專利名稱：滅活支氣管博德特氏菌培養(yǎng)物的方法，由此制得的細(xì)菌組合物及含有它的疫苗及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及滅活支氣管炎博德特氏菌培養(yǎng)物的方法，以及該方法制得的支氣管炎博德特氏菌組合物，含有它的疫苗，該疫苗在例如制藥中的用途等。
背景技術(shù)：
對(duì)感染性生物產(chǎn)生免疫是疾病控制中的有力工具。誘導(dǎo)對(duì)感染免疫的那些抗原被稱為免疫原。它們誘導(dǎo)的保護(hù)性抗體可與其它天然防御系統(tǒng)合作抑制感染過程，或它們可以中和感染生物的有害產(chǎn)物，如毒素。
增強(qiáng)抗體反應(yīng)的有效方法是使用佐劑。因此，佐劑被包括在疫苗中作為添加劑或賦形劑以增強(qiáng)對(duì)抗原的反應(yīng)。佐劑可以以不同的機(jī)理起作用，包括(1)捕獲體內(nèi)抗原以導(dǎo)致緩慢釋放，(2)吸引免疫系統(tǒng)的細(xì)胞至注射部位，(3)刺激免疫系統(tǒng)的細(xì)胞增殖和活化，和(4)促進(jìn)受者身體中抗原的分散。
許多具有不同化學(xué)特性的試劑已被用作佐劑，包括油包水和水包油乳液、無機(jī)鹽、多核苷酸和天然物質(zhì)。以商標(biāo)AMPHIGENTM為人所知的佐劑描述在美國專利號(hào)5,084,269中。AMPHIGENTM佐劑由溶解在油(通常是輕液體石蠟)中的去油卵磷脂組成。在疫苗制劑中，AMPHIGENTM分散在水溶液中或作為水包油乳液的免疫抗原的懸浮液中。
當(dāng)使用根據(jù)上面美國專利號(hào)5,084,269的AMPHIGENTM佐劑時(shí)觀察到一些問題。例如，AMPHIGENTM中的卵磷脂不足以產(chǎn)生穩(wěn)定的油乳液，因此導(dǎo)致在注射組織中油的聚集和儲(chǔ)存。礦物油不能被動(dòng)物代謝或除去。結(jié)果，油成為嚴(yán)重的慢性炎癥和瘢痕的來源。將AMPHIGENTM直接乳化在抗原制劑中有損壞抗原的危險(xiǎn)。而且，如果所需的乳液沒有形成，則有價(jià)值的抗原必須被棄去。
因此，可用于動(dòng)物，包括人的疫苗的有效的且能解決上述問題的佐劑是極其需要的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及可用于增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)抗原的免疫反應(yīng)的佐劑。尤其是，本發(fā)明涉及能在疫苗組合物中形成水包油乳液的佐劑。本發(fā)明還涉及當(dāng)用于疫苗制劑中時(shí)，在接種部位導(dǎo)致最小的炎癥和瘢痕的佐劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有本發(fā)明佐劑的疫苗制劑。最后，本發(fā)明涉及在接種中使用本發(fā)明佐劑的方法。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的佐劑含有卵磷脂、油和能乳化佐劑的兩親性表面活性劑，例如Tween或Span表面活性劑。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，表面活性劑為Tween80、Span80或Span85。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的佐劑包含卵磷脂、油和兩種能乳化佐劑或乳化包含佐劑的疫苗組合物的兩種兩親性表面活性劑。在一個(gè)優(yōu)選的方面，兩種表面活性劑中的一種主要在水相中，例如Tween80，另一種表面活性劑主要在油相中，例如Span80。
卵磷脂為一種磷脂。卵磷脂的粗的制品可包含甘油三酯。為了本發(fā)明的目的，“卵磷脂”包括純化和粗制品。在一個(gè)優(yōu)選的方面，卵磷脂為去油的。
適宜的油包括礦物油，例如DRAKEOLNTM輕礦物油。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的佐劑包含水性載體溶液，例如生理可接受的緩沖液、水或鹽水溶液。
在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的佐劑包含卵磷脂、礦物油、兩種兩親性表面活性劑和一種水性載體溶液(例如鹽水)。
在本發(fā)明另一個(gè)具體實(shí)施方案中，描述了使用福爾馬林和戊二醛滅活支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)培養(yǎng)物的方法。在另一個(gè)方面，提供使用福爾馬林和戊二醛滅活的支氣管炎博德特氏菌培養(yǎng)物。在另一個(gè)方面，提供來自使用福爾馬林和戊二醛滅活的支氣管炎博德特氏菌培養(yǎng)物的抗原組合物。另一個(gè)方面，提供包含來自使用福爾馬林和戊二醛滅活的支氣管炎博德特氏菌培養(yǎng)物的抗原組合物的疫苗組合物。
附圖的簡要說明

