專利名稱：穩(wěn)定的醫(yī)藥用河豚毒素冷凍干燥制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥用凍干制劑，特別是含有符合人體安全注射使用的河豚毒素的冷凍干燥制劑。
背景技術：
河豚毒素是自然界中發(fā)現(xiàn)的非蛋白質神經毒素之一，可高選擇和高親和性地與神經細胞膜鈉離子通道SS1/SS2結合，幾十年來一直在神經藥理學和肌肉生理學等研究領域中被廣泛用作藥理學工具藥，市場上典型產品為Sigma-Aldrich公司提供的1毫克河豚毒素含量的檸檬酸鹽固態(tài)凍干粉(該公司貨號T5881)。河豚毒素除了用于科研之外，1998年起，發(fā)明人所在公司已申報河豚毒素注射液(水溶液)為一類新藥，用于戒毒、鎮(zhèn)痛等治療用途(Pan，et al.US 5,846,975；Dong，et al.US 6,407,088)。但河豚毒素注射液(水溶液)對溫度很敏感，容易受溫度的影響而發(fā)生降解，溫度越高，降解越快。一旦有效活性物質河豚毒素含量低于其標示量的90％或有關物質的相對含量超過醫(yī)藥標準規(guī)定限度(大于對照溶液主峰面積)就不符合臨床使用要求。我們用HPLC測定了河豚毒素注射液中河豚毒素的含量及有關物質的相對含量，結果發(fā)現(xiàn)，河豚毒素注射液的含量隨溫度和貯存時間而變化，試驗結果表明40℃條件下，1天后河豚毒素的含量從0天的100％降為91.9％，下降了8.1％，3天后降為89.37％，下降了10.63％(見表1)。以上結果表明，在40℃條件下，河豚毒素注射液在放置3天后，其含量低于規(guī)定限度，不符合藥用要求。在25℃條件下，河豚毒素注射液在放置1個月后，其含量由0月的100％降為95.34％，下降了4.66％，有關物質含量大于對照溶液主峰面積，超過規(guī)定限度，不符合醫(yī)藥用標準要求；在放置3個月后，河豚毒素的含量降為89.77％，下降了10.23％，有關物質含量大于對照溶液主峰面積，兩者均不符合醫(yī)藥用標準要求(見表2)。以上結果表明，河豚毒素注射液在25℃下貯存，不能保證其產品質量，1個月后，有關物質含量就超過規(guī)定，不符合醫(yī)藥用標準要求。為了保證河豚毒素注射液的質量，防止河豚毒素含量下降和有關物質含量升高，必須將其置于4-8℃冰箱中保存。這就給河豚毒素的臨床使用帶來諸多困難和不便，相應在貯存、運輸、裝卸、批發(fā)、零售、醫(yī)院和應用各個環(huán)節(jié)都得注意保持4-8℃低溫，否則溫度偏高可能影響臨床效果，對此，我們必須設法盡快予以解決，研制出安全穩(wěn)定，室溫下就能長期貯存的可靠產品。
表1 河豚毒素注射液(990120A)40℃穩(wěn)定性研究試驗條件貯藏時間 外觀含量(％) 備注0天無色澄明液體100以0天含量1天無色澄明液體91.9 作100％計。
40℃. 3天無色澄明液體89.375天無色澄明液體87.4510天 無色澄明液體88.06說明含量＜90％即不符合標準規(guī)定。
表2 河豚毒素注射液25℃穩(wěn)定性研究時間(月)含量(％) 有關物質(％) 備注0 100＜對照溶液主峰面積以0天含量作100％1 95.34 ＞對照溶液主峰面積計。
2 93.72 ＞對照溶液主峰面積3 89.77 ＞對照溶液主峰面積6 82.47 ＞對照溶液主峰面積說明含量＜90％或有關物質＞對照溶液主峰面積，即不符合標準規(guī)定。
