專利名稱：治療缺血性心臟病的川芎內(nèi)酯及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由植物類中藥飲片提取的藥物，特別是一種治療缺血性心臟病的川芎內(nèi)酯及其制備方法。
背景技術(shù)：
川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖)味辛性溫，既能活血化瘀又可行氣止痛，以川芎為主藥的“冠心II號(hào)”，“速效救心丸”等，都是臨床上治療缺血性心臟病的有效成藥。缺血性心臟病的基本病機(jī)是“虛氣留滯，毒損心絡(luò)”，而川芎具有辛香透絡(luò)，活血化瘀之功，可以條達(dá)氣血，俾氣血條暢，毒邪無所依附而消散，則心絡(luò)舒展自如?？梢?，川芎是通過祛邪以扶正，同時(shí)，又具有止痛之效。因此，為治療心血瘀阻，毒損心絡(luò)胸痹之良藥。
但是，目前對(duì)川芎的臨床應(yīng)用主要依靠飲片煎煮制取，由于飲片質(zhì)量不易控制，作用不穩(wěn)定，用量大而作用小。因此，近年來中藥界已開始研究川芎對(duì)心血管系統(tǒng)的藥理作用，以提高其藥效。川芎對(duì)心血管系統(tǒng)的藥理作用研究，在陰健主編的《中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用I》pp108-118的綜述中表明，川芎具有擴(kuò)張冠脈，增加冠脈血流量，降低心肌氧耗，并對(duì)心肌缺血性損傷有保護(hù)作用，但其有效成分的研究幾乎全集中于川芎嗪(四甲基吡嗪)，許多文獻(xiàn)甚至以合成四甲基吡嗪的作用來闡明川芎藥理活性。我們的研究表明，川芎中四甲基吡嗪含量甚微，有些產(chǎn)地的川芎生藥中甚至未能檢出四甲基吡嗪，因此，川芎對(duì)心血管系統(tǒng)的藥理作用物質(zhì)基礎(chǔ)是否歸于四甲基吡嗪，值得商榷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于從中藥川芎中分離精制內(nèi)酯類化合物，用于治療缺血性心臟病。其創(chuàng)新點(diǎn)在于川芎內(nèi)酯為結(jié)構(gòu)確定的化合物，比川芎飲片易于質(zhì)量控制而作用穩(wěn)定，而且用量小作用強(qiáng)，可開發(fā)成二類乃至一類新藥而具有較好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明治療缺血性心臟病的川芎內(nèi)酯，是由川芎飲片提取的川芎總內(nèi)酯包含的，其中川芎內(nèi)酯A與川芎內(nèi)酯B分別占總內(nèi)酯成分重量的50％±10％和20％±5％，總內(nèi)酯中還有少量二聚體，該二聚體共有3種，內(nèi)酯A、B及二聚體的分子結(jié)構(gòu)式如下 川芎內(nèi)酯A 川芎內(nèi)酯B
二聚體1 二聚體2 二聚體3利用1HNMR，13CNMR及EIMS法鑒定了川芎內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)，其光譜數(shù)據(jù)如下川芎內(nèi)酯A為化合物4，5-二氫-3-丁叉基苯肽(4，5-dihydro-3-butylidene-phthalide)，系淺黃色油狀物。EIMS m/z(％)190(M+，72)，161(100)，134(28)，133(26)，106(50)，105(60)，78(50)，77(50)，55(90).分子式C12H14O2。分子量190。1HNMR(CDCl3)δ0.91(3H，t，J＝7.5，H-11)，1.46(2H，Hexa，J＝7.5，H-10)，2.33(2H，q，J＝7.5，H-9)，2.44(2H，m，H-5)，2.57(2H，t，J＝7.2，H-4)，5.19(1H，t，J＝7.5，H-8)，5.97(1H，dt，J＝10.0，5.0，H-6)，6.23(1H，dt，J＝10.0，2.0，H-7)。13CNMR(CDCl3)δ13.7(q，C-11)，18.4(t，C-10)，22.3(t，C-9，5)，28.0(t，C-4)，112.8(d，C-8)，116.9(d，C-7)，123.9(s，C-7a)，129.9(d，C-6)，147.0(s，C-3a)，148.5(s，C-3)，167.5(s，C-1)；川芎內(nèi)酯B為化合物4，5-二氫-3-丁基苯肽(4，5-dihydro-3-butyl-phthalide)，系淺黃色油狀物。EIMS m/z(％)192(M+，25)，163(5)，135(10)，107(100)，79(40)，77(35)，分子式C12H16O2，分子量192。1HNMR(CDCl3)δ0.87(3H，t，J＝7.5，H-11)，1.36(4H，m，H-9，10)，1.50(1H，m，H-8a)，1.85(1H，m，H-8b)，2.43(2H，m，H-4)，2.47(2H，m，H-5)，4.90(1H，dd，J＝8.0，3.5，H-3)，5.88(1H，dt，J＝9.5，4.5，H-6)，6.16(1H，dt，J＝9.5，2.5，H-7)。13CNMR(CDCl3)δ13.8(q，C-11)，20.7(t，C-10)，22.3(t，C-9)，22.4(t，C-8)，26.7(t，C-5)，31.9(t，C-4)，82.5(d，C-3)，116.8(d，C-7)，124.4(s，C-7a)，128.3(d，C-6)，161.4(s，C-3a)，171.2(s，C-1)。
