專利名稱：鼠尾草酸在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鼠尾草酸在制藥領(lǐng)域的新用途，特別是在制備治療柯薩奇病毒感染疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)為唇形科迷迭香屬藥用植物，為常綠灌木，以全草入藥。迷迭香又稱“海洋之露”，“圣馬麗亞的玫瑰”，英文名Rosemary。迷迭香地中海沿岸叢生，目前在我國(guó)已有種植。
傳統(tǒng)中醫(yī)藥認(rèn)為，迷迭香性溫味辛，具有芳香健胃、鎮(zhèn)靜安神等功效，常用于治療各種頭痛、神經(jīng)衰弱等。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的研究證明，迷迭香揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、霍亂弧菌等具有抑制殺滅作用；迷迭香及其提取物，如鼠尾草酸(carnosic acid)還具有抗氧化功能等，現(xiàn)已被廣泛用作抗氧化劑、香料及調(diào)味品等。故而迷迭香及其提取物，如鼠尾草酸等的開發(fā)應(yīng)用，引起了科學(xué)界的極大興趣，也受到國(guó)際醫(yī)藥界的廣泛重視，成為當(dāng)今開發(fā)研究的熱門話題(Oxidation，Reduction，and Methylation ofCarnosic Acid by Nocardia.Mohammed Hosny，Holly A.Johnson，et al.J.Nat.Prod.2002，65，1266-1269.)。
該鼠尾草酸的分子量為332，其結(jié)構(gòu)式為
上述鼠尾草酸的制備方法如下將迷迭香全草加入3-10倍(重量)的50％-95％乙醇，于40-80℃加熱提??；將提取液減壓濃縮后，加水稀釋，用氯仿充分萃取多次，減壓濃縮氯仿抽出物，進(jìn)行硅膠柱(氯仿抽提物與硅膠以體積比為1∶20～1∶50上柱)層析分離；選用正己烷∶乙酸乙酯(體積比為從100∶1到20∶80)梯度洗脫，分部收集流份，通過(guò)薄層檢查后合并；分出含有鼠尾草酸的流份進(jìn)行葡聚糖柱(Sephadex)分離；用溶劑甲醇∶氯仿(體積比)為1∶1洗脫，分部收集，通過(guò)薄層檢查后合并，分出鼠尾草酸部位。
其中，上述薄層檢測(cè)條件為∶硅膠薄板；展開劑選用氯仿和甲醇，氯仿∶甲醇(體積比)＝8.5∶1.5。
但目前還沒有鼠尾草酸等迷迭香提取物有抑制柯薩奇病毒的相關(guān)報(bào)道。
另一方面，柯薩奇病毒屬于腸道病毒，分布廣泛。依病毒亞群和血清型的不同或?qū)Σ煌M織的嗜性不同(受體差異)，可引起各種不同的疾病。他們首先在人類消化道細(xì)胞內(nèi)繁殖，然后釋放，再通過(guò)血液循環(huán)侵犯其它器官，引起各種臨床綜合癥?，F(xiàn)已公認(rèn)柯薩奇B組病毒是引起心肌炎最常見的一種病毒。它可引起各年齡組人發(fā)生心肌炎并遺留永久性心肌損傷，新生兒可造成較高的死亡率?？滤_奇病毒B組3型能引起無(wú)菌性腦膜炎、肌無(wú)力和麻痹、皮疹和粘膜疹、心包膜炎、心肌炎、呼吸道疾病結(jié)膜炎、嬰兒的全身感染等疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)全球病毒監(jiān)測(cè)研究報(bào)導(dǎo)顯示，柯薩奇病毒B3(CVB3)在人群中感染最為常見。在新生兒、兒童突發(fā)死亡病例中，20％為病毒心肌炎所致。病毒性心肌炎在新生兒、兒童中的發(fā)病率為360/10萬(wàn)，死亡率為8％。1993年我國(guó)沈陽(yáng)發(fā)生的新生兒柯薩奇病毒感染流行中死亡率為18.4％。病毒性心肌炎(Viral Myocarditis VMC)是病毒侵犯心臟引起的以心肌壞死和間質(zhì)內(nèi)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主要病理變化的一種常見病。許多報(bào)道已證實(shí)了該病的致病原因主要與腸道病毒，特別是CVB3有關(guān)。由于病毒感染后可在心肌中持續(xù)存在，并且目前缺乏有效的抗病毒治療手段。因此，被CVB3感染的患者往往表現(xiàn)為難治愈、病程長(zhǎng)。目前尚無(wú)有效治療柯薩奇病毒的藥物，因此，研究開發(fā)抗柯薩奇B組病毒藥物，特別是抗CVB3的藥物具有現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述課題，開發(fā)研究在迷迭香中提取鼠尾草酸，提供該鼠尾草酸的新用途，即在制藥中的新應(yīng)用。
具體而言，本發(fā)明提供了鼠尾草酸在抑制柯薩奇病毒活性方面的應(yīng)用。
特別提供了制備治療柯薩奇病毒感染疾病的藥物中的應(yīng)用。
進(jìn)一步提供了制備治療柯薩奇B3型病毒感染疾病的藥物中的應(yīng)用。
為更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面以實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明中鼠尾草酸的制備方法，以及其抑制柯薩奇病毒活性的效果。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)上述現(xiàn)有技術(shù)制備鼠尾草酸。
