專利名稱：一種新城疫dna疫苗及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA疫苗及其構(gòu)建和應(yīng)用，特別是涉及一種新城疫病毒pVAX1-LasotaHN DNA疫苗及其構(gòu)建和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1990年Dr.John Woffer和Dr.Feigner偶然發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒DNA在肌肉細(xì)胞中能進(jìn)行轉(zhuǎn)化和表達(dá)，并推測(cè)用DNA注入機(jī)體可能產(chǎn)生免疫反應(yīng)。1992年美國(guó)的Robinson實(shí)驗(yàn)室、Johoston實(shí)驗(yàn)室、David實(shí)驗(yàn)室同時(shí)開(kāi)發(fā)研究出了DNA疫苗的雛形，并在1992年9月召開(kāi)的疫苗學(xué)新進(jìn)展大會(huì)上同時(shí)進(jìn)行了報(bào)告。1992年Tang在Nature上報(bào)導(dǎo)，將含有人生長(zhǎng)激素基因的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入小鼠，在小鼠血清中檢測(cè)到特異抗人生長(zhǎng)激素抗體，DNA疫苗的新技術(shù)自此問(wèn)世，并且立刻引起世界各國(guó)的高度重視，被人們視為疫苗研究領(lǐng)域的一場(chǎng)革命。1994年美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)以國(guó)家生物戰(zhàn)略發(fā)展計(jì)劃的專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助開(kāi)展DNA疫苗治療HIV的研究工作。1994年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了在人體進(jìn)行DNA疫苗治療愛(ài)滋病的臨床試驗(yàn)。1995年5月，報(bào)導(dǎo)了世界第一例DNA疫苗的臨床試驗(yàn)，世界衛(wèi)生組織(WHO)撥款把DNA疫苗納入WHO全球免疫研制開(kāi)發(fā)計(jì)劃之中。
DNA疫苗新技術(shù)的核心是將編碼抗原的核酸序列組裝到含有必要表達(dá)調(diào)控元件的真核表達(dá)載體中構(gòu)建核酸疫苗，然后將其導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，重組的核酸疫苗可以利用動(dòng)物體內(nèi)的酶系合成外源基因編碼的蛋白，從而誘發(fā)動(dòng)物對(duì)該外源蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答，達(dá)到免疫目的。許多動(dòng)物模型和人體實(shí)驗(yàn)都證明了DNA疫苗能激發(fā)有效的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答既可激活體液免疫，又能激活細(xì)胞免疫，這表明DNA免疫技術(shù)，不僅能通過(guò)產(chǎn)生抗體預(yù)防病毒感染，更重要的是DNA疫苗可誘導(dǎo)極有效的專一性T殺傷細(xì)胞的能力，清除已經(jīng)被感染的機(jī)體細(xì)胞，達(dá)到治療疾病的目的，而且沒(méi)有副作用反應(yīng)。與當(dāng)前常用的減毒活苗疫苗或滅活菌疫苗相比，DNA疫苗具有明顯的優(yōu)勢(shì)，1)所需的免疫量較小，20-100微克；2)DNA疫苗能同時(shí)高效激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更強(qiáng)；3)不僅具有預(yù)防疾病的作用而且還有治療疾病功效；4)基因免疫安全、長(zhǎng)效(免疫能力有長(zhǎng)時(shí)間的記憶)、穩(wěn)定、操作便捷。因此DNA疫苗具有其它免疫方法難以比擬的潛在優(yōu)勢(shì)。其應(yīng)用前景十分誘人。
雞新城疫，也稱新城疫病毒(Newcastle disease virus，以下簡(jiǎn)稱NDV)是國(guó)內(nèi)外養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要制約因素。速發(fā)型新城疫病毒(NDV)是雞群中流行的新城疫病毒毒株。當(dāng)前，NDV是危害世界養(yǎng)雞業(yè)、養(yǎng)鴿業(yè)的重要傳染病之一。雞感染新城疫病毒后，目前尚無(wú)特殊治療藥物。雛雞疫苗接種是預(yù)防的主要措施，目前一般采用的是新城疫病毒減毒活苗或滅活苗作預(yù)防疫苗。這種減毒疫苗雖有一定效果，但工藝繁瑣，效果差，每當(dāng)新城疫病毒流行，雞的死亡率仍是非常之高。此外，這種減毒活苗或滅活苗僅能激活體液免疫，所以只在預(yù)防上有一定作用，但無(wú)法控制和治療該病毒引起的雞瘟。不能滿足國(guó)內(nèi)外養(yǎng)禽業(yè)急需具有高效、安全可靠、有預(yù)防作用的雞新城疫疫苗的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有傳統(tǒng)接種NDV病毒減毒活苗或滅活菌作為預(yù)防疫苗，產(chǎn)生的抗體滴度低、免疫效果差、易產(chǎn)生免疫逃避、僅有較弱的預(yù)防作用而無(wú)治療新城疫的功能等缺陷，從而提供一種能預(yù)防和治療新城疫pVAX1-LasotaHN DNA疫苗。
