專利名稱：抗腫瘤的多藥耐藥rna干擾藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗腫瘤的藥物，尤其是抗腫瘤的多藥耐藥RNA干擾藥物。
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是新近發(fā)展起來(lái)的一種封閉基因表達(dá)的有效方法。它采用與目的基因同源的21-23核苷酸長(zhǎng)的干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)切酶形成誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)，RISC以siRNA為模板特異地識(shí)別其同源基因mRNA并對(duì)其進(jìn)行遞進(jìn)式剪切，形成強(qiáng)有效的瀑布效應(yīng)，誘導(dǎo)序列特異性的mRNA降解，細(xì)胞表現(xiàn)特定基因的缺陷表型。該策略可以將癌癥基因關(guān)閉，而僅有一個(gè)堿基突變則喪失RNA干擾作用，對(duì)正常細(xì)胞影響甚微，特異性強(qiáng)。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種抗腫瘤的多藥耐藥RNA干擾藥物，針對(duì)多藥耐藥基因mdr-1及其表達(dá)蛋白進(jìn)行靶點(diǎn)治療，具有靶向性抗腫瘤細(xì)胞多藥耐藥mdr-1基因和P-糖蛋白表達(dá)及功能，干擾RNA序列是針對(duì)mdr-1基因mRNA不同位點(diǎn)選取的3段21個(gè)堿基的siRNA序列，稱之為si-mdr1、si-mdr2和si-mdr3，所述RNA干擾藥物為si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3三條核苷酸序列中的任意一種、兩種或三種的組合，si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3三條核苷酸序列為si-mdr1CUGUACUGGUCCAUACGGAUUUUGACAUGACCAGGUAUGCCUsi-mdr2CGCCGAGGCUAUGUACCAAUUUUGCGGCUCCGAUACAUGGUUsi-mdr3CCUCCGGUUGUAUGUACGGUUUUGGAGGCCAACAUACAUGCC所述的si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3的靶位點(diǎn)為si-mdr1的靶位點(diǎn)5’-AAGACAUGACCAGGUAUGCCU-3’----(865-885)si-mdr2的靶位點(diǎn)5’-AAGCGGCTCCGATACATGGTT-3’----(2472-2492)si-mdr3的靶位點(diǎn)5’-AAGGAGGCCAACATACATGCC-3’----(3564-3584)給藥途徑可采用直接裸DNA注射法、脂質(zhì)體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法中的一種。
本發(fā)明研制的siRNA能有效抑制多藥耐藥基因MDR-1的表達(dá)，為RNAi技術(shù)應(yīng)用于白血病的治療提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)和有效新藥。
圖2是本發(fā)明siRNA處理對(duì)P-gp表達(dá)的影響的結(jié)果。
圖中，1si-neg組；2si-mdr1組；3si-mdr2組；4si-mdr3組；5PCR陰性對(duì)照。
本發(fā)明所涉及的siRNA序列是針對(duì)mdr-1基因mRNA不同位點(diǎn)選取的3段21個(gè)堿基的siRNA序列，稱之為si-mdr1、si-mdr2和si-mdr3。另設(shè)隨機(jī)序列作為陰性對(duì)照(si-neg)。siRNA序列如下si-mdr1的靶位點(diǎn)5’-AAGACAUGACCAGGUAUGCCU-3’----(865-885)s-mdr1CUGUACUGGUCCAUACGGAUUUUGACAUGACCAGGUAUGCCUsi-mdr2的靶位點(diǎn)5’-AAGCGGCTCCGATACATGGTT-3’----(2472-2492)si-mdr2 CGCCGAGGCUAUGUACCAAUUUUGCGGCUCCGAUACAUGGUUsi-mdr3的靶位點(diǎn)5’-AAGGAGGCCAACATACATGCC-3’----(3564-3584)si-mdr3 CCUCCGGUUGUAUGUACGGUUUUGGAGGCCAACAUACAUGCCsi-neg 5’-AATAGGATACGTGACGCTATG-3’UCCUAUGCACUGCGAUACUUUUAGGAUACGUGACGCUAUG本發(fā)明所用的K562/A02細(xì)胞系是耐阿霉素(ADM)紅白血病的細(xì)胞系。細(xì)胞接種于含10％的小牛血清的RPMI1640(Gibco BRL公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前無(wú)藥培養(yǎng)兩周。