專利名稱：一種藥物組合物、其制備方法及其在制備治療sars以及sars引起的心腦部并發(fā)癥藥物方 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物組合物、其制備方法及其用途，具體地說(shuō)，涉及一種由從除人以外的哺乳動(dòng)物肌肉組織中提取的活性多肽和從除人以外的哺乳動(dòng)物腦組織中提取的神經(jīng)節(jié)苷脂制備的藥物組合物、其制備方法及其在制備治療SARS以及治療心肌和腦部疾病引起的功能障礙方面的藥物用途。
神經(jīng)節(jié)苷脂的臨床藥用價(jià)值有用于各種原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)損害的功能恢復(fù)；用于腦血管意外創(chuàng)傷及創(chuàng)傷后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的治療；用于缺血性和出血性腦病變的治療。
目前上市的神經(jīng)節(jié)苷脂類藥物有阿根廷生產(chǎn)的施捷因，為單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉鹽注射液，其由基因工程方法生產(chǎn)，為單一組分，不含活性多肽，不太利于吸收和利用。
意大利Fidia公司從牛腦組織中提取的單唾液酸四己糖基神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)注射液(商品名Sygen)已于20世紀(jì)90年代正式在我國(guó)銷售。
中國(guó)專利申請(qǐng)93112578公開了一種腦保健營(yíng)養(yǎng)品、其制造方法和用途，該保健品為含有神經(jīng)節(jié)苷脂的營(yíng)養(yǎng)液，神經(jīng)節(jié)苷脂含量至少每毫升含有0.5mg，其制造方法主要使用水、氯仿、酒精提取，其用途在于增強(qiáng)人腦的學(xué)習(xí)、記憶功能，促進(jìn)人腦的正常發(fā)育和腦損傷后的恢復(fù)。
中國(guó)專利申請(qǐng)95111569公開了一種含神經(jīng)節(jié)苷脂為主的糖脂類物質(zhì)的生產(chǎn)方法，包括粉碎、溶劑提取、過(guò)濾和濃縮，其特征是將干凈的動(dòng)物腦經(jīng)粉碎，加入40-100％含量的酒精和石油醚提取，或者在干凈的動(dòng)物腦中加入40～100％含量的酒精后粉碎，加入石油醚提取，上述提取物過(guò)濾，清液濃縮，所述的動(dòng)物腦、酒精和石油醚的重量比是1∶1～20∶0.5～8。
中國(guó)專利申請(qǐng)00133077公開了一種單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的高純度制備工藝。
生物體內(nèi)，小分子多肽、氨基酸廣泛參與各種生化過(guò)程，包括各種物質(zhì)的合成、物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、信息物資的生成與傳遞，同時(shí)為所有的生命活動(dòng)提供能量，尤其是對(duì)腦組織更為重要。
從國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的提取神經(jīng)節(jié)苷脂的方法看，多采用不同比例有機(jī)溶劑抽提總脂，然后用分配萃取方法提取神經(jīng)節(jié)苷脂混合物，再用離子交換層析、分子排阻及硅膠層析法分離神經(jīng)節(jié)苷脂。
有報(bào)道，將組織勻漿用氯仿-甲醇溶液抽提、離心，上清液加水萃取、蒸干得粗脂。將粗脂溶于甲醇，過(guò)陰離子交換柱，收集神經(jīng)節(jié)苷脂。
另有報(bào)道，將組織加入氯仿-甲醇溶液抽提，抽提液濃縮、旋轉(zhuǎn)蒸干得總脂。將總脂加入異丙醚-正丁醇溶劑溶解后用氯化納溶液萃取、離心，水相為酸性鞘糖脂提取物。凍干粗脂過(guò)Sepbadex G-50柱層析，收集混合神經(jīng)節(jié)苷脂組分凍干。
目前，腦組織提取物類如腦復(fù)素注射液、活腦素注射液、腦組織注射液、熱藏大腦注射液、腦多肽注射液等，均為由各類腦組織蛋白水解制成，含神經(jīng)組織活性多肽，但神經(jīng)節(jié)苷脂檢測(cè)不出，因?yàn)樯鲜銎贩N一般每毫升含腦組織0.5克左右，含量太低。
兔肉提取物類，如心血通注射液，系由兔肌肉、兔心肌水解制成，每毫升含兔肌肉不足1克，且只含肌肉組織活性多肽，而且活性較低。
專利申請(qǐng)01126465公開了一種治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物和保健品，含有神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物，提供了神經(jīng)節(jié)苷脂作為組合物組分，與其它組分協(xié)同發(fā)揮作用的藥物組合物。
目前已公開的腦提取液中的神經(jīng)節(jié)苷脂的含量均較低，而且雖然也有神經(jīng)節(jié)苷脂作為組合物組分，與其它組分協(xié)同發(fā)揮作用的藥物組合物的公開報(bào)道，但仍未有其與動(dòng)物其他機(jī)體組織協(xié)同發(fā)揮作用的相關(guān)報(bào)道。
通常醫(yī)學(xué)上的非典型肺炎(Atypical pneumonias)是指一組具有類似肺炎臨床表現(xiàn)、胸部X線特征和對(duì)抗生素治療有反應(yīng)的肺炎。但自2002年11月在我國(guó)廣東地區(qū)發(fā)現(xiàn)、并在世界上20幾個(gè)國(guó)家陸續(xù)發(fā)生，導(dǎo)致全球數(shù)百人死亡的非典型肺炎具有極強(qiáng)的傳染性，國(guó)內(nèi)將其稱為傳染性非典型肺炎，2003年2月，WHO將其命名為重癥急性呼吸綜合癥(Severe actue respiratory syndrome SARS)。世界衛(wèi)生組織2003年4月16日在日內(nèi)瓦正式確認(rèn)，冠狀病毒的一個(gè)變種是引起非典型肺炎的病原體。SARS病人的免疫功能明顯下降，在短時(shí)間內(nèi)病情急轉(zhuǎn)直下，有些病人從發(fā)病到死亡只有短短數(shù)天，并有不少老年病人死于SARS引起的心腦血管并發(fā)癥?？梢?jiàn)，迅速開發(fā)有效預(yù)防和治療“SARS”的藥物對(duì)于控制疾病的流行、治療患者以及人類戰(zhàn)勝疾病都是非常重要并非常有意義的。
本發(fā)明的另一目的在于提供該藥物組合物的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供藥物組合物在制備治療SARS以及SARS并發(fā)癥藥物方面的用途。
本發(fā)明的再一目的是提供藥物組合物在制備治療心肌或腦部疾病引起的功能障礙方面藥物的用途。
本發(fā)明還涉及藥物組合物在制備治療老年性癡呆、腦血管意外創(chuàng)傷及創(chuàng)傷后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥、冠心病、心絞痛、心肌疾病、腦血管病、以及缺血性和出血性腦病變治療藥物上的用途。
本發(fā)明所述的一種藥物組合物，其中含有動(dòng)物肌肉組織提取物和腦組織提取物，腦組織提取物中含有單唾液酸四己糖基神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)、雙唾液酸四己糖基神經(jīng)節(jié)苷脂、三唾液酸四己糖基神經(jīng)節(jié)苷脂與活性多肽，肌肉組織提取物中含有活性多肽，該活性多肽分子量由0.3um濾膜在過(guò)濾時(shí)控制。