試驗證明，河豚毒素注射液(水針劑)在室溫下不穩(wěn)定，必須將其在低溫下貯藏(4-8℃)，這給運輸、貯存、使用帶來不便。為了解決上述問題，一個簡單的做法是將河豚毒素做成凍干制劑。一般在水溶液中不穩(wěn)定的生物活性物質在凍干脫水后貯存期都可延長，待臨床應用時，加滅菌注射用水再生即可。但河豚毒素用于醫(yī)藥時，其每劑量的用量只有0.5～60μg，如此微量的河豚毒素在溶液中經凍干脫水后形成不了所要求的固態(tài)殘留物，必需加入醫(yī)藥上能接受的賦形劑，才能提供微量河豚毒素得以附著的支架，在溶液凍干脫水后能形成固狀物。然而我們不論用河豚毒素工具藥中所采用的檸檬酸鹽或是最常用的甘露糖醇來作賦形劑，實驗結果表明所制成河豚毒素的凍干制劑在40℃貯存條件下，用檸檬酸鹽作賦形劑時，產品的外觀會收縮變形，不符合醫(yī)藥用規(guī)定要求，河豚毒素含量會逐漸下降，有關物質含量在5天后大于對照溶液主峰面積，超過規(guī)定限度，不符合醫(yī)藥用標準要求；用甘露糖醇作賦形劑時，產品外觀雖符合規(guī)定，但含量會逐漸下降，有關物質含量在5天后也大于對照溶液主峰面積，超過規(guī)定限度，不符合藥用要求(見表3)。在25℃條件下貯存6個月后，選用檸檬酸鹽作賦形劑，河豚毒素的含量由0月的100％降為95.1％，下降了4.9％，有關物質含量大于對照溶液主峰面積，超過規(guī)定限度，不符合醫(yī)藥用標準要求；選用甘露糖醇作賦形劑，6個月后，河豚毒素的含量由0月的100％降為96.59％，下降了3.41％，有關物質含量大于對照溶液主峰面積，超過規(guī)定限度，也不符合醫(yī)藥用標準要求(見表4)。
表3 表4


說明含量＜90％或有關物質＞對照溶液主峰面積，即不符合標準規(guī)定，不能供醫(yī)藥用。
這提示我們現(xiàn)有技術的凍干制劑中，賦形劑只起到物理上的部份穩(wěn)定作用，我們檢索了所有公開文獻，未發(fā)現(xiàn)有介紹在微量河豚毒素凍干粉劑制備時能增加化學穩(wěn)定性的添加劑。我們逐漸意識到必須從河豚毒素的化學結構著手，開辟一條尋求提高河豚毒素實用制劑對溫度穩(wěn)定的新途徑。
河豚毒素的化學名為10氫-12-(羥甲基)-2-亞氨基-5，97，10α-二甲橋-10αH-(1，3)二橋氧并(6，5-d)-嘧啶-4，7，10，11，12-戊醇，分子式為C11H17N3O8，分子量為319.28，結構式如下

河豚毒素的結構式河豚毒素在220℃以上變黑，但不分解，[α]D25-8.64(C＝8.55稀醋酸中)。pKa8.76(水)；9.4(50％乙醇)。溶于稀醋酸，微溶于水、無水乙醇、乙醚，不溶于其他有機溶劑，在強酸和強堿溶液中毒性破壞。(The Merck Index.13th Ed.2001，9318)河豚毒素在固態(tài)時對熱是相當穩(wěn)定的，但是它的水溶液特別是低濃度的稀酸水溶液穩(wěn)定性較差(Kang，et al.US 6,559,154)技術內容首先，我們把需要解決的技術問題歸納為①河豚毒素在酸性水溶液中含量為什么會下降？②河豚毒素含量下降后其轉化產物是什么？轉化產物與河豚毒素比較有什么差別？③河豚毒素的轉化機理？④如何阻止河豚毒素的轉化？對問題①河豚毒素在酸性水溶液中含量為什么會下降？1965年T.GOTO等人就指出，在酸的催化作用下河豚毒素發(fā)生差向異構化，轉變?yōu)?-表河豚毒素，然后再轉變?yōu)?，9-脫水河豚毒素(Tetrahedron.1965.Vol.21.2059-2088)，。此外，河豚毒素在水中加熱迴流時會變?yōu)楹与嗨?Annals New York Academy of Sciences.1985，47932-43)。
河豚毒素及其衍生物之間相互轉化方式由于河豚毒素在酸性水溶液中會發(fā)生差向異構化而轉化為4-表河豚毒素和4，9-脫水河豚毒素，從而導致含量下降。若加熱回流，則直接變?yōu)楹与嗨帷?br> 本申請人長期對河豚毒素的提取、純化、結構改造及異構化后的產物4-表河豚毒素和4，9-脫水河豚毒素的測定等研究，證實了以上的結論。