本發(fā)明的另一目的是提供該新城疫DNA疫苗的構(gòu)建。
本發(fā)明的再一目的是提供該新城疫DNA疫苗的用途。
本發(fā)明的目的是由如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供的新城疫DNA疫苗，該疫苗由NDV-LasotaHN基因和真核表達(dá)載體pVAX1組成，其特征在于所述的NDV-LasotaHN基因是NDV病毒的致病決定基因，其為NDV病毒的Lasota E4基因中第6400至8144的核苷酸，具有圖1中所示的核苷酸序列本發(fā)明提供的所述新城疫DNA疫苗的構(gòu)建，包括如下步驟1)NDV Lasota病毒總RNA的提取及純化將NDV Lasota E4病毒株注射到孵化14天的雞胚里面，待雞胚死亡后，收集尿囊液，按常規(guī)方法提取NDV Lasota病毒總RNA；2)設(shè)計(jì)特異性引物根據(jù)Lasota病毒F蛋白基因序列分析設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物，上游引物5′-CGACAACAGTCCTCAATCATGG-3′；下游引物5′-TTGACTCAACTAGCCAGACCTGG-3′；3)通過(guò)溫度降落過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法，克隆得到NDV Lasota HN的全長(zhǎng)cDNA基因序列；
4)將步驟3)擴(kuò)增的LasotaHN，利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化LasotaHN cDNA片段；5)將LasotaHN全長(zhǎng)cDNA片段重組到pVAX1真核表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建成一種新城疫DNA疫苗——抗NDV的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗。
所述步驟3)的溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在48℃反應(yīng)45分鐘，接著在94℃滅活5分鐘，并啟動(dòng)溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法擴(kuò)增反應(yīng)在第一個(gè)變性步驟時(shí)加入聚合酶，變性溫度為94℃，持續(xù)1分鐘，退火溫度從68℃開(kāi)始，持續(xù)1分鐘，然后以每四個(gè)循環(huán)下降1℃的速度降至56℃，持續(xù)1分鐘，延伸溫度為65℃，持續(xù)1.5分鐘；最后在以退火溫度57℃/分鐘繼續(xù)擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)；最后在71℃延伸10分鐘。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述新城疫DNA疫苗在制備用于預(yù)防雞新城疫疾藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了所述新城疫DNA疫苗在制備用于治療雞新城疫疾病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗優(yōu)益之處在于1)所需的免疫量較小，20～50微克即可；2)核酸疫苗能同時(shí)高效激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更強(qiáng)；3)不僅具有預(yù)防雞新城疫疾病的作用而且還有治療該疾病功效；4)基因免疫安全、長(zhǎng)效(免疫能力有長(zhǎng)時(shí)間的記憶)、穩(wěn)定、操作便捷。


圖1為NDV-LasotaHN基因的核苷酸序列。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明實(shí)施例中使用的三黃雞由北京昌平養(yǎng)雞廠孵育，來(lái)杭雞為北京動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心孵育。