由川芎總內(nèi)酯分離出川芎內(nèi)酯A、B，即該川芎內(nèi)酯是指川芎內(nèi)酯A或川芎內(nèi)酯B。
以川芎內(nèi)酯A、B為原料，可人工合成川芎內(nèi)酯A、B二聚體，該二聚體為結(jié)晶性化合物，它具有與川芎內(nèi)酯A、B相同的不飽和五元內(nèi)酯環(huán)及環(huán)外丁(烯)基活性基團(tuán)。
用于上述治療缺血性心臟病的川芎內(nèi)酯的制備方法是取川芎飲片以乙醇滲漉，二者重量比為1∶4，滲漉液減壓回收乙醇至無乙醇味，加入與殘物等體積的水，充分?jǐn)嚢韬箪o置分層，取上層油脂層以石油醚溶解，用含水甲醇萃取，甲醇萃取物行硅膠柱層析，以石油醚∶乙酸乙酯(20∶1)除油脂，再用石油醚∶乙酸乙酯(8∶1)洗出川芎總內(nèi)酯。川芎總內(nèi)酯再行硅膠及ODS層析分離得到川芎內(nèi)酯A、B及其二聚體化合物。
藥理實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明
1、川芎內(nèi)酯A，B可明顯降低缺血及再灌注時(shí)室性心律失常的發(fā)生率，持續(xù)時(shí)間縮短；顯著縮小心肌梗塞面積，血漿乳酸脫氫酶、磷酸肌酸激酶活性增高程度明顯降低。表明川芎內(nèi)酯A，B對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。
2、川芎內(nèi)酯A、B明顯延長小白鼠在缺氧狀態(tài)下的存活時(shí)間，提示川芎內(nèi)酯A，B可以提高小白鼠的耐缺氧能力。
3、川芎內(nèi)酯A、B降低血小板聚集率，全血粘度及血漿粘度，表明川芎內(nèi)酯A、B具有活血化瘀之功能。
4、川芎內(nèi)酯A、B對(duì)正常開胸大鼠血壓、心率、左心室內(nèi)壓、左室壓最大上升及下降速率和主動(dòng)脈流量沒有影響，表明川芎內(nèi)酯A、B對(duì)大鼠心臟功能沒有負(fù)性肌力作用。
以上結(jié)果為川芎內(nèi)酯A，B治療缺血性心臟病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。


圖1為川芎內(nèi)酯A的1HNMR譜圖2為川芎內(nèi)酯A的13CNMR譜圖3為川芎內(nèi)酯B的1HNMR譜圖4為川芎內(nèi)酯B的13CNMR譜圖5為二聚體1的1HNMR譜圖6為二聚體1的13CNMR譜圖7為二聚體2的1HNMR譜圖8為二聚體2的13CNMR譜圖9為二聚體3的1HNMR譜圖10為二聚體3的13CNMR譜具體實(shí)施方式
提取分離工藝及藥效學(xué)研究實(shí)施例實(shí)施例1 川芎總內(nèi)酯的提取分離取川芎飲片粗粉10kg，以95％乙醇拌勻后，置滲漉筒內(nèi)室溫悶潤24h，飲片與乙醇重量比為1∶4，開始用95％乙醇滲漉，滲漉速度1000ml/h，滲漉8h，靜置16h后再行滲漉，共收集滲漉液5萬ml(5000ml滲漏液/kg飲片)。滲漉液減壓回收乙醇至無醇味(殘物約1萬ml)后，加入1萬ml水，充分?jǐn)嚢韬箪o置2h，分取上層油脂狀物，以石油醚含水甲醇系統(tǒng)萃取分離。取甲醇萃取液，減壓回收甲醇。甲醇萃取物(油狀物)置硅膠柱，以石油醚∶乙酸乙酯(20∶1)洗去油脂后，再以石油醚∶乙酸乙酯(8∶1)洗脫川芎總內(nèi)酯。
實(shí)施例2 川芎內(nèi)酯A、B的分離取總內(nèi)酯置硅膠柱中，以石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)進(jìn)行層析分離。收集亮蘭色熒光部分，用作川芎內(nèi)酯A的精制。取隨后之熒光吸收部分用作川芎內(nèi)酯B的精制。
實(shí)施例3 川芎內(nèi)酯A、B的精制取實(shí)施例2中收集的亮蘭色熒光部分(油狀物)進(jìn)行ODS層析分離，以含水甲醇為洗脫劑，收集亮蘭色熒光部分，減壓回收甲醇，殘物加入無水乙醇反復(fù)脫水，得淺黃色油狀物川芎內(nèi)酯A。
取實(shí)施例2中熒光吸收部分(油狀物)按上述方法層析分離，收集TLC單一熒光吸收斑點(diǎn)組分，回收甲醇，無水乙醇脫水，得淺黃色油狀物川芎內(nèi)酯B。
實(shí)施例4 川芎內(nèi)酯A、B的純度檢查方法HPLC法；儀器Waters 996型HPLC儀；固定相Kromasil 100 C185μm；檢測波長240nm；流速0.9ml/min；流動(dòng)相∶甲醇-水(70∶30)；柱溫18-19℃。川芎內(nèi)酯A純度為98.35％，川芎內(nèi)酯B純度為99.05％。
