專利名稱：格爾德霉素在制備治療嚴重急性呼吸綜合癥(sars)藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及格爾德霉素(Geldanamycin)在制備治療嚴重急性呼吸綜合癥(SARS)藥物中的應(yīng)用。
2003年上半年，我國及世界二十余個國家遭遇了突發(fā)性的嚴重急性呼吸綜合癥(severe acute respiratory syndrome，英文縮寫SARS)(以下簡稱SARS)的襲擊，該病由SARS冠狀病毒所致，傳染性極強，傳染快，潛伏期短，僅有2～14天，感染人數(shù)多，發(fā)病死亡率高，危害極大，且尚無特效抗病毒藥物。
格爾德霉素是由中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所于湖北省武漢市珞珈山地區(qū)土壤中分離的格爾德霉素產(chǎn)生菌(放線菌C-3559)的發(fā)酵液中分離純化的具有廣譜抗病毒作用(包括DNA及RNA病毒)的次級代謝產(chǎn)物。
放線菌C-3559屬于鏈霉菌的吸水類群，黑漆鏈霉菌，S.atrolaccus Yen 1957。其形態(tài)特征包括基絲不斷裂，只有氣絲形成孢子鏈，孢子絲呈緊密螺旋形，不形成菌核和分子孢子器，孢子表面光滑，培養(yǎng)特征包括孢子成熟后，孢子絲自溶使菌落表面形成黑色粘性濕斑(吸水現(xiàn)象)。

生理特征包括1.碳源利用在葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、麥芽糖和肌醇等碳源的培養(yǎng)基生長良好。2.其它生理特征纖維素不利用，牛奶胨化，硝酸鹽還原陰性。細胞壁化學特征包括含LL-DAP屬細胞壁I型，糖型C，不含特征性糖。
格爾德霉素的提取、分離方法1.發(fā)酵液過濾后濾液上X5大孔吸附樹脂柱，吸附完畢水沖后，用80％丙酮洗下有效部分，除去丙酮有黃色沉淀為格爾德霉素粗品。
2.上述格爾德霉素粗品，再用大孔吸附柱進行第二次層析，用80％丙酮洗下有效部分，純度在90％以上，放在冰箱中析出黃色針狀結(jié)晶，即為純度達95％以上的格爾德霉素。再進行二次重結(jié)晶，純度可達98％以上的格爾德霉素。提取回收率可達30％～35％。
對采用上述方法在放線菌C-3559的發(fā)酵液中提取分離的單一有效組分，即C-3559活性組份理化性質(zhì)的測定及鑒別對活性組份進行穩(wěn)定性、熔點、溶解度，元素分析，UV、IR、MS及1HNMR及18CNMR及DEPT譜等波譜的測定，并進行了文獻資料的檢索，發(fā)現(xiàn)它與苯安沙霉素類中的格爾德霉素相同。
將兩者的性質(zhì)列表比較于下表