實(shí)施例1.本發(fā)明的新城疫DNA疫苗——pVAX1-LasotaHN DNA疫苗的構(gòu)建本發(fā)明的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗的構(gòu)建步驟如下1)NDV病毒(Virus)總RNA的提取及純化
采用Promega公司RNAgentsTotal RNA Isolation System kit提取NDV Lasota病毒總RNA，其具體操作是將由北京中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供的NDV Lasota E4病毒株注射到孵化14天的雞胚里面，在燈光下觀察發(fā)現(xiàn)雞胚死亡后，收集尿囊液20ml，將收集的尿囊液以700rpm的速度離心15分鐘；將上清液加入20ml 16wt％PEG-0.525MNaCl，冰浴1小時(shí)；以10000rpm的速度離心5分鐘，于4℃沉淀病毒顆粒；用800μl變性液將病毒沉淀溶解，移至1.5ml EP管；加80μl乙酸鈉混勻，加入800μl苯酚∶氯仿∶異戊醇(體積比1∶1∶1)混勻，振動(dòng)8～12秒，水浴15分鐘；以10000rpm的速度于4℃離心15分鐘，取出上清液；以10000rpm的速度于4℃離心10分鐘；分出沉淀，干燥后加10μl無(wú)核酸酶水，-80℃保存；2)設(shè)計(jì)特異性引物根據(jù)Lasota病毒HN蛋白基因序列分析設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物，上游引物5′-CGACAACAGTCCTCAATCATGG-3′；下游引物5′-TTGACTCAACTAGCCAGACCTGG-3′；3)通過(guò)TDRT-PCR(溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))克隆擴(kuò)增LasotaHN基因全長(zhǎng)cDNA50μL的反應(yīng)體系由10μL的AMV/Tf1 5×反應(yīng)緩沖液、2mM的dNTPs混合物、3mM的MgSO4、1μM的上游引物及下游引物、0.1U/μL的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、0.1U/μL的Tf1DNA聚合酶，2μg的總RNA和無(wú)核酸酶水組成；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在48℃反應(yīng)45分鐘，接著在94℃滅活5分鐘，并啟動(dòng)溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法(TDRT-PCR)擴(kuò)增反應(yīng)在降落TD-PCR擴(kuò)增階段，變性溫度為94℃，持續(xù)1分鐘，退火溫度從68℃開(kāi)始，持續(xù)1分鐘，然后以每四個(gè)循環(huán)下降1℃的速度降至56℃，持續(xù)1分鐘，延伸溫度為65℃，持續(xù)1.5分鐘；最后在以退火溫度57℃分鐘繼續(xù)擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)；最后在71℃延伸10分鐘；4)通過(guò)TDRT-PCR擴(kuò)增的LasotaHN基因cDNA，方法同3)，利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化LasotaHN基因cDNA片段；5)將LasotaHN全長(zhǎng)cDNA片段重組到pVAX1真核表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建成抗NDV的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗根據(jù)pVAX1載體試劑盒的使用說(shuō)明選用真核質(zhì)粒表達(dá)載體pVAX1含有真核啟動(dòng)子CMV，能夠在真核細(xì)胞中高效表達(dá)外源蛋白質(zhì)，將LasotaHN全長(zhǎng)cDNA片段重組到pVAX1真核表達(dá)質(zhì)粒中用連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Top10F’，取80ul轉(zhuǎn)化的菌液涂布LB(含氨芐青霉素)平板，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取菌落搖菌過(guò)夜，用堿裂法提取質(zhì)粒DNA，即本實(shí)施例的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗，進(jìn)行酶切鑒定并對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。
