專利名稱：一個脫毛相關(guān)基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個脫毛相關(guān)基因及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禿頭癥在全世界所有人群中都有很高的發(fā)病率，預防和治療禿頭癥是醫(yī)學和美容領(lǐng)域中的一大難題。但是，至今只有少數(shù)幾個脫毛相關(guān)基因通過實驗小鼠被定位和克隆，所以在實驗小鼠中，新脫毛相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)與克隆是治療禿頭癥的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過遺傳雜交、基因定位等技術(shù)，在中國特有的昆明小鼠無毛突變?nèi)?犀牛小鼠KIZ)中克隆出了一種新的無毛等位基因，根據(jù)命名法規(guī)，該基因被命名為hrrhKIZ。該基因被定位于小鼠(Mus musculus)14號染色體(見圖1)，在細胞遺傳圖譜上的位置是14D1(見圖2)，在連鎖圖譜上的位置是39.5cM(見圖3)，全長約20.281Kb DNA序列，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)有4017bp，含有19個外顯子，從成熟mRNA的第378位(2號外顯子)開始翻譯，共編碼1182個氨基酸殘基(見圖4)。本發(fā)明通過家系分析實驗，確定該突變基因是導致昆明小鼠KIZ脫毛的遺傳基礎(chǔ)；對無毛基因(hrrhKIZ)的序列進行分析后發(fā)現(xiàn)，該基因第2817位堿基有一個無義突變，導致一個精氨酸密碼子(CGA)變成終止子密碼子(TGA)；對無毛基因(hrrhKIZ)所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行分析，該突變確實能夠使其功能喪失；在人類基因組中也有該基因的同源序列。所以，該突變基因可以用來研究人類丘疹性禿頭癥的致病機制，也可以作為設(shè)計治療丘疹性禿頭癥藥物的靶基因。


圖1為本發(fā)明基因在染色體上的定位(14號染色體)。
圖2為本發(fā)明基因在14號染色體中的細胞遺傳圖譜中的定位(14D1)。
圖3為本發(fā)明基因在14號染色體中的物理圖譜中的定位。
圖4為本發(fā)明基因的外顯子分布圖。
具體實施例方式1、發(fā)明人在昆明小鼠封閉群中發(fā)現(xiàn)了3只無毛突變小鼠(犀牛小鼠KIZ)，該突變小鼠在出生3周齡后開始脫毛，直至全裸(胡須除外)；趾甲長而彎曲；隨著年齡的增加，其皮膚產(chǎn)生嚴重的褶皺。皮膚切片觀察發(fā)現(xiàn)它的毛囊嚴重退化，形成一個橢圓囊。另外真皮及皮下組織有許多大小不等的真皮包囊，且為多層分布。通過遺傳雜交實驗，確認了該小鼠的無毛突變是由常染色體上一隱性基因所控制。
2、根據(jù)文獻，該突變與國外的“犀牛小鼠”非常相似，所以選擇無毛基因(hr)為候選基因。通過對該候選基因的cDNA進行測序，得到了該基因編碼區(qū)的全序列，共4017bp，登記GeneBank，接受號為AY312855。
3、生物信息學分析用本cDNA序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST，在小鼠基因組中找到了4條同源性很高的序列，BC049182、NM_021877、Z32675、AC122268，這四條序列均為小鼠無毛基因(hr)。我們所測的序列與上述4個無毛基因最主要的差別是，在2817位堿基有一個無義突變，導致精氨酸(CGA)變成終止子(TGA)。從814位氨基酸開始，后面的肽段終止合成，產(chǎn)生一個不成熟的蛋白質(zhì)，從而該將蛋白質(zhì)喪失功能。
本序列僅在其它哺乳動物中找到了同源序列。和其同源性最高的是大鼠(Rattus norvegicus)序列，序列號為NM_024364、U71293，expect均達到0.0，堿基序列有93％的同源性；同時在人(Homo sapiens)基因組中也找到了同源序列，序列號為NM005144，堿基序列有84％的同源性。該基因比較保守，由此可以推測其具有重要而且相似的功能。那么，我們可以用實驗小鼠模型來研究人類丘疹性禿頭癥的致病機制。
4、基因表達分析根據(jù)文獻報道，該基因在皮膚和腦中有顯著表達，但是在其它組織中也有微量的表達，如胃、舌上皮、眼、軟骨、腎等。而且其表達還受到甲狀腺激素的調(diào)控。通過組織切片觀察，在犀牛小鼠KIZ中，該基因有表達的組織一般都受到了不同程度的損害，但損害最大的是毛囊和表皮。這些結(jié)果表明該基因是一個多效基因，而且主要影響皮膚中毛囊的發(fā)育，所以該基因突變是導致犀牛小鼠KIZ脫毛的原因。
5、遺傳分析為了分析昆明小鼠中正常群體和突變?nèi)后w在該突變位點的變化，根據(jù)Z32675設(shè)計PCR引物，用以擴增該基因第11外顯子并測序。結(jié)果表明正常群體中的個體在該位點都是正常純合(C/C)，沒有檢測出突變。突變?nèi)后w中，所有無毛小鼠在該位點是突變純合(T/T)，而有毛小鼠在該位點有兩種狀態(tài)，一種是正常純合(C/C)，另外一種是雜合(C/T)。上面的實驗結(jié)果表明，該基因第2817位的無義突變是導致無毛小鼠hrrKIZ脫毛的分子遺傳基礎(chǔ)。
根據(jù)上述的研究結(jié)果，hrrKIZ基因和正常小鼠的無毛基因(hr)相比在2817位堿基處存在一個無義突變，而且該突變導致了犀牛毛小鼠KIZ脫毛。因為該基因在哺乳動物中非常保守，和人的同源性也很高，所以該基因可以用來研究人類禿頭癥的致病機理，并作為治療丘疹性禿頭癥藥物的靶基因。