實(shí)例5 川芎內(nèi)酯A，B對(duì)麻醉大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用采用麻醉大鼠整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，開胸后結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，觀察了川芎內(nèi)酯A，B1g.kg-12g.kg-1對(duì)麻醉大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響。結(jié)果表明川芎內(nèi)酯A，B可明顯降低缺血及再灌注時(shí)室性心律失常的發(fā)生率，縮短其持續(xù)時(shí)間；顯著縮小心肌梗塞面積，血漿乳酸脫氫酶、磷酸肌酸激酶活性增高程度明顯降低。表明川芎內(nèi)酯A，B對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。
實(shí)例6 川芎內(nèi)酯A、B對(duì)小鼠耐缺氧作用采用常規(guī)小鼠耐缺氧實(shí)驗(yàn)方法，觀察川芎內(nèi)酯A、B灌胃給藥對(duì)耐缺氧能力的影響。結(jié)果表明川芎內(nèi)酯A、B明顯延長小白鼠在缺氧狀態(tài)下的存活時(shí)間，提示川芎內(nèi)酯A，B可以提高小白鼠的耐缺氧能力。
實(shí)例7 川芎內(nèi)酯A.B對(duì)大鼠血液流變學(xué)的影響Wistar大鼠，雄性，體重240-270g，戊巴比妥鈉麻醉(30mg.kg-1iv)后，腹主動(dòng)脈采血，枸櫞酸鈉抗凝，測定血小板聚集率(比濁法)，全血粘度及血漿粘度。結(jié)果表明川芎內(nèi)酯A、B降低血小板聚集率，全血粘度及血漿粘度，提示川芎內(nèi)酯A、B具有活血化瘀之功能。
實(shí)例8 對(duì)麻醉大鼠心臟功能和血流動(dòng)力學(xué)的影響采用麻醉大鼠整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察了川芎內(nèi)酯A、B對(duì)正常大鼠心臟功能和血流動(dòng)力學(xué)的影響。結(jié)果表明川芎內(nèi)酯A、B對(duì)正常開胸大鼠血壓、心率、左心室內(nèi)壓、左室壓最大上升及下降速率和主動(dòng)脈流量沒有影響，提示川芎內(nèi)酯A、B對(duì)大鼠心臟功能沒有負(fù)性肌力作用。
從3個(gè)二聚體的結(jié)構(gòu)分析，二聚化后其結(jié)構(gòu)中仍然保留著不飽和五元內(nèi)酯環(huán)之結(jié)構(gòu)部分，從構(gòu)效學(xué)的觀點(diǎn)出發(fā)，預(yù)計(jì)二聚體應(yīng)保持與聚合單元化合物相似的生物活性，而且二聚體均為結(jié)晶性化合物，其熔點(diǎn)分別為113~115℃，108~110℃，154~156℃，與聚合單元化合物相比要穩(wěn)定得多，而且由于其可結(jié)晶性質(zhì)而易于分離純化，而且采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法可從單元化合物聚合反應(yīng)而成。

另外，具有如下結(jié)構(gòu)類型的化合物同樣具有不飽和五元環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，也應(yīng)具有與川芎內(nèi)酯A、B相似的生理活性。
R1~R8可為氫，亦可為羥基及其它簡單取代基團(tuán)由于川芎內(nèi)酯A占總內(nèi)酯成分的50％±，B占20％±，因此可以認(rèn)定川芎總內(nèi)酯也同樣對(duì)心血管系統(tǒng)有類似的生理活性。
同理，任何以川芎總內(nèi)酯為主，配伍其它中藥的復(fù)方制劑，并以川芎內(nèi)酯A，B或相關(guān)化合物為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的藥物亦應(yīng)有類似的藥效作用。
附 藥理研究實(shí)驗(yàn)報(bào)告書一、川芎內(nèi)酯A，B對(duì)麻醉大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用1.材料1.1 藥物及試劑 川芎。硝基藍(lán)四唑(N-BT)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥材供應(yīng)站批號(hào)，971120。乳酸脫氫酶測定試劑盒(比色法)，北京化工廠，批號(hào)，020205。磷酸肌酸激酶(CPK)測定試劑盒，北京化工廠，批號(hào)，020104。川芎內(nèi)酯A，B1.2 動(dòng)物 雄性Wistar大鼠，體重300-400克，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)醫(yī)動(dòng)字第01-3008。
