專利名稱：血液灌流用內(nèi)毒素吸附劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，特別是一種血液灌流用內(nèi)毒素吸附劑及制備方法。
背景技術(shù)：
內(nèi)毒素血癥是臨床最常見的致死疾病之一，死亡率可達40％-90％，在美國每年都有超過十萬人死于此病Skelter et al，Arch.Microbiol.1995，164，383-389.，臨床上尚無有效的治療方法。內(nèi)毒素血癥是由于革蘭氏陰性菌外細胞壁上的內(nèi)毒素釋放到血液中引起的。內(nèi)毒素進入血液后引起一系列反應(yīng)最終導(dǎo)致器官壞死、不可逆休克和死亡。如何做到及時、有效地清除或破壞患者體內(nèi)的內(nèi)毒素，是治療內(nèi)毒素血癥的關(guān)鍵問題。近年來國外研制了多種拮抗內(nèi)毒素的分子生物學(xué)制劑，但由于抗體的生產(chǎn)工藝復(fù)雜、藥源少、成本高，價格十分昂貴，且迄今為止尚無一種能夠通過III期臨床實驗姚詠明等.中國危重病急救醫(yī)學(xué)，1999，11456。
對一些重大疑難性病癥，血液凈化療法有著獨特療效，甚至能出現(xiàn)“起死回生”般的奇跡，是臨床治療不可缺少的重要手段，其中血液灌流療法是依靠吸附劑直接吸附除去血液中的有毒成份或致病物質(zhì)，達到凈化血液、緩解和治療疾病的目的。近年來，全血灌流療法由于其費用低而受到國際上空前的關(guān)注，認為它是血液凈化發(fā)展的主要趨勢James F.et al.，Blood Purif.2002，2081-86。該療法已用于紅斑狼瘡、重癥安眠藥中毒、類風(fēng)濕等疾病的治療，收到較好的療效。國外研究者已開始研究利用血液凈化的方法治療內(nèi)毒素血癥，日本的研究人員將多粘菌素B涂附在血濾器中空纖維的內(nèi)壁上，可以較好地清除血漿中的內(nèi)毒素Tani T，et al.，Atificial Organs 22(12)1038-1044(1998)。維也納大學(xué)的研究人員利用自己設(shè)計的MDS系統(tǒng)，將聚乙烯亞胺接在纖維素上進行動物實驗，去除內(nèi)毒素效果也較好K.von Appen，et al.，Atif.Organs，20(5)420-425(1996)。但上述兩種方法需要將血漿與血球分離后，進行血漿灌流，費用十分昂貴，不適合在國內(nèi)推廣。國內(nèi)僅有利用活性碳全血灌流法吸附內(nèi)毒素的動物實驗報道，表明用活性碳灌流可直接吸附血中內(nèi)毒素，但效果不明顯王今達.中國危重病急救醫(yī)學(xué)，1998，10578。以球形瓊脂為載體的血液灌流用內(nèi)毒素吸附劑未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于血液灌流的內(nèi)毒素吸附劑，它具有良好的血液相容性，可通過血液灌流的方法，高效吸附患者血液中的內(nèi)毒素，可用于全血灌流，也可用于血漿灌流。
本發(fā)明是以球形瓊脂凝膠為載體，固定有效量的親和配基構(gòu)成，粒度為0.45-1.0mm，吸附劑的胺基含量為40-100μmol/g吸附劑。
所述的親和配基是多粘菌素B、精氨酸、賴氨酸、組氨酸或聚賴氨酸。。
所述的聚賴氨酸的分子量為1.0-4.0萬。
所述血液灌流用內(nèi)毒素吸附劑的制備方法，包括下述步驟(1)制備球形瓊脂載體將2～10％的瓊脂水溶液加熱熔化，倒入甲苯-四氯化碳體系中，加入吐溫80，攪拌，使瓊脂溶液在有機相中分散成液滴，60～90℃反應(yīng)2-4小時，冷卻后，傾倒出上層有機溶劑，篩選0.45-1.0mm的瓊脂球，用水充分洗滌后，作為吸附劑載體。