實(shí)施例2.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗外源LasotaHN基因體外瞬時(shí)表達(dá)和表達(dá)含量的鑒定LasotaHN基因的體外mRNA表達(dá)建立HeLa細(xì)胞體外瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，將實(shí)施例1中構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-LasotaHN經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)在24孔板的HeLa細(xì)胞中，于36小時(shí)收集細(xì)胞，提取36小時(shí)收集的轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞的總RNA，采用RT-PCR方法分析LasotaHN基因的體外表達(dá)。通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增出LasotaHN cDNA條帶，結(jié)果表明pVAX1-LasotaHN真核表達(dá)質(zhì)粒在Hela細(xì)胞體外瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中在mRNA水平上能高效表達(dá)，mRNA水平的表達(dá)量比對(duì)照組(空質(zhì)粒)高出157％。
外源LasotaHN的體外蛋白表達(dá)采用免疫熒光的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞LasotaHN蛋白的表達(dá)。取轉(zhuǎn)染36小時(shí)的HeLa細(xì)胞于4wt％磷酸緩沖液-多聚甲醛(PH7.4)中室溫固定1小時(shí)，用磷酸緩沖液(為方便起見(jiàn)，以下簡(jiǎn)稱PBS)漂洗3次后，1∶50(為方便起見(jiàn)，本專利所有實(shí)施例中的1∶x都是指用PBS物質(zhì)稀釋x倍的)正常血清室溫封閉分鐘，棄封閉血清，加入50μL 1∶250稀釋的雞抗NDV蛋白抗血清(0.5mg/mL)37℃孵育3小時(shí)，經(jīng)PBS漂洗后，樣品于1∶100稀釋羊抗雞IgG-FITC 4℃孵育1小時(shí)，PBS漂洗后用20μg/mL碘化丙啶(PI)在4℃染色2分鐘，PBS漂洗，于激光共聚焦顯微鏡(Confocal)488nm和564nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀察分析。免疫熒光結(jié)果證實(shí)pVAX1-LasotaHN能在Hela細(xì)胞體外瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生具有生物活性的LasotaHN蛋白，蛋白水平的表達(dá)量比對(duì)照組(空質(zhì)粒)高164％。
實(shí)施例3.在體內(nèi)pVAX1-LasotaHN DNA疫苗外源LasotaHN基因表達(dá)和表達(dá)含量的鑒定外源LasotaHN基因的體內(nèi)表達(dá)檢測(cè)將北京昌平養(yǎng)雞廠孵育的三黃雞隨機(jī)分為2組，每組18只，一組為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)三黃雞的肌肉注射實(shí)施例1中構(gòu)建的20μgpVAX1-LasotaHN質(zhì)粒DNA；另一組為對(duì)照組，對(duì)三黃雞的肌肉注射20μg pVAX1空質(zhì)粒DNA。于注射質(zhì)粒DNA后第3周取免疫三黃雞的肌肉、肝臟和脾臟組織，提取pVAX1-LasotaHN免疫三黃雞收集的肌肉組織、肝臟和脾臟組織總RNA，采用RT-PCR方法檢測(cè)外源LasotaHN基因在三黃雞體內(nèi)的表達(dá)情況。由檢測(cè)結(jié)果可知，pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫后肌肉、肝臟和脾臟組織細(xì)胞中LasotaHN在mRNA水平上表達(dá)，mRNA水平的平均表達(dá)量比對(duì)照組(空質(zhì)粒)高出289％。
實(shí)施例4.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗體內(nèi)免疫反應(yīng)的檢測(cè)ELISA檢測(cè)三黃雞體液免疫應(yīng)答實(shí)驗(yàn)分組、pVAX1-LasotaHN DNA疫苗注射方式及部位都與實(shí)施例3相同。用1∶50倍稀釋的正常血清(未射任何質(zhì)粒)和1∶50倍稀釋的肌肉注射20μg pVAX1空質(zhì)粒DNA的血清分別作為對(duì)照，收集pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫三黃雞三周后的血清按1∶100和1∶500的比例稀釋，以1μg/mL的Lasota E4標(biāo)準(zhǔn)蛋白50μL/孔作包被抗原，采用標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法檢測(cè)體液免疫應(yīng)答。由檢測(cè)結(jié)果可知，pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫后機(jī)體能產(chǎn)生高滴度抗體(抗體滴度＞1∶3700)。
