專利名稱：槐果堿在制備由冠狀病毒引起的疾病的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗病毒藥物的用途及制備，進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及槐果堿作為抗病毒藥物的用途及其制備方法。
背景技術(shù)：
嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndromes，SARS)是近來流行于我國(guó)和世界其他地區(qū)的一種新型的呼吸道傳染性疾病，由于其具有較強(qiáng)的傳染性和較高的死亡率，它的流行和發(fā)展已經(jīng)嚴(yán)重威脅到我國(guó)人民的生命安全和身體健康，并造成了一定的社會(huì)恐慌。SARS是主要通過近距離空氣飛沫和密切接觸傳播的呼吸道傳染病，臨床主要表現(xiàn)為肺炎，在家庭和醫(yī)院有顯著的群發(fā)現(xiàn)象。起病急，以發(fā)熱為首發(fā)癥狀，體溫一般高于38℃，偶有畏寒；可伴有頭痛、關(guān)節(jié)酸痛、肌肉酸痛、乏力、腹瀉；可有咳嗽，多為干咳、少痰，偶有血絲痰；可有胸悶，嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸加速，氣促，或明顯呼吸窘迫?，F(xiàn)已確定SARS的病原體是一種冠狀病毒，許多國(guó)家和地區(qū)都在著手研究臨床診斷、預(yù)防和治療SARS的方法。
目前發(fā)現(xiàn)SARS患者痊愈后體內(nèi)產(chǎn)生抗體，從其血液中獲得的免疫球蛋白具有一定的治療效果。但是，這種途徑局限性很大。一方面，很難獲得足夠的血液來源，不能規(guī)模生產(chǎn)。另一方面，這種途徑獲得的血液數(shù)量很少，無法象規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)品那樣進(jìn)行嚴(yán)格、系統(tǒng)的檢驗(yàn)鑒定，很容易造成其他疾病的傳播。另一方面，可以從基因工程領(lǐng)域著手研究，開發(fā)可批量生產(chǎn)的抗體藥物，但是這一方案存在研究時(shí)間過于緩慢、開發(fā)資金過于龐大的弊端。
SARS病毒屬于RNA病毒，在現(xiàn)有技術(shù)中，柯薩奇B病毒(CVB)也是一種RNA病毒。本發(fā)明人通過多年的研究，已從眾多的中藥中篩選出唯一一味低毒而明顯對(duì)抗CVB作用的中藥——苦參，其中含有對(duì)抗CVB的有效成分——槐果堿單體(sophocarpine，簡(jiǎn)稱SC)，現(xiàn)已制成純度較高的槐果堿注射液，有關(guān)該項(xiàng)技術(shù)內(nèi)容已經(jīng)在本發(fā)明人的申請(qǐng)?zhí)枮镃N99119850的專利中公開?；赟ARS病毒與柯薩奇B病毒存在的共同點(diǎn)，發(fā)明人針對(duì)SARS病毒進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)槐果堿也有明顯的抗SARS病毒、保持未感染細(xì)胞的活性作用，由此可確定槐果堿對(duì)抗SARS病毒是有效果的。
苦參是我國(guó)歷史悠久的傳統(tǒng)藥物之一，始載于我國(guó)最早的醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，具有清熱燥濕、祛風(fēng)殺蟲的功能，主治心腹痞滿脹氣、癥瘕積聚、黃疸等。我國(guó)藥典1997年版及部分地方藥品標(biāo)本已將《苦豆草流浸片》收載主治菌痢及腸炎(<中草藥學(xué)(中冊(cè))>，1976年8月第一版，494-495)。晚近的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，苦參生物堿對(duì)中樞神經(jīng)有抑制、鎮(zhèn)痛及降溫作用，能提高機(jī)體免疫力，并有抗癌作用。苦參提取物苦參生物堿能治療乙肝，有改善臨床癥狀及肝功能、使部分患者HbeAg轉(zhuǎn)陰的效果。有文獻(xiàn)記載苦參生物堿具有平喘及抗心律失常的作用。本發(fā)明人的申請(qǐng)?zhí)枮镃N99119850的專利中公開了從苦參中提取的生物堿——槐果堿作為制備治療柯薩奇B病毒性心肌炎的藥物的應(yīng)用。但至今未見使用苦參生物堿制備治療SARS病毒藥物的報(bào)導(dǎo)。