(2)環(huán)氧氯丙烷活化載體載體在2M NaOH溶液中，30-50℃下與環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)1-4小時，用水洗至中性，除去未反應(yīng)的環(huán)氧氯丙烷，得到環(huán)氧氯丙烷修飾的載體。
(3)胺解反應(yīng)環(huán)氧氯丙烷修飾的載體在pH9～12的水溶液中于50-70℃下，與二胺反應(yīng)1-4小時。加入乙醇胺溶液在室溫下反應(yīng)1-6h以封閉未反應(yīng)的環(huán)氧基團。
(4)交聯(lián)反應(yīng)pH7.4的磷酸緩沖溶液中加入胺解的凝膠球，加25％的戊二醛，室溫振蕩1-4小時，胺解載體中30％胺基與戊二醛交聯(lián)，以增加載體的強度，70％胺基與戊二醛相連，留有懸掛醛基，可與配體中的伯胺基生成西佛堿，將配基引入到載體上。由此方法引入的配基含量較高。最后用水沖洗。
(5)固載配基將交聯(lián)后的瓊脂球在pH9-12下與配基反應(yīng)1-2小時，使懸掛醛基與配基中的伯胺基生成西佛堿，然后用1M的NaCl沖洗至中性。
(6)還原固載配基后的凝膠球于pH7.4的磷酸緩沖溶液中加入硼氫化鈉，室溫振蕩2～6小時，反應(yīng)后用1M的氯化鈉和水沖洗至中性。
所述的血液灌流用內(nèi)毒素吸附劑的制備方法各步驟的物料配比為甲苯∶四氯化碳為1～4∶1，v/v；瓊脂球∶2M的NaOH∶環(huán)氧氯丙烷為1∶1～4∶0.5～2，w/v/v；瓊脂球∶二胺為5∶0.1～0.5，w/w；25％的戊二醛的用量為胺化瓊脂球的25％-150％，v/w；NaBH4∶瓊脂球為0.1～0.5∶5，w/w。
所述的二胺為乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺或己二胺。
所述的血液灌流用內(nèi)毒素吸附劑用于臨床全血灌流清除血中內(nèi)毒素，治療內(nèi)毒素血癥等疾病。
使用所述的吸附劑進行血液灌流的方法，包括下述步驟室溫下，取吸附劑裝入灌流柱內(nèi)，內(nèi)毒素血癥患者的全血，以15ml/min的流速灌流2小時，采用偶氮顯色法檢測吸附前后內(nèi)毒素濃度；或室溫下，將吸附劑直接加入含內(nèi)毒素的血漿中，靜態(tài)吸附20分鐘，吸附劑∶血清為1∶20，w/v。
用本發(fā)明靜態(tài)吸附內(nèi)毒素血癥患者的血漿，對內(nèi)毒素清除率可達70％，可見吸附劑對內(nèi)毒素有較高的清除能力。
本發(fā)明吸附劑具有良好的血液相容性，可通過血液灌流的方法，高效吸附患者血液中的內(nèi)毒素，可用于全血灌流，也可用于血漿灌流。本發(fā)明是全血灌流用內(nèi)毒素吸附劑，通過全血灌流療法治療內(nèi)毒素血癥等疾病。不需要將血球與血漿分開而區(qū)別于國外的血漿灌流方法，從而大大降低了治療成本。


圖1.瓊脂球載體交聯(lián)前后熱失重曲線。
圖2.瓊脂球載體交聯(lián)前后微商熱失重曲線。
具體實施例方式
下列用具體實施例說明本發(fā)明，但它們不對本發(fā)明作任何限制。
實施例11-1球形瓊脂凝膠載體的制備將500ml三口瓶置于60℃水浴中，向瓶內(nèi)加入100ml甲苯，50ml四氯化碳，0.5ml吐溫80，均勻攪拌。