1.3 儀器DH-140B型動(dòng)物人工呼吸機(jī)(浙江醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠)，BIOPAC多導(dǎo)生理記錄儀(美國)，ZS-3型半自動(dòng)生化分析(北京中生生物工高科技公司)。
2.方法2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?shí)驗(yàn)動(dòng)物用戊巴比妥鈉麻醉(30mg·kg-1ip)。氣管切開，行人工呼吸。呼吸頻率45-50次/分。暴露左頸總動(dòng)脈，插動(dòng)脈套管以監(jiān)測血壓。于胸骨左源3-4肋間，打開胸腔及心包膜，暴露心臟；在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳下緣之間，經(jīng)左冠狀動(dòng)脈下淺層心肌穿一絲線，線的兩端穿過一條直徑2mm的聚乙烯塑料管，其末端用一小動(dòng)脈夾固定。通過打開和夾緊動(dòng)脈夾造成冠狀動(dòng)脈的阻斷與再通。連續(xù)記錄冠狀動(dòng)脈結(jié)扎前后及再通后Π導(dǎo)心電圖。觀察VT、VF的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間。動(dòng)脈血壓和心電圖均同步記錄于多導(dǎo)生理記錄儀。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血，分離血漿測LDH、CPK活性。然后，迅速摘取心臟，左心室稱重后，將其切成1-2mm的心肌薄片，浸于N-BT溶液中染色30分鐘。非缺血區(qū)的心肌組織為深藍(lán)，缺血區(qū)心肌不染色。按稱重法計(jì)算心肌梗死面積。
2.2 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠48只。隨機(jī)隨機(jī)分為6組，每組8只。1)對(duì)照組等量生理鹽水；2)川芎內(nèi)酯A2g.kg-1組；3)川芎內(nèi)酯A1g.kg-1組；4) 川芎內(nèi)酯B2g.kg-1組；5)川芎內(nèi)酯B1g.kg-1組；上述各組于給藥40分鐘后，結(jié)扎左主冠狀動(dòng)脈10分鐘，再灌注20分鐘。6)，假手術(shù)組左主冠狀動(dòng)脈下穿線，不結(jié)扎。
2.3統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；心律失常的發(fā)生率，用X2檢驗(yàn)；其他數(shù)據(jù)分析用單因素方差分析方法。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1對(duì)缺血再灌注所致心律失常的影響 川芎內(nèi)酯A，B2g.kg-1可明顯降低缺血及再灌注時(shí)室性心律失常的發(fā)生率，并縮短其持續(xù)時(shí)間。與單純?nèi)毖俟嘧⒔M比較，有顯著性差異。結(jié)果見表1。
3.2對(duì)心肌梗塞面積和血漿乳酸脫氫酶、磷酸肌酸激酶的影響 川芎內(nèi)酯A，B2g.kg-1均能顯著縮小心肌梗塞面積，血漿乳酸脫氫酶、磷酸肌酸激酶活性增高程度明顯降低，與單純?nèi)毖俟嘧⒔M相比，均有顯著性差異。結(jié)果見表2。
表1 對(duì)大鼠心肌缺血再灌注所致心律失常的影響(x±s) n＝8劑量 VT和VF發(fā)生率(％)持續(xù)時(shí)間(VT+VF)(s)組別(g·kg-1)缺血期 再灌期 缺血期 再灌期假手術(shù)組- - - - -單純I/R組 - 75 312.3±34.8 288.3±55.387.5川芎內(nèi)酯A組 1 50 50 416.6±12.5 212.8±61.22 37.5* 37.5* 48.3±14.6**25.8±1.26**川芎內(nèi)酯B組 1 75 75 360.4±12.8 229.43±85.92 37.5* 37.5* 43.7±21.5**47.3±19.4***P＜0.05； **P＜0.01，與單純I/R組相比。
表2 對(duì)大鼠心肌缺血再灌注所致梗塞面積和LDH、CPK活性的影響X±SD n＝8劑量 LDH CPK 梗塞面積組 別(g.kg-1) (U.mL-1)) (10-3IU.L-1) (％)假手術(shù)組- 112±34 234±87 -單純I/R組 - 211±16**613±114**29.18±4.09川芎內(nèi)酯A組 1 216±22 568±13635.18±3.172 176±32* 286±64*15.38±4.16*川芎內(nèi)酯B組 1 286±55 611±61 35.38±14.762 164±20* 268±46*17.25±6.83*
*P＜0.05；與單純I/R組相比；**P＜0.01；與假手術(shù)組相比。
二、川芎內(nèi)酯A、B對(duì)小鼠耐常壓缺氧作用1.原理缺氧對(duì)機(jī)體是一種劣性刺激，影響機(jī)體各種代謝，特別是影響機(jī)體的氧化功能，最終會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的心腦等重要器官缺氧供能不足而死亡。