實(shí)施例5.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗的安全性評(píng)估對(duì)于免疫動(dòng)物的安全性檢測(cè)檢測(cè)不同劑量(20μg～300μg)pVAX1-LasotaHNDNA疫苗免疫30只三黃雞，160天后無(wú)一只死亡；進(jìn)行不同劑量pVAX1-LasotaHNDNA疫苗注射動(dòng)物后的毒理性和常規(guī)生理指標(biāo)的觀察測(cè)定，利用組織化學(xué)方法確定注射疫苗后動(dòng)物組織病理變化將相應(yīng)組織器官進(jìn)行冰凍切片，在顯微鏡下觀察，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)動(dòng)物組織有病理變化。
實(shí)施例6.評(píng)估pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫家禽后是否對(duì)其他動(dòng)物產(chǎn)生影響。
20只孵出三天的三黃雞和20只孵出三天的來(lái)杭雞混養(yǎng)，隨機(jī)取10只注射20μgpVAX1-LasotaHN DNA疫苗并作好標(biāo)記，6周后，采用RT-PCR方法檢測(cè)其它30只未射任何質(zhì)粒三黃雞體或來(lái)杭雞體內(nèi)是否有pVAX1-LasotaHN DNA疫苗外源Lasota HN基因的表達(dá)，30只雞的檢測(cè)結(jié)果顯示未檢到外源LasotaHN基因在mRNA水平的表達(dá)，這表明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫家禽后對(duì)其他未免疫的動(dòng)物無(wú)感染作用。
實(shí)施例7.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗在雞群中實(shí)際預(yù)防和治療雞新城疫的療效實(shí)驗(yàn)-I在北京動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心孵育36只白來(lái)杭雞雛雞，一周后將雌雄兼有的雛雞隨機(jī)分成四組，第1-3組每組8只，第4組12只。所注射的新城疫病毒NDV Lasota E4為100μl稀釋100倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液。
第1組不接種任何質(zhì)粒，3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第2組接種100μl生理鹽水，3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第3組接種20μg pVAX1空質(zhì)粒，3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第4組接種20μg pVAX1-LasotaHN DNA疫苗，3周后注射新城疫病毒NDV LasotaE4；從注射新城疫病毒NDV Lasota E4后第三天開(kāi)始觀察，結(jié)果為第1組、第2組、第3組3天后24只小雞分別出現(xiàn)程度不同的雞瘟癥狀，其中8只死亡；4天后16只小雞雞瘟癥狀加重，其中9只死亡；5天后7只小雞僅有1只存活；6天后1只小雞亦死亡；第4組3天后12只小雞無(wú)任何雞瘟癥狀，健康活潑；4天后12只小雞無(wú)任何雞瘟癥狀，健康活潑；5天后12只小雞無(wú)任何雞瘟癥狀，健康活潑；6天后4只小雞出現(xiàn)輕微雞瘟癥狀，其余8只健康活潑；7天后又有3只小雞出現(xiàn)輕微雞瘟癥狀，其余5只健康活潑；10天后其中1只小雞死亡，其余11只健康活潑；120天后11只小雞均無(wú)任何雞瘟癥狀，健康活潑；由此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，pVAX1-LasotaHN DNA疫苗具有高效的抗雞新城疫病毒感染的作用，與三組對(duì)照組相比抗雞新城疫病毒感染的效果顯著(p＜0.01)。
實(shí)施例8.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗在雞群中實(shí)際預(yù)防和治療雞新城疫的療效實(shí)驗(yàn)-II在北京昌平養(yǎng)雞廠孵育60只三黃雞雛雞，一周后將雌雄兼有60只雛雞隨機(jī)分成四組，第1～3組每組10只，第4組30只。所注射的新城疫病毒NDV Lasota E4為100μl稀釋100倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液。