稱取4克瓊脂粉加入蒸餾水30ml，加熱熔化，將熔化的瓊脂倒入甲苯-四氯化碳體系中，攪拌，使瓊脂溶液在有機相中分散成大小適宜的液滴。冷卻到室溫，傾倒出上層有機溶劑，篩選0.45-1.0mm的瓊脂球，用水洗滌后，移入錐形瓶，4℃濕態(tài)保存。
1-2環(huán)氧氯丙烷活化取瓊脂球20.0克，加入29.6毫升2M的氫氧化鈉，再加入13.3毫升的環(huán)氧氯丙烷，在40℃下反應(yīng)2小時，用水洗滌至中性，并徹底洗去剩余的環(huán)氧氯丙烷，得到環(huán)氧活化的凝膠球，環(huán)氧基固載量為110.2μmol/g凝膠球。
1-3胺解1-3-1于80ml蒸餾水中加入1克1，2-乙二胺，調(diào)節(jié)pH值為10，加入20克環(huán)氧活化的凝膠球，于50℃下反應(yīng)2小時。反應(yīng)后用水沖洗至中性，得到乙二胺化的凝膠球。乙二胺固載量為90.6μmol/g凝膠球。將得到的產(chǎn)品與0.1g乙醇胺溶液在室溫下反應(yīng)2h以封閉未反應(yīng)的環(huán)氧基團。
1-3-2于80ml蒸餾水中加入2克1，3-丙二胺，調(diào)節(jié)pH值為11，加入20克環(huán)氧活化的凝膠球，于60℃下反應(yīng)3小時。反應(yīng)后用水沖洗至中性，得到丙二胺化的凝膠球。丙二胺固載量為92.8μmol/g凝膠球。將得到的產(chǎn)品與0.1g乙醇胺溶液在室溫下反應(yīng)3h以封閉未反應(yīng)的環(huán)氧基團。
1-3-3于80ml蒸餾水中加入2克1，4-丁二胺，調(diào)節(jié)pH值為12，加入20克環(huán)氧活化的凝膠球，于70℃下反應(yīng)1小時。反應(yīng)后用水沖洗至中性，得到丁二胺化的凝膠球。丁二胺固載量為91.3μmol/g凝膠球。將得到的產(chǎn)品與0.1g乙醇胺溶液在室溫下反應(yīng)5h以封閉未反應(yīng)的環(huán)氧基團。
1-3-4于80ml蒸餾水中加入2克1，5-戊二胺，調(diào)節(jié)pH值為9，加入20克環(huán)氧活化的凝膠球，于50℃下反應(yīng)4小時。反應(yīng)后用水沖洗至中性，得到戊二胺化的凝膠球。戊二胺固載量為90.9μmol/g凝膠球。將得到的產(chǎn)品與0.1g乙醇胺溶液在室溫下反應(yīng)1h以封閉未反應(yīng)的環(huán)氧基團。
1-3-5于80ml蒸餾水中加入2克1，6-己二胺，調(diào)節(jié)pH值為10，加入20克環(huán)氧活化的凝膠球，于50℃下反應(yīng)3小時。反應(yīng)后用水沖洗至中性，得到己二胺化的凝膠球。己二胺固載量為92.9μmol/g凝膠球。將得到的產(chǎn)品與0.1g乙醇胺溶液在室溫下反應(yīng)3h以封閉未反應(yīng)的環(huán)氧基團。
1-4引入戊二醛手臂及部分交聯(lián)反應(yīng)1-4-1于50毫升0.05M pH＝7.4的磷酸緩沖溶液中加入20克己二胺化的載體，在攪拌條件下滴加15毫升25％的戊二醛，室溫振蕩2小時。瓊脂球上剩余醛基為74.3μmol/克。反應(yīng)后用0.1M磷酸緩沖溶液和水沖洗。
1-4-2在1-4-1條件下，將己二胺換成戊二胺，振蕩1小時，瓊脂球上剩余醛基為70.3μmol/克。
1-4-3在1-4-1條件下，將己二胺換成丁二胺，振蕩1小時，瓊脂球上剩余醛基為68.3μmol/克。
1-4-4在1-4-1條件下，將己二胺換成丙二胺，振蕩4小時，瓊脂球上剩余醛基為74.3μmol/克。
1-4-5在1-4-1條件下，將己二胺換成乙二胺，振蕩1小時，瓊脂球上剩余醛基為78.3μmol/克。