本發(fā)明所述的藥物組合物，其特征在于含有從除人以外的哺乳動(dòng)物肌肉組織中提取的活性多肽和從除人以外的哺乳動(dòng)物腦組織中提取的神經(jīng)節(jié)苷脂，其中中活性多肽重量為神經(jīng)節(jié)苷脂中唾液酸的6.1～100倍。
優(yōu)選的為藥物組合物中活性多肽重量為神經(jīng)節(jié)苷脂中唾液酸的50～80倍，更優(yōu)選為60～70倍，最優(yōu)選的為64倍。
哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)節(jié)苷脂含量豐富，例如可從豬、狗、牛、羊、鹿、馬、兔等新鮮腦組織中提取含有神經(jīng)節(jié)苷脂的物質(zhì)，上述哺乳動(dòng)物的肌肉組織也可以提取活性多肽。
上述哺乳動(dòng)物肌肉組織優(yōu)選為兔肌肉組織。
上述哺乳動(dòng)物腦組織優(yōu)選為牛腦組織。
在傳統(tǒng)治療中，兔肉組織用來(lái)治療心肌疾病已經(jīng)有比較顯著的療效，而且從生產(chǎn)過(guò)程的可操作性和有效利用率方面考慮，多選用兔肉來(lái)提取活性多肽；牛腦主要是用來(lái)提取神經(jīng)節(jié)苷脂，國(guó)外已經(jīng)用牛腦外的其它動(dòng)物組織提取制成了同類產(chǎn)品，但主要基于神經(jīng)節(jié)苷脂的提取量考慮。
本發(fā)明優(yōu)選牛腦來(lái)提取神經(jīng)節(jié)苷脂，不僅要使神經(jīng)節(jié)苷脂達(dá)到一定的量，還要從牛腦組織中提取一部分活性多肽，這部分活性多肽在治療心、腦疾病方面起著不可忽視的作用。
因此，從生產(chǎn)成本、生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性、臨床療效等因素考慮，優(yōu)選牛腦組織和兔肉組織作為生產(chǎn)原料。
上述動(dòng)物肌肉組織可以是動(dòng)物的任意部位肌肉。
一種制備所述的藥物組合物的方法，其特征在于包括如下步驟(1)肌肉提取液的制備A)將動(dòng)物任意部位肌肉組織加水勻漿后冷藏，然后過(guò)濾除渣，保留濾液；B)濾液在中性條件下保溫酶解；C)水解液離心除沉淀，上清液用微孔濾膜過(guò)濾，得濾液，即為肌肉提取液；(2)腦提取液的制備A)將動(dòng)物腦組織加溶劑勻漿后過(guò)濾，濾渣用溶劑抽提提取，提取液與濾液合并后蒸干，得干燥物；B)將干燥物溶于溶劑中，向其中加入鹽的水溶液提取分液；C)分液的上、下層液相分別用至少兩種溶劑的混合水溶液洗滌，合并洗滌后的上層液相部分，減壓濃縮，然后用預(yù)冷丙酮沉淀，干燥后得干燥物；D)將干燥物溶于至少兩種溶劑的混合水溶液，層析柱分離，洗脫液濃縮后用預(yù)冷丙酮沉淀、分離，得到的沉淀經(jīng)后處理，得到神經(jīng)節(jié)苷脂溶液；(3)將上述提取液混合，使混合液中多肽的重量為神經(jīng)節(jié)苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，經(jīng)后處理，得成品制劑。
其中，肌肉提取液的制備過(guò)程中，加1.6～2.5倍重量水勻漿，勻漿后在低于10℃下冷藏，用尼龍布過(guò)濾。
酶解采用霉菌蛋白酶，控制pH為中性條件下加熱保溫水解。
水解液離心沉淀后，上清液過(guò)0.3um濾膜，得多肽含量為0.5～15mg/ml的肌肉提取液。
在腦提取液的制備過(guò)程中，勻漿所用溶劑為丙酮，濾渣用氯仿—甲醇(1～20∶1～20，V/V)的混合液充分抽提，合并的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干，得干燥物。
溶解干燥物的溶劑為體積比為2～30∶1～20的鹵代烴和醇的混合溶劑，鹽的水溶液優(yōu)選KCl水溶液。
分液的上、下層液相分別用鹵代烴和醇的混合水溶液洗滌，減壓濃縮至初始體積的1/8～1/2，然后用低于0℃預(yù)冷丙酮沉淀。
將干燥物溶于鹵代烴和醇的混合水溶液，用鹵代烴和醇的混合水溶液梯度洗脫柱層析分離。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明的制備方法包括(1)肌肉提取液的制備A)步驟中將動(dòng)物任意部位肌肉組織加1.6～2.5倍重量水勻漿，勻漿液加水稀釋后，在4～8℃冷藏12～16小時(shí)，使用80目的尼龍布過(guò)濾，保留濾液；B)濾液中加入霉菌蛋白酶保溫水解，霉菌蛋白酶濃度為0.03～0.5％，水解條件為pH＝7.2～7.6，保溫39～45℃，保溫時(shí)間為2～4小時(shí)；C)水解液離心，離心條件為3000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為15～30分鐘，保留上清液，上清液過(guò)0.3um濾膜，保留通過(guò)部分，得濾液；即為肌肉提取液，其中多肽含量為0.5～15mg/ml；(2)腦提取液的制備A)將動(dòng)物腦組織加3～4倍重量的丙酮?jiǎng)驖{后過(guò)濾，保留濾渣和濾液；濾渣用3～5倍重量的氯仿—甲醇(1～20∶1～20，V/V)混合液抽提三次，分別過(guò)濾；將上述濾液合并后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中37℃減壓蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿—甲醇(2～30∶1～20，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/20～1/80體積的0.1mol/L的KCl溶液，室溫下攪拌1小時(shí)，靜置8～16小時(shí)后分液；C)分液后，上層液相用等體積的氯仿—甲醇—水(50～150∶5～40∶0.5～5，V/V/V)混合液洗滌，下層液相用等體積的氯仿—甲醇—水(1～10∶30～80∶35～85，V/V/V)混合液洗滌，合并兩次洗滌后的上層液相部分，在37℃減壓濃縮至初始體積的1/8～1/2，然后用-20℃預(yù)冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；D)將干燥物溶于的氯仿—甲醇—水(30～80∶10～50∶1～90，V/V/V)混合液，制成1～5％濃度的溶液，加入層析柱，調(diào)整流速5mL/分鐘，用氯仿—甲醇—水(60～90∶15～40∶1～10，V/V/V)混合液10～30L洗脫，然后改用氯仿—甲醇—水(40～80∶20～50∶5～15，V/V/V)混合液8～15L洗脫，收集后洗脫液6～12L，減壓濃縮后用3～5倍體積的-20℃預(yù)冷丙酮沉淀，-20℃靜止2小時(shí)后傾去上層清液，余下部分在1000轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘，得到的沉淀用適量丙酮洗2次，真空干燥，將干燥物溶于水得腦提取液，濃度為每1ml含唾液酸0.01～0.5mg；(3)將上述提取液混合，使混合液中多肽的重量為神經(jīng)節(jié)苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，經(jīng)后處理，得成品制劑。