SEQUENCE LISTING<110>張亞平，田明，熊郁良，王婉瑜<120>一個脫毛相關(guān)等位基因(hrrhKIZ)<130><140><141>2003-6-9<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4017<212>DNA<213>小鼠無毛基因(hrrhKIZ)<220><221>gene<222>(1)..(4017)<223><400>1ggatccttct ctccctccgg ggacacccgc tccctagccc cggctcgaccctccccaaag60cgcagcacgg agtctcggcg tcccatggcg caacccacag cct tggcccagaagctggtg120cggcccatcc gcgccgtgtg ccgcatcctg caaattccgg agtccgacccctccaacctg180cggccctaga gcgcccccga cgcccggggg gaaagagagc gcgagagcgctgagcagaaa240gcgggagaac gccccgaagc cggcccatgg ggagcgagta cccagcaccggctagcacga300ccgccgccca caccgcgccc ggcctgtgaa gcccaggacc cccctccccgggagaggccc360atgagggcag gagagtgatg gagagtatgc ccagcttcct gaaggacaccccagcctggg420agaagacagc ccctgtgaac ggcattgtgg gacaggagcc tggtacctcaccacaggatg480gcttgcgcca tggggcactg tgcctaggag aacctgctcc cttttggaggggtgttctga540gcaccccaga ctcctggctc cctcctggct tcctccaagg ccccaaggacacactctcac600tggtggaggg tgagggtcct cggaacgggg agaggaaggg cagctggctaggcggcaagg660aaggactgcg ctggaaggaa gcgatgctgg cccatccact ggccttttgtgggccggcat720gcccacctcg ctatggcccc ctgatacctg agcatagtgg tggccatcccaagagtgacc780ctgtggcctt ccggcccttg cactgccctt tcctgctgga gaccaagattctagagcgag840ctcccttctg ggttcctacc tgcttgcctc cctacctgat gtccagcctgcccccagagc900gtccatatga ctggcctttg gccccaaacc catgggtata ctctgggagccagccaaaag960tgccctctgc ctttggctta ggcagcaagg gcttttacca caaggatccgaacatcctca1020ggccagcaaa ggagcccttg gcagagtctg ggatgttggg cttagcccctggtgggcatc1080tccagcaagc ctgtgaatca gaaggcccct cacttcacca gagggatggggagacaggag1140ctggcaggca gcagaatctt tgcccagttt tcttggggta cccagacactgttcctcggg1200ccccctggcc ttcttgtccc ccaggcctgg ttcacagtct tggcaacatttgggctgggc 1260caggaagtaa tagccttggg taccagctag gaccaccagc cacaccaaggtgcccatctc 1320ctgggcctcc tacccctcca gggggctgtt gctcatccca tctacctgccagagaggggg 1380atcttggccc ttgtaggaaa tgccaggata gcccagaggg aggtagcagtgggccagggg 1440aatccagtga agaaaggaac aaagctgatt ccagggcctg tcccccaagccatcacacca 1500agctgaaaaa gacctggctc acacgccact cggaacagtt tgagtgcccaggtggctgtt 1560cagggaagga agagagccca gccactgggc tccgggcact caagagggcaggtagtccag 1620aggtccaagg agcatcaagg ggcccagctc ccaaacgccc atcccaccctttcccaggca 1680ctgggaggca gggggccagg gcttggcagg agacaccgga gacaatcataggaagcaagg 1740cggaggcaga gcaacaagag gaacagagag ggccccgaga tggcaggattaggctccagg 1800agtccagact tgtggataca tcctgccagc atcacttagc aggtgtcacccagtgccaaa 1860gctgtgtcca ggcagctgga gaggtagggg tactgaccgg ccacacccagaaatcacgta 1920ggtcacccct ggaggagaag cagttggagg aggaggattc ctctgccacttccgaagaag 1980gaggaggagg gcctggccca gaagcttcac tcaacaaggg cctggccaagcacctgctga 2040gtggtttggg ggaccgactc tgccgcctgc tgcggaagga gcgggaggcccttgcctggg 2100cacagcgaga aggccagggg ccagccatga cagaggacag cccaggcat tccacattgct2160gcagtcgatg ccaccacgga ctcttcaaca cccactggag atgttcccactgtagccacc2220ggctgtgtgt agcctgtggt cgcatagccg gcgctggaaa gaacagggagaaaacaggtt2280ctcaggaaca gcacacagat gactgcgccc aggaggctgg gcatgctgcctgttccctga2340tcctgaccca gtttgtctcc agccaggcgc tggcagaact gagcactgtgatgcaccaag2400tctgggccaa