第1組不接種任何質(zhì)粒，3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第2組接種100μl生理鹽水，3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第3組接種20μg pVAX1空質(zhì)粒，3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第4組接種20μg pVAX1-LasotaHN DNA疫苗，3周后注射新城疫病毒NDV LasotaE4；從注射新城疫病毒NDV Lasota E4后第三天開(kāi)始觀察，結(jié)果為第1組、第2組、第3組3天后30只小雞均未出現(xiàn)雞瘟癥狀，健康活潑；4天后30只小雞均仍未出現(xiàn)雞瘟癥狀，健康活潑；5天后30只小雞均開(kāi)始出現(xiàn)雞瘟癥狀，且癥狀輕重不一；6天后30只小雞雞瘟癥狀加重，其中25只小雞死亡；7天后其余5只小雞雞瘟癥狀加重；10天后5只小雞相繼死亡；第4組3～5天后30只小雞無(wú)任何雞瘟癥狀，健康活潑；6～7天后30只小雞中有8只小雞出現(xiàn)輕微雞瘟癥狀，其它小雞均健康活潑；8～9天后30只小雞有14只小雞出現(xiàn)輕微雞瘟癥狀，其它小雞均健康活潑；10天后30只小雞有3只死亡其它27只均無(wú)任何雞瘟癥狀；20天后將存活的27只小雞再次注射100μl稀釋100倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液；24天后27只雞中有3只小雞出現(xiàn)輕微雞瘟癥狀，其它雞均健康活潑；28天后3只小雞出現(xiàn)的雞瘟癥狀消失，27只雞均健康活潑；30天后這27只雞第三次注射100μl稀釋50倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液；34天后27只雞健康活潑，均未出現(xiàn)雞瘟癥狀；38天后，除1只死亡外，其它26只雞均健康活潑。
雞群實(shí)驗(yàn)再次證明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗具有高效的抗雞新城疫病毒感染的作用，與三組對(duì)照組相效果十分顯著(p＜0.01)，一旦接受pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫，連續(xù)三次用強(qiáng)新城疫病毒NDV Lasota E4病毒株攻擊，雞群均不會(huì)被病毒感染，證明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗抗病毒效果穩(wěn)定、可靠。
實(shí)施例9.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗在雞群中實(shí)際治療雞新城疫的療效實(shí)驗(yàn)在北京昌平養(yǎng)雞廠孵育30只三黃雞雛雞，分為三組，每組10只。
第一組10只雛雞5天后注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶200)，4～5天后小雞出現(xiàn)輕微雞瘟癥狀，此時(shí)給每只小雞注射20μg pVAX1-LasotaHN DNA疫苗；接種疫苗后第三至四天小雞新城疫病癥狀減弱；第六天后，3只小雞患病死亡，另7只小雞癥狀未見(jiàn)有明顯變化；第十天后，6只小雞恢復(fù)健康，其余1只死亡。
治療實(shí)驗(yàn)表明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗具有一定的治療雞瘟的作用，對(duì)孵化后一周內(nèi)的雛雞，強(qiáng)病毒攻擊感染雞瘟后注射pVAX1-LasotaHN DNA疫苗，療效達(dá)60％。
第二組10只雛雞15天后注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100)，4～5天后小雞出現(xiàn)雞瘟癥狀，此時(shí)給每只小雞注射20μg pVAX1-LasotaHN DNA疫苗，接種疫苗后3～4天小雞新城疫病癥狀明顯減弱；第七天，除3只小雞死亡外，其它7只小雞雞瘟癥狀減弱；第十天后，7只小雞完全恢復(fù)健康；康復(fù)的7只小雞一周后，再次注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100)，90天后7只雞健康活潑，均未出現(xiàn)雞瘟癥狀。
第二組治療實(shí)驗(yàn)表明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗對(duì)孵化后15天遭強(qiáng)病毒攻擊感染雞瘟的小雞療效達(dá)70％，且治療雞瘟的同時(shí)，還具有良好的預(yù)防效果。
第三組10只雛雞30天后注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100)，4～5天后雞出現(xiàn)雞瘟癥狀，此時(shí)給每只小雞注射20μg pVAX1-LasotaHN DNA疫苗，接種疫苗后3～4天小雞新城疫病癥狀明顯減弱；第八天，除1只小雞死亡外，其它9只雞雞瘟癥狀減弱；第十天后，9只小雞完全恢復(fù)健康；康復(fù)的9只小雞一周后，再次注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100)，90天后9只雞健康活潑，均未出現(xiàn)雞瘟癥狀。