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，分別將si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3、si-neg以200nmol的終濃度加入K562/A02細(xì)胞培養(yǎng)液，于孵育后24～48h收獲細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明從mRNA和蛋白質(zhì)水平二個(gè)層次來(lái)檢測(cè)si-mdr1、si-mdr2和si-mdr3抑制多藥耐藥基因表達(dá)以及提高耐藥白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性的作用。mRNA的檢測(cè)采用RT-PCR和PCR產(chǎn)物定量分析。技術(shù)路線1)RT-PCR按TRIzol總RNA抽提試劑盒提取總RNA。電泳鑒定RNA的質(zhì)量，紫外光分光光度計(jì)定量。取總RNA 2.5μg，加入50μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，用SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自Invitrogen公司)，按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)體系按常規(guī)(試劑購(gòu)自Invitrogen公司)。循環(huán)條件94℃變性45秒，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，最后延伸10分鐘。
另以β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物為內(nèi)參對(duì)照。擴(kuò)增引物序列及擴(kuò)增片段如下mdr-1上游引物5‘-TTACACGTGGTTGGAAGC-3’下游引物5‘-CATAGATCAGCAGGAAAG-3’，擴(kuò)增片段300bp。β-actin 上游引物5-’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTC-3’，擴(kuò)增片段548bp。
PCR產(chǎn)物定量取10μl的擴(kuò)增產(chǎn)物在15g/L的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行電泳，以PCR mark(華美公司)作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，電壓100V，20分鐘。溴化乙錠染色，紫外反射儀上顯像、照相。用掃描分析進(jìn)行目的基因的半定量(以mdr-1/β-actin cDNA的比值反映mdr-1 mRNA的表達(dá)水平)。
多藥耐藥基因mdr-1表達(dá)水平的檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)P-gp的表達(dá)。收集48h的各組K562/A02細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入P-gp單抗10μl(Neomarkers公司產(chǎn)品)，4℃，30分鐘；PBS洗滌，加FITC標(biāo)記的二抗，4℃，30分鐘。PBS洗滌，上機(jī)檢測(cè)。
本發(fā)明采用MTT檢測(cè)阿霉素對(duì)藥物處理白血病細(xì)胞和對(duì)照K562細(xì)胞的半數(shù)抑制劑量IC50，用相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率＝(IC50A-IC50B)/(IC50A-IC50C)。IC50A是K562/A02的IC50，IC50B是siRNA作用后的IC50，IC50C是K562的IC50；抵抗因子RF＝K562/A02的IC50/K562的IC50。
本發(fā)明還用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素積累的測(cè)定，將經(jīng)RNAi處理的細(xì)胞調(diào)成1×106/ml與1g/ml的柔紅霉素共同孵育于37℃，1小時(shí)后取出，冰浴以終止柔紅霉素的作用。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素激發(fā)的熒光強(qiáng)度，來(lái)反映DNR在細(xì)胞內(nèi)的濃度，激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)550nm。用未經(jīng)處理的K562/A02細(xì)胞為空白對(duì)照。