更為優(yōu)選的，本發(fā)明的制備方法包括如下步驟(1)肌肉提取液的制備A)將動(dòng)物任意部位肌肉組織加1.6～2.5倍重量水勻漿，勻漿液加水稀釋后，在4～8℃冷藏12～16小時(shí)，使用80目的尼龍布過(guò)濾，保留濾液；B)在濾液中加入霉菌蛋白酶保溫水解，霉菌蛋白酶濃度為0.1％，水解條件為PH＝7.2～7.6，保溫45℃，保溫時(shí)間為2.5小時(shí)；C)水解液離心，離心條件為3000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為20分鐘，保留上清液，上清液過(guò)0.3um濾膜，保留通過(guò)部分，得濾液；濾液減壓濃縮得濃縮液，即為肌肉提取液，其中多肽含量為0.5～15mg/ml；(2)腦提取液的制備A)將動(dòng)物腦組織加3～4倍重量的丙酮?jiǎng)驖{后過(guò)濾，保留濾渣和濾液；濾渣用3～5倍重量的氯仿—甲醇(1∶1，V/V)混合液抽提三次，分別過(guò)濾；將上述濾液合并后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中37℃減壓蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿—甲醇(2∶1，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/80體積的0.1mol/L的KCl溶液，室溫下攪拌1小時(shí)，靜置8～16小時(shí)后分液；C)分液后，上層液相用等體積的氯仿—甲醇—水(86∶14∶1，V/V/V)混合液洗滌，下層液相用等體積的氯仿—甲醇—水(3∶48∶47，V/V/V)混合液洗滌，合并兩次洗滌后的上層液相部分，在37℃減壓濃縮至初始體積的1/4，然后用-20℃預(yù)冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；D)將干燥物溶于的氯仿—甲醇—水(65∶25∶4，V/V/V)混合液，制成2.5％濃度的溶液，加入層析柱，調(diào)整流速5mL/分鐘，用氯仿—甲醇—水(65∶25∶4，V/V/V)混合液20L洗脫，然后改用氯仿—甲醇—水(60∶35∶8，V/V/V)混合液12L洗脫，收集后洗脫液10L，減壓濃縮后用4倍體積的-20℃預(yù)冷丙酮沉淀，-20℃靜止2小時(shí)后傾去上層清液，余下部分在1000轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘，得到的沉淀用適量丙酮洗2次，真空干燥，將干燥物溶于水得腦提取液，濃度為每1ml含唾液酸0.01～0.5mg；(3)將上述提取液混合，使混合液中多肽的重量為神經(jīng)節(jié)苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，經(jīng)后處理，得成品制劑。
上述步驟(1)的B)中，使用的霉菌蛋白酶為常規(guī)市售產(chǎn)品，為了使本發(fā)明生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，應(yīng)盡可能由固定生產(chǎn)商提供；水解時(shí)，pH值的控制可用飽和Ca(OH)2溶液來(lái)調(diào)整。
上述步驟(1)的C)中，上清液過(guò)0.3um濾膜為肌肉提取液中的活性多肽分子量的控制步驟。使用的0.3um濾膜為市售產(chǎn)品，其生產(chǎn)商應(yīng)為國(guó)家認(rèn)可的生產(chǎn)單位，使用的濾膜型號(hào)與尺寸可根據(jù)具體的生產(chǎn)量、選用的過(guò)濾器尺寸來(lái)確定。
上述步驟(2)的B)中氯仿—甲醇混合液加入量以完全溶解干燥物為準(zhǔn)。
上述步驟(2)中丙酮的加入量以不再有沉淀析出為準(zhǔn)。
上述步驟(2)的D)中所用的層析柱通過(guò)如下過(guò)程制備將硅膠顆粒過(guò)篩選60～80目的均勻顆粒，在110℃下干燥1小時(shí)，使其活化，然后用5倍柱體積的氯仿-甲醇(5～20∶0.5～3，V/V)混合液作為載體，將硅膠調(diào)成糊狀，使其均勻分散后裝入80×10cm的層析柱，即得。其中優(yōu)選的氯仿-甲醇混合比為9∶1(V/V)。
本發(fā)明的減壓蒸發(fā)的壓力控制在0.04～0.08MPa左右。
上述步驟(3)中成品制劑的劑型為藥劑學(xué)上可接受的劑型，比如片劑、膠囊、口服液、小容量注射劑、大輸液或凍干粉針等，優(yōu)選為小容量注射劑、大輸液或凍干粉針，最優(yōu)選為小容量注射劑。因此，所述步驟(3)所述的后處理可以是按照制備藥劑學(xué)上可接受的劑型的常規(guī)方法進(jìn)行。
本發(fā)明的制備方法采用硅膠柱一步純化得混合神經(jīng)節(jié)苷脂，先減壓濃縮后用預(yù)冷丙酮沉淀，真空干燥后溶于蒸餾水，作為腦提取物備用，使制得的提取物有效成分收率較高，組分更合理，同時(shí)也節(jié)省了操作時(shí)間，降低了原輔料消耗。神經(jīng)節(jié)苷脂具有感知、傳遞細(xì)胞內(nèi)外信息的功能，參與細(xì)胞的識(shí)別、粘著、生長(zhǎng)、分化以及細(xì)胞信息傳遞等過(guò)程。作為某些神經(jīng)遞質(zhì)、激素、病毒和干擾素的受體，具有參與神經(jīng)組織的分化、再生、修復(fù)，與神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)、細(xì)胞間的識(shí)別作用。能加速損傷的神經(jīng)組織的再生修復(fù)，促進(jìn)神經(jīng)支配功能恢復(fù)，減低興奮性氨基酸的釋放，從而減輕細(xì)胞毒性和血管水腫，是腦血管意外治療的良藥，用于治療老年性癡呆及其它神經(jīng)性疾病取得良好療效。
目前在亞洲地區(qū)流行的嚴(yán)重的SARS傳染病的冠狀病毒基因組為RNA，通過(guò)呼吸道、黏膜或接觸，病毒經(jīng)受體介導(dǎo)吸附于敏感細(xì)胞膜或細(xì)胞膜的糖蛋白受體，通過(guò)膜融合或融膜合成細(xì)胞內(nèi)吞入。臨床癥狀的病理生理變化主要是靶細(xì)胞發(fā)生極性殺細(xì)胞感染，并進(jìn)一步發(fā)展為多器官衰竭，尤其是中老年人極易引起多種并發(fā)癥，奪去生命。本發(fā)明的研究人員研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的藥物組合物能夠有效地預(yù)防或治療SARS及其SARS引起的心肌和腦部疾病。
本發(fā)明所述的藥物組合物中含有天然活性多肽和多種神經(jīng)節(jié)苷脂，其含量高于已有的多肽提取液和神經(jīng)節(jié)苷脂提取液，同時(shí)本發(fā)明藥物組合物中含有天然活性多肽和多種神經(jīng)節(jié)苷脂利于吸收和利用，能促進(jìn)心、腦組織的新陳代謝，參與腦組織神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化和再生過(guò)程，改善腦血液循環(huán)和腦代謝功能，可應(yīng)用于制備治療心肌和腦部疾病引起的功能障礙藥物方面，可用于治療心肌梗死、癡呆、腦外傷、腦水腫等癥；本發(fā)明藥物組合物作為制備治療老年性癡呆、腦血管意外創(chuàng)傷及創(chuàng)傷后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥、冠心病、心絞痛、心肌疾病、腦血管病、以及缺血性和出血性腦病變等藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明研究人員進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)該藥物組合物中活性多肽重量為神經(jīng)節(jié)苷脂中唾液酸的64倍時(shí)，二者的協(xié)同作用最好，更利于人體的吸收和利用。本發(fā)明優(yōu)選藥物組合物注射液的常規(guī)用量為規(guī)格2ml 6.4mg(多肽) 100μg(唾液酸)；5ml 16.0mg(多肽) 250μg(唾液酸)；10ml 32.0mg(多肽) 500μg(唾液酸)；肌肉注射2～4ml/次，2次/日或遵醫(yī)囑；靜脈滴注10-20ml/次，加入300ml 0.9％氯化鈉注射液或5％葡萄糖注射液，緩慢滴注(每分鐘2ml)，1次/日，兩周為一療程。
