專利名稱：抑制sars病毒基因表達(dá)的反義核酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反義技術(shù)領(lǐng)域，具體的本發(fā)明涉及具有抑制SARS病毒及SARS病毒基因表達(dá)的反義核酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
反義寡脫氧核苷酸(AS ODN)是上世紀(jì)七十年代發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，自1989年以來(lái)，已有數(shù)百個(gè)反義ODN抑制各種基因表達(dá)和應(yīng)用的專利。
1998年在美國(guó)有第一個(gè)反義ODN藥物獲FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床實(shí)際使用。其作用原理主要有二個(gè)1.反義ODN進(jìn)入細(xì)胞后，與其靶蛋白質(zhì)mRNA的靶位點(diǎn)序列反向互補(bǔ)結(jié)合。這種結(jié)合抑制了核糖體在mRNA上的移動(dòng)，從而抑制了靶蛋白質(zhì)的生物合成。2.反義ODN是脫氧核糖核酸，mRNA為核糖核酸，故它們形成的雙鏈為DNA與RNA的雜交雙鏈。細(xì)胞內(nèi)源的核糖核酸酶H專一性剪切這種雜交雙漣中的RNA鏈。mRNA核糖核酸鏈被切斷后，翻譯無(wú)法進(jìn)行，靶蛋白質(zhì)生物合成被抑制。另外，小分子干擾核糖核酸(SiRNA)可與病毒的mRNA結(jié)合，從而阻斷病毒的翻譯，抑制靶蛋白的表達(dá)。它是一個(gè)成熟的技術(shù)。
傳染性非典型肺炎即嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe AcuteResplratolySyndrome)是由SARS病毒感染所引起的，它正在嚴(yán)重危害我國(guó)和世界多國(guó)人民的身體健康，也正在嚴(yán)重干擾我國(guó)經(jīng)濟(jì)的正常開展。它已成為當(dāng)前我國(guó)一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)、政治、經(jīng)濟(jì)問題。對(duì)于SARS病毒，目前還沒有有效的治療和/或預(yù)防SARS病毒所引起的非典型肺炎及相關(guān)疾病的藥物。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)治療和/或預(yù)防SARS病毒所引起的非典型肺炎及相關(guān)疾病的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供在翻譯水平抑制SARS病毒重要蛋白質(zhì)表達(dá)的反義核酸，包括反義ODN和SiRNA，它可用于制備治療和/或預(yù)防由SARS病毒引起的非典型肺炎及相關(guān)疾病的藥物。
本發(fā)明的第一方面，提供一種反義核酸，所述反義核酸特異性地與SARS病毒的RNA的一部分相結(jié)合，所述反義核酸為RNA或DNA分子，且能有效地抑制SARS病毒基因的表達(dá)。
在一優(yōu)選例中，所述反義核酸包括選自SEQ NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26(本發(fā)明文件中用SEQ NO1到SEQ NO26表示)所示的任意一條核苦酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述反義核酸為選自SEQ NO1到SEQ NO26所示的任意一條核昔酸序列。
優(yōu)選的，所述反義核酸為硫代反義寡脫氧核苷酸或小分子干擾核糖核酸。
在另一優(yōu)選例中，所述反義核酸包括選自SEQ NO1到SEQ NO26所示的任意兩條以上的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述反義核酸為選自SEQ NO1到SEQ NO26所示的任意兩條或三條核苷酸序列。
本發(fā)明的第二方面，提供了本發(fā)明所述的反義核酸的應(yīng)用，其特征在于該反義核酸在制備治療和/或預(yù)防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第三方面，提供了一種組合物，其特征在于，它包括安全有效量的本發(fā)明所述的反義核酸分子以及藥學(xué)上可接受的載體。該反義核酸分子包含SARS病毒特異性反義區(qū)域，能夠特異性的結(jié)合到SARS病毒所表達(dá)的部分RNA上，其中所述的反義分子能夠有效降低的SARS病毒表達(dá)，從而在體內(nèi)或體外使SARS病毒RNA序列失活。