1-5固載配基1-5-1在20毫升pH11的水溶液中加入0.2克多粘菌素B，加入交聯(lián)后的1-4-2瓊脂球5克，室溫振蕩2小時，然后用1M的氯化鈉沖洗。吸附劑胺基固載量為44.8μmol胺基/g。
1-5-2在20毫升pH9的水溶液中加入0.2克精氨酸，加入交聯(lián)后的1-4-3瓊脂球5克，室溫振蕩1小時，然后用1M的氯化鈉沖洗。吸附劑胺基固載量為69.5μmol胺基/g。
1-5-3在20毫升pH10的水溶液中加入0.2克賴氨酸，加入交聯(lián)后的1-4-4瓊脂球5克，室溫振蕩1小時，然后用1M的氯化鈉沖洗。吸附劑胺基固載量為87.6μmol胺基/g。
1-5-4在20毫升pH12的水溶液中加入0.2克聚賴氨酸，加入交聯(lián)后的1-4-1瓊脂球5克，室溫振蕩2小時，然后用1M的氯化鈉沖洗。吸附劑胺基固載量為74.5μmol胺基/g。
1-5-5在20毫升pH9的水溶液中加入0.2克組氨酸，加入交聯(lián)后的1-4-5瓊脂球5克，室溫振蕩2小時，然后用1M的氯化鈉沖洗。吸附劑胺基固載量為94.5μmol胺基/g。
1-6還原1-6-1于10毫升0.1M pH7.4的磷酸緩沖溶液中加入0.3g的硼氫化鈉，加入5g固載配基后的1-5-4凝膠球，室溫振蕩4小時，反應(yīng)后用1M的氯化鈉和水沖洗至中性。得到內(nèi)毒素吸附劑。
在上述條件下，將1-5-4分別換成1-5-1，1-5-2，1-5-3，1-5-5進行硼氫化鈉還原，得到系列內(nèi)毒素吸附劑。
實施例2戊二醛交聯(lián)對瓊脂球載體性質(zhì)的影響2-1分別取50mg戊二醛交聯(lián)前1-1及戊二醛交聯(lián)后1-4瓊脂球，洗凈，真空干燥后研碎。采用TG209熱重分析儀測定載體球的熱失重曲線，升溫速度14.0℃/min，升溫范圍20～620℃。交聯(lián)以后，熱失重的峰值從277.4℃增高到295.8℃，這說明交聯(lián)后瓊脂球的熱穩(wěn)定性得到了提高(見圖1，2)。圖1.瓊脂球載體交聯(lián)前后熱失重曲線。圖2.瓊脂球載體交聯(lián)前后微商熱失重曲線。
熱重法是評價高分子材料熱穩(wěn)定性的一種最重要的方法。。從圖1的熱失重曲線可以看出，交聯(lián)后熱失重的比例由67.06％減少到48.05％，這說明經(jīng)過交聯(lián)凝膠球受熱脫水量減少了；另一方面，從圖2的微商熱失重曲線可以看出，交聯(lián)以后熱失重的峰值從277.4℃增高到295.8℃，這也說明交聯(lián)后凝膠球的熱穩(wěn)定性提高了。
2-2準確量取30ml交聯(lián)前后的瓊脂球，裝入一個直徑1cm底部帶有磨砂板的玻璃柱內(nèi)，從柱的上部加入蒸餾水，保持蒸餾水在柱內(nèi)穩(wěn)定流動，用秒表測定蒸餾水的流出速度。交聯(lián)前的流動速度為38.4毫升/分，交聯(lián)后為66.8毫升/分。交聯(lián)以后，水在柱內(nèi)的流動速度明顯加快，說明交聯(lián)后瓊脂球的硬度得到明顯提高。
實施例3血液相容性實驗取實施例1制備的吸附劑2毫升，在生理鹽水中浸泡12小時后裝入灌流柱內(nèi)，用注射器注入5毫升混有抗凝劑的兔子全血，以15ml/min的流速灌流2小時。同時以一空灌流柱作為對照柱。通過MEK-6318K血細胞分析儀測定灌流前后血液各成分的變化。結(jié)果表明，灌流前后，各種血液成分變化不大，下降的百分數(shù)均在5％以內(nèi)，這表明該系列吸附劑具有較好的血液相容性，可用于全血灌流。
