專利名稱：甲殼低聚糖硫酸酯和/或殼聚糖硫酸酯作為制備降血糖藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋藥物的研究與開發(fā)，具體講是一種防治糖尿病的藥物化合物——甲殼低聚糖硫酸酯和/或殼聚糖硫酸酯作為制備降血糖藥物中的應(yīng)用，其屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
眾所周知，高血糖是糖尿病的一個(gè)重要特征。糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，其是由于胰島素分泌絕對或相對不足引起糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂，出現(xiàn)持續(xù)性的高血糖狀態(tài)。糖尿病的久病者常伴發(fā)動(dòng)脈硬化，心血管，腎臟，眼病及神經(jīng)系統(tǒng)等慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重者威脅生命，其發(fā)病率高，并發(fā)癥多，嚴(yán)重影響人們的身體健康。全世界有糖尿病患者1.25億人，我國的糖尿病患者已達(dá)4000萬人，并還有上升趨勢，世界衛(wèi)生組織將糖尿病列為世界三大疑難病之一。
當(dāng)前臨床上常用于治療糖尿病的降糖藥物主要有兩種，一種是磺脲類，一種是雙胍類。其中，磺脲類藥物主要是通過刺激胰島素分泌，從而降低血糖水平。有一種消渴丸藥物，就是目前市場上常用的治療糖尿病的藥物，其主藥成分優(yōu)降糖屬磺脲類降血糖藥。比法國施維雅藥廠生產(chǎn)的第二代藥達(dá)美康，其降糖作用高，具有劑量小、作用快、療效高、持續(xù)時(shí)間長、副作用輕等優(yōu)點(diǎn)。但是，這種藥物在人體內(nèi)有蓄積作用，這就增加了肝、腎等內(nèi)臟器官的負(fù)荷，尤其對老年人和肝、腎功能不全者，更是不適應(yīng)的，此外還易發(fā)生低血糖。鑒于糖尿病對人體健康的危害極大，而目前市場上尚無十分理想的治療糖尿病的藥物，人們一直在努力以尋求治療糖尿病的最佳途徑。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖具有一定的降血糖作用，推測其作用機(jī)理在于殼聚糖能刺激胰島β細(xì)胞合成、分泌及釋放胰島素，并降低胰島α細(xì)胞分泌胰高血糖素，同時(shí)作用于肝臟，抑制肝糖元異生和體內(nèi)糖分的吸收，減少糖輸出，并增強(qiáng)周圍組織對糖的利用而降低血糖，還可能會(huì)增加胰島素受體和葡萄糖受體，提高胰島素敏感性，加強(qiáng)生物活性，使受體后的抵抗減弱，抑制細(xì)胞內(nèi)氧化酶系統(tǒng)而致組織缺氧，增強(qiáng)葡萄糖代謝，加速其利用，從而降低血糖。
眾所周知，殼聚糖是自然界大量存在的一類天然生物多糖，無毒，具有很多生物活性，如抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等，但殼聚糖不溶于水的性質(zhì)限制了它的應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)中對殼聚糖硫酸酯(CSB)研究的主要內(nèi)容有殼聚糖硫酸酯含硫量較低，硫酸酯基含量小于33％。因殼聚糖不溶于水，很多人用非均相反應(yīng)，這就造成殼聚糖利用率很低?，F(xiàn)又有人研究，用均相反應(yīng)，但其所使用的酸溶劑為二氯乙酸。此酸溶劑價(jià)格高(94元/500ml)，雖然可增加殼聚糖的利用率，但總成本未見起色。還有人，在N2氣氛下反應(yīng)2～8h制備殼聚糖硫酸酯，其方可使殼聚糖硫酸酯的含硫酸酯基量僅達(dá)到32.7％；還有人主要研究殼聚糖硫酸酯的抗凝血活性，抗艾滋病方面應(yīng)用，而對其降血糖方面功效，還未見報(bào)道。
(三)技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的是要提供一種降血糖的海洋藥材，即一種防治糖尿病的藥物化合物——甲殼低聚糖硫酸酯和/或殼聚糖硫酸酯作為制備降血糖藥物中的應(yīng)用。由于研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖經(jīng)磺化后所得聚糖硫酸酯(CSA、CSB)衍生物，具有與肝素類似的結(jié)構(gòu)，并具有強(qiáng)聚陰離子性質(zhì)，因而引起了廣大學(xué)者的關(guān)注。因此對殼聚糖進(jìn)行化學(xué)改性和修飾，以擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，已成為當(dāng)今的熱門。本發(fā)明的防治糖尿病的藥物化合物具有與肝素類似結(jié)構(gòu)和強(qiáng)聚陰離子性質(zhì)，已研究其除了具有抗凝、抗栓和抗病毒等作用外，且對人體無毒副作用，有望在深層次研究而被開發(fā)利用，為人類造福。