在一優(yōu)選例中，所述的反義核酸為選自SEQ NO1到SEQ NO26所示的任意一條核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的反義核酸為選自SEQ NO1到SEQ NO26所示的任意兩條或三條核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的反義核酸為硫代反義寡脫氧核苦酸或小分子干擾核糖核酸。


圖1.針對(duì)E基因的AS ODN的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖2.針對(duì)M基因的AS ODN的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖3.針對(duì)N基因的AS ODN的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖4.RT-PCR循環(huán)圈數(shù)的確定。
A.電泳圖譜B.RT PCR循環(huán)數(shù)與DNA產(chǎn)量的關(guān)系曲線。
圖5.針對(duì)SARS病毒N、M、E基因的AS ODN的篩選A.針對(duì)N基因的10、17、62、63號(hào)AS ODN的篩選。
B.針對(duì)N基因的64、65號(hào)AS ODN的篩選。
C.針對(duì)M基因的8、15、55、56、57號(hào)AS ODN的篩選D.針對(duì)E基因的19、51號(hào)AS ODN的篩選圖6.針對(duì)protein N基因的62號(hào)AS ODN的量效關(guān)系A(chǔ).針對(duì)protein N基因的62號(hào)AS ODN的量效關(guān)系。62號(hào)AS ODN的濃度依次為2uM、10uM、30uM、50uM。N基因表達(dá)載體用量為0.8ug/孔(24孔細(xì)胞培養(yǎng)板)。
B.針對(duì)protein N基因的62號(hào)AS ODN的量效關(guān)系曲線。抑制效果達(dá)到50％時(shí)AS ODN濃度為5.0uM。
圖7.針對(duì)protein N基因的63號(hào)AS ODN的量效關(guān)系A(chǔ).針對(duì)protein N基因的63號(hào)AS ODN的量效關(guān)系。63號(hào)AS ODN的濃度依次為2uM、10uM、30uM、50uM。N基因表達(dá)載體用量為0.8ug/孔(24孔細(xì)胞培養(yǎng)板)。
B.針對(duì)protein N基因的63號(hào)AS ODN的量效關(guān)系曲線。抑制效果達(dá)到50％時(shí)AS ODN濃度為15.6uM。
圖8針對(duì)protein E基因的19號(hào)AS ODN的量效關(guān)系A(chǔ).針對(duì)protein E基因的19號(hào)AS ODN的量效關(guān)系。
B.針對(duì)protein E基因的19號(hào)AS ODN的量效關(guān)系曲線。抑制效果達(dá)到50％時(shí)AS ODN濃度為5.6uM。
圖9針對(duì)protein E基因的51號(hào)AS ODN的量效關(guān)系
A.針對(duì)protein E基因的51號(hào)AS ODN的量效關(guān)系。
B.針對(duì)protein E基因的51號(hào)AS ODN的量效關(guān)系曲線。抑制效果達(dá)到50％時(shí)AS ODN濃度為4.4uM。
圖10針對(duì)protein M基因的8號(hào)AS ODN的量效關(guān)系A(chǔ).針對(duì)protein M基因的8號(hào)AS ODN的量效關(guān)系。
B.針對(duì)proteinM基因的8號(hào)AS ODN的量效關(guān)系曲線。抑制效果達(dá)到50％時(shí)AS ODN濃度為4.5uM。
圖11針對(duì)protein M基因的56號(hào)AS ODN的量效關(guān)系A(chǔ).針對(duì)protein M基因的56號(hào)AS ODN的量效關(guān)系。
B.針對(duì)protein M基因的56號(hào)AS ODN的量效關(guān)系曲線。抑制效果達(dá)到50％時(shí)AS ODN濃度為10.7uM。
圖12 siRNA(No.8及No.19)抑制M及E基因的表達(dá)。
A.8號(hào)siRNA抑制M基因表達(dá)；B.19號(hào)siRNA抑制E基因表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