本發(fā)明所述的藥物組合物含有營(yíng)養(yǎng)肌體組織與腦組織的活性物質(zhì)，采用神經(jīng)節(jié)苷脂與多肽的協(xié)同作用，達(dá)到了最佳的臨床效果。
本發(fā)明藥物組合物注射液含有營(yíng)養(yǎng)肌體組織與腦組織的活性物質(zhì)，包括活性多肽、神經(jīng)節(jié)苷脂等物質(zhì)，能促進(jìn)心、腦組織的新陳代謝，參與腦組織神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化和再生過(guò)程，改善腦血液循環(huán)和腦代謝功能，可用于治療心肌和腦部疾病引起的功能障礙；用于治療心肌梗死、癡呆、腦外傷、腦水腫等癥；本發(fā)明藥物組合物在制備治療老年性癡呆、腦血管意外創(chuàng)傷及創(chuàng)傷后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥、冠心病、心絞痛、心肌疾病、腦血管病、以及缺血性和出血性腦病變治療藥物上的用途。
實(shí)施例1步驟(1)取新鮮兔肌肉10kg，加20L水勻漿，4℃下冷藏12小時(shí)，80目尼龍布過(guò)濾，濾液加入0.1％霉菌蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為7.4，45℃保溫2.5小時(shí)。水解液在3000rpm下離心20分鐘。離心上清液經(jīng)0.3um濾膜過(guò)濾，濾液減壓濃縮至800ml，作為兔肌肉提取液備用，其中多肽含量為8mg/ml。步驟(2)取10kg新鮮牛腦用40L丙酮?jiǎng)驖{，勻漿液用濾紙過(guò)濾，得濾渣2500g，濾渣用10L氯仿—甲醇(1∶1)混合液抽提三次，分別過(guò)濾后合并濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，在37℃減壓蒸干，得干燥物1.25g。干燥物用20L氯仿—甲醇混合液(2∶1，V/V)溶解，加入250ml的0.1mol/LKCl溶液。室溫?cái)嚢?小時(shí)，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中靜置8小時(shí)。分液后，上相用等體積的氯仿—甲醇—水(86∶14∶1，V/V/V)洗1次；下相用等體積的氯仿—甲醇—水(3∶48∶47，V/V/V)洗1次；合并2次上相于37℃減壓濃縮至約5L，-20℃預(yù)冷丙酮沉淀，真空干燥。
層析柱通過(guò)如下過(guò)程制備將硅膠顆粒過(guò)篩選80目的均勻顆粒，在110℃下干燥1小時(shí)，使其活化，然后用5倍柱體積的氯仿-甲醇(9∶1，V/V)混合液作為載體，將硅膠調(diào)成糊狀，使其均勻分散后裝入80×10cm的層析柱，即可。
將前述真空干燥物1.2g溶于氯仿—甲醇—水(65∶25∶4，V/V/V)50ml加入層析柱，調(diào)整流速5ml/分鐘，用氯仿—甲醇—水(65∶25∶4，V/V/V)20L溶液洗脫，然后改用氯仿—甲醇—水(60∶35∶8)12L洗脫，收集后洗脫液10L，減壓濃縮后用40L的-20℃預(yù)冷丙酮沉淀，-20℃靜止2小時(shí)，傾去上層清液，離心10分鐘(1000rpm)，沉淀用適量丙酮洗2次，沉淀真空干燥過(guò)夜。
將1.2g干燥物溶于800ml注射用水，作為牛腦提取物備用，濃度為每1ml含唾液酸125μg。步驟(3)將兔肌肉提取液800ml和牛腦提取液800ml混合，加注射用水至2L，無(wú)菌超濾后灌裝成2ml/支，高壓滅菌，包裝入庫(kù)，每支含有6.4mg多肽、100μg唾液酸。
實(shí)施例2步驟(1)取新鮮鹿肌肉10kg，加16L水勻漿，6℃下冷藏14小時(shí)，80目尼龍布過(guò)濾，濾液加入0.05％霉菌蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為7.2，39℃保溫4小時(shí)。水解液在3000rpm下離心20分鐘。離心上清液經(jīng)0.3um濾膜過(guò)濾，濾液減壓濃縮至800ml，其中多肽含量為2.725mg/ml，作為鹿肌肉提取液備用。步驟(2)取10kg新鮮牛腦用35L丙酮?jiǎng)驖{，勻漿液用濾紙過(guò)濾，得濾渣2500g，濾渣用7.5L氯仿—甲醇(5∶1)混合液抽提三次，分別過(guò)濾后合并濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，在37℃減壓蒸干，得干燥物1.25g。干燥物用20L氯仿—甲醇混合液(10∶1，V/V)溶解，加入1000ml的0.1mol/LKCl溶液。室溫?cái)嚢?小時(shí)，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中靜置10小時(shí)。分液后，上相用等體積的氯仿—甲醇—水(50∶10∶0.5，V/V/V)洗1次；下相用等體積的氯仿—甲醇—水(1∶30∶35，V/V/V)洗1次；合并2次上相于37℃減壓濃縮至約2.5L，-20℃預(yù)冷丙酮沉淀，真空干燥。
層析柱通過(guò)如下過(guò)程制備將硅膠顆粒過(guò)篩選70目的均勻顆粒，在110℃下干燥1小時(shí)，使其活化，然后用5倍柱體積的氯仿-甲醇(20∶3，V/V)混合液作為載體，將硅膠調(diào)成糊狀，使其均勻分散后裝入80×10cm的層析柱，即可。
將前述真空干燥物1.2g溶于氯仿—甲醇—水(30∶50∶40，V/V/V)120ml加入層析柱，調(diào)整流速5ml/分鐘，用氯仿—甲醇—水(90∶15∶6，V/V/V)30L溶液洗脫，然后改用氯仿—甲醇—水(80∶20∶5)8L洗脫，收集后洗脫液12L，減壓濃縮后用35L的-20℃預(yù)冷丙酮沉淀，-20℃靜止2小時(shí)，傾去上層清液，離心10分鐘(1000rpm)，沉淀用適量丙酮洗2次，沉淀真空干燥過(guò)夜。
將1.16g干燥物溶于800ml注射用水，作為牛腦提取物備用，濃度為每1ml含唾液酸80μg唾液酸。步驟(3)將鹿肌肉提取液800ml和牛腦提取液800ml混合，加注射用水至2L，無(wú)菌超濾后灌裝成2ml/支，高壓滅菌，包裝入庫(kù)，每支腦苷肌肽含有2.18mg多肽、64μg唾液酸。
實(shí)施例3步驟(1)取新鮮兔肌肉10kg，加25L水勻漿，8℃下冷藏16小時(shí)，80目尼龍布過(guò)濾，濾液加入0.5％霉菌蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為7.6，42℃保溫2小時(shí)。水解液在3000rpm下離心20分鐘。離心上清液經(jīng)0.3um濾膜過(guò)濾，濾液減壓濃縮至800ml，其中多肽含量為5mg/ml，作為兔肌肉提取液備用。步驟(2)取10kg新鮮馬腦用30L丙酮?jiǎng)驖{，勻漿液用濾紙過(guò)濾，得濾渣2500g，濾渣用12.5L氯仿—甲醇(20∶1)混合液抽提三次，分別過(guò)濾后合并濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，器，在37℃減壓蒸干，得干燥物1.25g。干燥物用20L氯仿—甲醇混合液(30∶1，V/V)溶解，加入500ml的0.1mol/LKCl溶液。室溫?cái)嚢?小時(shí)，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中靜置16小時(shí)。分液后，上相用等體積的氯仿—甲醇—水(120∶35∶5，V/V/V)洗1次；下相用等體積的氯仿—甲醇—水(10∶68∶77，V/V/V)洗1次；合并2次上相于37℃減壓濃縮至約10L，-20℃預(yù)冷丙酮沉淀，真空干燥。
層析柱通過(guò)如下過(guò)程制備將硅膠顆粒過(guò)篩選80目的均勻顆粒，在110℃下干燥1小時(shí)，使其活化，然后用5倍柱體積的氯仿-甲醇(15∶2，V/V)混合液作為載體，將硅膠調(diào)成糊狀，使其均勻分散后裝入80×10cm的層析柱，即可。