圖1顯示描繪如下所述制備的乳液的液滴大小分布圖。線(a)和(b)顯示約94％的液滴具有1微米或更小的直徑。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及可用于增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫反應(yīng)的佐劑。尤其是，本發(fā)明涉及能乳化疫苗制劑的油性佐劑。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及當(dāng)用于疫苗制劑中時(shí)能基本上避免含礦物油疫苗典型的注射部位炎癥或瘢痕的佐劑。本發(fā)明的佐劑含有卵磷脂、油和能夠乳化佐劑或含佐劑疫苗組合物的兩親性表面活性劑。
本發(fā)明部分基于如下發(fā)現(xiàn)，即在包含如美國專利號(hào)5,084,269中描述的佐劑的疫苗中加入約1.5％v/v(即通過例如將98.5體積的包含佐劑的疫苗與1.5體積的兩親性表面活性劑混合獲得的1.5％體積/體積濃度)至3.5％v/v的兩親性表面活性劑能有效地充分乳化用該佐劑配制的疫苗并且使接種動(dòng)物的注射部位的刺激最小化。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的佐劑包含卵磷脂和油以及兩親性表面活性劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的佐劑包含卵磷脂和油以及能乳化用本發(fā)明佐劑配制的疫苗組合物的兩親性表面活性劑。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，兩種兩親性表面活性劑被用于本發(fā)明的佐劑中，例如Tween和Span表面活性劑。
優(yōu)選的佐劑，這里稱為“1號(hào)佐劑”，包含約2％v/v卵磷脂、約18％v/v礦物油和約8％v/v表面活性劑(例如約5.6％v/v Tween和約2.4％v/vSpan80)，剩余的體積為鹽水。在一個(gè)優(yōu)選的方面，疫苗組合物被配制成包含濃度為疫苗組合物的約75％的抗原和濃度為疫苗組合物的25％v/v的佐劑，優(yōu)選1號(hào)佐劑。除非另有說明，本文以百分?jǐn)?shù)提供的所有濃度以體積/體積表示。
可用于本發(fā)明佐劑中的表面活性劑可用于本發(fā)明佐劑中的表面活性劑為兩親性的并可為獸醫(yī)或醫(yī)學(xué)應(yīng)用所接受。具體的表面活性劑是否為醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)應(yīng)用所接受可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來確定。如果表面活性劑分子的一部分為疏水性，另一部分為親水性的，則表面活性劑為兩親性的。參見美國專利號(hào)5,690,942；5,376,369；4,933,179和4,606,918，它們描述了可用于本發(fā)明佐劑中的表面活性劑?？捎糜诒景l(fā)明佐劑中的表面活性劑的實(shí)例包括，但不局限于，Tween表面活性劑和Span表面活性劑。Tween和Span表面活性劑包括，但不局限于，單月桂酸酯(Tween20，Tween21，Span20)、單棕櫚酸酯(Tween40、Span40)、單硬脂酸酯(Tween60、Tween61、Span60)、三硬脂酸酯(Tween65、Span65)、單油酸酯(Tween80、Tween81、Span80)和三油酸酯(Tween85、Span85)。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，使用Tween80、Tween85、Span80或Span85。
優(yōu)選可用于本發(fā)明佐劑中的表面活性劑為兩親性并具有優(yōu)選為至少佐劑的所有其它成分的HLB值之和一半的親水親酯平衡(“HLB”)值。更優(yōu)選，表面活性劑具有從約佐劑所有其它成分的HLB值之和一半至兩倍的HLB值。更優(yōu)選地，表面活性劑具有約與佐劑的所有其它成分的HLB值相等的HLB值?？扇菀椎孬@得表面活性劑、卵磷脂、油和載體溶液的HLB值，或如果需要，可通過常規(guī)的實(shí)驗(yàn)確定。例如，參見美國專利號(hào)4,504,275和4,261,925和本文提供的參考文獻(xiàn)。
可用于本發(fā)明佐劑中的兩親性表面活性劑具有從約2至約20，優(yōu)選從約3至17的HLB值。本領(lǐng)域已知確定具體表面活性劑的HLB值的方法。參見美國專利號(hào)5,603,951；4,933,179和4,606,918，它們描述了具有特定HLB值的表面活性劑。
用本發(fā)明佐劑配制的疫苗組合物中的表面活性劑的濃度為約1.5％-3.5％v/v，更優(yōu)選約1.5％-約3％v/v，更優(yōu)選約1.5％-約2.5％，最優(yōu)選約2％v/v。當(dāng)使用一種以上表面活性劑時(shí)，用于本發(fā)明佐劑配制的疫苗組合物中的所有表面活性劑的濃度的總和也為約1.5％-3.5％，更優(yōu)選約1.5％-約3％，更優(yōu)選約1.5％-約2.5％，最優(yōu)選約2％v/v。
本發(fā)明佐劑中表面活性劑的濃度還取決于佐劑在疫苗組合物中所用的濃度。例如，可用本發(fā)明的佐劑配制疫苗組合物，以致約25％體積的疫苗組合物為佐劑(“25％佐劑”)，其余的約75％由其它成分組成，例如抗原組合物。另一方面，25％佐劑中的表面活性劑的濃度為約6％-14％v/v。更優(yōu)選，25％佐劑中的表面活性劑的濃度為約6％-約12％，更優(yōu)選約6％-約10％，最優(yōu)選約8％v/v。