對問題②河豚毒素含量下降后其轉化產物是什么？轉化產物與河豚毒素有何差別？文獻報導河豚毒素在酸性水溶液中會轉化為4-表河豚毒素和4，9-脫不河豚毒素，為確證這一結論，我們進行了河豚毒素在水溶液中的熱動力學研究。
研究進行如下取一定濃度的(百分濃度)不同pH值的河豚毒素溶液，分別在80℃±1℃和90℃±1℃水溶液中平衡，然后在不同的平衡時間點取樣并立即冷凍到-18℃，用HPLC測定轉化產物及其含量(Zhou，et al.US.6,562,968)，結果見表5、表6。
表5 80℃下河豚毒素熱動力學研究(溶液pH值4.67)

由表5可見，河豚毒素在80℃水溶液中會轉化為4-表河豚毒素和4，9-脫水河豚毒素。
表6 90℃下河豚毒素熱動力學研究(溶液PH值4.85)

由表6可見，河豚毒素在90℃水溶液中會轉化為4-表河豚毒素和4，9-脫水河豚毒素，并有部分轉化為河豚酸。
河豚毒素的常見衍生物(1)4-表河豚毒素(2)4，9-脫水河豚毒素(3)河豚酸通過以上研究，我們確認了河豚毒素在水溶液會轉化為4-表河豚毒素和4，9-脫水河豚毒素，如果溫度達到90℃，河豚毒素就會有部分轉化為河豚酸。
河豚毒素、4-表河豚毒素、4，9-脫水河豚毒素在化學上非常類似，4-表河豚毒素與河豚毒素的分子式、分子量完全相同，唯一區(qū)別是4位羥基的立體位置不同；4，9-脫水河豚毒素與河豚毒素和4-表河豚毒素的分子式只差一個H2O，分子量少18，但他們的生物活性卻有顯著差異。例如河豚毒素的毒性為4500鼠單位/毫克，4-表河豚毒素的毒性為710鼠單位/毫克，4，9-脫水河豚毒素的毒性只有92鼠單位/毫克(Toxicon.1985，23271～276)，而河豚酸的毒性只有河豚毒素的約1/700。
鑒于河豚毒素、4-表河豚毒素和4，9-脫水河豚毒素的生物活性差異極為顯著，故河豚毒素一旦轉化為4-表河豚毒素和4，9-脫水河豚毒素后，其原有的生物活性會大大下降，并失去其醫(yī)藥用價值。
問題③河豚毒素轉化為4-表河豚毒素和4，9-脫水河豚毒素的化學機理？從河豚毒素的分子結構上很容易看出C-4的特殊性，聯(lián)有平伏鍵羥基和直立鍵氫原子的C-4在氮的鄰位，因此，C-4上的羥基具有特殊的化學和生理活性。當溶液中有H+存在，H+將會與C-4羥基上的氧原子結合，由結構A變成帶正電荷的結構B，結構B失去一分子水，生成C-4帶正電荷的結構C。在溶液中結構C與水分子結合，水分子既可從原來脫去水分子的位置上進行攻擊而衍生出結構E，也可從脫去水分子位置的反面進攻，而衍生出結構D。從結構E除去H+，則又產生原來的河豚毒素即結構A，從結構D除去H+，則會產生結構F。結構F和結構A之間的區(qū)別在于氫原子和羥基的位置互相交換，在結構A中，C-4的H原子是直立鍵，羥基是平伏鍵，而在結構F中，C-4上的H原子是平伏鍵，而羥基是直立鍵。結構A和結構F兩者在化學上稱為差向異構體。河豚毒素發(fā)生異構化的機理如下
河豚毒素4位羥基異構化的機理結構A稱作“河豚毒素”，是自然界中從河豚魚得到的河豚毒素(TTX)的主要成分。而結構F通常稱為4-表河豚毒素。由于其C-4上的羥基與C-9上的羥基很接近，在H+的作用下，很容易失去一分子水而生成更加穩(wěn)定的4，9-脫水河豚毒素。這三種所謂的“河豚毒素”，其化學性質只有稍微差別，而其生物活性卻有明顯不同。
從以上的分析，我們可以得出結論，河豚毒素的不穩(wěn)定性是由于水分子的作用，在H+的協(xié)助下發(fā)生差向異構化，差向異構化后進一步導致4，9-脫水河豚毒素的生成。為了阻止河豚毒素的差向異構化，就是要阻止4位碳上的羥基異構化，當然想徹底改變河豚毒素的穩(wěn)定性，最好的辦法是把C-4上的羥基還原，為此，我們從河豚毒素合成了4-去氧河豚毒素，其結構式如下 4-去氧河豚毒素的結構式4-去氧河豚毒素非常穩(wěn)定，HPLC分析顯示其水溶液加熱煮沸2h后沒有轉變，但是其LD50為3336.5μg/kg，毒性比河豚毒素要小330倍。進一步用小鼠醋酸扭體法測定它的鎮(zhèn)痛效果，結果顯示其鎮(zhèn)痛效果也比河豚毒素小約330倍。