2.材料2.1動(dòng)物 小鼠，雄性，體重25-30g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)醫(yī)動(dòng)字第01-3008。
2.2藥品 川芎內(nèi)酯A，B鈉石灰3.方法3.1實(shí)驗(yàn)分組及過程取32只小鼠，隨機(jī)分成4組；給藥組分別灌胃給予川芎內(nèi)酯A，B1.1g.kg-1，2.2g.kg-1；對(duì)照組小鼠給等量生理鹽水；給藥后30分鐘，將小鼠放入盛有5g鈉石灰的廣口瓶內(nèi)，用凡士林涂抹瓶口蓋嚴(yán)，防止漏氣，并立即計(jì)時(shí)；以呼吸停止為指標(biāo)，觀察小鼠因缺氧死亡的時(shí)間。與對(duì)照組比較，測其顯著性。
3.2統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；其他數(shù)據(jù)分析用單因素方差分析方法。
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果川芎內(nèi)酯A、B明顯延長小白鼠在缺氧狀態(tài)下的存活時(shí)間，與對(duì)照組相比，差別有顯著性意義。結(jié)果見表3。
表3 對(duì)小鼠耐常壓缺氧作用的影響X±SDn＝8組 別動(dòng)物數(shù)(n)劑量(g.kg-1) 存活時(shí)間(min)對(duì)照組8- 12.39±1.07川芎內(nèi)酯A組 81.1 12.76±4.57川芎內(nèi)酯A組 82.2 13.91±5.66*川芎內(nèi)酯B組 81.1 20.38±6.89川芎內(nèi)酯B組 82.2 26.11±7.56**與對(duì)照組比較，P＜0.05三、川芎內(nèi)酯A.B對(duì)大鼠血液流變學(xué)的影響1.材料1.1 動(dòng)物Wistar大鼠，雄性，體重240-270g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)醫(yī)動(dòng)字第01-3008。
1.2 器材DIC-PA 3210型血小板聚集儀(日本)LBY-NW1自動(dòng)清洗毛細(xì)管式血漿粘度計(jì)(北京普利生)LBY-NA6自動(dòng)清洗旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì)(北京普利生)1.3藥品及試劑川芎內(nèi)酯A、B二磷酸腺苷ADP(5.3mg/ml)
枸櫞酸鈉抗凝液(3.8％)2方法2.1 實(shí)驗(yàn)分組及過程大鼠按體重隨機(jī)分成5組，每組8只；給藥組分別灌胃給予川芎內(nèi)酯A，B1.0g.kg-1，2.0g.kg-1，對(duì)照組給等量生理鹽水；1小時(shí)后，用戊巴比妥鈉麻醉(30mg.kg-1)；固定后由腹主動(dòng)脈采血，枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)；部分血液1000rpm離心10分鐘，制備富血小板血漿(PRP)；3000rpm再次離心15分鐘，制備貧血小板血漿(PPP)。將PRP與PPP按一定比例調(diào)至所需濃度，用光密度法測定由ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的百分率；部分血液3000rpm離心15分鐘，測定血漿粘度；部分血液測定全血粘度。
2.2 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；其他數(shù)據(jù)分析用單因素方差分析方法。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果川芎內(nèi)酯A、B降低血小板聚集率，與對(duì)照組相比，差別有顯著性意義。結(jié)果見表4。
表4 川芎內(nèi)酯A對(duì)血小板聚集功能的影響X±SD(n＝8)全血粘度 血漿粘度劑量 血小板聚集組別(mPa.s) (mPa.s)(g.kg-1) (％)100S-1200-1對(duì)照組- 48.0±4.954.77±0.92 4.22±0.70 1.44±0.03川芎內(nèi)酯A組 1.041.0±12.98 3.80±0.25*3.37±0.16* 1.24±0.05*川芎內(nèi)酯A組 2.028.9±5.67* 3.39±0.37*3.15±0.31* 1.22±0.08*川芎內(nèi)酯B組 1.040.39±8.45 3.95±0.49*3.51±0.30* 1.35±0.07*川芎內(nèi)酯B組 2.033.98±11.37* 3.92±0.40*3.57±0.23* 1.33±0.12**P＜0.05與對(duì)照組比較四、對(duì)麻醉大鼠心臟功能和血流動(dòng)力學(xué)的影響1.材料1.1 藥物川芎1.2 動(dòng)物雄性SD大鼠，體重300-400g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)醫(yī)動(dòng)字第01-3008。