SARS病毒RNA編碼多個(gè)蛋白質(zhì)基因。其中，M蛋白、E蛋白、N蛋白均為SARS病毒所特有，人細(xì)胞中無(wú)替代其功能的其他蛋白質(zhì)存在。如能抑制這些蛋白質(zhì)中的任何一個(gè)，SARS病毒的生長(zhǎng)周期即不能完成，病毒生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制。
通過對(duì)SARS病毒RNA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算機(jī)模擬，發(fā)明人在M、N、E蛋白編碼區(qū)內(nèi)(二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬圖見附圖)和在負(fù)鏈RNA中選取下列位點(diǎn)(見表1)，合成這些片斷，測(cè)定這些反義ODN在vero-E6細(xì)胞中抑制SARS病毒M、N、E蛋白的表達(dá)，并進(jìn)行量效關(guān)系實(shí)驗(yàn)及SiRNA抑制SARS病毒的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。

(表1)如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“‘反義”是指反義核酸(DNA或RNA)和其類似物，也指一系列化學(xué)物種，這些化學(xué)物種具有一系列核苷酸堿基序列，能通過與SARS病毒的核苷酸堿基氫鍵相互作用識(shí)別SARS病毒序列或其部分序列。
這些RNA或DNA類似物包括但不限于2’-O-烷基糖修飾、甲基磷酸脂、硫代磷酸酯、二磷酸酯、甲縮醛(formacetal)、3’-硫代甲縮醛(3’-thioformacetal)、砜、氨基磺酸酯和硝基骨架修飾、氨基化合物和其中堿基部分已被修飾的類似物。而且，分子的類似物可以為多聚物，其中的核糖或脫氧核糖部分已被其它合適的部分修飾或替換，產(chǎn)生的多聚物包括但不限于嗎琳代類似物和肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)及其它類似物。這些類似物包括上述修飾的不同組合，包含連接基團(tuán)和/或糖或堿基的結(jié)構(gòu)修飾來(lái)改進(jìn)RNaseH介導(dǎo)的SARS病毒RNA的破壞、結(jié)合親和力、核酸酶抗性和/或其特異性。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“反義核酸”、“反義ODN”、“AS ODN”、“反義核酸分子”或“反義分子”可互換使用，它們都指具有抑制SARS病毒表達(dá)的反義核苷酸序列(SEQ ID NO1到SEQ ID NO26)的多核苷酸(DNA)，它們包括反義寡脫氧核苷酸和硫代反義寡脫氧核苷酸?！靶》肿痈蓴_核糖核酸”、“siRNA”、“反義核酸分子”、“反義核酸”或“反義分子”也可互換使用，它們都指具有抑制SARS病毒表達(dá)的反義核苷酸序列(SEQ ID NO1到SEQ ID NO26)的多核苷酸(RNA)。
在治療應(yīng)用中，本發(fā)明的反義核酸能夠根據(jù)不同給藥方式配成制劑，包括口服、局部或局部化給藥。技術(shù)和配方通常在最新版的Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa中可以找到?；钚越M分為反義分子，其通常結(jié)合著一種載體如稀釋的賦形劑，包括裝填物、補(bǔ)充劑、接合劑、潤(rùn)濕劑、分解質(zhì)、表面活性劑、可降解的多聚物或潤(rùn)滑劑、依賴于給藥模式的性質(zhì)和配藥形式。典型的配藥形式包括藥片、藥粉，藥粒和膠囊，液體制劑包括懸浮液、乳化液和溶液。
本發(fā)明的反義核酸特別適合于口服給藥，這在常規(guī)的藥物傳送條件下需要在將藥暴露于胃酸條件下長(zhǎng)達(dá)4小時(shí)，當(dāng)以持續(xù)釋放的形式呈遞時(shí)，能夠長(zhǎng)達(dá)12小時(shí)。將這些反義核酸配成以持續(xù)釋放形式的制劑對(duì)于治療非典型肺炎和由SARS病毒引起的疾病非常有利。
還可以通過跨粘膜或經(jīng)皮方法獲得反義核酸系統(tǒng)給藥，或口服復(fù)合物。對(duì)于跨粘膜或經(jīng)皮給藥，適合于穿透屏障的滲透劑可以被用于制劑中。這些滲透劑在本領(lǐng)域中通常是已知的，包括，例如用于跨粘膜給藥的膽酸鹽和梭鏈孢酸衍生物。此外，去垢劑可以被用來(lái)協(xié)助透過?？缯衬そo藥，例如可以是通過用鼻腔噴霧，以及適合于吸入或栓劑給藥的制劑。鼻腔噴霧制劑可用于治療和/或預(yù)防非典型肺炎和由SARS病毒引起的疾病。
本發(fā)明的反義核酸分子也能夠與適于被試者施用的可藥用載體結(jié)合。合適的藥物載體的例子為各種陽(yáng)離子脂質(zhì)體，包括但不限于N-(1-2，3-二油基氧)丙基-n，n，n-三甲基銨氯(N-(1-2，3-dioleyloxy)ProPyl)-n，n，n-trimethylammonium chloride)(DOTMA)和二油?；字峄掖及?dioleoylphophotidyl ethanolamine)(DOPE)。脂質(zhì)體也是本發(fā)明的反義分子的合適載體。其它合適的載體為包含所要求的反義分子的緩釋凝膠或聚合體。