本發(fā)明的任務(wù)是有以下技術(shù)方案完成的，研制了一種防治糖尿病的藥物化合物——甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)和/或殼聚糖硫酸酯(CSB)作為制備降血糖藥物中的應(yīng)用。兩該聚糖硫酸酯(CSA、CSB)可以有效量的組分與藥用載體和/或賦形劑，制成口服液，氣霧劑。
所述的兩該聚糖硫酸酯(CSA、CSB)還可用0.5％羧甲基纖維素鈉溶液配成所需濃度混懸液。
兩該聚糖硫酸酯(CSA、CSB)化合物的典型結(jié)構(gòu)式為 其中n為聚合度3～600，R1為SO3Na或H，R2為SO3Na或H或Ac，R1與R2同為H或Ac者除外；該化合物的活性基團(tuán)——硫酸酯基(OSO3-)的含量為40.73～42.21％；其中，淡黃色棉花狀的甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)分子量為1～6KD，淡黃色棉花狀的殼聚糖硫酸酯(CSB)分子量為30～100KD。
所述的甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)，其聚合度3～15；所述的殼聚糖硫酸酯(CSB)，其聚合度100～600。
所述防治糖尿病藥物的甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)的制備步驟如下(1)酯化試劑的制備一定量的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)置與三口瓶中，經(jīng)冰鹽浴冷卻后，攪拌下緩慢滴加適量氯磺酸，始終保持反應(yīng)體系溫度小于5℃；(2)稱取定量的殼聚糖原料；(3)加適量的2％乙酸溶液，將原料充分溶解；(4)將上述充分溶解的原料，放于微波爐中反應(yīng)數(shù)分鐘；(5)將上述加熱反應(yīng)的原料，用2N的NaOH溶液中和至中性，再放置一段時(shí)間；(6)將中和至中性的上述料液進(jìn)行抽濾；(7)取濾餅進(jìn)行烘干，所得的淡黃色固體物質(zhì)；再粉碎烘干的該物質(zhì)，測其分子量，該物質(zhì)即為較低分子量的甲殼低聚糖；(8)取適量上述粉碎烘干的產(chǎn)物，加入適量甲酰胺溶劑；(9)將上述混合物，攪拌均勻后，加入適量甲酸或二氯乙酸，混合均勻后；(10)再加入一定量磺化劑DMF·SO3，攪拌均勻后；(11)再在40～60℃溫度下，攪拌反應(yīng)1～2h；(12)將上述反應(yīng)液再加入3倍體積的95％乙醇，當(dāng)出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀時(shí)，放置4℃冷藏柜中沉化30min，得到的沉淀物即是甲殼低聚糖硫酸酯的粗產(chǎn)品；(13)將上述沉淀物進(jìn)行抽濾，取濾餅；(14)將上述濾餅再用水溶解，然后加2N的NaOH溶液中和至中性；(15)將上述溶液用透析袋進(jìn)行透析，除鹽后取透析液；或使用超濾方法除鹽，取截留溶液；(16)再將上述溶液，濃縮至1/10體積；(17)將上述濃縮液放于冰柜中凍結(jié)，然后冷凍干燥得淡黃色棉花狀物質(zhì)；(18)粉碎該棉花狀物質(zhì)，測定其含硫量及分子量，取符合規(guī)定的低分子量1～6KD的甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)作為防治糖尿病的藥物。
本發(fā)明的防治糖尿病藥物制備方法的甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)的制備步驟中所述的(1)中的DMF與氯磺酸的體積比為10～5∶1；所述的(3)中的2％乙酸溶液的量與(2)中殼聚糖的體積重量比為6～30∶1(V/W)；所述的(4)在微波爐中反應(yīng)到100℃，反應(yīng)時(shí)間3～6min；所述的(7)中的淡黃色固體物質(zhì)的分子量為9.21×103～3.86×104道爾頓；所述的(8)中取適量烘干產(chǎn)物與適量甲酰胺溶劑的體積重量比為15～50∶1(V/W)；所述的(9)中加入88％的濃甲酸量與(8)中的混合物的體積比為1∶3～10(V/V)；所述的(10)中加入磺化劑DMF·SO3的量為50～100ml；所述的(11)中的攪拌反應(yīng)，是在大氣氣氛下常壓反應(yīng)的；所述的(15)中的透析袋是用1和8KD的兩種膜包，所截取透析液是截留1～6KD分子量大小的產(chǎn)物。