實施例4動物血漿中內(nèi)毒素的吸附實驗4-1取0.05克還原后1-5-3吸附劑，加入1毫升內(nèi)毒素血癥模型大白鼠的血漿，室溫振蕩20分鐘，采用偶氮顯色法檢測吸附前后內(nèi)毒素濃度。吸附前血漿中內(nèi)毒素濃度0.635EU/ml(EU為內(nèi)毒素單位)，吸附后0.220EU/ml，而正常大白鼠血漿中內(nèi)毒素濃度為0.18～0.22EU/ml。
4-2取0.05克還原后1-5-5吸附劑，加入1毫升內(nèi)毒素血癥模型大白鼠的血漿，室溫振蕩20分鐘，采用偶氮顯色法檢測吸附前后內(nèi)毒素濃度。吸附前血漿中內(nèi)毒素濃度0.635EU/ml，吸附后0.380EU/ml。
4-3取1ml還原后1-5-4吸附劑裝入1×5ml灌流器內(nèi)，用醫(yī)用酒精反復(fù)流動洗滌，再用蒸餾水、二次蒸餾水、生理鹽水反復(fù)流動洗滌，最后用無熱源水100ml流動洗滌。用橫流泵控制流速15ml/min，用20ml內(nèi)毒素模型兔子全血(內(nèi)加抗凝劑)灌流2小時。采用偶氮顯色法檢測灌流前后內(nèi)毒素濃度。灌流前血漿內(nèi)毒素含量0.685EU/ml，灌流后血漿內(nèi)毒素含量0.122EU/ml。正常兔子血漿內(nèi)毒素含量0.067-0.135Eu/ml。
人體血漿中內(nèi)毒素的吸附實驗4-4取0.05克還原后1-5-4吸附劑，加入1毫升內(nèi)毒素血癥患者的血漿，室溫振蕩20分鐘，采用偶氮顯色法檢測吸附前后內(nèi)毒素濃度。吸附前血漿中內(nèi)毒素濃度0.683EU/ml，吸附后0.200EU/ml，而正常人血漿中內(nèi)毒素濃度為0.18～0.22EU/ml，這說明該吸附劑對內(nèi)毒素有較強吸附能力。
4-5取0.05克還原后1-5-1吸附劑，加入1毫升內(nèi)毒素血癥患者的血漿，室溫振蕩20分鐘，采用偶氮顯色法檢測吸附前后內(nèi)毒素濃度。吸附前血漿中內(nèi)毒素濃度0.523EU/ml，吸附后0.300EU/ml。
4-6取0.05克還原后1-5-2吸附劑，加入1毫升內(nèi)毒素血癥患者的血漿，室溫振蕩20分鐘，采用偶氮顯色法檢測吸附前后內(nèi)毒素濃度。吸附前血漿中內(nèi)毒素濃度0.523EU/ml，吸附后0.324EU/ml。
權(quán)利要求
1.一種血液灌流用內(nèi)毒素吸附劑，其特征在于它是以球形瓊脂凝膠為載體，固定有效量親和配基的樹脂構(gòu)成，粒度為0.45-1.0mm，吸附劑的胺基含量為40-100μmol/g吸附劑。
2.按照權(quán)利要求1所述的血液灌流用內(nèi)毒素吸附劑，其特征在于所述的親和配基是多粘菌素B、精氨酸、賴氨酸、組氨酸或聚賴氨酸。
3.按照權(quán)利要求2所述的血液灌流用內(nèi)毒素吸附劑，其特征在于所述的聚賴氨酸的分子量為1.0-4.0萬。
4.權(quán)利要求1所述血液灌流用內(nèi)毒素吸附劑的制備方法，包括下述步驟(1)制備球形瓊脂載體將2～10％的瓊脂水溶液加熱熔化，倒入甲苯-四氯化碳體系中，以吐溫80作分散劑，攪拌，使瓊脂溶液在有機相中分散成液滴，60～90℃反應(yīng)2-4小時，冷卻后，傾倒出上層有機溶劑，篩選0.45-1.0mm的瓊脂球，用水充分洗滌后，作為吸附劑載體；(2)環(huán)氧氯丙烷活化載體上述載體在2M