反義核酸可以通過任何有效途徑施用給病人，包括肌肉注射、靜脈內(nèi)注射、胸內(nèi)注射、鼻內(nèi)注射、腹膜注射、皮下注射、和口服給藥?？诜o藥需要腸衣以保護(hù)所要求的反義分子和其類似物在胃腸道中不被降解。反義核酸分子可以與一定量的生理上可接受的載體和稀釋劑混合，例如鹽溶液或其它合適的液體。
任何所施用的特定反義核酸分子的實(shí)際用量依賴于很多因素，如疾病或感染的類型和階段、反義分子對(duì)體內(nèi)其它細(xì)胞的毒性、其被細(xì)胞吸收的速率、施用核酸分子的病人的年齡和體重。通過常規(guī)方法例如逐漸增加反義分子的劑量使其從對(duì)抑制細(xì)胞增殖無(wú)效到有效，可以確定病人的有效量。呈遞給疾病細(xì)胞的濃度范圍從約0.1μM到約30μM都能夠有效抑制基因表達(dá)并表現(xiàn)出可檢測(cè)的表型。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1反義ODN的合成用Bechman Oligo 1000M合成儀合成表一所示的硫代反義ODN及作為通用對(duì)照的N20(隨機(jī)合成的脫氧寡核苷酸(20nt))。用ParmaciaFPLC純化硫代反義ODN(分子篩柱)。
實(shí)施例2反義ODN在vero-E6細(xì)胞中抑制SARS病毒M、N、E蛋白的表達(dá)1.方法(1)SARS病毒M、N、E基因表達(dá)載體的構(gòu)建SARS病毒北京1號(hào)株RNA(北京CDC提供)，經(jīng)RT-PCR后克隆入商用載體pcDNA3.1(購(gòu)自INVITROGEN公司)而得。
(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
a.轉(zhuǎn)染前一天于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔接種0.5-2×105個(gè)Vero-E6細(xì)胞，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)過夜。至轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞鋪滿孔面積的95％。
b.SARS病毒M、N、E蛋白表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑，按其操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。具體用量為每孔細(xì)胞加靶基因載體0.8ug，Lipofectamine2000 2μl。靶基因轉(zhuǎn)染后一個(gè)小時(shí)將反義ODN或?qū)φ誑20直接加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，篩選時(shí)其用量為每孔50uM。
c.6小時(shí)后補(bǔ)加胎牛血清至終濃度為10％。于5％CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)至24小時(shí)后檢測(cè)。
(3)RT-PCR檢測(cè)a.轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，除去培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS緩沖液清洗細(xì)胞一次。
b.用Trizol Reagent(GIBCO)抽提細(xì)胞總RNA溶于30μl水(不含RNA酶，RNase free)中。用RNase free的DNase于37℃消化30分鐘，
然后于60℃處理10分鐘將DNase熱滅活。
c.用TaKaRa的One step RNAPCR kit對(duì)抽提的總RNA，取5μl為模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，以確定AS ODN的抑制效果并進(jìn)行篩選。
RT-PCR條件如下50℃，30min；94℃，2min； 72℃，10min反應(yīng)總體積為50μl。
d.RT-PCR循環(huán)數(shù)的確定以M基因?yàn)闃颖荆?4孔板中轉(zhuǎn)入0.8μg M基因的表達(dá)載體。24小時(shí)后抽總RNA溶于30μl水(RNase free)中。取5μl為模板，如上條件做RT-PCR。分別于20、25、26、27、28、29、32、34個(gè)循環(huán)處取樣20μl進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。由圖1可得，取28個(gè)循環(huán)做RT-PCR能較真實(shí)的反應(yīng)模板量。