所述防治糖尿病的藥物的殼聚糖硫酸酯(CSB)的制備步驟如下(1)酯化試劑的制備一定量的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)置與三口瓶中，經(jīng)冰鹽浴冷卻后，攪拌下緩慢滴加適量氯磺酸，始終保持反應(yīng)體系溫度小于5℃；(2)取適量殼聚糖原料，加入適量甲酰胺溶劑；(3)將上述混合物，攪拌均勻后，加入適量甲酸或二氯乙酸，混合均勻后；(4)再加入一定量磺化劑DMF·SO3，攪拌均勻后；在40～60℃溫度下，攪拌反應(yīng)1～2h；(5)將上述反應(yīng)液再加入3倍體積的95％乙醇，當(dāng)出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀時(shí)，放置4℃冷藏柜中沉化30min，得到的沉淀物即是殼聚糖硫酸酯的粗產(chǎn)品；(6)將上述沉淀物進(jìn)行抽濾，取濾餅；(7)將上述濾餅再用水溶解，然后加2N的NaOH溶液中和至中性；(8)將上述溶液用透析袋進(jìn)行透析，除鹽后取透析液；或使用超濾方法除鹽取截留溶液；(9)再將上述溶液，濃縮至1/10體積；(10)將上述濃縮液放于冰柜中凍結(jié)，然后冷凍干燥得淡黃色棉花狀物質(zhì)——?dú)ぞ厶橇蛩狨?CSB)；(11)粉碎該棉花狀物質(zhì)，測定其含硫量及分子量，取符合規(guī)定分子量30～100KD的殼聚糖硫酸酯(CSB)作為防治糖尿病的藥物。
本發(fā)明的防治糖尿病藥物的制備方法中的殼聚糖硫酸酯(CSB)的制備步驟中，所述的(1)中DMF與氯磺酸的體積比為10～5∶1；所述的(2)中的取適量殼聚糖原料的量與適量甲酰胺溶劑的比為15～50∶1(V/W)；所述的(3)中加入88％濃甲酸量為3～10ml；所述的(4)中加入磺化劑DMF·SO3的量為50～100ml其中的攪拌反應(yīng)是在大氣氣氛下常壓反應(yīng)的；所述的(8)中所用的透析袋是用截留分子量最低限為1.2KD的透析袋，進(jìn)行透析脫鹽。
本發(fā)明的甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)和/或殼聚糖硫酸酯(CSB)作為制備降血糖海洋藥物的應(yīng)用是本發(fā)明的重要保護(hù)范圍。
所述的甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)和/或殼聚糖硫酸酯(CSB)可以有效量的組分與藥用載體和/或賦形劑，制成口服液，氣霧劑。
所述的甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)和/或殼聚糖硫酸酯(CSB)還可用0.5％羧甲基纖維素鈉溶液配成所需濃度混懸液。
本發(fā)明的防治糖尿病的藥物化合物，其包括甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)和/或殼聚糖硫酸酯(CSB)，這兩種防治糖尿病藥物的試驗(yàn)積極效果如下(A)甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)的毒理學(xué)試驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，體重18-22克，雌雄各半，由山東省新藥藥理研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，合格證號970102飼養(yǎng)條件室溫18-22℃，小鼠每籠5只，自由攝水?dāng)z食，飼料為顆粒鼠料，由山東省新藥藥理研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。
試驗(yàn)方法預(yù)試驗(yàn)表明，本品毒性較低，難以測出LD50，故進(jìn)行其小鼠一日內(nèi)最大耐受量測定。