本發(fā)明的佐劑中表面活性劑的濃度取決于不同的因素。例如，佐劑中油的濃度越高，乳化本發(fā)明佐劑配制的疫苗組合物需要的表面活性劑越多。可用于確定表面活性劑濃度的另一因素是卵磷脂的濃度。佐劑中卵磷脂的濃度越高，乳化需要的表面活性劑越少。
當(dāng)本發(fā)明的佐劑以小于25％v/v的濃度用于疫苗組合物中時(shí)，佐劑中的佐劑成分的濃度應(yīng)相應(yīng)增加。水性載體是一個(gè)例外，因?yàn)檩d體通常包含未被所有其它成分占據(jù)的體積；因此如果除開載體的所有成分的濃度增加，佐劑中載體的濃度將降低，反之亦然。例如，當(dāng)以在組合物中約12.5％v/v的濃度使用佐劑時(shí)，佐劑中成分的濃度為25％佐劑中的成分濃度的大約2倍。類似地，當(dāng)本發(fā)明的佐劑以高于25％v/v的濃度用于疫苗組合物中時(shí)，佐劑中成分的濃度不得不相應(yīng)地降低，例如當(dāng)佐劑以在疫苗組合物中約50％的濃度使用時(shí)，佐劑中成分的濃度為25％佐劑中成分濃度的大約一半。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，兩種兩親性表面活性劑可用于本發(fā)明的佐劑中。優(yōu)選地，兩種表面活性劑將包括一種在佐劑中的水相比油相更濃的表面活性劑(“親水性表面活性劑”)和一種在佐劑的油相更濃的表面活性劑(“親脂性表面活性劑”)。例如，Tween80在水相中更濃，Span80在油相中更濃。優(yōu)選的親水性表面活性劑具有約9-約20的HLB值，優(yōu)選的親脂性表面活性劑具有約2-約9的HLB值。參見美國專利號(hào)5,603,951；4,933,179和4,606,918，它們描述了具有在可用于本發(fā)明佐劑的兩種范圍的HLB值的表面活性劑。
當(dāng)兩種表面活性劑用于本發(fā)明佐劑中時(shí)，混合在用本發(fā)明佐劑配制的疫苗組合物中的兩種表面活性劑的濃度為約1.5％-3.5％，更優(yōu)選約1.5％-約3％，更優(yōu)選約1.5％-約2.5％，最優(yōu)選約2％v/v。用于本發(fā)明佐劑中的兩種表面活性劑每一種的濃度可互不相同。例如，當(dāng)使用親水性表面活性劑和親脂性表面活性劑時(shí)，例如Tween80和span80，Tween80的濃度可為約1.2X-約5X，更優(yōu)選約1.5X-約4X，更優(yōu)選約1.8X-約3X，更優(yōu)選約2X-約2.5X，更優(yōu)選約2.3X，Span80的濃度一樣高，這優(yōu)選是在具有如1號(hào)佐劑的卵磷脂和油濃度的佐劑中使用。
用于本發(fā)明佐劑中的親水性表面活性劑的濃度部分地取決于水相的大小，親脂性表面活性劑的濃度部分取決于油相的大小。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，由80％v/v水相和20％v/v油相組成的本發(fā)明佐劑可包含濃度高達(dá)親脂性表面活性劑濃度的4倍(即80/20)，或例如高達(dá)約2倍的親水性表面活性劑。
本發(fā)明佐劑的非表面活性劑成分除開兩親性表面活性劑，本發(fā)明佐劑包含卵磷脂和油。在另一個(gè)方面，本發(fā)明佐劑包含水性載體溶液。
本領(lǐng)域已知的任何卵磷脂可用于本發(fā)明佐劑。卵磷脂指磷脂的混合物。當(dāng)以粗提物提供時(shí)，卵磷脂還可包含甘油三酯。卵磷脂可為植物或動(dòng)物來源的。此外，卵磷脂可為合成來源的。卵磷脂的實(shí)例描述在美國專利號(hào)5,690,942；5,597,602和5,084,269中。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，與其天然來源相比，用于本發(fā)明佐劑中的卵磷脂中的甘油三酯的含量更低，即卵磷脂為去油的。本領(lǐng)域已知許多卵磷脂去油的方法，例如如美國專利號(hào)5,597,602所述。
用本發(fā)明佐劑配制的疫苗組合物中的卵磷脂的濃度為約0.25％-約12.5％v/v，更優(yōu)選約0.5％-約10％v/v，更優(yōu)選約0.5％-約7.5％，更優(yōu)選約0.5％-約2.5％，最優(yōu)選約0.5％-約1.25％v/v。
25％佐劑中的卵磷脂的濃度為至少約1％v/v，優(yōu)選至少約2％v/v。在另一個(gè)方面，25％佐劑中的卵磷脂的濃度為約1％-約50％v/v，更優(yōu)選為約2％-約40％，更優(yōu)選為約2％-約30％v/v，更優(yōu)選為約2％-約20％，更優(yōu)選為約2％-約10％，最優(yōu)選為約2％-約5％v/v。具有更高或更低濃度的本發(fā)明佐劑中的卵磷脂濃度以如上舉例所述的方式確定。
本發(fā)明佐劑包含油，例如描述在美國專利號(hào)5,814,321；5,084,269中的油。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明佐劑包含礦物油，例如DRAKEOLTM。在另一個(gè)方面，使用油的混合物?？梢砸约儍粲突虬秃推渌煞秩缏蚜字幕旌衔锏男问教峁┯停糜谥苽浔景l(fā)明佐劑。
