellana、Ipomoeabatatas.、梔子、林蔭千里光、土豆、Artichoke(Cynara scolymus L.)、Arnica montana、Isertiapittieri、Artemisia vulgaris.、Eleutherococcus senticosus、Eleutherococcus senticosus、Phagnalonrupestre、Cydonia oblonga Miller(pulp and peel).、常春藤屬Hedera helix.、Canthiumschimperianum.、魚眼草屬Dichrocephala bicolor、Guettarda acreana、秘魯植物Tessariaintegrifolia and Mikania cordifolia、Pluchea symphytifolia、Quercus stenophylla Makino、Euphorbia resinifera Berg、Artemisia caruifolia、genus Leontodon、leaves of Corchorus olitoriusL.、Tesaria intergrifolia、Mikania cardifolia等?；蛲ㄟ^全合成或半合成方法制備。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明優(yōu)選的抗冠狀病毒化合物為二咖啡酰奎尼酸。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明最優(yōu)選的抗冠狀病毒化合物為1，5-二-O-咖啡酰奎尼酸。
根據(jù)本發(fā)明，二咖啡?？崴峥蓮纳鲜鲋参镏型ㄟ^以下提取路線制備植物(旋覆花、金銀花等)→乙醇提取→乙酸乙酯萃取→柱層析分離。
根據(jù)本發(fā)明，二咖啡?？崴峥赏ㄟ^3，4-二羥基被保護的咖啡酰氯與羥其被選擇性保護的奎尼酸進行酯化反應(yīng)制備。
下面將通過二咖啡?？崴岬目构跔畈《咀饔脕磉M一步闡述本發(fā)明。
在RDa細胞培養(yǎng)內(nèi)，采用病毒CPE法，觀察不同濃度的二咖啡?？鼘幩釋跔畈《镜囊种菩Ч囼灲Y(jié)果表明二咖啡?？鼘幩峋哂幸种乒跔畈《镜淖饔?。1 試驗材料1.1驗證藥物二咖啡?？鼘幩?DCQA)。1.2陽性對照藥物注射用更昔洛韋 批號020802 由湖北科益藥業(yè)股份有限公司提供。1.3細胞腫瘤橫紋肌傳代細胞(RDa)由CDC病毒所提供。1.4病毒冠狀病毒9號分離株(SARS病人咽拭子9號標本)由301醫(yī)院提供。1.5CO2培養(yǎng)箱NUAIR US AUTO FLOW提供。1.6XSZ-D2)由重慶光學(xué)儀器廠生產(chǎn)2 試驗方法2.1預(yù)備試驗2.1.1二咖啡酰奎寧酸對RDa細胞的毒性測定RDa細胞以40萬/ml濃度接種96孔培養(yǎng)板，37℃、5％CO2培養(yǎng)24小時，加入驗證藥物，驗證藥物二咖啡?？鼘幩岜侗认♂尀?000ug/ml～3.9ug/ml，陽性對照藥物更昔洛韋倍比稀釋為2000ug/ml～3.9ug/ml，每濃度接種3孔，每孔100μl，同時設(shè)正常細胞對照，37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)6天，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化(CPE)，以25％以下形態(tài)變化為“+”，26％～50％形態(tài)變化為“++”，51％～75％形態(tài)變化為“+++”，76％～100％形態(tài)變化為“++++”，用Reed-Muench法，計算藥物半數(shù)中毒濃度(TD50)和最大無毒濃度(TD0)。2.1.2在RDa細胞培養(yǎng)內(nèi)對冠狀病毒9號的分離和毒力測定冠狀病毒9號的分離(SARS病人咽拭子分離)RDa細胞以每毫升40萬濃度接種試管，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時，棄掉培養(yǎng)液，每管加入SARS病人咽拭子標本9號，33℃轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)5小時后，加入維持液1ml，同時設(shè)正常細胞對照，33℃轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)5～7天。