2.給藥方式2.1i.g給藥樣品甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)溶液配制25g/100ml，給藥量0.4ml/10g，取健康昆明種小鼠20只，雌雄各半，試驗(yàn)前12小時(shí)禁食不禁水，第二日按0.4ml/10g體重i.gCSA混懸液，于8:00am ig一次，藥后立即觀察動(dòng)物反應(yīng)情況，并記錄動(dòng)物行為活動(dòng)、呼吸、精神狀態(tài)、大小便性狀及顏色、被毛、鼻、眼、口腔分泌物和死亡情況，連續(xù)觀察7天。
2.2i.p給藥選擇樣品CSA，配制溶液濃度12.5g/100ml，給藥量0.2ml/10g，取健康昆明種小鼠20只，雌雄各半，試驗(yàn)前12小時(shí)禁食不禁水，第二日按0.2ml/10g體重i.p混懸液，于8:00am i.p一次，藥后立即觀察動(dòng)物反應(yīng)情況，并記錄動(dòng)物行為活動(dòng)、呼吸、精神狀態(tài)、大小便性狀及顏色、被毛、鼻、眼、口腔分泌物和死亡情況，連續(xù)觀察7天。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1.CSA.ig給藥后小鼠行為活動(dòng)、呼吸、精神狀態(tài)、大小便性狀及顏色、被毛、鼻、眼、口腔等均未見明顯異常，連續(xù)觀察7天未見明顯變化，第7天處死并剖檢部分小鼠，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等主要臟器均無肉眼可見異常。表明CSA小鼠ig給藥的一日最大耐受量大于10g/kg，本品一次用藥無明顯毒性作用。
3.2.CSA i.p給藥后小鼠活動(dòng)立即增加，十分鐘后動(dòng)物逐漸出現(xiàn)扭體，活動(dòng)減少，一小時(shí)后扭體癥狀消失，動(dòng)物開始出現(xiàn)俯臥，閉目不動(dòng)，直至藥物后八小時(shí)仍少動(dòng)，藥后第二天動(dòng)物恢復(fù)正常。連續(xù)觀察7天未見明顯變化，第7天處死并剖檢部分小鼠，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等主要臟器均無肉眼可見異常。表明CSA小鼠i.p給藥的一日最大耐受量大于2.5g/kg，本品一次用藥無明顯毒性作用。
該樣品的原料殼聚糖天然無毒，具有生物相容性并在體內(nèi)降解，經(jīng)磺化引入SO42-，結(jié)構(gòu)類似肝素，與其它含SO42-的天然多糖一樣，其毒副作用小。經(jīng)過我們的實(shí)驗(yàn)證明CSA毒副作用小，可見甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)作為新藥開發(fā)是可行的。
(B)殼聚糖硫酸酯(CSB)(CSB)的降血糖試驗(yàn)11.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，體重24-28克，雌雄各半，由山東省新藥藥理研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，合格證號9701022.主要藥品試劑及設(shè)備淡黃色粉末CSA用0.5％羧甲基纖維素鈉溶液配成所需濃度混懸液。Lab-500型全自動(dòng)生化分析法，由南京桃園應(yīng)用生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。血糖試劑盒(葡萄糖氧化酶法)，由北京中生生物工程高技術(shù)公司生產(chǎn)，批號981129。
3.試驗(yàn)分組及高血糖癥造型取小鼠6組，各組小鼠經(jīng)尾靜脈注射四氧嘧啶70mg/kg造成高血糖模型，72h后測定空腹血糖水平。結(jié)果表明，四氧嘧啶可造成小鼠血糖顯著升高。然后分別給藥igCSA、CSB 300mg/kg和1000mg/kg，陽性對照組消渴丸組1250mg/kg，陰性對照組給等體積的0.5％羧甲基纖維素鈉溶液。分別與給藥后2、4、6、12和24h測定血糖水平，甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)能明顯抑制四氧嘧啶所致小鼠血糖升高，見表1表1殼低聚糖硫酸酯對四氧嘧啶所致小鼠高血糖的影響
注x±s，n＝10，各對照組比較，*1p＜0.001，*2p＜0.01從上表可以看出，甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)低高劑量組對四氧嘧啶所致的小鼠高血糖有明顯的抑制作用，高劑量組比低劑量組抑制率高，說明高低劑量組之間有明顯的量效關(guān)系。它們抑制血糖的效果要比對照組消渴丸好，抑制率比消渴丸高。高分子量殼聚糖硫酸酯(CSB)由表中可以看出，它的降血糖效果比低分子量殼聚糖硫酸酯(CSB)的效果好，也表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。說明分子量是影響降血糖活性的一重要因素。