從上述所有實驗結果我們得出結論河豚毒素分子中4位碳原子上的羥基是活性中心，它的存在對河豚毒素分子的生物活性起關鍵作用，而使C-4羥基保持在水平位置又是它的穩(wěn)定的關鍵所在。促使它轉變?yōu)橹绷⑽恢玫氖撬肿樱@就是問題④如何阻止河豚毒素的轉化之所在，即我們篩選醫(yī)藥用微量河豚毒素凍干制劑的配方時，應尋找能使C-4羥基保持在水平位置上的輔料，以增強河豚毒素在制劑中的穩(wěn)定性。
解決問題的方法由于C-4羥基的立體位置是河豚毒素具有生物活性的關鍵基團之一，我們以此為出發(fā)點，尋找一種既能為醫(yī)藥上可接受又不改變C-4羥基的性質與立體位置，從而阻止其發(fā)生差向異構化的物質為輔料。首先考慮羥基上的氫原子能與電負性很大的原子如氧原子形成氫鍵。因氧原子外層有6個電子，在形成化合物后，仍有兩對未用電子對，故電負性很大，很容易與C-4羥基上的氫原子和氮原子上的氫原子形成氫鍵，這樣通過氫鍵的形成就生成了一個六元環(huán)的化合物，從而“鎖定”了C-4上的羥基，也就是使C-4羥基立體空間位置被固定。其次考慮河豚毒素結構上兩個六元環(huán)是兩個椅式結構拼合而成，根據相似兼容法則，能否找到一個化合物與河豚毒素結構類似，能將河豚毒素分子包圍起來。能符合以上兩種要求的化合物為含糖苷鍵的化合物如雙糖等化合物。鑒于以上分析及不斷研究，我們研究發(fā)現(xiàn)在河豚毒素制劑中加入一定量的雙糖如乳糖、蔗糖、纖維二糖、麥芽糖，通過冷凍干燥后制成的凍干劑，確實解決了河豚毒素在制劑中的穩(wěn)定性，室溫下貯存1年后，其河豚毒素的含量及有關物質含量均未發(fā)生明顯變化，符合醫(yī)藥用規(guī)定標準。以下以乳糖為例描述河豚毒素和雙糖通過形成氫鍵而阻止C-4羥基異構化的機理。
乳糖和河豚毒素通過氫鍵形成六元環(huán)“鎖定”C-4羥基的示意圖基于同一原理，聚糖如縮合葡萄糖、右旋糖酐等及其衍生物如羥乙基淀粉、羥丙基環(huán)糊精等分子中也含有糖苷鍵，且分子結構與河豚毒素的結構有相似之處，也應對河豚毒素有穩(wěn)定作用。我們研究發(fā)現(xiàn)聚糖確實有此作用。而分子中沒有糖苷鍵的化合物，如單糖(葡萄糖、果糖、甘露糖等)則不能“鎖定”C-4上羥基的空間位置，故不能阻止河豚毒素差向異構化的發(fā)生，其原因可能是由于在單糖中氧原子在環(huán)中，β異頭物中存在C-1羥基偶極和環(huán)氧偶極之間平行的相互作用，它們之間相互排斥，這種排斥作用不利于環(huán)氧原子形成六元環(huán)的氫鍵(王鏡巖等.生物化學.北京高等教育出版社，2002.13)。
單糖β異頭物環(huán)氧原子的偶極與C-1上羥基的偶極互相平行本發(fā)明的技術方案如下為了克服現(xiàn)存技術的不足之處，本發(fā)明人發(fā)明了一種以凍干制劑形式提供原在水溶液或檸檬酸鹽凍干形態(tài)都不夠穩(wěn)定的生物活性成分-河豚毒素的醫(yī)藥配方及制法，從而達到室溫下就能長期貯存的目的。臨床應用時加入人體可接受的水溶液載體后即可再生，供注射給藥。
本發(fā)明所述的穩(wěn)定的醫(yī)藥用河豚毒素冷凍干燥制劑，是含有微量生物活性物質河豚毒素(Tetrodotoxin TTX)、穩(wěn)定劑、助溶劑的藥物組合物，所述的河豚毒素在冷凍干燥制劑組合物中的量僅為0.5-60μg/每劑量，其余為穩(wěn)定劑、助溶劑。