gtttgacatt cgggggcact gtttctgcca ggttgatgcccgtgtgtggg2460cccccgggga tgggggtcag cagaaggaac caacagagaa aactcccccaactccacaac2520cttcctgcaa tggagattcc aatcggacca aggacatcaa agaagagaccccagactcca2580ctgagagccc agcagaggat ggtgctggcc ggtcacccct tccttgtccctctctctgtg2640agctgctagc ctctactgct gtcaaactct gcctggggca tgaccggattcacatggcct2700ttgctccggt caccccagct ctgcccagtg atgaccgcat taccaacatcctggacagca2760ttattgcgca ggtagtagaa cggaagatcc aagagaaagc cctggggccaggcctgtgag2820cagggtcagg cttacgcaag ggcctgagcc ttccattgtc accagtgcgaacccggctgt2880ctcctcctgg agctttgctg tggctgcagg agcccaggcc taagcatggcttccatctct2940tccaggaaca ctggcggcag ggccagcccg tgttagtgtc aggcatccagaagacattga3000gacttagcct gtggggaatg gaagcccttg ggacacttgg tggccaggtgcagacactga3060ctgcccttgg gcctccccag cccacgaacc tggacagcac ggcattctgggagggattct3120ctcatcctga gacacgtcca aagttagatg agggctctgt cctcctgctacaccgaaccc3180tgggggataa ggacgctagc agggtgcaga accttgcctc cagccttccactcccagaat3240actgtgccca ccaagggaaa ctcaacctag cgtcctacct ccccctgggcctcacactgc3300atccactgga gccccagctc tgggcggcct atggtgtgaa ctcacaccgtggacacctgg3360ggaccaagaa tctatgcgtg gaggtgtctg acttaatcag tatcctggtgcacgccgagg3420cccagctgcc tccctggtat cgagcacaga aagatttcct ctcaggcctggatggggaag3480gactctggtc tccagggagc cagaccagca ctgtgtggca tgtgttccgggcccaggatg3540cccagcgcat ccgtcgct tt ctccagatgg tgtgcccagc tggagcaggaaccttggagc3600ctggtgcccc aggcagctgc tacttggatg cagggttgcg ccgacggctaagagaagagt3660ggggtgtgag ctgctggacc ctgctgcagg ctcctgggga agcggtgctggtcccggctg3720gggcgcccca tcaggtgcag ggcctggtga gcacaatcag tgtcactcagcactttctgt3780ctcctgagac ctctgccctc tctgctcagc tctgccacca gggagccagcctaccccctg3840accaccgtat gctttatgcc cagatggacc gggctgtgtt ccaagcagtaaaggcggctg3900tgggggcgtt acaggaagct aaatagggga tcctggtgcc tggaggggtggtgggtaggt3960aactgagtgt ccagtctgca taatatcaac agggaatgaa tggtactggggaactta 401權(quán)利要求
1.一個脫毛相關(guān)基因，該基因的主要特征在于1.1、該基因位于小鼠14號染色體39.5cM處，全長約20.281Kb DNA序列，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為4017bp，含有19個外顯子；從成熟mRNA的第378位開始翻譯，共編碼1182個氨基酸殘基；1.2、該基因在2817位堿基有一個無義突變，導致一個精氨酸密碼子變成終止密碼子，該突變導致其功能喪失。
2.一個脫毛相關(guān)基因的應(yīng)用，其特征在于該基因能用來研究人類丘疹性禿頭癥的致病機理，并作為設(shè)計治療丘疹性禿頭癥藥物的靶基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個脫毛相關(guān)基因及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明確定了一無毛基因與昆明小鼠脫毛性狀的相關(guān)性。該基因被定位于小鼠14號染色體，在細胞遺傳圖譜上的位置是14D1，在連鎖圖譜上的位置是39.5cM，全長約20.281KbDNA序列，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)有4017bp，含有19個外顯子，從成熟mRNA的第378位(2號外顯子)開始翻譯，共編碼1182個氨基酸殘基。通過測序，該基因第2817位無義突變(C→T)是導致昆明種犀牛小鼠KIZ脫毛的遺傳基礎(chǔ)。而且，該基因在人類基因組中也非常保守，具有相似的功能。所以該基因可以用來研究人禿頭癥的致病機理，以及作為設(shè)計治療丘疹性禿頭癥藥物的靶基因。
文檔編號A61K48/00GK1487082SQ03135280
公開日2004年4月7日 申請日期2003年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月22日
發(fā)明者張亞平, 田明, 熊郁良, 王婉瑜 申請人:中國科學院昆明動物研究所