四氧嘧啶能選擇性地破壞胰島β細(xì)胞，而殼聚糖硫酸酯(CSB)對四氧嘧啶所致的血糖升高有明顯的抑制作用，這表明殼聚糖硫酸酯(CSB)可能減弱四氧嘧啶對胰島β細(xì)胞的損傷或改善受損傷的β細(xì)胞的功能。從而具有抗四氧嘧啶所致血糖升高的效果。
(C)甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)的調(diào)節(jié)血糖試驗(yàn)21.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，體重200-300克，雌雄各半。由山東省新藥藥理中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，合格證號9701022.試驗(yàn)分組及高血糖癥造型將小鼠隨機(jī)分成6組，每組10只。陽性對照組ig優(yōu)降糖25mg/kg，陰性對照組給等體積的0.5％羧甲基纖維素鈉溶液，其余四組分別ig CSA、CSB300mg/kg和1000mg/kg。與給藥后4h，各組小鼠ip腎上腺素0.02mg/kg，于注射后1h斷頭取血測血糖。結(jié)果表明甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)300mg/kg和1000mg/kg可明顯抑制腎上腺素的升高血糖作用，見表2。表2殼聚糖硫酸酯(CSB)對腎上腺素引起血糖升高的影響
從上表可以看出，甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)低高劑量組對腎上腺素所致的小鼠高血糖有明顯的抑制作用，高劑量組比低劑量組抑制率高，說明高低劑量組之間有明顯的量效關(guān)系。它們抑制血糖的效果要比對照組優(yōu)降糖好，抑制率比優(yōu)降糖高。由表中還可以看出高分子量殼聚糖硫酸酯(CSB)降血糖效果比低分子量甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)效果好，也表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。說明分子量是影響降血糖活性的一重要因素。腎上腺素能促進(jìn)肝糖原和肌糖原的分解而引起血糖升高，甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)能拮抗腎上腺素的升血糖作用，可能與抑制糖原分解有關(guān)。
本發(fā)明所述甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)的制備步驟(9)中與所述殼聚糖硫酸酯(CSB)的制備步驟(3)中所加入的酸溶劑都是88％的濃甲酸(本發(fā)明的實(shí)施例中優(yōu)選使用88％的濃甲酸5ml)。使用該酸溶劑時(shí)不用除水及其它雜質(zhì)，簡化了工藝程序，節(jié)約了干燥成本。選擇甲酸還由于甲酸的價(jià)格(10元/500ml)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于二氯乙酸(94元/500ml)，用此酸溶劑所進(jìn)行的均相反應(yīng)，所得產(chǎn)物的含硫量和產(chǎn)率均與用二氯乙酸相當(dāng)，其性格價(jià)能比大大提高了。在本領(lǐng)域技術(shù)中使用甲酸作為酸溶劑還未見有報(bào)道。
本發(fā)明所述甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)的制備步驟(11)中與所述殼聚糖硫酸酯(CSB)的制備步驟(4)中的攪拌反應(yīng)，是在大氣氣氛下常壓進(jìn)行反應(yīng)的。此項(xiàng)改進(jìn)與前人“在N2氣氛下反應(yīng)2～8h”的技術(shù)相比，其方法更簡單易行，而且節(jié)省了能源。
綜上所述，本發(fā)明的防治糖尿病的藥物化合物的兩種聚糖硫酸酯(CSA、CSB)的活性含硫量高，殼聚糖原料利用率也高；所用制備材料與前人所用的相比，性能價(jià)格比高。兩種聚糖硫酸酯(CSA、CSB)首次作為降血糖的海洋藥物方面的應(yīng)用。由于受活性基團(tuán)硫酸酯基及其分子量的影響，該防治糖尿病的藥物化合物在抗血糖、調(diào)血脂、增強(qiáng)免疫力、抗凝血等方面顯示出的活性。本防治糖尿病的藥物化合物的制備方法采用均相反應(yīng)，簡單易行，操作成本低，污染少，原料利用率高。