根據(jù)上述數(shù)據(jù)，我們推斷活性組分C-3559應(yīng)有與格爾德霉素相同的結(jié)構(gòu)。
用2003年2月北京SARS病流行期間由軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所微生物檢驗研究中心病毒室從北京病人肺組織分離的病毒BJ01株及其敏感的Vero-E6細胞，按《新藥(西藥)臨床前研究指導原則》中體外抗病毒藥效試驗部分的規(guī)定，檢測格爾德霉素(以下簡稱C-3559)對Vero-E6細胞的毒性和在Vero-E6細胞內(nèi)對SARS冠狀病毒的抑制效果。重復實驗表明格爾德霉素(C-3559)在Vero-E6細胞內(nèi)抑制SARS冠狀病毒的IC50為0.34～1.57umol/L，陽性對照藥利巴韋林的IC50為52.0ug/ml。說明格爾德霉素(C-3559)能明顯抑制SARS冠狀病毒復制。
下面是針對本發(fā)明格爾德霉素進行的藥物體外抗SARS冠狀病毒藥效檢測報告。
一.試驗目的檢測C-3559體外抗SARS冠狀病毒的作用。檢測單位軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所微生物檢驗研究中心病毒室。
二.材料1.受試藥C-3559(純度＞98％)，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供。
2.陽性對照藥物利巴韋林(病毒唑)注射液，0.1g/ml，山東新華制藥股份有限公司生產(chǎn)，批準文號H19993063，批號02100020。臨床用途用于呼吸道合胞病毒引起的病毒性肺炎與支氣管炎。臨床成人日用量為一次0.5g，一日2次。
3.細胞Vero-E6細胞，本室細胞庫保存。用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天，傳代一次。
4.病毒株SARS冠狀病毒，2003年2月SARS冠狀病毒流行期間，由本室從北京病人肺組織中分離病毒BJ01株，第5代。
5.試劑DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清，Gibco BRL公司產(chǎn)品，批號分別為31600-026和16000-36。
6.儀器96孔細胞培養(yǎng)板，Corning公司。生物倒置顯微鏡XDS-1B型，重慶光學儀器廠。
三.方法與結(jié)果(1)藥品的配制方法受試藥C-3559，黃色粉末，用DMSO配制成10mmol/L母液，0.22μm一次性針頭式濾器過濾除菌，4℃保存。陽性對照藥用純水配制成10mg/ml母液。使用時用細胞生長液配制成所需濃度。
2.C-3559對Vero-E6細胞的毒性作用每毫升30～40萬個Vero-E6細胞接種96孔細胞培養(yǎng)板，每孔0.1ml，置37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，加入不同濃度的測試藥，測試藥倍比稀釋為80～5μmol/L，每個濃度4孔，每孔0.1ml，同時設(shè)無藥物細胞對照組，培養(yǎng)5天，以觀察細胞形態(tài)變化(CPE)為指標，每天在倒置顯鏡下觀察記錄CPE，完全形態(tài)變化為4；75％為3；50％為2；25％為1；無形態(tài)變化為0。按照REED-MUENCH方法，計算該藥對Vero-E6細胞的最大無毒濃度(TD0)為20μmol/L和半數(shù)中毒濃度(TD50)為30μmol/L。陽性對照藥利巴韋林的TD0和TD50為大于6000μg/ml。試驗重復二次，結(jié)果一致。
3.SARS冠狀病毒毒力測定(微量法)SARS冠狀病毒BJ01株第5代病毒液用DMEM維持液連續(xù)10倍稀釋10-1～10-10。將稀釋的不同濃度的病毒液接種到已長成單層的Vero-E6細胞96孔培養(yǎng)板孔內(nèi)，每個濃度4孔，每孔0.1ml，同時設(shè)正常細胞對照，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)觀察CPE 5～7天，記錄結(jié)果。按照REED-MUENCH方法計算半數(shù)感染劑量(TCID50)。
4.C-3559對SARS冠狀病毒的抑制試驗(細胞形態(tài)變化法)將每毫升30～40萬個Vero-E6細胞接種到96孔培養(yǎng)板，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄掉生長液，將SARS冠狀病毒BJ01株第5代病毒液，用DMEM維持液稀釋為10～100個TCID50/0.1ml，每孔0.1ml接種Vero-E6細胞，吸附2小時，棄掉病毒液。加入不同濃度藥液，測試藥倍比稀釋為20～0.3μmol/L，每孔0.1ml。同時設(shè)立正常細胞對照、病毒對照和陽性藥物對照組。37℃培養(yǎng)，每天觀察細胞形態(tài)變化。試驗以病毒對照孔完全形態(tài)變化時為最終觀察時間，記錄CPE.按REED-MUENCH方法計算C-3559的半數(shù)有效濃度(IC50).試驗重復二次，結(jié)果見下表。
C-3559抗SARS病毒IC50

小結(jié)C-3559在VERO-E6細胞內(nèi)抑SARS冠狀病毒的IC50為0.34～1.57μmol/L，陽性對照藥利巴韋林的IC50為52.0μg/ml。
4.結(jié)論(1)C-3559對Vero-E6細胞的毒性C-3559加入Vero-E6細胞中培養(yǎng)5天，以細胞形態(tài)變化為指標，C-3559的TD0為20μmol/L，TD50為30μmol/L。
(2)C-3559在Vero-E6細胞中對SARS冠狀病毒的抑制作用C-3559抑制SARS冠狀病毒的IC50為0.34～1.57μmol/L；試驗表明C-3559可明顯抑制SARS冠狀病毒復制；平均IC50為0.96μmol/L。
(3)C-3559的治療指數(shù)(TI)為19～88。
(4)陽性對照藥利巴韋林的IC50為52.0μg/ml，TI＞115。注IC50＝抑制50％細胞病變或蝕斑形成的藥物濃度。
治療指數(shù)＝TD50/IC50
權(quán)利要求
1.格爾德霉素在制備治療嚴重急性呼吸綜合癥(SARS)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
格爾德霉素在制備治療嚴重急性呼吸綜合癥藥物中的應(yīng)用。以細胞病變法格爾德霉素對SARS冠狀病毒的抑制試驗表明格爾德霉素對SARS冠狀病毒復制具有明顯抑制作用，IC
文檔編號A61P31/14GK1460474SQ0314659
公開日2003年12月10日 申請日期2003年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月8日
發(fā)明者陶佩珍, 婁志賢, 姚天爵 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所