用本發(fā)明佐劑配制的疫苗組合物中油的濃度為約1％-約23％v/v，更優(yōu)選為約1.5％-約20％，更優(yōu)選為約2.5％-約15％，更優(yōu)選為約3.5％-約10％，更優(yōu)選為約3.5％-約7.5％，更優(yōu)選為約4％-約6％，最優(yōu)選為約4.5％。
25％佐劑中油的濃度至少為5％v/v，優(yōu)選至少為約8％v/v，更優(yōu)選至少為約12％v/v。另一個(gè)方面，25％佐劑中油的濃度為約4％-約92％v/v，更優(yōu)選為約6％-80％v/v，更優(yōu)選為約10％-約60％v/v，更優(yōu)選為約14％-約40％v/v，更優(yōu)選為約14％-約30％v/v，更優(yōu)選為約16％-24％v/v，最優(yōu)選為約18％。具有更高或更低濃度的本發(fā)明佐劑中油的濃度如上舉例描述的方式確定。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，水性載體用于本發(fā)明佐劑中，例如鹽水(例如磷酸鹽緩沖鹽水)、Tris-HCl、檸檬酸磷酸緩沖液、Hepes緩沖液、本領(lǐng)域已知的其它藥物可接受的緩沖液或水。載體的pH優(yōu)選為生理可接受的，例如為6-8，最優(yōu)選7左右。用于本發(fā)明佐劑中的水性載體優(yōu)選占取任何其它成分的剩余體積。
本發(fā)明的佐劑優(yōu)選以將佐劑配制在疫苗組合物中后濃度的約2X-約10X濃度提供，更優(yōu)選為約2X-約8X，更優(yōu)選為約3X-約6X，最優(yōu)選約4X。
本發(fā)明佐劑的應(yīng)用本發(fā)明佐劑可用于增強(qiáng)對(duì)疫苗制劑中抗原的免疫反應(yīng)。本發(fā)明佐劑可與來自任何細(xì)菌或來自任何病毒的抗原一起使用，只要抗原不被破壞或變性?？乖膶?shí)例為，但不局限于，豬紅斑丹毒絲菌抗原、支氣管炎博德特氏菌抗原、多殺巴斯德氏菌產(chǎn)毒株的抗原、導(dǎo)致新生兒腹瀉的大腸桿菌菌株的抗原、大葉性肺炎放線桿菌抗原、溶血巴斯德氏菌抗原或所有上面抗原的混合物。本發(fā)明的佐劑還可用于包含美國專利號(hào)5,616,328和5,084,269中描述的抗原的疫苗組合物中。
在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明佐劑被用于包含從豬紅斑丹毒絲菌培養(yǎng)物的液相中獲得的抗原的疫苗組合物中。在一個(gè)優(yōu)選的方面，通過加入福爾馬林(約0.5％v/v最終濃度)滅活豬紅斑丹毒絲菌的培養(yǎng)物，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，例如通過離心或過濾除去細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，將培養(yǎng)物上清濃縮約10倍，將氫氧化鋁凝膠(優(yōu)選REHYDRAGELTM)以約30％v/v的最終濃度加入至濃縮的上清中以穩(wěn)定抗原。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，將硫柳汞(約0.01％v/v最終濃度)(Dimportex，西班牙，由Flavine公司進(jìn)口，Klosters，新澤西州)和EDTA(約0.07％v/v最終濃度)加入至抗原中作為保存劑。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，疫苗組合物被配制成包含抗原和本發(fā)明的佐劑(例如1號(hào)佐劑)的疫苗組合物，其中佐劑占例如疫苗組合物的約25％v/v。優(yōu)選的豬紅斑丹毒絲菌抗原描述在1999年1月29日提出的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)＿＿中，題目是“豬紅斑丹毒絲菌抗原和疫苗組合物”，其被本文引作參考。
在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的佐劑被用于包含下述抗原的疫苗組合物中其中抗原來自通過對(duì)數(shù)期(優(yōu)選對(duì)數(shù)期后期)加入福爾馬林、接著加入戊二醛滅活的支氣管炎博德特氏菌培養(yǎng)物。除殺死細(xì)菌細(xì)胞外，該新的獨(dú)特的滅活方式的目的是使支氣管炎博德特氏菌內(nèi)毒素和外毒素失去毒性，同時(shí)保留支氣管炎博德特氏菌細(xì)胞抗原有效地引發(fā)所需免疫反應(yīng)的能力。以約0.2％v/v-約1％v/v，更優(yōu)選約0.4％v/v-約0.8％v/v，最優(yōu)選約0.6％v/v的濃度將福爾馬林加入至支氣管炎博德特氏菌培養(yǎng)物中。在將福爾馬林加入至培養(yǎng)物后約10分鐘-約40分鐘，更優(yōu)選約15分鐘-約30分鐘，最優(yōu)選約20分鐘加入戊二醛。以約0.2％v/v-約1％v/v，更優(yōu)選約0.4％v/v-約0.8％v/v，最優(yōu)選約0.6％v/v的濃度將戊二醛加入至支氣管炎博德特氏菌培養(yǎng)物中。在戊二醛加入培養(yǎng)物之前，其具有約10％v/v-約50％v/v，更優(yōu)選約15％v/v-約35％v/v，最優(yōu)選約25％v/v的濃度。在將福爾馬林和戊二醛加入至支氣管炎博德特氏菌培養(yǎng)物后，在約32℃-約42℃，更優(yōu)選約35℃-約39℃，最優(yōu)選約37℃下將產(chǎn)生的混合物攪拌保溫。將混合物保溫約12小時(shí)-約60小時(shí)，更優(yōu)選約24小時(shí)-約48小時(shí)。制備來自支氣管炎博德特氏菌培養(yǎng)物的抗原組合物的所有其它反應(yīng)步驟描述在下面實(shí)施例7中和美國專利號(hào)5,019,388和4,888,169中。