針對(duì)mdr-1基因及其蛋白進(jìn)行靶點(diǎn)治療是國(guó)內(nèi)外白血病多藥耐藥逆轉(zhuǎn)研究的熱點(diǎn)，現(xiàn)在常用的逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米、環(huán)胞菌素A等在有效逆轉(zhuǎn)耐藥時(shí)的濃度對(duì)人體產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用。由于本發(fā)明使用的RNAi有高度的序列專一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此無(wú)論是在功能基因組研究，還是腫瘤的基因治療方面均具有廣闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明根據(jù)Elbashir等的siRNA user guide設(shè)計(jì)原則，針對(duì)mdr-1基因不同靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)了3條干擾siRNA序列，用以逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥細(xì)胞株的MDR。K562/A02是具有典型多藥耐藥特征的慢性粒細(xì)胞白血病急變細(xì)胞系，高表達(dá)mdr-1基因。IC50、細(xì)胞內(nèi)藥物濃度、p170表達(dá)及mRNA相對(duì)量檢測(cè)證實(shí)3條序列能不同程度的封閉mdr-1基因，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥表型。這些發(fā)明證實(shí)siRNA可望成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的有效手段。發(fā)明的siRNA可以單獨(dú)使用或幾條siRNA聯(lián)合，還可以與其它逆轉(zhuǎn)劑如反義核酸聯(lián)合制成藥物組合物，用于白血病和其它腫瘤的治療。
上述基因序列的給藥途徑，可使用的方法有以下幾種1、直接裸DNA注射法(1)新噴氣注射系統(tǒng)釋放裸DNA治療序列，可以采用一種新的噴氣注射系統(tǒng)，將裸DNA釋放到體內(nèi)的肺腫瘤中。沃爾瑟(W.Walther)博士和同事開(kāi)發(fā)了一種便攜的“高速噴氣注射器”系統(tǒng)，在病毒媒介和脂質(zhì)體基因釋放系統(tǒng)之外提供了又一選擇。研究者使用這種系統(tǒng)注射3段裸DNA到小鼠的Lewis肺腫瘤中，第一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)β-半乳糖激酶基因(LacZ)，第二個(gè)表達(dá)綠熒光(GFP)基因，第三個(gè)表達(dá)人類(lèi)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。每個(gè)小鼠都接受5次注射，壓力為3Pa，釋放3～5微升質(zhì)粒DNA。
沃爾瑟博士等在《基因治療》(Gene Therapy)報(bào)告說(shuō)，注射后腫瘤上的基因呈廣泛表達(dá)。LacZ和GFP基因表達(dá)在注射后48小時(shí)變得明顯，在72～96小時(shí)達(dá)到峰值；LacZ表達(dá)和TNF-α分泌在24～120小時(shí)出現(xiàn)。他們認(rèn)為，“這些發(fā)現(xiàn)證明了噴氣注射的適用性，即在體內(nèi)傳送基因到腫瘤時(shí)使用最小劑量的裸DNA進(jìn)行癌癥基因治療?！?2)裸DNA直接注射將裸質(zhì)粒DNA直接注射到機(jī)體的肌肉、皮內(nèi)、皮下、粘膜、靜脈內(nèi)。這種方法簡(jiǎn)單易行。
2、脂質(zhì)體包裹DNA直接注射法包裹DNA的脂質(zhì)體能與組織細(xì)胞發(fā)生膜融合，而將DNA攝入，減少了核酸酶對(duì)DNA的破壞。注射途徑同裸DNA直接注射。
3、金包被DNA基因槍轟擊法將質(zhì)粒DNA包被在金微粒子表面，用基因槍使包被DNA的金微粒子高速穿入組織細(xì)胞。
4、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法選擇一種容易進(jìn)入某組織器官的細(xì)菌，將其繁殖基因去掉，然后用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌，當(dāng)這些細(xì)菌進(jìn)入某組織器官后，由于不能繁殖，則自身裂解而釋放出質(zhì)粒DNA。即可口服的減毒沙門(mén)氏菌。實(shí)施例1.RNAi對(duì)耐藥基因mdr-1 mRNA表達(dá)的情況K562/A02細(xì)胞經(jīng)siRNA處理24h后檢測(cè)，與陰性對(duì)照相比，si-mdr1組mRNA表達(dá)下調(diào)(17.23±2.47)％(p＞0.05)，si-mdr2和si-mdr3處理24小時(shí)后檢測(cè)mdr-1的mRNA表達(dá)明顯減少，分別為(38±1.23)％和(58±1.54)％(p＜0.05)，見(jiàn)

圖1。
RNAi處理后K562/A02細(xì)胞藥物敏感性變化IC50指細(xì)胞抑制率為50％時(shí)化療藥物的濃度，由表1可知si-mdr2和si-mdr3作用后，K562/A02對(duì)化療藥物ADM的敏感性增加，提示RNAi可以恢復(fù)K562/A02對(duì)化療藥物的敏感性。實(shí)施例3.siRNA對(duì)K562/A02細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用表1為siRNA對(duì)K562/A02細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用的結(jié)果比較。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)平行孔，取均值。si-mdr1，si-mdr2和si-mdr3均有多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用，si-mdr3的作用最為顯著。