將前述真空干燥物1.2g溶于氯仿—甲醇—水(80∶10∶20，V/V/V)24ml加入層析柱，調(diào)整流速5ml/分鐘，用氯仿—甲醇—水(75∶15∶10，V/V/V)20L溶液洗脫，然后改用氯仿—甲醇—水(40∶50∶15)15L洗脫，收集后洗脫液8L，減壓濃縮后用40L的-20℃預(yù)冷丙酮沉淀，-20℃靜止2小時(shí)，傾去上層清液，離心10分鐘(1000rpm)，沉淀用適量丙酮洗2次，沉淀真空干燥過(guò)夜。
將1.25g干燥物溶于注射用水，作為馬腦提取物備用，濃度為每1ml含唾液酸500μg唾液酸。步驟(3)將兔肌肉提取液1400ml和馬腦提取液200ml混合，無(wú)菌超濾后灌裝成2ml/支，高壓滅菌，包裝入庫(kù)，每支腦苷肌肽含有8.75mg多肽、125μg唾液酸。
實(shí)施例4步驟(1)取新鮮鹿肌肉10kg，加25L水勻漿，參照實(shí)施例1步驟(1)制備鹿肌肉提取液備用，其中多肽含量為1.6mg/ml。步驟(2)取10kg新鮮馬腦用45L丙酮?jiǎng)驖{，參照實(shí)施例1步驟(2)，制備馬腦提取液備用，濃度為每1ml含唾液酸50μg唾液酸。步驟(3)將鹿肌肉提取液110ml和馬腦提取液500ml混合，無(wú)菌超濾后灌裝成2ml/支，高壓滅菌，包裝入庫(kù)，每支腦苷肌肽含有0.57mg多肽、82μg唾液酸。
實(shí)施例5步驟(1)參照實(shí)施例1步驟(1)，制備肌肉提取液多肽含量為8mg/ml。步驟(2)取10kg新鮮狗腦用40L丙酮?jiǎng)驖{，參照實(shí)施例1步驟(2)，制備狗腦提取液備用，濃度為每1ml含唾液酸137.5μg。步驟(3)將兔肌肉提取液800ml和狗腦提取液800ml混合，加注射用水至2L，無(wú)菌超濾后灌裝成2ml/支，高壓滅菌，包裝入庫(kù)，每支腦苷肌肽含有6.4mg多肽、110μg唾液酸。
實(shí)施例6步驟(1)同實(shí)施例1步驟(1)。步驟(2)取10kg新鮮豬腦用35L丙酮?jiǎng)驖{，參照實(shí)施例1步驟(2)，制備豬腦提取液備用，濃度為每1ml含唾液酸300μg唾液酸。步驟(3)將兔肌肉提取液1500ml和豬腦提取液400ml混合，無(wú)菌超濾后灌裝成2ml/支，高壓滅菌，包裝入庫(kù)，每支腦苷肌肽含有6.3mg多肽、126μg唾液酸。
實(shí)施例7步驟(1)同實(shí)施例1步驟(1)。步驟(2)取10kg新鮮羊腦用33L丙酮?jiǎng)驖{，參照實(shí)施例1步驟(2)，制備羊腦提取液備用，濃度為每1ml含唾液酸400μg唾液酸。步驟(3)將兔肌肉提取液2000ml和羊腦提取液250ml混合，無(wú)菌超濾后灌裝成2ml/支，高壓滅菌，包裝入庫(kù)，每支腦苷肌肽含有7.1mg多肽、89μg唾液酸。
實(shí)施例8步驟(1)取新鮮狗肌肉10kg，加22L水勻漿，參照實(shí)施例1步驟(1)制備肌肉提取液備用，肌肉提取液多肽含量為2.5mg/ml。步驟(2)同實(shí)施例1步驟(2)，濃度為每1ml含唾液酸200μg唾液酸。步驟(3)將狗肌肉提取液2000ml和牛腦提取液250ml混合，無(wú)菌超濾后灌裝成2ml/支，高壓滅菌，包裝入庫(kù)，每支腦苷肌肽含有4.4mg多肽、45μg唾液酸。
實(shí)施例9步驟(1)參照實(shí)施例1步驟(1)，制備肌肉提取液多肽含量為15mg/ml。步驟(2)參照實(shí)施例3步驟(2)，制備鹿腦提取液備用，濃度為每1ml含唾液酸375μg。步驟(3)將兔肌肉提取液400ml和狗腦提取液800ml混合，加注射用水至2L，無(wú)菌超濾后灌裝成2ml/支，高壓滅菌，包裝入庫(kù)，每支腦苷肌肽含有6mg多肽、300μg唾液酸。
實(shí)施例10～18參照實(shí)施例1～9中步驟(1)和(2)，步驟(3)將肌肉提取液和腦提取液進(jìn)行混合后，按本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，制成顆粒，干燥后壓制成片，即得藥物組合物的片劑。
實(shí)施例19～27參照實(shí)施例1～9中步驟(1)和(2)，步驟(3)將肌肉提取液和腦提取液進(jìn)行混合后，加入適宜的賦型劑(如右旋糖酐40或甘露醇等)，進(jìn)行除菌灌裝后，按本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，經(jīng)冷凍干燥制成凍干粉針產(chǎn)品。
實(shí)施例28～36參照實(shí)施例1～9中步驟(1)和(2)，步驟(3)將肌肉提取液和腦提取液進(jìn)行混合后，加入適量注射用水投入到稀配罐中；在濃配罐中按最終配制總體積的0.9％加入氯化鈉，加入0.4‰活性碳煮沸脫炭過(guò)濾，冷卻后，將藥液過(guò)濾至稀配罐中，在稀配罐中補(bǔ)加注射用水至配液量，調(diào)PH為7.2～7.5，過(guò)濾。灌封于輸液瓶中，100℃流通蒸汽滅菌45分鐘，即得輸液產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)例1本實(shí)驗(yàn)例為外觀、pH值、蛋白質(zhì)項(xiàng)目的檢測(cè)。
本發(fā)明藥物組合物注射液為無(wú)色或微黃澄明液體。
按照中國(guó)藥典2000年版二部附錄VIH測(cè)定，本發(fā)明藥物組合物注射液pH值為6.5-8.0，符合注射液標(biāo)準(zhǔn)。
取本發(fā)明藥物組合物注射液1ml，加20％磺基水楊酸溶液1ml，沒(méi)有渾濁產(chǎn)生，說(shuō)明本發(fā)明注射液蛋白質(zhì)檢查符合規(guī)定。
實(shí)驗(yàn)例2本實(shí)驗(yàn)例為多肽的定性測(cè)定。
取本發(fā)明藥物組合物注射液1ml，加茚三酮試液3滴，加熱，呈紫色，為肽鍵(-CO-NH-)的特征反應(yīng)，說(shuō)明本發(fā)明藥物組合物注射液含有多肽。
實(shí)驗(yàn)例3本實(shí)驗(yàn)例為神經(jīng)節(jié)苷脂的定性測(cè)定。
按照中國(guó)藥典2000年版二部附錄VB試驗(yàn)，采用薄層色譜法，以單一神經(jīng)節(jié)苷脂GM1為對(duì)照品，加磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)，制成每1ml含0.2mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。分別取本發(fā)明藥物組合物注射液及對(duì)照品溶液各50ul，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿—甲醇—0.2％氯化鈣溶液(60∶45∶10，V/V/V)為展開劑，展開后，晾干，噴以間苯二酚溶液，噴后即加玻片封蓋(兩玻片間需用夾夾緊)，120℃加熱至斑點(diǎn)清晰，譜圖顯示本發(fā)明藥物組合物注射液色譜圖主斑點(diǎn)的顏色及位置與對(duì)照品色譜圖的斑點(diǎn)一致(見(jiàn)

圖1)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明藥物組合物注射液中含有神經(jīng)節(jié)苷脂，主要為神經(jīng)節(jié)苷脂GM1。