以上所述河豚毒素包括河豚毒素和其類似物脫水河豚毒素，胺基河豚毒素，甲氧基河豚毒素，乙氧基河豚毒素，具有生物活性成分的河豚毒素是從海洋動物河豚魚的卵巢、肝臟中提取得到，或者從其它物種，如兩棲類動物、扁形動物渦蟲類、紐形動物的紐蟲類、棘皮動物海星類、毛顎動物箭蟲類、軟件動物腹足類等以及某些細菌如溶藻弧菌等細菌中提取得到。提取方法可參照現(xiàn)有公開文獻的方法，例如本申請人的專利(Zhou，et al.，US 6,552,191)。其類似物是用河豚毒素經結構改造而得到的化合物。
在本發(fā)明中，作為符合人體安全注射使用的生物活性物質的河豚毒素，其含量極微，每劑量只有0.5μg～60μg，無法制成凍干制劑，通常必須加入醫(yī)藥上可接收的賦形劑，以增加凍干前溶液的濃度。研究發(fā)現(xiàn)，只有加入一種或一種以上對河豚毒素有穩(wěn)定作用的物質才能阻止河豚毒素在貯存期間發(fā)生差向異構化，阻止其轉變?yōu)?-表河豚毒素和4，9-脫水河豚毒素。在本發(fā)明中，能阻止河豚毒素差向異構化并具有穩(wěn)定作用的物質是乳糖、蔗糖、麥芽糖和纖維二糖等雙糖或縮合葡萄糖、右旋糖酐等聚糖或其衍生物如羥乙基淀粉、羥丙基環(huán)糊精等，可以單獨使用或兩種以上混合使用，每劑量的用量為5mg～100mg。
本發(fā)明中，生物活性物質河豚毒素幾乎不溶于水，為了獲得所需濃度的水溶液，必須加入一種能增加河豚毒素溶解度的助溶劑。從河豚毒素的化學結構分析，它是一個有機堿，故可溶于酸中，但強酸會使其分解，經過研究，只有加入不揮發(fā)的有機酸如檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、乳糖酸等最理想，它們能與河豚毒素形成有機酸鹽而溶于水中，又容易控制其酸度。試驗證明，本發(fā)明中所用助溶劑的量應使凍干前溶液的pH值為3.0～6.0，通常每劑量用量為0.00005～0.0005mg。
本發(fā)明是采用冷凍干燥法將含生物活性物質河豚毒素和雙糖或聚糖或其衍生物的水溶液或水溶性溶劑的溶液經冷凍干燥后而得到固體(Reminton’s Pharmaceutical Sciences.Seventeenth Edition.1985，1314.)。所述的水溶液很容易制備，通過0.22μm的膜，再通過截留分子量為10000的超濾器，經冷凍干燥后即可得到無菌和無熱原的凍干制劑，如此得到的凍干制劑是穩(wěn)定的，能較長時間阻止生物活性物質河豚毒素的轉化。
為了使得到的凍干制劑有一個恒定合適的pH值，并避免注射時引起局部組織的刺激疼痛或壞死，通常加入計算量的助溶劑，使pH值控制在3.0～6.0之間，如果pH值低于3.0，可用稀氫氧化鈉(鉀)溶液或相應助溶劑的鈉(鉀)鹽進行調節(jié)。其用量應根據冷凍干燥前溶液的pH值而定，如果溶液的pH值已在3.0～6.0之間，則可以不必調節(jié)pH值。
本發(fā)明制備含微量河豚毒素冷凍干燥制劑的方法是將助溶劑、穩(wěn)定劑和pH值調節(jié)劑分別溶解于水中，將微量河豚毒素溶于計量的助溶劑中，再加到穩(wěn)定劑溶液中，加水至規(guī)定體積，混合均勻，測定pH值應在3.0～6.0之間，否則用氫氧化鈉(鉀)或相應的有機酸鈉(鉀)鹽調節(jié)pH值，經除菌過濾、超濾后定量灌裝于玻璃小瓶中，半加塞、冷凍干燥、壓塞、軋蓋即得。
以上所述的冷凍干燥制劑組合物用人體可接受的水溶液載體再生，得到可用于肌肉或皮下注射給藥的無菌、無熱原澄明液體，水溶液載體為滅菌注射用水或其它水溶液載體，水溶液載體的用量為0.5-5ml，最佳用量為1-2ml。
具體制備工藝是1.將定量助溶劑溶于注射用水中。
2.將pH值調節(jié)劑溶于注射用水中。
3.將穩(wěn)定劑雙糖或聚糖或其衍生物溶于注射用水中。
