專利名稱：一種抗亞洲一型口蹄疫病毒的多肽疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬遺傳工程領域，具體涉及一種抗亞洲一型口蹄疫病毒的多肽疫苗及其制備方法。
口蹄疫的致病原為口蹄疫病毒(FMDV)。FMDV屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，其結構較簡單，完整的病毒粒子由4種結構蛋白VP1、VP2、VP3及VP4各60個拷貝構成的衣殼包裹一條單股正鏈RNA組成，其中VP1是主要的抗原蛋白。根據免疫原性不同，F(xiàn)MDV有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3及Asial共7個血清型及65個以上的亞型，各型之間彼此幾乎沒有交叉免疫力，感染了一型FMDV的動物仍可感染另一型FMDV而發(fā)病。這給有多種血清型口蹄疫爆發(fā)流行的地區(qū)口蹄疫防治工作帶來了很大的困難。
目前尚無治療FMD的有效辦法，捕殺、消毒以及預防接種是控制FMD的常用途徑。由于捕殺會帶來巨大的經濟損失，且難以在大范圍內進行，因此，進行廣泛的免疫接種是現(xiàn)階段最主要的防治措施。預防FMDV的疫苗有減毒疫苗、滅活疫苗、重組多肽疫苗以及仍處在研究階段的DNA疫苗。減毒疫苗對動物有較好的免疫效果，保護時間也較長，并且很經濟，但減毒病毒經過傳代以后其毒力可能恢復，有的在通常情況下沒有毒力，但在特殊的生理狀況下例如孕娠、哺乳期以及幼年動物往往可以致病。因此，盡管減毒疫苗的研究工作仍在繼續(xù)，但很少在實際中應用。滅活疫苗是目前在大多數(shù)國家和地區(qū)廣泛應用的疫苗，但也存在著安全問題，主要是滅活不徹底或在加工過程中防護不當使病毒從加工廠逃逸出去從而引起FMD的爆發(fā)和流行。隨著基因工程技術的發(fā)展，安全高效的基因工程疫苗的成功開發(fā)使安全性很差的傳統(tǒng)疫苗(如減毒疫苗、滅活疫苗等)逐步被取代。
由于FMDV各型之間彼此幾乎沒有交叉免疫力，預防不同血清型口蹄疫病毒的感染，應該用不同的型特異疫苗，才能取得理想的保護效果。
本發(fā)明提出的抗亞洲一型口蹄疫病毒的多肽疫苗，由Asial型口蹄疫病毒B，T細胞表位氨基酸的DNA序列串聯(lián)單獨編碼表位蛋白，或與載體大分子相連編碼表位融合蛋白制備獲得。其中B細胞表位包括Asial型口蹄疫病毒結構蛋白VP1 80～101、133～160和200～213位氨基酸。當然，這些B細胞表位也可以同時包含T細胞表位。T細胞表位包括Asial型VP4 20～34位氨基酸或VP1 20～34和35～48位氨基酸。
本發(fā)明中，為了選擇最佳肽段，保持高的抗病毒免疫原性，上述B，T細胞表位氨基酸可改動及前后移動1～5個氨基酸。上述串聯(lián)結構的肽段與肽段之間引入有若干氨基酸作為接頭。
本發(fā)明中，所述多肽疫苗的B，T細胞表位DNA序列串聯(lián)方式為B細胞表位---T細胞表位---B細胞表位，或T細胞表位---B細胞表位---B細胞表位，或B細胞表位---B細胞表位---T細胞表位。B，T細胞表位DNA序列可單獨編碼免疫原性蛋白制備疫苗，或與載體蛋白相連編碼融合蛋白制備疫苗。載體蛋白可以是β-半乳糖苷酶，家畜自體IgG重鏈恒定區(qū)中的某區(qū)段，或乙肝病毒核心抗原等。
制備該多肽疫苗，采用化學方法合成編碼Asial型VP1和VP4上B細胞表位和T細胞表位的肽段基因，將其串聯(lián)，串聯(lián)片段單獨或與載體大分子C端相連再插入質粒載體，再轉入細菌表達，經過發(fā)酵制備得所需的抗口蹄疫病毒疫苗。具體步驟是將重組質粒轉入大腸桿菌菌株，將菌株置于細菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度在30℃到37℃之間，培養(yǎng)時間8到25小時，然后收集菌體；若所用質粒為原核表達質粒，則收集菌體破碎，離心收集含有融合或非融合蛋白的包涵體，將包涵體配成油乳劑，即可獲得抗口蹄疫病毒多肽疫苗。
本發(fā)明制備的疫苗安全性好，具有較強的免疫原性，對豚鼠保護力強。
串聯(lián)基因結構特征為串聯(lián)抗原基因的兩端各有一個拷貝的編碼B細胞表位的VP1133～158位氨基酸的DNA序列，中間是一個拷貝的編碼T細胞表位的VP4 20～34位氨基酸的DNA序列；連接這些序列的兩個接頭分別是“Pro-Gly”(接頭1)2個氨基酸和“Gln-Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val-Pro-Ser-Arg”(接頭2)11個氨基酸。
本實施例串聯(lián)基因的DNA序列為SEQ.ID.No.1；SEQ.ID.No.1對應的氨基酸序列為SEQ.ID.No.2。
采用原核偏愛密碼子，分10個片段合成串聯(lián)基因。串聯(lián)基因與EcoRI及BamHI酶切消化的質粒載體pWR590在T4 ligase等作用下發(fā)生連接反應，獲得的重組DNA，轉化大腸桿菌C600感受態(tài)細胞，培養(yǎng)于氨芐青霉素平板中，37℃倒置過夜。隨意挑取轉化子，分別以酶切，DNA測序分析鑒定轉化子，序列分析證明插入的串聯(lián)基因序列與設計相符，即獲得陽性克隆，將此克隆命名為pAS1。