實(shí)驗(yàn)例4本實(shí)驗(yàn)例為毒性實(shí)驗(yàn)參數(shù)□ 細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定依照中國(guó)藥典2000年版二部附錄XIE進(jìn)行檢查，本發(fā)明藥物組合物注射液每1ml中含細(xì)菌內(nèi)毒素的量小于5EU。□ 異常毒性測(cè)定依照中國(guó)藥典2000年版二部附錄XIC靜脈注射法檢查，符合規(guī)定。□ 毒性實(shí)驗(yàn)測(cè)定LD50為298±79mg/Kg，最大耐受量超過(guò)成人用量的250倍?！? 長(zhǎng)期毒性測(cè)定連續(xù)給藥三個(gè)月觀察血、尿指標(biāo)，病理檢查均未見(jiàn)異常?！? 過(guò)敏性試驗(yàn)取體重250-350g健康豚鼠6只，間日腹腔注射本發(fā)明藥物組合物注射液0.5ml，連續(xù)3次，在第三次注射后的第十四天，自靜脈注射本品1.0ml，注射后15分鐘內(nèi)觀察動(dòng)物，均不出現(xiàn)連續(xù)干咳、連續(xù)前爪抓鼻、明顯聳毛、四肢發(fā)軟、躺臥、呼吸困難、痙攣、虛脫及死亡現(xiàn)象。連續(xù)觀察3天，動(dòng)物健存。結(jié)論本發(fā)明藥物組合物注射液符合注射液要求，無(wú)任何毒性作用，應(yīng)用人體安全。
實(shí)驗(yàn)例5本實(shí)驗(yàn)例為高分子量物質(zhì)測(cè)定按照中國(guó)藥典2000年版二部附錄VD中高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用凝膠色譜柱(TSK GEL 2000SWxl7.8mm*300mm，5um)；流動(dòng)相為三氟醋酸-乙腈-水(0.05∶10∶90)；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。理論板數(shù)按胰島素峰計(jì)算應(yīng)不得低于3000。
對(duì)照品溶液的制備取胰島素(分子量5800)適量，用流動(dòng)相制成每1ml中含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。
測(cè)定法取對(duì)照品溶液和本發(fā)明藥物組合物注射液各20ul，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖2、3，小于胰島素峰保留時(shí)間的峰面積，按面積歸一化法計(jì)算，不得超過(guò)5.0％。
該藥物組合物注射液通過(guò)靜脈滴注途徑給藥，根據(jù)專家意見(jiàn)，增加高分子量物質(zhì)檢查。根據(jù)三批樣品的測(cè)定結(jié)果，高分子量物質(zhì)限定為“小于胰島素峰保留時(shí)間的峰面積，按面積歸一化法計(jì)算，不超過(guò)5.0％”。
實(shí)驗(yàn)例6本實(shí)驗(yàn)例定量測(cè)定本發(fā)明藥物組合物注射液的多肽含量。
按照類似品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用Folin—酚法測(cè)定，規(guī)定肽含量應(yīng)為標(biāo)示量的85-115％。參見(jiàn)表1。
表1多肽含量測(cè)定結(jié)果

Folin—酚測(cè)定法試劑堿性銅溶液——取氫氧化銅10g，碳酸鈉50g，加水400ml溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5g，加水50ml溶解，另取硫酸銅0.25g，加水30ml溶解，將兩液混合，作為乙液。
臨用前，甲液與乙液合并，并加水至500ml。
操作法(1)對(duì)照品溶液的制備取牛血清白蛋白對(duì)照品，加水制成每1ml中含0.3mg的溶液。
(2)供試品溶液的制備取本發(fā)明注射液，加水制成每1ml中約含多肽0.15mg的溶液。
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9ml，分別置具塞試管中，各加水至1.0ml，再分別加入堿性銅溶液1.0ml，搖勻，各加入福林酚溶液(福林試液中的貯備液1→16)4.0ml，立即混勻，置55℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，置冷水中10分鐘，在650nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度；同時(shí)以0管作為空白。以測(cè)得的吸收度與對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算回歸方程。
(4)測(cè)定法精密量取供試品溶液1.0ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“加入堿性銅溶液”起，依法測(cè)定，從回歸方程求得供試品溶液的濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即為多肽含量。
實(shí)驗(yàn)例7本實(shí)驗(yàn)例定量測(cè)定本發(fā)明藥物組合物注射液的唾液酸含量。
采用間苯二酚測(cè)定法測(cè)定，規(guī)定唾液酸含量應(yīng)為標(biāo)示量的85～115％。參見(jiàn)表2。
表2唾液酸含量測(cè)定結(jié)果

間苯二酚測(cè)定法試劑1、間苯二酚貯存液取間苯二酚2g，加水100ml溶解，作為貯存液(可4℃保存數(shù)月)。
2、硫酸銅溶液(0.1mol/L)取硫酸銅2.5g，加水100ml溶解，即得。
3、間苯二酚溶液取間苯二酚貯存液10ml，加硫酸銅溶液0.25ml，加鹽酸80ml，加水至100ml。
操作法(1)參比溶液的制備取唾液酸參比試劑適量，加0.9％氯化鈉溶液制成每1ml中含100μg的溶液。
(2)供試品溶液的制備取本發(fā)明腦苷肌肽注射液，加0.9％氯化鈉溶液制成每1ml中約含唾液酸50μg的溶液。
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取參比溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0ml，分別置具塞試管中，各加水至2.0ml，再分別加入間苯二酚溶液2.0ml，搖勻，置水浴中反應(yīng)15分鐘，取出置冷水中10分鐘。分別加醋酸正丁酯-正丁醇(85∶15)5ml，劇烈振搖后放置15分鐘。取上層液于585nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度；同時(shí)以0管作為空白。以測(cè)得的吸收度與對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算回歸方程，其相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.995。
(4)測(cè)定法精密量取供試品溶液2.0ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“加入間苯二酚溶液”起，依法測(cè)定，從回歸方程求得供試品溶液的濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即為唾液酸含量。
比較例1本比較例說(shuō)明本發(fā)明藥物組合物注射液治療腦血管病的臨床效果。
1、資料與方法對(duì)照組用藥為腦復(fù)素注射液5ml5mg，用量用法靜脈注射，每次20ml，每日1次，15天為一療程，每療程間隔15天；肌肉注射，每次5ml，一日2次。
采用盲目隨機(jī)對(duì)照分為治療組和對(duì)照組各41例。
治療組男27例，女14例，年齡35-80歲，平均58歲。
對(duì)照組男26例，女15例，年齡40-83歲，平均61歲。
表3治療組與對(duì)照組臨床表現(xiàn)對(duì)比

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組平均積分相差不明顯，t＝0.2594，p＝0.8，故可為研究用。
在綜合治療的基礎(chǔ)上，加用注射液，用藥開始時(shí)間在發(fā)病后1-10天。用量每次20ml，一日1次，7天為一療程有10例；15天為一療程31例。