4.向微量河豚毒素中加入計算量的助溶劑溶液，攪拌，使溶解。
5.將4加入3中，并加注射用水至規(guī)定體積，搖勻。
6.測定溶液的pH值，應在3.0～6.0之間，否則，用pH值調節(jié)劑溶液調節(jié)。
7.除菌過濾(例如Millipore公司的過濾系統(tǒng))和超濾(例如Pull公司的超濾系統(tǒng))后得到無菌、無熱原的澄明溶液。
8.將7得到的溶液在無菌條件下定量分裝于玻璃小瓶中，半加塞后，送至冷凍干燥機中，預凍至物品溫度達到-40℃以下，打開冷阱制冷，使冷阱溫度下降到-50℃以下，起動真空泵，維持真空度在5帕以下，并自然升溫至設定值，維持24小時，然后升溫至30℃維持10小時以上，自動壓塞。
9.取出軋蓋即得。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明突出的實質性和顯著的進步是河豚毒素注射液無論在冷藏(4-8℃)或常溫下都非常難以保存，特別在常溫條件下很容易發(fā)生差向異構化，轉變?yōu)?-表河豚毒素和4，9-脫水河豚毒素而失去藥用價值，本發(fā)明人正是經過大量的研究，找到了能阻止河豚毒素差向異構化的穩(wěn)定劑，使得制劑中極微量的河豚毒素能在常溫下保持穩(wěn)定。具體的優(yōu)點如下1.制劑配方中加入穩(wěn)定劑雙糖或聚糖或其衍生物，能有效保護河豚毒素在貯存期間不發(fā)生差向異構化，能有效阻止河豚毒素轉化為4-表河豚毒素和4，9-脫水河豚毒素，產品質量得到保證。
2.采用冷凍干燥技術，產品中含水份很少，提高了產品的穩(wěn)定性。
3.以上兩種技術的結合，能有效解決醫(yī)藥用微量河豚毒素在制劑中的穩(wěn)定性。
4.產品不需在4-8℃冰箱中保存，可在常溫下保存，大大節(jié)約貯藏、運輸成本，方便醫(yī)療使用，更重要的是提供了安全可靠、質量穩(wěn)定、室溫下貯存期可長達壹年以上的產品。
具體實施例方式
實施例1以表7所示的量制備河豚毒素與雙糖(乳糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖)的冷凍干燥制劑。配方1用果糖(單糖)作賦形劑，配方2、3、4、5用雙糖作穩(wěn)定劑(同時兼作賦形劑)。將檸檬酸(助溶劑)和穩(wěn)定劑分別溶于注射用水中，將河豚毒素溶于檸檬酸溶液中，后將穩(wěn)定劑溶液加入其中，加注射用水至規(guī)定體積，攪拌均勻，調節(jié)pH值為4.0，除菌過濾、超濾，定量灌裝于玻璃小瓶中，半加塞，送入冷凍干燥機中，預凍至物品溫度達到-40℃以下，打開冷阱制冷，使冷阱溫度下降到-50℃以下，起動真空泵，維持真空度在5帕以下，并自然升溫至設定值，至少24小時，再自然升溫至30℃至少維持10小時，壓塞、軋蓋即得。
表7

將以上所得到的河豚毒素凍干制劑和河豚毒素注射液(水針劑)在40℃高溫下同時進行穩(wěn)定性試驗，于1、3、5、10天取樣，HPLC法測定河豚毒素含量和有關物質含量，并與0天測定結果比較，結果見表8。
表8不同配方河豚毒素凍干劑與河豚毒素注射液40℃高溫下穩(wěn)定性試驗結果

說明1.6*為河豚毒素注射液(水針劑)2.含量＜90％或有關物質＞對照溶液主峰面積，即不符合標準規(guī)定，不能供醫(yī)藥用。