表1IC50(μg/ml) 相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率(％)K562 0.05 /K562/A02 4.47 /si-neg 4.28 4.29si-mdr1 3.67 18.10si-mdr2 2.53* 43.89si-mdr3 1.36** 70.36注與K562/A02細(xì)胞組相比較，p值*＜0.05，**＜0.01。實(shí)施例4.RNAi處理后細(xì)胞內(nèi)DNR積累的變化用si-mdr處理K562/A02和K562細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)K562/A02細(xì)胞內(nèi)DNR較處理前其熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性率均有增加的趨勢(shì)，且有顯著性差異。但與親代細(xì)胞K562相比，熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性率仍較低，見(jiàn)表2。
表2si-RNA處理后細(xì)胞內(nèi)ADM積累變化平均熒光強(qiáng)度陽(yáng)性率(％)K562 86.35 97.18Si-neg 37.66 27.76si-mdr141.05 34.57si-mdr257.88* 61.40si-mdr364.48**78.07**注1.與K562/A02細(xì)胞組相比較，p值*＜0.05，**＜0.01；2.每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。
權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤的多藥耐藥RNA干擾藥物，針對(duì)多藥耐藥基因mdr-1及其表達(dá)蛋白進(jìn)行靶點(diǎn)治療，具有靶向性抗腫瘤細(xì)胞多藥耐藥mdr-1基因和P-糖蛋白表達(dá)及功能，其特征是干擾RNA序列是針對(duì)mdr-1基因mRNA不同位點(diǎn)選取的3段21個(gè)堿基的siRNA序列，稱之為si-mdr1、si-mdr2和si-mdr3，所述RNA干擾藥物為si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3三條核苷酸序列中的任意一種、兩種或三種的組合，si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3三條核苷酸序列為si-mdr1 CUGUACUGGUCCAUACGGAUUUUGACAUGACCAGGUAUGCCUsi-mdr2 CGCCGAGGCUAUGUACCAAUUUUGCGGCUCCGAUACAUGGUUsi-mdr3 CCUCCGGUUGUAUGUACGGUUUUGGAGGCCAACAUACAUGCC
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的多藥耐藥RNA干擾藥物，其特征是所述的si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3的靶位點(diǎn)為si-mdr1的靶位點(diǎn)5’-AAGACAUGACCAGGUAUGCCU-3’----(865-885)si-mdr2的靶位點(diǎn)5’-AAGCGGCTCCGATACATGGTT-3’----(2472-2492)si-mdr3的靶位點(diǎn)5’-AAGGAGGCCAACATACATGCC-3’----(3564-3584)
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的多藥耐藥RNA干擾藥物，其特征是給藥途徑可采用直接裸DNA注射法、脂質(zhì)體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗腫瘤的多藥耐藥RNA干擾藥物，提供了一組針對(duì)耐藥基因mdr－1和P－糖蛋白(P－gp)表達(dá)及功能的抗白血病和其它腫瘤的治療藥物的干擾RNA的核苷酸序列，具有靶向性抗腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(mdr－1)基因和P－糖蛋白(P－gp)表達(dá)及功能，提高白血病細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療藥的敏感性，增強(qiáng)化療藥物殺滅造血系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的作用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1476899SQ0313037
公開(kāi)日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2003年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月8日
發(fā)明者韓忠朝, 彭智 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所