從豆科槐屬植物苦參(Sophora flavescens Ait)及豆科槐屬植物苦豆子(Sophora alopecuroides L.)的干燥根及其地面部分中所提取的物質(zhì)，已可分離出20余種生物堿，其中槐果堿是其中主要的一種，分子式為C15H22ON2，熔點(diǎn)為53-54℃，[α]D-32.9°，(t＝15，乙醇)，其結(jié)構(gòu)式為

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種槐果堿在制備由冠狀病毒引起的疾病的藥物中的用途，所述的藥物的劑型為藥劑學(xué)上認(rèn)可的任何一種劑型。
進(jìn)一步地，本發(fā)明目的還在于提供了一種槐果堿在制備由冠狀病毒引起的嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(SARS)的藥物中的用途。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于提供槐果堿作為制備由冠狀病毒引起的嚴(yán)重急性呼吸綜合癥藥物的制備方法，該方法包括如下步驟(1)將苦豆子粉碎，加入5-10％氫氧化氨濕潤(rùn)，經(jīng)氯仿回流加熱提取，加入7-15％硫酸萃取，獲得總生物堿(2)總生物堿通過加入甲苯萃取，然后加入5-10％鹽酸提取槐果堿；(3)調(diào)節(jié)pH5-10，抽濾，再以丙酮重結(jié)晶，獲槐果堿精品；(4)將槐果堿精品溶解于注射用水中，過濾，含量測(cè)定，調(diào)節(jié)pH4.0-4.5；(5)通過0.65um微孔濾膜灌裝、封口，經(jīng)流通蒸汽100℃滅菌30分鐘即可制得注射針劑。
在本發(fā)明的槐果堿作為制備由冠狀病毒引起的嚴(yán)重急性呼吸綜合癥藥物的制備方法中，注射針劑中槐果堿的濃度介于100-800μg/ml之間。更佳的，注射針劑中槐果堿的濃度介于100-600μg/ml之間。
本發(fā)明所述的槐果堿能夠有效阻止冠狀病毒的生物合成(包括蛋白合成)，并進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗病毒作用，槐果堿的結(jié)構(gòu)如下
本發(fā)明的發(fā)明人在以前的研究中，針對(duì)一種RNA病毒——柯薩奇B病毒(CVB)，從眾多中藥中篩選出一味低毒而明顯抗CVB的中藥——苦參，其中含有對(duì)抗CVB的有效成分——槐果堿單體。由于SARS病毒是一種冠狀病毒，也屬于RNA病毒，根據(jù)槐果堿對(duì)抗病毒的機(jī)理，認(rèn)為其也有抗SARS病毒的效果，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定槐果堿可作為一種治療SARS的有效藥物。
為了驗(yàn)證槐果堿的抗病毒功效，尤其是抗SARS病毒功效，本發(fā)明人作了深入的研究。在槐果堿藥物體外抗SARS病毒活性篩選中，以Vero-E6細(xì)胞作為病毒宿主細(xì)胞(易感細(xì)胞)，檢測(cè)樣品抵抗病毒感染細(xì)胞的作用，其檢測(cè)指標(biāo)為細(xì)胞病變反應(yīng)(Cell Pathogenic Effect，CPE)以及感染細(xì)胞保護(hù)率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在體外篩選模型中，槐果堿樣品在100μg/ml以上濃度時(shí)顯示明顯的抗SARS病毒、保護(hù)感染細(xì)胞的活性。接著進(jìn)行復(fù)篩，再次實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果進(jìn)一步表明，槐果堿在100μg/ml以上濃度時(shí)顯示有明顯的抗SARS病毒、保護(hù)被感染細(xì)胞的活性作用，在100μg/ml以下濃度時(shí)也有一定的活性，并且在上述的實(shí)驗(yàn)濃度中對(duì)Vero-E6細(xì)胞未見明顯的細(xì)胞毒性作用。