1.3 儀器DH-140B型動(dòng)物人工呼吸機(jī)，MP-100多導(dǎo)生理記錄系統(tǒng)(美國)，CBI血流儀(美國)。
2.方法2.1 心功能的測定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用戊巴比妥鈉麻醉(30mg.kg-1iv)。氣管切開，行人工呼吸。呼吸頻率45-50次/分。暴露左頸總動(dòng)脈，插動(dòng)脈套管以監(jiān)測血壓(BP)。于胸骨左緣3-4肋間，打開胸腔及心包膜，暴露心臟；用內(nèi)充肝素生理鹽水的聚乙烯塑料管從心尖部插入左室腔內(nèi)，接壓力換能器，觀察左室內(nèi)壓(LSVP)。分離升主動(dòng)脈，嵌入直徑適當(dāng)?shù)奶筋^，通過CBI血流儀測主動(dòng)脈流量。左室壓最大上升及下降速率(±dp/dtmax)，用MP-100的專用程序通過對(duì)LVP的微分求得。BP、HR、LVP、主動(dòng)脈流量和±dp/dtmax均同步記錄于MP-100多導(dǎo)生理記錄系統(tǒng)。術(shù)后穩(wěn)定30分鐘后，首先記錄上述指標(biāo)的正常值；然后經(jīng)十二指腸給藥，觀察給藥后5份、10分、15分、30分、60分上述指標(biāo)的變化。
2.2 實(shí)驗(yàn)分組大鼠40只，隨機(jī)分為5組，每組8只。1.正常對(duì)照組等量生理鹽水組；2.川芎內(nèi)脂A2g.kg-1組；3.川芎內(nèi)脂A1g.kg-1組；4.川芎內(nèi)脂B2g.kg-1組；5.川芎內(nèi)脂B 1g.kg-1組。
2.3統(tǒng)計(jì)分析用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.0中重復(fù)測量方差分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±SD表示。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 對(duì)血壓、心率和心電圖的影響十二指腸給予川芎內(nèi)脂A、B1g.kg-1、2g.kg-1，在觀察時(shí)間內(nèi)對(duì)動(dòng)脈收縮壓和舒張壓、心率沒有影響。結(jié)果見表5、6。
3.2 對(duì)左室內(nèi)壓、左室壓最大上升及下降速率和主動(dòng)脈流量的影響十二指腸給予川芎內(nèi)脂A、B1g.kg-1、2g.kg-1，在觀察時(shí)間內(nèi)對(duì)左室內(nèi)壓、左室壓最大上升及下降速率和主動(dòng)脈流量沒有影響。結(jié)果見表7。
表5 川芎內(nèi)脂A、B對(duì)麻醉大鼠血壓的影響 X±SD n＝8測定 川芎內(nèi)酯A 川芎內(nèi)酯B測定時(shí)間空白組指標(biāo)2.0g/kg2.0g/kg102.20± 113.14±給藥前 100.97±20.2519.01 9.79100.40± 103.67±5分 96.70±15.7318.25 10.00收 102.41± 116.63±10分 96.75±15.43縮 10.30 20.71給壓 96.50±115.70±藥 15分 96.37±13.40(mmHg) 14.90 19.79后95.56±118.20±30分 91.35±16.3516.24 17.0897.48±106.57±60分 93.62±13.9512.47 20.6866.23±給藥前 61.65±16.73 68.23±14.5918.1665.46±5分 65.67±18.37 69.76±16.9610.52舒 60.38±10分 60.55±16.44 64.93±17.70張 14.91給壓 66.50±藥 15分 58.55±17.87 70.80±16.00(mmHg) 19.43后64.28±30分 57.65±18.52 65.12±17.2513.0959.49±60分 59.10±17.34 60.62±16.7319.97表6 川芎內(nèi)脂A、B對(duì)麻醉大鼠心率(bpm)的影響(X±SD n＝8)川芎內(nèi)酯A川芎內(nèi)酯B測定時(shí)間 空白組2.0g/kg 2.0g/kg