第三組治療實(shí)驗(yàn)表明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗對(duì)孵化后30天遭強(qiáng)病毒攻擊感染雞瘟的小雞療效達(dá)90％。
這三組實(shí)驗(yàn)表明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗的療效與雞齡大小有一定相關(guān)性。
FPI03021-sequence list.txtSEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所<120>一種新城疫的DNA疫苗及其用途<130>FPI03021<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1744<212>DNA<213>Newcastle disease virus<400>1agtcctcaat catggaccgc gccgttagcc aagttgcgtt agagaatgat gaaagagagg 60caaaaaatac atggcgcttg atattccgga ttgcaatctt attcttaaca gtagtgacct120tggctatatc tgtagcctcc cttttatata gcatgggggc tagcacacct agcgatcttg180taggcatacc gactaggatt tccagggcag aagaaaagat tacatctaca cttggttcca240atcaagatgt agtagatagg atatataagc aagtggccct tgagtctccg ttggcattgt300taaatactga gaccacaatt atgaacgcaa taacatctct ctcttatcag attaatggag360ctgcaaacaa cagtgggtgg ggggcaccta tccatgaccc agattatata ggggggatag420gcaaagaact cattgtagat gatgctagtg atgtcacatc attctatccc tctgcatttc480aagaacatct gaattttatc ccggcgccta ctacaggatc aggttgcact cgaataccct540catttgacat gagtgctacc cattactgct acacccataa tgtaatattg tctggatgca600gagatcactc acattcatat cagtatttag cacttggtgt gctccggaca tctgcaacag660ggagggtatt cttttctact ctgcgttcca tcaacctgga cgacacccaa aatcggaagt720cttgcagtgt gagtgcaact cccctgggtt gtgatatgct gtgctcgaaa gtcacggaga780cagaggaaga agattataac tcagctgtcc ctacgcggat ggtacatggg aggttagggt840tcgacggcca gtaccacgaa aaggacctag atgtcacaac attattcggg gactgggtgg900ccaactaccc aggagtaggg ggtggatctt ttattgacag ccgcgtatgg ttctcagtct960acggagggtt aaaacccaat tcacccagtg acactgtaca ggaagggaaa tatgtgatat 1020acaagcgata caatgacaca tgcccagatg agcaagacta ccagattcga atggccaagt 1080cttcgtataa gcctggacgg tttggtggga aacgcataca gcaggctatc ttatctatca 1140aggtgtcaac atccttaggc gaagacccgg tactgactgt accgcccaac acagtcacac 1200tcatgggggc cgaaggcaga attctcacag tagggacatc tcatttcttg tatcaacgag 1260ggtcatcata cttctctccc gcgttattat atcctatgac agtcagcaac aaaacagcca 1320ctcttcatag tccttataca ttcaatgcct tcactcggcc aggtagtatc ccttgccagg 1380cttcagcaag atgccccaac tcgtgtgtta ctggagtcta tacagatcca tatcccctaa 1440tcttctatag aaaccacacc ttgcgagggg tattcgggac aatgcttgat ggtgtacaag 1500caagacttaa ccctgcgtct gcagtattcg atagcacatc ccgcagtcgc attactcgag 1560tgagttcaag cagtaccaaa gcagcataca caacatcaac ttgttttaaa gtggtcaaga 1620ctaataagac ctattgtctc agcattgctg aaatatctaa tactctcttc ggagaattca 1680gaatcgtccc gttactagtt gagatcctca aagatgacgg ggttagagaa gccaggtctg 1740gcta174權(quán)利要求