包含本發(fā)明佐劑的疫苗組合物和其給藥本發(fā)明佐劑可用于疫苗制劑中以免疫動(dòng)物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，疫苗制劑包含本發(fā)明佐劑和抗原。疫苗制劑中各成分的最佳比例可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法確定。
疫苗制劑本身或以藥物或治療組合物的形式施用于人體。包含本發(fā)明佐劑和抗原的藥物組合物可通過常規(guī)的混合、溶解、成粒、包衣、研磨、乳化、裝膠囊、包載或冷凍干燥方法制備?？墒褂靡环N或多種有助于將本發(fā)明抗原制成可作為藥物使用的制劑的生理可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或輔助劑，來制備藥物組合物。適宜的制劑取決于選擇的給藥途徑。在本申請(qǐng)中，“生理可接受的載體”包括人或動(dòng)物使用可接受的而相對(duì)沒有有害副作用(相對(duì)于治療的疾病)的載體，以及同樣可接受的稀釋劑、賦形劑和輔助劑。
全身性制劑包括用于通過注射，例如皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)注射給藥的那些。
對(duì)于注射，可將疫苗制劑配制在水溶液中，優(yōu)選生理相容的緩沖液如Hanks氏溶液、Ringer氏溶液、磷酸緩沖鹽溶液或任何其它生理鹽水緩沖液。這種溶液可包含配制劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。或者，蛋白可為粉末形式以用于在使用前用適宜的賦形劑如無菌無熱源水重配。
疫苗的給藥有效量的確定在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力內(nèi)，尤其是根據(jù)本文提供的詳細(xì)公開。
最初可根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)估測(cè)有效劑量。例如，在動(dòng)物模型中，可使用本領(lǐng)域熟知的方法配制實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的制劑。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地根據(jù)本文描述的結(jié)果優(yōu)化對(duì)所有動(dòng)物種類的給藥。劑量和間隔可根據(jù)個(gè)體調(diào)節(jié)。例如，當(dāng)以疫苗的形式使用時(shí)，本發(fā)明的疫苗制劑可在1-36周期間以約1-3次給藥。優(yōu)選地，以約3周-約4個(gè)月的間隔給藥1或2次，并且此后可周期性地給予加強(qiáng)接種。適宜的劑量為當(dāng)如上所述給予時(shí)，疫苗制劑的量能在在至少4-12月中在免疫動(dòng)物中引起足以保護(hù)動(dòng)物免于感染的免疫反應(yīng)。通常，一劑中的抗原量為從約1pg到約100mg/kg宿主，通常約10pg至約1mg，優(yōu)選約100pg-約1ug。適宜的劑量根據(jù)注射的途徑和病人的大小而變化，但通常約0.1ml至約5ml。
現(xiàn)已描述了本發(fā)明，為了舉例說明，以非限制性的方式提供下面的除非另有說明，本文的所有百分濃度以v/v提供。除非另有說明，油-卵磷脂佐劑的百分?jǐn)?shù)值指卵磷脂(混合物的10％)和載體油(DRAKEOLTM)(混合物的90％)在水性載體(連續(xù)相)中的濃度。例如，20％油-卵磷脂佐劑包含2％v/v卵磷脂(Central Soya，F(xiàn)ortWayne，IIndiana)，18％v/v DRAKEOLTM5(Penreco，Karns City，賓西法尼亞州)和80％v/v鹽溶液(如果加入例如表面活性劑等其它成分，鹽溶液含量降低)。除非另有說明，疫苗組合物中的油-卵磷脂佐劑的百分?jǐn)?shù)值，即在用抗原溶液稀釋佐劑溶液后，指卵磷脂(混合物的10％)和載體油(DRAKEOLTM)(混合物的90％)在疫苗制劑中的濃度，其中疫苗制劑包括佐劑和含抗原的溶液。除非另有說明，在佐劑組合物中加入表面活性劑的所有情況下，表面活性劑濃度的百分?jǐn)?shù)值指所有加入的表面活性劑在佐劑或疫苗制劑中的總濃度。
當(dāng)油-卵磷脂佐劑被用作疫苗制劑中的佐劑時(shí)，發(fā)現(xiàn)不加入另外的表面活性劑它不乳化水性制劑，因?yàn)橛?卵磷脂佐劑中的卵磷脂不足以乳化。因此，使用分散不足的油-卵磷脂佐劑制備的疫苗在組織的注射部位形成主要為礦物油的聚集或貯液。這種油不能被注射動(dòng)物代謝和除去，以致它殘留下來作為嚴(yán)重的慢性炎癥和結(jié)痂的來源。
還得出，將表面活性劑加入至包含油-卵磷脂佐劑和抗原的疫苗制劑中以乳化制劑不是適宜方案。當(dāng)在乳化前將油和表面活性劑加入至疫苗制劑時(shí)遇到的問題是抗原可能被損壞，并且如果未獲得適宜的乳液，則制劑將不得不棄去，包括有價(jià)值的抗原。