NaOH溶液中，30-50℃下與環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)1-4小時，用水洗至中性，除去未反應(yīng)的環(huán)氧氯丙烷，得到環(huán)氧氯丙烷修飾的載體；其特征在于它還包括(3)胺解反應(yīng)上述環(huán)氧氯丙烷修飾的載體在pH9～12于50-70℃下與二胺反應(yīng)1-4小時；水洗后，加入乙醇胺溶液在室溫下反應(yīng)1-6h以封閉未反應(yīng)的環(huán)氧基團；(4)交聯(lián)反應(yīng)將經(jīng)胺解的瓊脂載體在攪拌下加入25％的戊二醛，室溫振蕩1-4小時，胺解載體中約30％的胺基與戊二醛交聯(lián)，以增加載體的強度和配基引入量，70％胺基與戊二醛相連，留有懸掛醛基；(5)固載配基將交聯(lián)后的瓊脂球pH＝9-12下與親和配基反應(yīng)，通過上述的醛基與所述的配基中的伯胺基反應(yīng)生成西佛堿，將親和配基引入到吸附劑上，然后用1M的NaCl沖洗至中性；(6)還原固載配基后的凝膠球在pH7.4的磷酸緩沖液中加入NaBH4，室溫振蕩2～6小時，反應(yīng)后用1M的氯化鈉和水沖洗至中性。
5.按權(quán)利要求4所述的血液灌流用內(nèi)毒素吸附劑的制備方法，其特征在于各步驟的物料配比為甲苯∶四氯化碳為1～4∶1，v/v；瓊脂球∶2M的NaOH∶環(huán)氧氯丙烷為1∶1～4∶0.5～2，w/v/v；25％的戊二醛的用量為胺化瓊脂球的25％-150％，v/w；NaBH4∶瓊脂球為0.1～0.5∶5，w/w。
6.按權(quán)利要求4所述的血液灌流用內(nèi)毒素吸附劑的制備方法，其特征在于所述的二胺為乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺或己二胺。
7.按權(quán)利要求4所述的血液灌流用內(nèi)毒素吸附劑的制備方法，其特征在于所述的用硼氫化鈉還原的條件是pH7.4的磷酸緩沖液。
8.權(quán)利要求1所述的血液灌流用內(nèi)毒素吸附劑用于臨床全血灌流，清除患者血液中的內(nèi)毒素，治療內(nèi)毒素血癥疾病。
9.一種使用權(quán)利要求1所述的吸附劑進行血液灌流的方法，其特征在于它包括下述步驟室溫下，取吸附劑裝入灌流柱內(nèi)，內(nèi)毒素血癥患者的全血以15ml/min的流速灌流2小時，采用偶氮顯色法檢測吸附前后內(nèi)毒素濃度；或室溫下，將吸附劑直接加入含內(nèi)毒素的血漿中，靜態(tài)吸附20分鐘，吸附劑∶血清為1∶20，w/v。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種血液灌流用內(nèi)毒素吸附劑及其制備方法。本發(fā)明是以球形瓊脂凝膠為載體，固定有效量的親和配基，粒度為0.45－1.0mm，吸附劑的胺基含量為40－100μmol/g吸附劑。以瓊脂為原料，采取向甲苯－四氯化碳混合液中加瓊脂水溶液的方法，得到球狀瓊脂，經(jīng)堿性條件下環(huán)氧氯丙烷活化后與二胺反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)與戊二醛反應(yīng)，產(chǎn)生部分交聯(lián)，得到強度較好的珠狀瓊脂作為吸附劑載體。載體與多粘菌素B等含胺基的配基反應(yīng)后，經(jīng)NaBH
文檔編號A61M1/34GK1493368SQ0314423
公開日2004年5月5日 申請日期2003年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月2日
發(fā)明者袁直, 劉濤, 侯光輝, 王孝杰, 張文升, 袁 直 申請人:南開大學(xué)