1.一種新城疫DNA疫苗，該疫苗由NDV-LasotaHN基因和真核表達(dá)載體pVAX1組成，其特征在于所述的NDV-LasotaHN基因是NDV病毒的致病決定基因，其為NDV病毒的Lasota E4基因中第6400至8144的核苷酸，具有圖1中所示的核苷酸序列。
2.一種權(quán)利要求1所述的新城疫DNA疫苗的構(gòu)建，包括如下步驟1)NDV Lasota病毒總RNA的提取及純化將NDV Lasota E4病毒株注射到孵化14天的雞胚里面，待雞胚死亡后，收集尿囊液，按常規(guī)方法提取NDV Lasota病毒總RNA；2)設(shè)計(jì)特異性引物根據(jù)Lasota病毒HN蛋白基因序列分析設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物，上游引物5′-CGACAACAGTCCTCAATCATGG-3′；下游引物5′-TTGACTCAACTAGCCAGACCTGG-3′；3)通過(guò)溫度降落過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法，克隆得到NDVLasotaHN的全長(zhǎng)cDNA基因序列；4)將步驟3)擴(kuò)增的LasotaHN，利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化LasotaHN cDNA片段；5)將LasotaHN全長(zhǎng)cDNA片段重組到pVAX1真核表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建成一種新城疫DNA疫苗——抗NDV的pVAX1-LasotaHNDNA疫苗。
3.如權(quán)利要求2所述的新城疫DNA疫苗的構(gòu)建，其特征在于所述步驟3)的溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在48℃反應(yīng)45分鐘，接著在94℃滅活5分鐘，并啟動(dòng)溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法擴(kuò)增反應(yīng)在第一個(gè)變性步驟時(shí)加入聚合酶，變性溫度為94℃，持續(xù)1分鐘，退火溫度從68℃開(kāi)始，持續(xù)1分鐘，然后以每四個(gè)循環(huán)下降1℃的速度降至56℃，持續(xù)1分鐘，延伸溫度為65℃，持續(xù)1.5分鐘；最后在以退火溫度57℃/分鐘繼續(xù)擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)；最后在71℃延伸10分鐘。
4.一種權(quán)利要求1所述的新城疫DNA疫苗在制備用于預(yù)防雞新城疫疾藥物中的應(yīng)用。
5.一種權(quán)利要求1所述的新城疫DNA疫苗在制備用于治療雞新城疫疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及的新城疫DNA疫苗由NDV－LasotaHN基因和真核表達(dá)載體pVAX1組成，該DNA疫苗的構(gòu)建是通過(guò)如下步驟NDV Lasota病毒總RNA的提取及純化、設(shè)計(jì)特異性引物、通過(guò)TDRT－PCR擴(kuò)增，克隆得到NDV LasotaHN的全長(zhǎng)cDNA基因序列、將純化后的LasotaHN全長(zhǎng)cDNA片段重組到pVAX1真核表達(dá)質(zhì)粒中。與當(dāng)前常用的疫苗相比，本核酸疫苗達(dá)到相同免疫效果所需的量小，并且能同時(shí)、高效激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更強(qiáng)，而且安全、長(zhǎng)效、穩(wěn)定、操作便捷。本新城疫DNA疫苗可以用于預(yù)防和治療雞新城疫疾的藥物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1565630SQ03137560
公開(kāi)日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月18日
發(fā)明者彭景楩, 陳云, 楊穎 , 孫泉紅, 王金玲 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所