檢測(cè)了包含油-卵磷脂佐劑并混合有表面活性劑以乳化疫苗制劑的不同的佐劑組合物。實(shí)施例2.包含低濃度的表面活性劑的佐劑的使用下面的實(shí)施例描述了包含40％油-卵磷脂和2％的合成表面活性劑即Tween80和Span80(van Water & Rogers，Omaha，Nebraska)在磷酸緩沖鹽溶液中的乳液的使用。無菌制備佐劑并與抗原分離。將乳液加入至抗原制劑中而不進(jìn)一步乳化。合成表面活性劑有助于油-卵磷脂佐劑分散為粗的相對(duì)穩(wěn)定的乳液。將佐劑乳液以1∶8的比例加入至水性抗原制劑中，將油-卵磷脂佐劑含量從40％降至5％，表面活性劑從2％降至0.25％。
佐劑被用于一些疫苗中。發(fā)現(xiàn)由于乳液粗且不太穩(wěn)定，在注射組織中油滴趨于聚集并分離為永久的刺激性油滴。使用該佐劑觀察到的另一個(gè)問題是它與Al凝膠聚集。許多疫苗包含用于許多目的的Al凝膠，例如作為佐劑或穩(wěn)定抗原或結(jié)合內(nèi)毒素。油-卵磷脂佐劑帶有負(fù)電，導(dǎo)致它與帶正電的Al凝膠形成粗聚集物。這些聚集物為不可見的，難以穿過皮下注射針頭，對(duì)注射組織極具刺激性。實(shí)施例3.包含高濃度表面活性劑的佐劑的使用如上，借助于Tween80和Span80表面活性劑，但在疫苗組合物中總的表面活性劑濃度為8％，將油-卵磷脂佐劑(5％v/v)乳化在抗原制劑中。乳液非常細(xì)且穩(wěn)定。它幾乎具有溶液的澄清度并且靜置時(shí)不分層。顯微鏡下，借助于最大的放大倍數(shù)(分辨率0.2微米)，大多數(shù)液滴小得看不見。因此，它為微滴乳液。當(dāng)用于疫苗制劑中時(shí)，該佐劑被發(fā)現(xiàn)基本上無注射部位反應(yīng)，當(dāng)加入Al凝膠時(shí)，沒有可檢測(cè)的油和凝膠的聚集。由于其高表面活性劑含量，該佐劑容易乳化，外觀吸引人，穩(wěn)定，不與Al凝膠反應(yīng)并在接種部位基本上無刺激性。然而，盡管有這些優(yōu)點(diǎn)，與使用低濃度的表面活性劑制備的粗乳液相比，該乳液具有稍低的佐劑效能。實(shí)施例4.包含中等濃度表面活性劑的佐劑的使用努力尋找了具有可接受的平滑性和充分效能的佐劑乳液。在這些實(shí)驗(yàn)中使用了20％油-卵磷脂佐劑，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)20％油-卵磷脂佐劑乳液比40％油-卵磷脂佐劑乳液容易制備。以1∶4的比例將其加入至疫苗中使得最終油濃度為5％，為抗原留下了75％的藥劑體積。初步實(shí)驗(yàn)顯示可用20％油和16％Tween80和Span80表面活性劑制備平滑的亞微細(xì)粒乳液(大多數(shù)液滴具有小于1微米的直徑，參見圖1)。
制備了兩種乳液用于檢測(cè)。一種包含20％油-卵磷脂佐劑和16％Tween80和Span80表面活性劑。以1∶4稀釋產(chǎn)生在疫苗制劑中包含5％油-卵磷脂佐劑和4％表面活性劑的乳液。用40％油-卵磷脂佐劑和2％Tween80和Span80表面活性劑制備另一種乳液。以1∶8稀釋產(chǎn)生包含5％油-卵磷脂佐劑和0.25％表面活性劑的乳液.
將Al凝膠(從Reheis，Berkeley Heights獲得的REHYDRAGELTM，新澤西)以10％濃度的加入至各種乳液樣品中。在含有0.25％表面活性劑的乳液中，油與Al凝膠聚集并分離，在液體柱的頂部形成一厚層(分層)。相反，在含有4％表面活性劑的乳液中，沒有聚集或分層。在4％表面活性劑的情況下，Al凝膠在試管的底部沉積，油滴分散在上清液中。實(shí)施例5.當(dāng)使用包含中等濃度表面活性劑的佐劑時(shí)注射部位的腫脹在豬中檢測(cè)疫苗制劑確定當(dāng)使用具有中等濃度表面活性劑的佐劑時(shí)注射部位是否腫脹。包含5％油-卵磷脂佐劑和0.25％或4％表面活性劑的疫苗制劑在豬的注射部位未導(dǎo)致腫脹。當(dāng)Al以10％的濃度加入至疫苗制劑中時(shí)，含有0.25％表面活性劑的制劑導(dǎo)致嚴(yán)重的注射部位的腫脹，而含有4％表面活性劑的幾乎不導(dǎo)致腫脹。
進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)以確定預(yù)防與Al聚集和注射部位腫脹中有效的表面活性劑濃度的范圍。當(dāng)在疫苗中使用1.5％表面活性劑濃度時(shí)，觀察油與Al凝膠的輕微聚集。在更低的表面活性劑濃度下聚集更嚴(yán)重。在為2％和4％表面活性劑濃度時(shí)，沒有聚集。在接種后2和4周時(shí)，由包含0.5％或更少表面活性劑的疫苗制劑在豬中誘導(dǎo)的腫脹比由含有1％或更多表面活性劑的制劑誘導(dǎo)的那些更大。接種后6周，證實(shí)1.5％表面活性劑是避免慢性腫脹所需的最小值。實(shí)施例6.具有有用的體外和體內(nèi)特性的佐劑為尋找不與Al凝膠反應(yīng)并在動(dòng)物接種后不導(dǎo)致反應(yīng)的佐劑，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。包含8％表面活性劑、產(chǎn)生含有5％油-卵磷脂佐劑和2％表面活性劑的疫苗制劑的20％油-卵磷脂佐劑被證實(shí)足以避免在體外與Al凝膠的反應(yīng)性和在接種部位對(duì)組織的刺激。表面活性劑濃度與佐劑功效之間的相互關(guān)系的證據(jù)不甚清楚。在個(gè)別情況下疫苗中4％的表面活性劑太多，例如對(duì)于凝集素對(duì)大腸桿菌K99的誘導(dǎo)和中和多殺巴斯德氏菌D型的毒素的抗毒素。