配方1用果糖作賦形劑，產品外觀不符合要求，在40℃高溫試驗下，河豚毒素的含量會逐漸下降，由100％(0天)降為95.99％(10天)，下降了4.01％，有關物質含量在5天后即超過對照溶液主峰面積，不符合規(guī)定要求，故果糖不能阻止河豚毒素的差向異構化的發(fā)生，不能解決河豚毒素的穩(wěn)定性。配方2、3、4、5分別用乳糖、蔗糖、麥芽糖及纖維二糖等雙糖作穩(wěn)定劑時，在40℃高溫試驗條件下，10天后河豚毒素的含量及有關物質含量均未發(fā)生明顯變化，河豚毒素的含量分別為99.97％、99.56％、99.18％和99.75％，有關物質含量均小于對照溶液主峰面積，符合醫(yī)藥用標準要求，穩(wěn)定性大大提高，說明雙糖能阻止河豚毒素的差向異構化，達到了保護河豚毒素的目的。配方6*為水針劑，在同樣試驗條件下，河豚毒素的含量逐漸下降，由100％(0天)降為90.06％(10天)，下降了9.94％，有關物質含量自第3天起即超過對照溶液主峰面積，不符合規(guī)定要求。由此說明河豚毒素凍干劑采用雙糖作穩(wěn)定劑后，穩(wěn)定性比水針劑有了明顯提高。
將以上得到的河豚毒素凍干劑和河豚毒素注射液(水針劑)在室溫下同時進行長期穩(wěn)定性試驗，于1、2、3、6、9、12個月取樣，HPLC法測定河豚毒素含量和有關物質含量，并與0月測定結果比較，結果見表9。
表9 不同配方河豚毒素凍干劑與河豚毒素注射液室溫下穩(wěn)定性試驗結果

說明1.6*為河豚毒素注射液(水針劑)2.含量＜90％或有關物質＞對照溶液主峰面積，即不符合標準規(guī)定，不能供醫(yī)藥用。
配方1用果糖作賦形劑，制劑外觀不合格，貯存期間河豚毒素的含量下降，12個月后含量由100％(0月)降為83.19％，下降了16.81％，2個月后有關物質含量已超過對照溶液主峰面積，不符合規(guī)定要求，不能供醫(yī)藥用。配方2、3、4、5分別用乳糖、蔗糖、麥芽糖及纖維二糖等雙糖作穩(wěn)定劑，在室溫下放置12個月，其外觀、河豚毒素的含量和有關物質含量均未發(fā)生明顯變化，河豚毒素的含量分別為101.92％、99.89％、99.87％和99.47％，有關物質含量均小于對照溶液主峰面積，符合醫(yī)藥用標準要求。配方6*為水針劑，在同樣條件下貯存，河豚毒素含量下降明顯，12個月后由100％(0月)降為73.38％，下降了26.62％，有關物質含量自2個月后即超過對照溶液主峰面積，不符合規(guī)定要求，說明其穩(wěn)定性較差?？梢婋p糖能很好地保護微量河豚毒素，室溫下貯存12個月后，其河豚毒素的含量和有關物質含量仍符合臨床應用要求，解決了河豚毒素制劑的穩(wěn)定性。
實施例2制備含生物活性物質河豚毒素30μg和30mg右旋糖酐的冷凍干燥制劑。按實施例1所述的方法，將pH值為4.0，內含0.003％河豚毒素和3％右旋糖酐溶液經冷凍干燥，即可得到白色疏松餅狀物，將該制劑用在40℃進行穩(wěn)定性研究，于1、3、5、10天取樣，HPLC法測定河豚毒素含量和有關物質含量，并與0天測定結果比較，結果見表10。
表10

以上結果表明，右旋糖酐因含有和雙糖類似的化學結構，故在配方中對河豚毒素有穩(wěn)定作用，在40℃高溫條件下，其外觀、含量及有關物質均符合標準規(guī)定。
實施例3制備含生物活性物質河豚毒素60μg和5mg乳糖(或蔗糖、麥芽糖、纖維二糖)的冷凍干燥制劑。按實施例1所述的方法，將pH值為3.0，內含0.006％河豚毒素和0.5％乳糖的溶液經冷凍干燥，即可得到白色疏松餅狀物，將該制劑用滅菌注射用水或醫(yī)藥上可接收的水溶性溶媒溶解，生成無菌、無熱原的澄明溶液，可直接供肌肉或皮下注射給藥。
實施例4制備含生物活性物質河豚毒素0.5μg和100mg乳糖(或蔗糖、麥芽糖、纖維二糖)的冷凍干燥制劑。按實施例1所述的方法，將pH值為6.0，內含0.00005％河豚毒素和10％乳糖的溶液經冷凍干燥，即可得到白色疏松餅狀物，加水溶性溶媒再生，可直接供肌肉或皮下注射給藥。
實施例5制備含生物活性物質河豚毒素5μg和15mg乳糖、15mg蔗糖(或麥芽糖、纖維二糖)的冷凍干燥制劑。按實施例1所述的方法，將pH值為4.5，內含0.0005％河豚毒素和1.5％乳糖、1.5％蔗糖的溶液經冷凍干燥，即可得到白色疏松餅狀物，將該制劑用滅菌注射用水或醫(yī)藥上可接收的水溶性溶媒溶解，生成無菌、無熱原的澄明溶液，可直接供肌肉或皮下注射給藥。