e.反義ODN對(duì)基因表達(dá)抑制率的計(jì)算方法 其中A為加藥組靶mRNA RT-PCR條帶的灰度；A’為加藥組作為RT-PCR對(duì)照的β-actine mRNA RT-PCR條帶的灰度；B為對(duì)照組靶mRNA RT-PCR條帶的灰度；B’為對(duì)照組作為RT-PCR對(duì)照的β-actinemRNA RT-PCR條帶的灰度。
2.結(jié)果表2抑制效率＜30％的AS ODN

表3抑制效率＞30％的AS ODN

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(僅顯示抑制效率大于30％的AS ODN，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表3)a.針對(duì)proteinN基因的AS ODN的篩選圖5A是針對(duì)N基因的10、17、62、63號(hào)AS ODN的篩選。N20為隨機(jī)合成的脫氧寡核苷酸(20nt)，作為對(duì)照。N基因表達(dá)載體與ASODN共轉(zhuǎn)染的各做兩組看其重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示10、63號(hào)AS ODN的表達(dá)載體中基本上無(wú)對(duì)應(yīng)proteinN基因的條帶，62號(hào)AS ODN的表達(dá)載體中有一組有微弱的對(duì)應(yīng)protein N基因的條帶。圖5B是針對(duì)N基因的64、65號(hào)AS ODN的篩選。64、65號(hào)AS ODN的表達(dá)載體中有較微弱的對(duì)應(yīng)protein N基因的條帶。
b.針對(duì)M基因的AS ODN的篩選圖5C是針對(duì)protein M基因的8、15、55、56、57號(hào)AS ODN的篩選。它們的表達(dá)載體中基本上無(wú)對(duì)應(yīng)protein M基因的條帶。
c.針對(duì)protein E基因的AS ODN的篩選圖5D是針對(duì)protein E基因的19、51號(hào)AS ODN的篩選。它們的表達(dá)載體中基本上無(wú)對(duì)應(yīng)protein E基因的條帶。
實(shí)施例3針對(duì)protein N基因的62號(hào)AS ODN的量效關(guān)系62號(hào)AS ODN的濃度依次為2μM、10μM、30μM、50μM。N基因表達(dá)載體用量為0.8μg/孔(24孔細(xì)胞培養(yǎng)板)。方法同實(shí)施例1。圖6A是針對(duì)protein N基因的62號(hào)AS ODN的量效關(guān)系。圖6B是針對(duì)protein N基因的62號(hào)AS ODN的量效關(guān)系曲線。
抑制效果達(dá)到50％時(shí)62號(hào)AS ODN濃度為5.0μM。
實(shí)施例4針對(duì)protein N基因的63號(hào)AS ODN的量效關(guān)系63號(hào)AS ODN的濃度依次為2μM、10μM、30μM、50μM。N基因表達(dá)載體用量為0.8μg/孔(24孔細(xì)胞培養(yǎng)板)。方法同實(shí)施例1。圖7A是針對(duì)protein N基因的63號(hào)AS ODN的量效關(guān)系。圖7B是針對(duì)proteinN基因的63號(hào)AS ODN的量效關(guān)系曲線。
抑制效果達(dá)到50％時(shí)63號(hào)AS ODN濃度為15.6μM。
實(shí)施例5針對(duì)protein E基因的19號(hào)AS ODN的量效關(guān)系19號(hào)AS ODN的濃度依次為2μM、10μM、30μM、50μM。E基因表達(dá)載體用量為0.8μg/孔(24孔細(xì)胞培養(yǎng)板)。方法同實(shí)施例1。圖8A是針對(duì)protein E基因的19號(hào)AS ODN的量效關(guān)系。圖8B是針對(duì)protein E基因的19號(hào)AS ODN的量效關(guān)系曲線。
抑制效果達(dá)到50％時(shí)19號(hào)AS ODN濃度為5.6μM。