因此，確定在20％油-卵磷脂佐劑中表面活性劑的最佳濃度為8％，這導(dǎo)致在疫苗組合物中表面活性劑為2％。這提供了相當(dāng)容易的乳化和良好的冷儲(chǔ)存穩(wěn)定性。在含有5％油-卵磷脂佐劑的疫苗中，2％表面活性劑對(duì)佐劑的功效和注射部位免受刺激是理想的。
測(cè)定了含有8％表面活性劑的20％油-卵磷脂佐劑的亞微細(xì)粒乳液的液滴大小。8％表面活性劑由5.6％Tween80的水相和2.4％Span80的油相組成。所有液滴的約90％直徑小于1微米，參見圖1。
從200ml過濾滅菌的卵磷脂-油溶液(10％卵磷脂的DRAKEOLTM礦物油)制備1000ml含有8％表面活性劑的20％油-卵磷脂儲(chǔ)液，高壓滅菌Tween80(56ml)和Span80(24ml)和磷酸緩沖鹽溶液(720ml)(Dulbecco PBS)?；旌下蚜字?油溶液和Span80并室溫下在無菌罐中混合至少1小時(shí)直至乳化完成?；旌消}溶液和Tween80并室溫下在無菌罐中混合至少1小時(shí)。使用乳化劑將油混合物乳化在水性混合物中。通過再循環(huán)繼續(xù)乳化直至所有佐劑被加入至鹽溶液中。接著室溫下將乳液兩次通過勻漿器。將佐劑儲(chǔ)存于2-8℃下。實(shí)施例7.使用包含中等濃度表面活性劑的佐劑的萎縮性鼻炎疫苗含有中等濃度表面活性劑的如實(shí)施例4描述的佐劑被用于包含支氣管炎博德特氏菌和產(chǎn)毒多殺巴斯德氏菌抗原的萎縮性鼻炎疫苗中。多殺巴斯德氏菌-支氣管炎博德特氏菌菌苗-類毒素疫苗是從支氣管炎博德特氏菌細(xì)胞和多殺巴斯德氏菌類毒素制備的。
支氣管炎博德特氏菌細(xì)胞-菌株2-9 NADL按美國專利號(hào)5,019,388和4,888,169所描述的制備，只是在生長周期結(jié)束時(shí)，將培養(yǎng)物連續(xù)混合并加入福爾馬林溶液至0.6％的最終濃度。在加入福爾馬林后20分鐘，加入25％戊二醛至0.6％的最終濃度。37℃±2℃下，將培養(yǎng)物攪拌24-48小時(shí)以完成滅活和解毒(參見表1)。接著，將培養(yǎng)液冷卻至15℃或更低以用于處理。將不處理的滅活的培養(yǎng)物立即儲(chǔ)存于2-8℃，可達(dá)14天。滅活后，通過離心將細(xì)菌從培養(yǎng)物中分離。棄去上清并將細(xì)胞重新懸浮于大約起始體積十分之一的磷酸緩沖鹽溶液中。將濃縮的懸浮液儲(chǔ)存在2-8℃下。用兩種醛處理支氣管炎博德特氏菌滅活內(nèi)毒素和外毒素，免除出于安全性的其它處理。
如美國專利號(hào)5,536,496和5,695,769所述，以兩種不同的形式制備多殺巴斯德氏菌類毒素。一種形式是，通過將福爾馬林加入至培養(yǎng)物中在細(xì)菌細(xì)胞中將毒素類毒素化；類毒素停留在細(xì)胞內(nèi)。另一種形式是，將活細(xì)胞機(jī)械性地打碎并提取毒素。如美國專利號(hào)5,536,496所述，通過暴露于高pH下將毒素類毒素化。如美國專利號(hào)5,616,328所述，通過一種專利方法將兩種形式的類毒素都用Al凝膠處理以控制游離的內(nèi)毒素(參見表1)。兩種形式的巴斯德菌類毒素之間協(xié)同作用引致的抗毒素反應(yīng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過如美國專利號(hào)5,695,769所述單獨(dú)使用時(shí)對(duì)每種形式的反應(yīng)之和。表1多殺巴斯德氏菌-支氣管炎博德特氏菌菌苗-類毒素疫苗制備過程中對(duì)細(xì)胞的處理
加入實(shí)施例4中描述的佐劑使疫苗組合物中油-卵磷脂佐劑的濃度為5％，表面活性劑的濃度為2％。
確定萎縮性鼻炎疫苗的最小免疫劑量的試驗(yàn)證實(shí)了具有中等濃度表面活性劑的油-卵磷脂佐劑的佐劑特性。將妊娠的母豬以4周的間隔接種2ml兩次。第二次劑量后約2周它們產(chǎn)仔。1月齡時(shí)，它們的小豬經(jīng)受一次嚴(yán)重的攻擊，此攻擊為順序地經(jīng)鼻內(nèi)施用毒性支氣管炎博德特氏菌和多殺巴斯德氏菌培養(yǎng)物。僅用安慰劑接種的7只母豬所生的小豬發(fā)生了嚴(yán)重的萎縮性鼻炎。施用包含全劑量抗原的疫苗的所有7只母豬的仔豬被仍在循環(huán)中的母體抗體強(qiáng)有力地保護(hù)。施用含1/2或1/8劑量抗原的疫苗的母豬未對(duì)其幼仔提供滿意的保護(hù)。實(shí)施例8使用含中等濃度佐劑的丹毒疫苗具有中等濃度表面活性劑的實(shí)施例4所述的佐劑被用于包含豬紅斑丹毒絲菌抗原的丹毒疫苗中。用于疫苗的抗原由用0.5％福爾馬林滅活至少24小時(shí)的豬紅斑丹毒絲菌培養(yǎng)物制備。離心澄清滅活的培養(yǎng)物，通過分子過濾濃縮約10倍。通過加入Al凝膠即REHYDRAGELTM至30％濃度來穩(wěn)定濃縮物。預(yù)吸附的濃縮物以這樣的量包含在疫苗中2ml藥劑包含至少3.2混濁度單位(OU)，其中該混濁度從滅活時(shí)培養(yǎng)物的光密度(OD)計(jì)算。(OD乘以最終濃度因子得出每毫升的OU值)。