203.19± 239.06±給藥前 236.85±7.8433.67 27.31190.27±241.97± 240.00±5分24.15 12.41 23.76192.48±219.81± 241.83±10分 24.74 23.73 24.55給15分 209.23±222.50± 215.97±藥15.68 16.97 23.23后216.19±220.15± 261.25±30分 20.04 20.29 18.6360分 207.14±221.55± 221.04±25.93 15.72 20.08表7 川芎內(nèi)脂A、B對(duì)麻醉大鼠LVSP、LVP±dp/dtmax及CO的影響X±SD n＝8測定川芎內(nèi)酯A 川芎內(nèi)酯B測定時(shí)間 空白組指標(biāo)2.0g/kg 2.0g/kg149.21± 160.10±給藥前 170.02±11.1119.83 11.73148.06± 162.03±5分164.17±5.968.68 18.9110 146.40± 147.78±171.81±7.02LVSP 分 16.03 16.79給(mmHg) 15 143.78± 145.17±藥 172.31±5.85分 14.37 19.31后30 137.48±136.20±5.47 171.09±15.63分 13.8760 138.31±136.20±8.14 159.53±23.16分 11.492551.9± 4138.8±給藥前 3903.3±194.2248.6 425.12604.3± 3952.8±5分 3940.7±281.7264.2 365.810 2621.3± 4100.9±LVP+dp/dtmax3784.9±271.5分 236.8 386.2給15 2572.4± 4018.2±(mmHg/s)藥 3715.3±309.9分 257.9 361.7后30 2365.2± 4135.6±3489.8±330.8分 213.8 349.860 2502.7± 3846.8±3303.7±243.0分 202.8 261.5LVP-dp/dtmax1477.9± 2469.5±給藥前 2847.4±429.8136.8 175.1
(mmHg/s) 1673.2±2330.6±5分 2522.4±330.6183.9292.8101603.3±2683.4±2605.2±385.9分159.2238.9給151673.2±2346.7±藥 2415.3±155.9分156.8377.8后301604.4±2536.5±2424.5±258.9分200.4250.8601464.0±2381.9±2349.7±327.7分187.8255.9135.50±給藥前 136.6±14.9 142.58±17.3914.63129.35±5分 141.9±15.4 159.81±19.0122.4810 134.23±147.8±14.6 153.57±26.32CO分 19.14給(ml/min) 15 131.67±藥156.0±19.4 159.42±26.81分 17.47后30 141.90±200.4±13.8 172.75±35.96分 18.7660 131.06±187.3±14.2 137.47±31.93分 16.85結(jié)論藥理實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明1.川芎內(nèi)酯A，B可明顯降低缺血及再灌注時(shí)室性心律失常的發(fā)生率，持續(xù)時(shí)間縮短；顯著縮小心肌梗塞面積，血漿乳酸脫氫酶、磷酸肌酸激酶活性增高程度明顯降低。表明川芎內(nèi)酯A，B對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。
2.川芎內(nèi)酯A、B明顯延長小白鼠在缺氧狀態(tài)下的存活時(shí)間，提示川芎內(nèi)酯A，B可以提高小白鼠的耐缺氧能力。
3.川芎內(nèi)酯A、B降低血小板聚集率，全血粘度及血漿粘度，表明川芎內(nèi)酯A、B具有活血化瘀之功能。
4.川芎內(nèi)酯A、B對(duì)正常開胸大鼠血壓、心率、左心室內(nèi)壓、左室壓最大上升及下降速率和主動(dòng)脈流量沒有影響，表明川芎內(nèi)酯A、B對(duì)大鼠心臟功能沒有負(fù)性肌力作用。
以上結(jié)果為川芎內(nèi)酯A，B治療缺血性心臟病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種治療缺血性心臟病的川芎內(nèi)酯，其特征在于該川芎內(nèi)酯是由川芎飲片提取的川芎總內(nèi)酯所包含的，其中川芎內(nèi)酯A與川芎內(nèi)酯B分別占總內(nèi)酯成分重量的50％±10％和20％±5％，總內(nèi)酯中還有少量二聚體，該二聚體共有3種，上述成分的分子結(jié)構(gòu)式如下 川芎內(nèi)酯A 川芎內(nèi)酯B 二聚體1 二聚體2 二聚體3利用1HNMR，13CNMR及EIMS法鑒定了川芎內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)，其光譜數(shù)據(jù)如下川芎內(nèi)酯A為化合物4，5-二氫-3-丁叉基苯肽(4，5-dihydro-3-butylidene-phthalide)，系淺黃色油狀物。EIMS m/z(％)190(M+，72)，161(100)，134(28)，133(26)，106(50)，105(60)，78(50)，77(50)，55(90).分子式C12H14O2。分子量190。