實(shí)施例1將迷迭香全草500克加入3倍的50％乙醇，于40℃加熱提??；將提取液減壓濃縮后，加水稀釋，用氯仿充分萃取多次，減壓濃縮氯仿抽出物，進(jìn)行硅膠柱(氯仿抽提物與硅膠以1∶20上柱)層析分離；選用正己烷∶乙酸乙酯(體積比為從100∶1到25∶75)梯度洗脫，分部收集流份，通過(guò)薄層檢查后合并；分出含有鼠尾草酸的流份進(jìn)行葡聚糖柱(Sephadex)分離；用溶劑甲醇∶氯仿(體積比)為1∶1洗脫，分部收集，通過(guò)薄層檢查后合并，分出鼠尾草酸部位。
其中，上述薄層檢測(cè)條件為硅膠薄板；展開劑選用氯仿和甲醇，氯仿∶甲醇＝8.5∶1.5。
實(shí)施例2將迷迭香全草750克加入10倍的95％乙醇，于80℃加熱提??；將提取液減壓濃縮后，加水稀釋，用氯仿充分萃取多次，減壓濃縮氯仿抽出物，進(jìn)行硅膠柱(氯仿抽提物與硅膠以1∶50上柱)層析分離；選用正己烷∶乙酸乙酯(體積比為從90∶10到40∶60)梯度洗脫，余下步驟同實(shí)施例1。
實(shí)施例3將迷迭香全草1000克加入7倍的75％乙醇，于60℃加熱提?。粚⑻崛∫簻p壓濃縮后，加水稀釋，用氯仿充分萃取多次，減壓濃縮氯仿抽出物，進(jìn)行硅膠柱(氯仿抽提物與硅膠以1∶40上柱)層析分離；選用正己烷∶乙酸乙酯(體積比為從95∶5到30∶70)梯度洗脫，其余步驟同實(shí)施例1。
上述實(shí)施例中的迷迭香原料來(lái)自從地中海國(guó)家引進(jìn)，種于我國(guó)西部(如云南、貴州等)的迷迭香。
上述實(shí)施例中所得的鼠尾草酸具有抑制柯薩奇病毒活性的作用，可用于制備治療柯薩奇病毒感染疾病的藥物，通過(guò)下面的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)明其活性。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1.測(cè)試項(xiàng)目抗柯薩奇B3病毒(CoxB3)活性2.測(cè)試原理以Vero(非洲綠猴腎)細(xì)胞為病毒宿主，測(cè)定樣品抑制柯薩奇B3病毒引起Vero細(xì)胞病變程度。
3.測(cè)試材料和方法1)測(cè)試材料a.病毒株柯薩奇B3病毒由美國(guó)ATCC提供。COXB3病毒所用Vero細(xì)胞的培養(yǎng)液為MEM(不含谷氨酰胺)。實(shí)驗(yàn)時(shí)加入NaHCO3調(diào)整pH后，再加入抗生素，谷氨酰胺和牛血清。
b.樣品處理樣品臨用前溶于DMSO配成100mg/ml作為母液，將其稀釋100倍為1000μg/ml作為開始檢測(cè)的第一個(gè)濃度(高濃度)，將前一個(gè)濃度用培養(yǎng)液稀釋3倍得到后一個(gè)濃度，依次類推，按濃度高低順序得到8個(gè)濃度的樣品溶液。
c.陽(yáng)性對(duì)照藥病毒唑(RBV)，浙江康裕藥業(yè)有限公司(批號(hào)960501)。
2)測(cè)試方法Vero細(xì)胞種96孔培養(yǎng)板，24小時(shí)后分別感染柯薩奇B3病毒1/210-5(100TCID50感染量)，吸附2小時(shí)，棄病毒液，按以上稀釋度加入樣品，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔和病毒對(duì)照孔，36小時(shí)觀察細(xì)胞病變程度(CPE)用Reed-Muench法分別計(jì)算樣品對(duì)柯薩奇B3病毒的半數(shù)抑制濃度(IC50)。
4.測(cè)試結(jié)果，具體如下表所示

注TC50半數(shù)有毒濃度；IC50對(duì)病毒半數(shù)抑制濃度；SI選擇指數(shù)，SI＝TC50/IC50。
5.結(jié)論測(cè)試結(jié)果顯示樣品鼠尾草酸在Vero細(xì)胞上有抗柯薩奇B3病毒活性，并且鼠尾草酸對(duì)柯薩奇B3病毒有顯著的抑制效果，IC50為12μg/ml，選擇指數(shù)SI為41.66。
權(quán)利要求
1.鼠尾草酸在抑制柯薩奇病毒活性方面的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于該應(yīng)用是指制備治療柯薩奇病毒感染疾病的藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于該柯薩奇病毒為B3型。
全文摘要
本發(fā)明公開了鼠尾草酸抑制柯薩奇病毒的活性，特別是柯薩奇B3型病毒活性的新用途，該物質(zhì)可用于抑制柯薩奇病毒的活性，特別是制備治療柯薩奇病毒感染疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61P31/14GK1600303SQ0315125
公開日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2003年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月26日
發(fā)明者劉桂云 申請(qǐng)人:上海市新文達(dá)生物科技有限公司