進(jìn)行豬紅斑丹毒絲菌接種以確定包含具有中等濃度表面活性劑的油-卵磷脂佐劑的疫苗功效。以25％v/v的最終濃度加入如實(shí)施例4所述的佐劑，產(chǎn)生5％的最終卵磷脂-油濃度。加入硫柳汞(0.01％w/v)和EDTA(0.07％w/v)作為保存劑。
在豬中試驗(yàn)兩次根據(jù)該方法制備的疫苗。給每只豬肌內(nèi)接種兩次2ml藥劑，其中一次在約3周時(shí)(剛斷奶)，第二次給藥在3周后。對(duì)照組以磷酸緩沖鹽溶液作為安慰劑。在一個(gè)研究中在約9周齡而在另一個(gè)研究中在6個(gè)月齡時(shí)，肌內(nèi)注射毒性豬紅斑丹毒絲菌來攻擊免疫性。如表2所示，免疫接種的保護(hù)在9周時(shí)為100％，在6個(gè)月(即宰殺年齡)時(shí)為75％。這些結(jié)果表明在正常的飼養(yǎng)期中疫苗提供滿意的抗丹毒的保護(hù)。
用于9周攻擊組的疫苗已有12個(gè)月時(shí)間。該結(jié)果證實(shí)保護(hù)性抗原被成功地穩(wěn)定化了。表2抗豬丹毒的保護(hù)
注意在9周時(shí)攻擊的接種組中，不包括第20只豬。這是一只極易怒的動(dòng)物，當(dāng)處理時(shí)它抗?fàn)幍萌绱藙×乙灾虏荒軠y(cè)定它的靜息體溫。攻擊后，這只豬仍然完全健康。
本發(fā)明不局限于用于說明本發(fā)明單一方面的作為實(shí)例的具體實(shí)施方案的范圍中，功能性等同的任何佐劑都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。的確，除開本文描述的那些外，從前面的描述和所附附圖出發(fā)，本發(fā)明的各種變化對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。這些變化也應(yīng)落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
本文引用的所有公開出版物其全文被引作參考。
權(quán)利要求
1.一種抗原組合物，其包含通過加入福爾馬林接著加入戊二醛滅活的支氣管炎博德特氏菌培養(yǎng)物。
2.一種疫苗組合物，其包含權(quán)利要求1的抗原組合物和佐劑，該佐劑包括約0.25％-約12.5％v/v的卵磷脂，約1％-約23％v/v的油和約1.5％-約3.5％v/v的至少一種兩親性表面活性劑。
3.一種滅活支氣管炎博德特氏菌培養(yǎng)物的方法，包括向所述培養(yǎng)物中加入福爾馬林，接著向所述培養(yǎng)物中加入戊二醛。
4.一種支氣管炎博德特氏菌組合物，其包含支氣管炎博德特氏菌培養(yǎng)物、福爾馬林和戊二醛。
5.一種用于保護(hù)哺乳動(dòng)物抗支氣管炎博德氏菌感染的疫苗，其包含能有效保護(hù)所述哺乳動(dòng)物抗支氣管炎博德特氏菌感染量的來自根據(jù)權(quán)利要求3的方法滅活的培養(yǎng)物的支氣管炎博德特氏菌細(xì)胞和生理可接受的載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗，其進(jìn)一步包含能有效保護(hù)哺乳動(dòng)物抗產(chǎn)毒多殺巴斯德氏菌感染量的產(chǎn)毒多殺巴斯德氏菌抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的疫苗在制備用于有效保護(hù)哺乳動(dòng)物抗支氣管炎博德特氏菌感染和產(chǎn)毒多殺巴斯德氏菌感染的藥物中的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的疫苗在制備保護(hù)小豬抗萎縮性鼻炎的疫苗中的用途，其中該疫苗能有效地在豬的初乳中提供抗支氣管炎博德特氏菌抗體和抗產(chǎn)毒多殺巴斯德氏菌抗體，該初乳在小豬出生后約24小時(shí)內(nèi)提供給小豬。
9.產(chǎn)生含抗支氣管炎博德特氏菌抗體和抗產(chǎn)毒多殺巴斯德氏菌抗體的豬初乳的方法，包括在溝紋形成之前或懷孕期間，對(duì)豬接種在雌豬產(chǎn)生的初乳中提供抗支氣管炎博德特氏菌抗體和抗產(chǎn)毒多殺巴斯德氏菌抗體的有效量的根據(jù)權(quán)利要求6的疫苗；和收集所述豬的初乳。
10.權(quán)利要求9的方法產(chǎn)生的豬初乳。
11.權(quán)利要求9的方法產(chǎn)生的豬初乳在制備用于保護(hù)小豬抗萎縮性鼻炎的藥物中的用途。
12.權(quán)利要求11的用途，其中在小豬出生約24小時(shí)內(nèi)給小豬提供該藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過加入福爾馬林、接著加入戊二醛滅活支氣管炎博德特氏菌培養(yǎng)物的方法，以及該方法制得的支氣管炎博德特氏菌組合物，含有它的疫苗，該疫苗在例如制備藥物中的用途等。
文檔編號(hào)A61K9/107GK1449825SQ0313060
公開日2003年10月22日 申請(qǐng)日期2000年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月29日
發(fā)明者D·A·迪爾威斯特, D·S·羅伯斯, L·A·斯威令金 申請(qǐng)人:輝瑞產(chǎn)品公司