(四)附圖及其實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于以下實(shí)施例中。
本發(fā)明的實(shí)施例結(jié)合附圖進(jìn)一步說明如下

圖1為殼聚糖原料的紅外光譜圖。
圖2為殼聚糖硫酸酯的紅外光譜圖。
圖3為殼低聚糖硫酸酯的13C-NMR圖譜。
本發(fā)明防治糖尿病的海洋藥物的制備方法實(shí)施例如下I、甲殼低聚糖硫酸酯的制備實(shí)施例①.酯化試劑的制備采用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)為反應(yīng)介質(zhì)制備磺化試劑——DMF·SO3(二甲基甲酰胺—氯磺酸)磺化劑。向裝有攪拌裝置的三口燒瓶中加入50mlN，N-二甲基甲酰胺，置于冰鹽水浴中。在攪拌狀態(tài)下，滴加一定體積氯磺酸，控制滴加的速度，使反應(yīng)體系的溫度保持在5℃以下。滴加完畢后在室溫下繼續(xù)攪拌一定時(shí)間，使磺化試劑更為安全有效。氯磺酸加入量如表3表3DMF與氯磺酸的比例對磺化劑狀態(tài)的影響
由上表可知，本實(shí)驗(yàn)選擇DMF與氯磺酸的比為10～5∶1均可，但5∶1效果最佳。
②.微波作用下殼聚糖的降解，制備如下(1)取2～5g上述粉碎烘干的產(chǎn)物，加入30～150ml甲酰胺溶劑；(2)將上述混合物，攪拌均勻后，加入3～10ml甲酸或二氯乙酸，混合均勻后；(3)再加入50～100ml磺化劑DMF·SO3，攪拌均勻后；(4)再在40～60℃溫度下，攪拌反應(yīng)1～2h；(5)將上述反應(yīng)液再加入3倍體積的95％乙醇，當(dāng)出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀時(shí)，放置4℃冷藏柜中沉化30min；(6)將上述沉淀物進(jìn)行抽濾，取濾餅；(7)將上述濾餅再用水溶解，然后加2N的NaOH溶液中和至中性；(8)將上述溶液用透析袋進(jìn)行透析，除鹽后取透析液；或使用超濾方法除鹽，取截留溶液；(9)再將上述溶液，濃縮至1/10體積；(10)將上述濃縮液放于冰柜中凍結(jié)，然后冷凍干燥得淡黃色棉花狀物質(zhì)；(11)粉碎該棉花狀物質(zhì)，測定其含硫量及分子量，取符合規(guī)定的低分子量1～6KD的甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)作為防治糖尿病的藥物。④制取本發(fā)明的兩種聚糖硫酸酯(CSA，CSB)的條件見表5、6表5在二氯乙酸作用下甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)制備條件及結(jié)果
表6在甲酸作用下甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)制備條件及結(jié)果
由上兩表可知，甲酸作為溶劑效果與二氯乙酸作為酸溶劑效果相當(dāng)，某種程度來講稍微好些，且甲酸價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于二氯乙酸，因此用性價(jià)比來衡量，甲酸優(yōu)于二氯乙酸。
II、殼聚糖硫酸酯(CSB)的制備實(shí)施例①.酯化試劑的制備與甲殼低聚糖硫酸酯中酯化試劑的制備相同。
②.高分子量的殼聚糖硫酸酯(CSB)的制備，制備步驟如下(1)取2～5g殼聚糖原料，加入30～150ml甲酰胺溶劑；將上述混合物，攪拌均勻后，加入3～10ml甲酸或二氯乙酸，混合均勻后；(2)再加入50～100ml磺化劑DMF·SO3，攪拌均勻后；(3)再在40～60℃溫度下，攪拌反應(yīng)1～2h；(4)將上述反應(yīng)液再加入3倍體積的95％乙醇，當(dāng)出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀時(shí)，放置4℃冷藏柜中沉化30min，得到的沉淀物即是殼聚糖硫酸酯的粗產(chǎn)品；
(5)將上述沉淀物進(jìn)行抽濾，取濾餅；(6)將上述濾餅再用水溶解，然后加2N的NaOH溶液中和至中性；(7)將上述溶液用透析袋進(jìn)行透析，除鹽后取透析液；或使用超濾方法除鹽取截留溶液；(8)再將上述溶液，濃縮至1/10體積；(9)將上述濃縮液放于冰柜中凍結(jié)，然后冷凍干燥得淡黃色棉花狀物質(zhì)——?dú)ぞ厶橇蛩狨?CSB)；(10)粉碎該棉花狀物質(zhì)，測定其含硫量及分子量，取符合規(guī)定分子量30～100KD的殼聚糖硫酸酯(CSB)作為防治糖尿病的藥物。