實(shí)施例6針對(duì)protein E基因的51號(hào)AS ODN的量效關(guān)系51號(hào)AS ODN的濃度依次為2μM(6次重復(fù))、10μM(4次重復(fù))、30μM(2次重復(fù))、50μM(2次重復(fù))。E基因表達(dá)載體用量為0.8μg/孔(24孔細(xì)胞培養(yǎng)板)。圖9A是針對(duì)protein E基因的51號(hào)AS ODN的量效關(guān)系。圖9B是針對(duì)protein E基因的51號(hào)AS ODN的量效關(guān)系曲線。抑制效果達(dá)到50％時(shí)51號(hào)AS ODN濃度為4.4μM。
實(shí)施例7針對(duì)protein M基因的8號(hào)AS ODN的量效關(guān)系8號(hào)AS ODN的濃度依次為2μM(6次重復(fù))、10μM(3次重復(fù))、30μM(2次重復(fù))、50μM(2次重復(fù))。M基因表達(dá)載體用量為0.8μg/孔(24孔細(xì)胞培養(yǎng)板)。方法同實(shí)施例1。圖10A是針對(duì)protein M基因的8號(hào)AS ODN的量效關(guān)系。圖10B是針對(duì)protein M基因的8號(hào)AS ODN的量效關(guān)系曲線。
抑制效果達(dá)到50％時(shí)8號(hào)AS ODN濃度為4.5μM。
實(shí)施例8針對(duì)protein M基因的56號(hào)AS ODN的量效關(guān)系56號(hào)AS ODN的濃度依次為2μM、10μM、30μM、50μM。M基因表達(dá)載體用量為0.8μg/孔(24孔細(xì)胞培養(yǎng)板)。方法同實(shí)施例1。圖11A是針對(duì)protein M基因的56號(hào)AS ODN的量效關(guān)系。圖11B是針對(duì)protein M基因的56號(hào)AS ODN的量效關(guān)系曲線。
抑制效果達(dá)到50％時(shí)56號(hào)AS ODN濃度為10.7μM。
實(shí)施例9siRNA(No.8與No.19)抑制SARS病毒M和E基因的表達(dá)為了進(jìn)一步確證AS ODN的抑制基因表達(dá)的作用，發(fā)明人挑選了兩個(gè)有效的AS ODN(No.8與No.19)，以這兩個(gè)位點(diǎn)為靶位點(diǎn)，合成相應(yīng)的siRNA，看其抑制效果。M、N基因的轉(zhuǎn)染如前方法中所述。M基因表達(dá)載體用量分別為每孔50μg、100μg和200μg(Lipofectamine2000用量分別為每孔0.25μl、0.5μl和1μl)，E基因表達(dá)載體用量為每孔100μg，siRNA的轉(zhuǎn)染也用Lipofectamine2000，其用量均為每孔400μg.轉(zhuǎn)染條件與反義ODN時(shí)的相同。共轉(zhuǎn)染后48小時(shí)抽提總RNA，用RT-PCR法檢測(cè)siRNA對(duì)M、N基因表達(dá)的抑制效率。用12％非變性丙烯酰胺膠進(jìn)行電泳，EB染色。
圖12是siRNA(No.8及No.19)抑制M及E基因的表達(dá)。圖12A是8號(hào)siRNA抑制M基因表達(dá)。圖12B是19號(hào)siRNA抑制E基因表達(dá)。
如圖12所示為8號(hào)siRNA對(duì)M基因表達(dá)的抑制效率在90％以上，19號(hào)siRNA對(duì)E基因表達(dá)的抑制效率也達(dá)到70％。這從另一方面證明所篩出的AS ODN確實(shí)具有較好抑制效果。
實(shí)施例10用報(bào)道基因法測(cè)定siRNA(No.8與No.19)抑制SARS病毒M和E基因的表達(dá)方法(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔接種1.2×105HEK-293T細(xì)胞，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)過夜。
(2)報(bào)道基因載體的構(gòu)建M，E蛋白cDNA克隆入人胎盤熱穩(wěn)定堿性磷酸酯酶(AP)cDNA基因的3’側(cè)獲得分泌表達(dá)質(zhì)粒(人胎盤總RNA經(jīng)RT-PCR后克隆入載體pcDNAAMP(Invitrogen))及siRNA用Invitrogen陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine+PLUS轉(zhuǎn)染試劑，按其操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。具體用量為每孔細(xì)胞加靶基因(報(bào)道基因)載體12.5μg，siRNA取200μg和500μg兩個(gè)濃度。轉(zhuǎn)染試劑PLUS 1，Lipofectamine 1μl。3小時(shí)終止轉(zhuǎn)染，于5％CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)至24小時(shí)后檢測(cè)。