2、結(jié)果表4從神經(jīng)功能缺損積分減少(功能改善)評(píng)定療效

從上表可見(jiàn)治療組在治療后神經(jīng)體征明顯改善(p＜0.05)，而對(duì)照組改善不明顯(p＞0.05)，證明治療組效果優(yōu)于對(duì)照組。
本組治療結(jié)果見(jiàn)表5表5腦卒中的近期療效觀察對(duì)比

治療中未見(jiàn)近期副反應(yīng)及并發(fā)癥。
3、討論研究結(jié)果表明，從治療結(jié)束時(shí)神經(jīng)功能缺損積分減少數(shù)結(jié)果看，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，治療組效果優(yōu)于對(duì)照組(p＞0.05)，在從臨床療效比較，治療組有效率為88％，對(duì)照組有效率為20％，經(jīng)x2檢驗(yàn)治療組療效明顯高于對(duì)照組(p＜0.01)，以上結(jié)果證明本發(fā)明藥物組合物注射液對(duì)腦血管病有明顯療效，并使死亡率明顯降低。
比較例2本比較例說(shuō)明本發(fā)明藥物組合物注射液治療心臟疾病的臨床效果1、表6治療冠心病、心絞痛療效觀察對(duì)比

2、表7心功能改善的治療對(duì)比 從臨床使用情況來(lái)看，對(duì)冠心病、心絞痛總有效率可達(dá)95.3％，能明顯改善心臟組織缺血狀態(tài)，改善和促進(jìn)心功能的恢復(fù)。
比較例3本比較例說(shuō)明在治療老年性急性腦卒中，本發(fā)明藥物組合物注射液療效優(yōu)于腦復(fù)素注射液、活腦素注射液。
1、對(duì)象所有人選病例均按中華醫(yī)學(xué)會(huì)第2次腦血管學(xué)術(shù)會(huì)議制定的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)詳細(xì)詢問(wèn)病史，神經(jīng)系統(tǒng)檢查及頭顱CT和(或)MR檢查確診。所有病人均為首次發(fā)病，按改良愛(ài)丁堡斯堪的納維亞(改良SSS評(píng)分)，疾病程度為中、重度，均未給予溶栓治療，因經(jīng)濟(jì)問(wèn)題未完成治療療程的不參與評(píng)價(jià)。治療組28例，男20例，女8例，平均年齡76歲(64-88歲)，其中腦梗塞18例，腦出血8例，蛛網(wǎng)膜下腔出血2例；隨機(jī)選擇以往用腦復(fù)素注射液、活腦素注射液治療的患者30例為對(duì)照組，男20例，女10例，平均年齡75歲(60-90歲)，其中腦梗塞19例，腦出血10例，蛛網(wǎng)膜下腔出血1例。兩組基線資料有可比性。
2、治療方法治療組本發(fā)明藥物組合物注射液一次10-20ml加入300ml氯化鈉注射液中或5％葡萄糖注射液中，每日1次，緩慢滴注，維持4-6周。
對(duì)照組腦復(fù)素注射液、活腦素注射液，每次20ml，每日1次，15天為一療程，一般用2個(gè)療程以上。
對(duì)兩組患者伴有糖尿病及高血壓者給予相應(yīng)對(duì)癥治療。治療組治療前后均檢查肝腎功能、血常規(guī)及心電圖。
3、療效評(píng)定根據(jù)改良SSS評(píng)分法，對(duì)入院時(shí)和出院時(shí)患者的神經(jīng)功能損傷進(jìn)行評(píng)價(jià)。
基本痊愈SSS評(píng)分減少90％以上；顯著進(jìn)步SSS評(píng)分減少46-89％；進(jìn)步SSS評(píng)分減少18-45％；無(wú) 變 化SSS評(píng)分變化在18％以下；
惡 化SSS評(píng)分增加大于18％。
4、結(jié)果治療組治療前后，肝腎功能、血常規(guī)及心電圖無(wú)明顯變化。
兩組療效見(jiàn)表8

注與對(duì)照組比較*x2＝6.59，p＜0.01，**x2＝4.92，p＜0.025。
以上說(shuō)明在治療老年性急性腦卒中，本發(fā)明腦苷肌肽藥物組合物注射液療效優(yōu)于腦復(fù)素注射液、活腦素注射液。
比較例4本比較例說(shuō)明本發(fā)明腦苷肌肽藥物組合物注射液用于治療心肌疾病的療效優(yōu)于心血通注射液。對(duì)照組心血通注射液。有關(guān)參數(shù)見(jiàn)表9

說(shuō)明本發(fā)明腦苷肌肽藥物組合物注射液用于治療心肌疾病的療效優(yōu)于心血通注射液。
盡管對(duì)本發(fā)明已作了詳細(xì)的說(shuō)明并引證了一些具體實(shí)例，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，只要不離開本發(fā)明的精神和范圍，作各種變化或修正是顯然的。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其特征在于含有從除人以外的哺乳動(dòng)物肌肉組織中提取的活性多肽和從除人以外的哺乳動(dòng)物腦組織中提取的神經(jīng)節(jié)苷脂，其中活性多肽重量為神經(jīng)節(jié)苷脂中唾液酸的6.1～100倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于活性多肽重量為神經(jīng)節(jié)苷脂中唾液酸的50～80倍，更優(yōu)選為60～70倍，最優(yōu)選的為64倍。
3.一種制備權(quán)利要求1所述的藥物組合物的方法，其特征在于包括如下步驟(1)肌肉提取液的制備A)將動(dòng)物任意部位肌肉組織加水勻漿后冷藏，然后過(guò)濾除渣，保留濾液；B)濾液在中性條件下保溫酶解；C)水解液離心除沉淀，上清液用微孔濾膜過(guò)濾，得濾液，為肌肉提取液；(2)腦提取液的制備A)將動(dòng)物腦組織加溶劑勻漿后過(guò)濾，濾渣用溶劑抽提提取，提取液與濾液合并后蒸干，得干燥物；B)將干燥物溶于溶劑中，向其中加入鹽的水溶液提取分液；C)分液的上、下層液相分別用至少兩種溶劑的混合水溶液洗滌，合并洗滌后的上層液相部分，減壓濃縮，然后用預(yù)冷丙酮沉淀，干燥后得干燥物；D)將干燥物溶于至少兩種溶劑的混合水溶液，層析柱分離，洗脫液濃縮后用預(yù)冷丙酮沉淀、分離，得到的沉淀經(jīng)后處理，得到神經(jīng)節(jié)苷脂溶液；(3)將上述提取液混合，使混合液中多肽的重量為神經(jīng)節(jié)苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，經(jīng)后處理，得成品制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)肌肉提取液的制備A)將動(dòng)物任意部位肌肉組織加1.6～2.5倍重量水勻漿，勻漿液加水稀釋后，在4～8℃冷藏12～16小時(shí)，使用80目的尼龍布過(guò)濾，保留濾液；B)在濾液中加入霉菌蛋白酶保溫水解，霉菌蛋白酶濃度為0.03～0.5％，水解條件為pH＝7.2～7.6，保溫39～45℃，保溫時(shí)間為2～4小時(shí)；C)水解液離心，離心條件為3000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為15～30分鐘，保留上清液，上清液過(guò)0.3um濾膜，保留通過(guò)部分，得濾液，為肌肉提取液，其中多肽含量為0.5～15mg/ml；(2)腦提取液的制備A)將動(dòng)物腦組織加3～4倍重量的丙酮?jiǎng)驖{后過(guò)濾，保留濾渣和濾液；濾渣用3～5倍重量的氯仿—甲醇(1～20∶1～20，V/V)混合液抽提三次，分別過(guò)濾；將上述濾液合并后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中37℃減壓蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿—甲醇(2～30∶1～20，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/20～1/80體積的0.1mol/L的KCl溶液，室溫下攪拌1小時(shí)，靜置8～16小時(shí)后分液；C)分液后，上層液相用等體積的氯仿—甲醇—水(50～150∶5～40∶0.5～5，V/V/V)混合液洗滌，下層液相用等體積的氯仿—甲醇—水(1～10∶30～80∶35～85，V/V/V)混合液洗滌，合并兩次洗滌后的上層液相部分，在37℃減壓濃縮至初始體積的1/8～1/2，然后用-20℃預(yù)冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；D)將干燥物溶于的氯仿—甲醇—水(30～80∶10～50∶1～90，V/V/V)混合液，制成1～5％濃度的溶液，加入層析柱，調(diào)整流速5ml/分鐘，用氯仿—甲醇—水(60～90∶1 