細胞形態(tài)出現(xiàn)CPE變化后，采用PCR的方法檢測冠狀病毒，9號標本PCR檢測為陽性，確定為冠狀病毒分離株。經(jīng)免疫熒光測定雙份SARS病人血清，IgM陽性，IgG4倍升高，確定為冠狀病毒。采用病毒CPE法測定其效價。病毒CPE法RDa細胞以每毫升40萬濃度接種96孔培養(yǎng)板，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時，加入病毒液，病毒稀釋10-1～10-8，8個濃度，每濃度3孔，每孔100μl，設(shè)正常細胞對照，37℃5％CO2培養(yǎng)5～7天，每24小時在倒置顯微鏡下觀察記錄細胞形態(tài)變化(CPE)以25％以下變化為“+”，26％～50％變化為“++”，51％～75％為“+++”，76％～100％變化為“++++”，用Reed-Muench法，計算病毒半數(shù)感染濃度TCID50。2.2正式試驗二咖啡?？鼘幩嵩赗Da細胞培養(yǎng)內(nèi)對冠狀病毒9號的抑制作用觀察不同濃度的二咖啡?？鼘幩嵩赗Da細胞培養(yǎng)內(nèi)對冠狀病毒9號的抑制作用，試驗采用病毒細胞(CPE)法，計算藥物的半數(shù)有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(shù)TI，判斷藥效。
RDa細胞以40萬/ml濃度接種96孔培養(yǎng)板，37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)24小時，細胞培養(yǎng)至單層，棄掉培養(yǎng)液，加入10TCID50的冠狀病毒液，同時設(shè)正常細胞對照和病毒對照，置37℃ 5％CO2吸附2.5小時后，棄掉病毒液，加入不同濃度的二咖啡?？鼘幩崴幰?，藥物選用對細胞的最大無毒濃度(TD0)2倍稀釋10個濃度即1000μg/ml～1.45μg/ml，陽性對照藥物更昔洛韋為2倍稀釋10個濃度即2000μg/ml～1.45μg/ml，將稀釋的藥物分別加入細胞孔內(nèi)，每濃度3孔，同時設(shè)正常細胞對照和病毒對照，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7天，逐日在倒置顯微鏡下觀察病毒CPE，以病毒對照出現(xiàn)+++-++++時結(jié)束試驗，用Reed-Muench法，計算藥物的半數(shù)有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(shù)(TI)判斷藥效，試驗重復(fù)三次。3 試驗結(jié)果3.1預(yù)備試驗結(jié)果二咖啡酰奎寧酸對RDa細胞的毒性作用二咖啡?？鼘幩岷完栃詫φ账幬镒⑸溆酶袈屙f在RDa細胞培養(yǎng)內(nèi)，采用細胞形態(tài)變化(CPE)法。計算藥物最大無毒濃度(TD0)和半數(shù)中毒濃度(TD50)，以下試驗結(jié)果為三次試驗結(jié)果的均值。
二咖啡?？鼘幩釋Da細胞的毒性試驗結(jié)果二咖啡?？鼘幩嶙畲鬅o毒濃度(TD0)為1000±0μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為2000±0μg/ml陽性對照藥物注射用更昔洛韋最大無毒濃度(TD0)為＞2000±0μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為＞2000±0μg/ml。3.2在RDa細胞培養(yǎng)內(nèi)對冠狀病毒9號毒力測定結(jié)果(TCID50)冠狀病毒9號半數(shù)感染量(TCID50)為10-5正式試驗結(jié)果二咖啡?？鼘幩嵩赗Da細胞培養(yǎng)內(nèi)對冠狀病毒9號的抑制作用(以下試驗數(shù)據(jù)為三次試驗結(jié)果的均值)二咖啡酰奎寧酸CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為31.25±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為62.5±0μg/ml，治療指數(shù)(TI)為16。
陽性對照藥物注射用更昔洛韋CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為15.6±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為31.25±0μg/ml，治療指數(shù)(TI)為＞64。