實施例6制備含生物活性物質河豚毒素20μg和15mg乳糖(或蔗糖、麥芽糖、纖維二糖)與15mg甘露糖醇的冷凍干燥制劑。按實施例1所述的方法，將pH值為5.5，內含0.002％河豚毒素和1.5％乳糖及1.5％甘露醇的溶液經冷凍干燥即可得到白色疏松餅狀物，將該制劑用滅菌注射用水或醫(yī)藥上可接收的水溶性溶媒溶解，生成無菌、無熱原的澄明溶液，可直接供肌肉或皮下注射給藥。
按本實施例得到的樣品，在室溫上貯存一年后，其河豚毒素含量為99.65％，有關物質含量小于對照溶液主峰面積，符合臨床使用要求。而僅用甘露糖醇作賦形劑時則不能達到此目的，由此更充分說明乳糖或蔗糖、麥芽糖、纖維二糖等在本凍干制劑具有明顯的保護作用。
權利要求
1.一種穩(wěn)定的醫(yī)藥用河豚毒素冷凍干燥制劑，其特征在于它含有微量生物活性物質河豚毒素(Tetrodotoxin TTX)、穩(wěn)定劑、助溶劑的藥物組合物，所述的河豚毒素在冷凍干燥制劑組合物中的量為0.5-60μg/每劑量，其余為穩(wěn)定劑、助溶劑。
2.根據權利要求1所述的穩(wěn)定的醫(yī)藥用河豚毒素冷凍干燥制劑，其特征在于所述河豚毒素包括河豚毒素和其類似物脫水河豚毒素，胺基河豚毒素，甲氧基河豚毒素，乙氧基河豚毒素。
3.根據權利要求1所述的穩(wěn)定的醫(yī)藥用河豚毒素冷凍干燥制劑，其特征在于所述的穩(wěn)定劑包括能降低河豚毒素C-4羥基活潑性的化合物如乳糖、蔗糖、麥芽糖和纖維二糖等雙糖或為縮合葡萄糖、右旋糖酐等聚糖或其衍生物如羥乙基淀粉、羥丙基環(huán)糊精等中的一種或一種以上的混合物，每劑量中穩(wěn)定劑的用量為5-100mg。
4.根據權利要求1所述的穩(wěn)定的醫(yī)藥用河豚毒素冷凍干燥制劑，其特征在于所述的助溶劑包括不揮發(fā)的有機酸，選自檸檬酸、酒石酸、蘋果酸或乳糖酸，每劑量中助溶劑的用量為0.00005-0.0005mg，并調節(jié)使凍干前溶液的pH值在3.0～6.0之間。
5.根據權利要求1所述的穩(wěn)定的醫(yī)藥用河豚毒素冷凍干燥制劑，其特征在于所述的冷凍干燥制劑組合物用人體可接受的水溶液載體再生，得到可用于肌肉或皮下注射給藥的無菌、無熱原澄明液體，水溶液載體為滅菌注射用水或其它水溶液載體，水溶液載體的用量為0.5-5ml，最佳用量為1-2ml。
6.一種如權利要求1所述的穩(wěn)定的河豚毒素冷凍干燥制劑的制備方法，其特征在于將助溶劑、穩(wěn)定劑分別溶解，將河豚毒素溶于助溶劑溶液中，與穩(wěn)定劑溶液混合，加注射用水至規(guī)定體積，測定pH值并調節(jié)pH值為3.0-6.0，除菌過濾、超濾，定量灌裝于玻璃瓶中，半加塞，凍干、壓塞、軋蓋。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有良好穩(wěn)定性的含有符合人體安全注射使用的室溫下能長期貯存的河豚毒素冷凍干燥制劑的組合物及制備方法，該組合物包含微量河豚毒素、穩(wěn)定劑和助溶劑，其制備方法是將助溶劑、穩(wěn)定劑分別溶解，將河豚毒素溶于助溶劑溶液中，與穩(wěn)定劑溶液混合，加注射用水至規(guī)定體積，調節(jié)pH值，除菌過濾、超濾，灌裝于玻璃瓶中，凍干得到產品，臨用前加水溶性溶劑再生即可。
文檔編號A61K9/19GK1568999SQ03146020
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月14日 優(yōu)先權日2003年7月14日
發(fā)明者張曉 , 康宇紅, 黃小燕 申請人:南寧楓葉藥業(yè)有限公司