5～40∶1～10，V/V/V)混合液10～30L洗脫，然后改用氯仿—甲醇—水(40～80∶20～50∶5～15，V//V/V)混合液8～15L洗脫，收集后洗脫液6～12L，減壓濃縮后用3～5倍體積的-20℃預(yù)冷丙酮沉淀，-20℃靜止2小時(shí)后傾去上層清液，余下部分在1000轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘，得到的沉淀用適量丙酮洗2次，真空干燥，將干燥物溶于水得腦提取液，濃度為每1ml含唾液酸0.01～0.5mg；(3)將上述提取液混合，使混合液中多肽的重量為神經(jīng)節(jié)苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，經(jīng)后處理，得成品制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)肌肉提取液的制備A)將動(dòng)物任意部位肌肉組織加1.6～2.5倍重量水勻漿，勻漿液加水稀釋后，在4～8℃冷藏12～16小時(shí)，使用80目的尼龍布過(guò)濾，保留濾液；B)在濾液中加入霉菌蛋白酶保溫水解，霉菌蛋白酶濃度為0.1％，水解條件為PH＝7.2～7.6，保溫45℃，保溫時(shí)間為2.5小時(shí)；C)水解液離心，離心條件為3000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為20分鐘，保留上清液，上清液過(guò)0.3um濾膜，保留通過(guò)部分，得濾液，為肌肉提取液，其中多肽含量為0.5～15mg/ml；(2)腦提取液的制備A)將動(dòng)物腦組織加3～4倍重量的丙酮?jiǎng)驖{后過(guò)濾，保留濾渣和濾液；濾渣用3～5倍重量的氯仿—甲醇(1∶1，V/V)混合液抽提三次，分別過(guò)濾；將上述濾液合并后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中37℃減壓蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿—甲醇(2∶1，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/80體積的0.1mol/L的KCl溶液，室溫下攪拌1小時(shí)，靜置8～16小時(shí)后分液；C)分液后，上層液相用等體積的氯仿—甲醇—水(86∶14∶1，V/V/V)混合液洗滌，下層液相用等體積的氯仿—甲醇—水(3∶48∶47，V/V/V)混合液洗滌，合并兩次洗滌后的上層液相部分，在37℃減壓濃縮至初始體積的1/4，然后用-20℃預(yù)冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；D)將干燥物溶于的氯仿—甲醇—水(65∶25∶4，V/V/V)混合液，制成2.5％濃度的溶液，加入層析柱，調(diào)整流速5mL/分鐘，用氯仿—甲醇—水(65∶25∶4，V/V/)混合液20L洗脫，然后改用氯仿—甲醇—水(60∶35∶8，V/V/V)混合液12L洗脫，收集后洗脫液10L，減壓濃縮后用4倍體積的-20℃預(yù)冷丙酮沉淀，-20℃靜止2小時(shí)后傾去上層清液，余下部分在1000轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘，得到的沉淀用適量丙酮洗2次，真空干燥，將干燥物溶于水得腦提取液，濃度為每1ml含唾液酸0.01～0.5mg；(3)將上述提取液混合，使混合液中多肽的重量為神經(jīng)節(jié)苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，經(jīng)后處理，得成品制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)的D)中所用的層析柱通過(guò)如下過(guò)程制備將硅膠顆粒過(guò)篩選60～80目的均勻顆粒，在110℃下干燥1小時(shí)，使其活化，然后用5倍柱體積的氯仿-甲醇(5～20∶0.5～3，V/V)混合液作為載體，將硅膠調(diào)成糊狀，使其均勻分散后裝入80×10cm的層析柱，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于其中氯仿-甲醇混合比為9∶1(V/V)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中成品制劑的劑型為藥劑學(xué)上可接受的劑型，比如片劑、膠囊、口服液、小容量注射劑、大輸液或凍干粉針，優(yōu)選為小容量注射劑、大輸液或凍干粉針，最優(yōu)選為小容量注射劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于所述的動(dòng)物任意部位肌肉組織為豬、狗、牛、羊、鹿、馬或兔的任意部位肌肉組織；所述的動(dòng)物腦組織為豬、狗、牛、羊、鹿、馬或兔的腦組織，優(yōu)選所述的動(dòng)物任意部位肌肉組織為兔的任意部位肌肉組織；所述的動(dòng)物腦組織為牛的腦組織。
10.權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物在制備治療SARS以及SARS引起的心腦部并發(fā)癥藥物方面的用途；在制備治療心肌和腦部疾病引起的功能障礙藥物方面的用途；作為治療心肌梗死、癡呆、腦外傷、腦水腫藥物中的應(yīng)用；以及作為制備治療老年性癡呆、腦血管意外創(chuàng)傷及創(chuàng)傷后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥、冠心病、心絞痛、心肌疾病、腦血管病、以及缺血性和出血性腦病變等藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種藥物組合物，含有從除人以外的哺乳動(dòng)物肌肉組織中提取的活性多肽和從除人以外的哺乳動(dòng)物腦組織中提取的神經(jīng)節(jié)苷脂，藥物組合物中活性多肽重量為神經(jīng)節(jié)苷脂中唾液酸的6.1～100倍，還公開了藥物組合物的制備方法及其在制備治療SARS以及SARS引起的心腦部并發(fā)癥藥物方面的用途，本發(fā)明的藥物組合物能促進(jìn)心、腦組織的新陳代謝，參與腦組織神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化和再生過(guò)程，改善腦血液循環(huán)和腦代謝功能，可用于治療心肌和腦部疾病引起的功能障礙。
文檔編號(hào)A61P31/14GK1454666SQ0313746
公開日2003年11月12日 申請(qǐng)日期2003年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月9日
發(fā)明者郭志華 申請(qǐng)人:吉林威威藥業(yè)股份有限公司