權(quán)利要求
1.下式(若存在對映體時，包括兩對映體)的二咖啡?？鼘幩嵫苌锛邦愃莆镌谥苽溆糜谥委煿跔畈《靖腥居嘘P(guān)疾病的藥物中的用途， 式1其中Q1為一價鍵，或CH2、CHOH、CH2CH2、CH2CHOH、CHOHCH2、CHCOOH、CH2CH2CHOH、CHOHCH2CH2、CH2CHOHCH2、CH2CHOHCHOH、CHOHCHOHCH2；Q2和Q3可分別為H或合在一起表示CH2CH2、CH2CHOH、CHOHCH2、CH2CH2CHOH、CHOHCH2CH2、CH2CHOHCH2、CH2CHOHCHOH、CHOHCHOHCH2、CH2COH(COOH)CH2、CH2CH2COH(COOH)CH2、CH2COH(COOH)CH2CH2，從而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。X1為O、NH、CH2或CHCOOH；X2為O、NH、CH2或CHCOOH；Y1、Y2、Y3和Y4各為一價鍵、O或NH；當(dāng)Y1、Y2、Y3和Y4各為一價鍵時，R1、R2、R3、R4為CH2COOH、CH2CH2COOH、CH2H2CH2COOH等；當(dāng)Y1、Y2、Y3和Y4各為O或NH時，R1、R2、R3、R4為H、CH3、CH3CO、CH3CH2CO、CH3CH2CH2CO等；Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10為H、Cl、Br或I；Z1和Z2為H，COOH、COOM，其中M表示H、C1-6烷基、芐基或堿金屬及堿士金屬(如Li、Na、K、Mg、Ca、Ba)等；
2.一種用于治療冠狀病毒感染有關(guān)疾病的藥物組合物，其包括作為活性成份的權(quán)利要求1二咖啡?？崴嵫苌锖皖愃莆铮八幱觅x形劑或載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中二咖啡?？鼘幩嵫苌锛邦愃莆餅槎Х弱？崴?。權(quán)利要求1式1中，當(dāng)Q1為CH2，Q2、Q3合在一起為CH2CHOHCHOH或CHOHCHOHCH2，Z1或Z2為COOH時；或當(dāng)Q1為CH2CHOH或CHOHCH2，Q2、Q3合在一起為CH2CHOH或CHOHCH2，Z1或Z2為COOH時；或當(dāng)Q1為CHOH，Q2、Q3合在一起為CH2COH(COOH)CH2，Z1和Z2為H時；或當(dāng)Q1為一價鍵，Q2、Q3合在一起為CH2CH2COH(COOH)CH2或CH2COH(COOH)CH2CH2，Z1和Z2為H時，為二咖啡?？崴嵫苌铩．?dāng)X1和X2為O，Y1、Y2、Y3和Y4各為O，R1、R2、R3、R4和Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10為H時，分別為1，3-二-O-咖啡?？崴?、1，4-二-O-咖啡?？崴?、1，5-二-O-咖啡?？崴?、3，4-二-O-咖啡?？崴?、3，5-二-O-咖啡?？崴帷?，5-二-O-咖啡?？崴?，它們的乙?；苌锛捌湎鄳?yīng)的鹽。它們在制備用于治療冠狀病毒感染有關(guān)疾病的藥物中的用途，
4.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中二咖啡酰奎寧酸衍生物為1，5-二-O-咖啡?？崴?。
5.權(quán)利要求3、4的二咖啡?？崴嵩谥委煿跔畈《居嘘P(guān)疾病中的用途。
6.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述藥物組合物可被配成片劑，膠囊，注射液或劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及二咖啡?？崴?、二咖啡?？崴嵫苌锛邦愃莆镌谥委煿跔畈《居嘘P(guān)疾病上的新用途，新的二咖啡?？崴嵫苌锛邦愃莆?、含二咖啡酰奎寧酸或新的二咖啡?？崴嵫苌锛邦愃莆锏乃幬锝M合物。
文檔編號A61K31/21GK1449751SQ03128729
公開日2003年10月22日 申請日期2003年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月7日
發(fā)明者董俊興, 張慧娟, 屠愛萍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所