(3)AP活性檢測(cè)轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，從24孔培養(yǎng)盤中吸出50μl培養(yǎng)基，65度加熱15分鐘，使細(xì)胞內(nèi)源AP滅活。
在96孔板中1∶1加入上述加熱處理后培養(yǎng)基和AP化學(xué)發(fā)光底物，用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定讀數(shù)，確定AP活力。
結(jié)果表明8號(hào)siRNA對(duì)M蛋白的抑制水平為66％(200μg)和85％(500μg)。19號(hào)siRNA對(duì)E蛋白的抑制水平為33％(200μg)和53％(500μg)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>抑制SARS病毒基因表達(dá)的反義核酸及其應(yīng)用<130>030721<160>26<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1aagtacgcta ttaactatta 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>2cgcgagtaga cgtaaaccgt 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3tcgattgtgt gcgtactgct 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成
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權(quán)利要求
1.一種反義核酸，其特征在于，該反義核酸特異性地與SARS病毒的RNA的一部分相結(jié)合，所述反義核酸為RNA或DNA分子，且能有效地抑制SARS病毒基因的表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述的反義核酸，其特征在于，該反義核酸包括選自SEQ NO1到SEQ NO26所示的任意一條核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的反義核酸，其特征在于，該反義核酸為選自SEQ NO1到SEQ NO26所示的任意一條核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的反義核酸，其特征在于，該反義核酸為硫代反義寡脫氧核苷酸或小分子干擾核糖核酸。
5.如權(quán)利要求1所述的反義核酸，其特征在于，該反義核酸包括選自SEQ NO1到SEQ NO26所示的任意兩條以上的核苷酸序列。
6.如權(quán)利要求5所述的反義核酸，其特征在于該反義核酸包括選自SEQ NO1到SEQ NO26所示的任意兩條或三條核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求1所述的反義核酸的應(yīng)用，其特征在于該反義核酸在制備治療和/或預(yù)防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
8.一種組合物，其特征在于，它包括安全有效量的權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的反義核酸以及藥學(xué)上可接受的載體。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于所述的反義核酸為選自SEQ NO1到SEQ NO26所示的任意一條核苷酸序列。
10.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于所述的反義核酸為選自SEQ NO1到SEQ NO26所示的任意兩條或三條核苷酸序列。
11.如權(quán)利要求9或10所述的組合物，其特征在于所述的反義核酸為硫代反義寡脫氧核苷酸或小分子干擾核糖核酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組能夠有效抑制SARS病毒RNA和蛋白表達(dá)的反義核酸及其應(yīng)用，所述反義核酸可以用于制備治療和/或預(yù)防SARS病毒所引起的非典型肺炎及相關(guān)疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK1569872SQ0314184
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月25日
發(fā)明者金由辛, 史毅, 李林, 陸長(zhǎng)德, 丁昱, 陳婷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院