將pAS1以含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液為發(fā)酵液，37℃攪拌速度6000rpm通氣培養(yǎng)8小時后收集菌體。再將菌體懸浮于破壁液中，用95W功率的超聲儀破壁5～8分鐘。超聲后10000rpm離心20分鐘收集包涵體。并配成油乳劑，即可獲得一種新型的抗Asial型口蹄疫病毒多肽疫苗。
用該疫苗免疫豚鼠，可誘導豚鼠產生高滴度的中和抗體，中和價PD50達1∶331，中和抗體的結果見表1。經該疫苗免疫的豚鼠可抵抗Asial型強毒攻擊，保護率達86％，抗病毒能力檢測結果見表2。
表1中和抗體測定的結果

表1中和抗體效價以半數(shù)保護量PD50表示，按Karber方法計算。Karber法公式為lgPD50＝L+d(S-0.5).L為血清最低稀釋度的對數(shù)，d為稀釋系數(shù)，S為保護比值的和。
表2 對豚鼠的免疫保護效果疫苗 疫苗免疫劑量 病毒攻擊劑量實驗豚鼠數(shù) 被保護豚鼠數(shù) 保護率pAS1 400μg 100ID50/0.2ml 7686％pWR590 400μg 100ID50/0.2ml 500多肽苗的DNA序列SEQ.ID.No.15’-AATT℃ATGAAAACCACCTACGGTGAAGAATCCACCCGTCGTGGTGACTTCGCTGCTCTGGCTCAGCGTCTGTCCCGTCGTCTGCCGCCGGGTTCCATCATCAACAACTACTACATGCAGCAGTACCAGAACTCCATGCAGTTCGAACTGGAGTTCATGGTTCCGTCCCGTAAAACCACCTACGGTGAAGAATCCACCCGTCGTGGTGACTTCGCTGCTCTGGCTCAGCGTCTGTCCCGTCGTCTGCCGTGAGCTGCAGCCG-3’對應的氨基酸序列SEQ.ID.No.2.N端-FMKTTYGEESTRRGDFAALAQRLSRRLPPGSIINNYYMQQYQNSMQFELEFMVPSRKTTYGEESTRRGDFAALAQRLSRRLP*AAA-C端
權利要求
1.一種抗亞洲一型口蹄疫病毒的多肽疫苗，其特征在于由Asial型口蹄疫病毒VP1和VP4上B，T細胞表位氨基酸的DNA序列串聯(lián)單獨編碼表位蛋白，或與載體大分子相連編碼表位融合蛋白而獲得，其中B細胞表位采用Asial型口蹄疫病毒結構蛋白VP1 80～101、133～160和200～213位氨基酸，T細胞表位包括Asial型VP4 20～34位氨基酸或VP1 20～34和35～48位氨基酸。
2.根據權利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于B，T細胞表位DNA序列串聯(lián)方式為B細胞表位---T細胞表位---B細胞表位，或T細胞表位---B細胞表位---B細胞表位，或B細胞表位---B細胞表位---T細胞表位。
3.根據權利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于B，T細胞表位DNA序列可單獨編碼免疫原性蛋白制備疫苗，或與載體蛋白相連編碼融合蛋白制備疫苗。
4.根據權利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于B，T細胞表位氨基酸可改動或前后移動1～5個氨基酸。
5.根據權利要求2所述的多肽疫苗，其特征在于該疫苗的的DNA序列為SEQ.ID.No.1，對應的氨基酸序列為SEQ.ID.No.2。
6.根據權利要求3所述的多肽疫苗，其特征在于所說的載體蛋白是β-半乳糖苷酶，家畜自體IgG重鏈恒定區(qū)中的某區(qū)段，或乙肝病毒核心抗原。
7.一種如權利要要求1-6所述的抗亞洲一型口蹄疫病毒的多肽疫苗的制備方法，其特征在于用化學方法合成編碼Asial型VP1和VP4上B細胞表位和T細胞表位的肽段基因，將其串聯(lián)，串聯(lián)基因單獨或與載體大分子C端相連再插入質粒載體，轉入細菌表達，經過發(fā)酵制備得抗口蹄疫病毒疫苗。
全文摘要
本發(fā)明是一種抗亞洲一型(Asial型)口蹄疫病毒的多肽疫苗及其制備方法。該疫苗由Asial型口蹄疫病毒VP1和VP4上B，T細胞表位氨基酸的DNA序列串聯(lián)單獨編碼表位蛋白，或與載體大分子相連編碼表位融合蛋白制備獲得。用化學方法合成編碼Asial型VP1和VP4上B細胞表位和T細胞表位的肽段基因，將其串聯(lián)，串聯(lián)基因單獨或與載體大分子相連再插入質粒載體，轉入細菌表達，經過發(fā)酵制備得抗口蹄疫病毒疫苗。該疫苗安全性好，具有較強的免疫原性，對豚鼠保護力強。
文檔編號A61P31/00GK1470285SQ03129229
公開日2004年1月28日 申請日期2003年6月13日 優(yōu)先權日2003年6月13日
發(fā)明者鄭兆鑫, 嚴維耀, 張青, 張震宇 申請人:復旦大學