制取的甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)條件見表7、8表7在二氯乙酸作用下甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)制備條件及結(jié)果
表8在甲酸作用下甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)制備條件及結(jié)果
由上兩表可知，甲酸作為溶劑效果與二氯乙酸作為酸溶劑效果相當(dāng)，某種程度來講稍微好些，且甲酸價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于二氯乙酸，因此用性能價(jià)格比來衡量，甲酸優(yōu)于二氯乙酸。
④.殼聚糖硫酸酯(CSB)的圖譜分析(1).殼聚糖硫酸酯(CSB)的紅外光譜圖分析結(jié)果由圖1殼聚糖原料的紅外光譜看出，3435cm-1是亞胺基伸縮振動(dòng)，2917cm-1和2874cm-1分別是-CH3，-CH2的伸縮振動(dòng)，1659，1597cm-1是酰胺I帶，酰胺II帶，1379cm-1是-CH2的面外彎曲振動(dòng)，1076cm-1是醚鍵(c-o-c)的伸縮振動(dòng)，此外，897cm-1，930cm-1，750cm-1處吸收弱，說明殼聚糖是以β-1.4糖苷鍵連結(jié)的多聚物，紅外光譜結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致(李繼珩，1997；王轉(zhuǎn)花，1997；周赤，1996)。
磺酸化產(chǎn)物IR見圖2，與圖1比較，在3429cm-1，2923cm-1，1629cm-1，1535cm-1，1062cm-1出現(xiàn)了殼聚糖骨架的特征峰，而在1257cm-1，803cm-1，1383cm-1處出現(xiàn)三個(gè)峰，分別是Vs(s＝0)，V(s-o-c)和Vas(s＝0)，紅外光譜與參考文獻(xiàn)圖譜一致(A.M.Naggi，1985)，證明反應(yīng)后在殼聚糖分子上引入了硫酸基團(tuán)。
(2).殼聚糖硫酸酯(CSB)的13C-NMR光譜分析結(jié)果從圖3看出，在殼聚糖的C6位引入硫酸酯基(-OSO3-)后，由于硫酸酯基的去屏蔽作用使C6的化學(xué)位移由62.85ppm明顯向低場漂移至69.3ppm，C3的化學(xué)位移由75.3ppm明顯向低場漂移至78.1ppm，C2的化學(xué)位移由56.7ppm明顯向低場漂移至58.2ppm，表明此反應(yīng)已成功的將硫酸酯基引入到殼聚糖上，在100.45ppm，77.78ppm，75.40ppm，處分別出現(xiàn)C-1，C-4，C-5信號，此三位點(diǎn)化學(xué)位移幾乎不變。
權(quán)利要求
1.甲殼低聚糖硫酸酯和/或殼聚糖硫酸酯作為制備降血糖藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述甲殼低聚糖硫酸酯和/或殼聚糖硫酸酯作為制備降血糖藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的甲殼低聚糖硫酸酯和/或殼聚糖硫酸酯可以有效量的組分與藥用載體和/或賦形劑，制成口服液，氣霧劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述甲殼低聚糖硫酸酯和/或殼聚糖硫酸酯作為制備降血糖藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的甲殼低聚糖硫酸酯和/或殼聚糖硫酸酯還可用0.5％羧甲基纖維素鈉溶液配成所需濃度混懸液。
全文摘要
本發(fā)明是一種甲殼低聚糖硫酸酯和/或殼聚糖硫酸酯作為制備降血糖藥物中的應(yīng)用。該防治糖尿病的藥物化合物，其包括甲殼低聚糖硫酸酯(CSA)和/或殼聚糖硫酸酯(CSB)。兩該化合物的典型結(jié)構(gòu)式為右式,其中n為聚合度3～600，R
文檔編號A61P3/00GK1471921SQ0313878
公開日2004年2月4日 申請日期2003年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月5日
發(fā)明者李鵬程, 邢榮娥, 劉松, 于華華 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所