1HNMR(CDCl3)δ0.91(3H，t，J＝7.5，H-11)，1.46(2H，Hexa，J＝7.5，H-10)，2.33(2H，q，J＝7.5，H-9)，2.44(2H，m，H-5)，2.57(2H，t，J＝7.2，H-4)，5.19(1H，t，J＝7.5，H-8)，5.97(1H，dt，J＝10.0，5.0，H-6)，6.23(1H，dt，J＝10.0，2.0，H-7)。13CNMR(CDCl3)δ13.7(q，C-11)，18.4(t，C-10)，22.3(t，C-9，5)，28.0(t，C-4)，112.8(d，C-8)，116.9(d，C-7)，123.9(s，C-7a)，129.9(d，C-6)，147.0(s，C-3a)，148.5(s，C-3)，167.5(s，C-1)；川芎內(nèi)酯B為化合物4，5-二氫-3-丁基苯肽(4，5-dihydro-3-butyl-phthalide)，系淺黃色油狀物。EIMS m/z(％)192(M+，25)，163(5)，135(10)，107(100)，79(40)，77(35)，分子式C12H16O2，分子量192。1HNMR(CDCl3)δ0.87(3H，t，J＝7.5，H-11)，1.36(4H，m，H-9，10)，1.50(1H，m，H-8a)，1.85(1H，m，H-8b)，2.43(2H，m，H-4)，2.47(2H，m，H-5)，4.90(1H，dd，J＝8.0，3.5，H-3)，5.88(1H，dt，J＝9.5，4.5，H-6)，6.16(1H，dt，J＝9.5，2.5，H-7)。13CNMR(CDCl3)δ13.8(q，C-11)，20.7(t，C-10)，22.3(t，C-9)，22.4(t，C-8)，26.7(t，C-5)，31.9(t，C-4)，82.5(d，C-3)，116.8(d，C-7)，124.4(s，C-7a)，128.3(d，C-6)，161.4(s，C-3a)，171.2(s，C-1)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療缺血性心臟病的川芎內(nèi)酯，其特征在于該川芎內(nèi)酯是指川芎內(nèi)酯A。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療缺血性心臟病的川芎內(nèi)酯，其特征在于該川芎內(nèi)酯是指川芎內(nèi)酯B。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的治療缺血性心臟病的川芎內(nèi)酯，其特征在于該川芎內(nèi)酯是由川芎內(nèi)酯A、B合成的川芎內(nèi)酯A、B二聚體，該二聚體為結(jié)晶性化合物，它具有與川芎內(nèi)酯A、B相同的不飽和五元內(nèi)酯環(huán)及環(huán)外丁(烯)基活性基團(tuán)。
5.用于權(quán)利要求1所述的川芎內(nèi)酯的制備方法，其特征在于取川芎飲片以乙醇滲漉，二者重量比為1∶4，滲漉液減壓回收乙醇至無乙醇味，加入與殘物等體積的水，充分?jǐn)嚢韬箪o置分層，取上層油脂層以石油醚溶解，用含水甲醇萃取，甲醇萃取物行硅膠柱層析，以石油醚∶乙酸乙酯(20∶1)除油脂，再用石油醚∶乙酸乙酯(8∶1)洗出川芎總內(nèi)酯。
6.用于權(quán)利要求5所述的川芎內(nèi)酯的制備方法，其特征在于取總內(nèi)酯置硅膠柱中，以石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)進(jìn)行層析分離。收集亮蘭色熒光部分，用作川芎內(nèi)酯A的精制；取隨后之熒光吸收部分用作川芎內(nèi)酯B的精制。
7.用于權(quán)利要求6所述的川芎內(nèi)酯的制備方法，其特征在于取收集的亮蘭色熒光部分(油狀物)進(jìn)行ODS層析分離，以含水甲醇為洗脫劑，收集亮蘭色熒光部分，減壓回收甲醇，殘物加入無水乙醇反復(fù)脫水，得淺黃色油狀物川芎內(nèi)酯A；取熒光吸收部分(油狀物)按上述方法層析分離，收集TLC單一熒光吸收斑點(diǎn)組分，回收甲醇，無水乙醇脫水，得淺黃色油狀物川芎內(nèi)酯B。
全文摘要
本發(fā)明是一種治療缺血性心臟病的川芎內(nèi)酯及其制備方法，由中藥川芎飲片中提取出川芎總內(nèi)酯，該總酯中川芎內(nèi)酯A、B占70％，并有少量川芎內(nèi)酯A、B二聚體。實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)證明川芎內(nèi)酯A、B對(duì)麻醉大鼠心肌缺血再灌注損傷具有非常顯著的保護(hù)作用，并能顯著提高小鼠耐缺氧能力，該二化合物及其相關(guān)化合物結(jié)構(gòu)明確，可研制成用于治療缺血性心臟病的二類或一類新藥。
文檔編號(hào)A61P9/10GK1569848SQ03146029
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2003年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月14日
發(fā)明者肖永慶, 梁日欣, 李文, 李麗, 張村 申請(qǐng)人:中國中醫(yī)研究院中藥研究所