由于冠狀病毒所致的SARS以呼吸道癥狀為突出，槐果堿在中藥中有平喘作用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)犬的相關(guān)血流動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)槐果堿能使已經(jīng)升高的肺毛細(xì)楔嵌壓(PCWP)下降至正常水平，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，其PCWP由給藥前的18mmHg下降至12mmHg，并保持穩(wěn)定?；惫麎A的使用還有利于降低肺循環(huán)阻力，改善肺郁血，降低心臟的前負(fù)荷、后負(fù)荷，有利于對(duì)心臟功能的保護(hù)。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，對(duì)大鼠的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)還證明，由于槐果堿在肺臟中的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過血濃度，而且維持時(shí)間較長(zhǎng)，有利于改善肺部癥狀，以及有利于SARS病毒的去除。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，采用細(xì)胞抑制病變法顯示，槐果堿的濃度在312ug/ml時(shí)，病毒對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的毒性消失。低于毒性濃度的槐果堿，即使是5ug/ml也能抑制病毒對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的致病變作用。3H-TdR滲入法證實(shí)、以及MTT微量檢測(cè)法和結(jié)晶紫染色法證實(shí)，槐果堿在高濃度和低濃度時(shí)，對(duì)感染病毒后培養(yǎng)細(xì)胞的DNA合成、能量代謝以及細(xì)胞存活數(shù)均有影響，并且隨藥物濃度的增加呈正相關(guān)。
在本發(fā)明中，槐果堿已經(jīng)驗(yàn)證具有明顯的抗SARS病毒功效，由于SARS病毒屬于一種冠狀病毒，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，槐果堿對(duì)于SARS病毒以外的其他類似的冠狀病毒也可能有一定的抗病毒作用，并能阻止它們的生物合成。
在本發(fā)明的用途中，有效成分槐果堿以注射液形式給藥，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，包含槐果堿的藥物也可以是其他有效的形式，比如含有槐果堿有效成分的片劑等。
應(yīng)用槐果堿作為SARS的藥物，可以有效提高SARS的治療率、減少死亡率，而且沒有明顯的細(xì)胞毒性作用。
槐果堿可以從豆科槐屬植物苦參以及苦豆子中提取獲得，因此使用槐果堿作為藥物，藥源豐富，毒副作用小，且制備方法操作簡(jiǎn)便，成本低廉，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明實(shí)施例1 槐果堿的提取以及針劑的制備將10kg苦豆子(含葉、花、莖干)粉碎，加入5％氫氧化氨濕潤(rùn)，經(jīng)氯仿回流加熱提取，8％硫酸萃取，獲得總生物堿；對(duì)總生物堿用甲苯萃取，并通過足量7％鹽酸提取槐果堿，調(diào)節(jié)pH8，抽濾，再以丙酮重結(jié)晶，獲槐果堿精品，得率為0.12％。
取一定量的槐果堿溶解于注射用水中，經(jīng)過濾、含量測(cè)定，調(diào)節(jié)pH4.0-4.5，再通過0.65um微孔濾膜灌裝、封口，最后經(jīng)流通蒸汽100℃滅菌30分鐘即可制得注射針劑。
實(shí)施例2 槐果堿藥物抗SARS病毒活性篩選(病毒-細(xì)胞水平模型)測(cè)試樣品為槐果堿；病毒株為BJ-01，來源于北京軍事科學(xué)院微生物流行病研究所。
1.初試實(shí)驗(yàn)以Vero-E6細(xì)胞作為病毒宿主細(xì)胞(易感細(xì)胞)，檢測(cè)樣品抵抗病毒感染細(xì)胞的作用，檢測(cè)指標(biāo)為細(xì)胞病變反應(yīng)(Cell Pathogenic Effect，CPE)以及感染細(xì)胞保護(hù)率。
槐果堿樣品溶于培養(yǎng)液或DMSO，配成適宜的初始濃度，2倍稀釋，7個(gè)稀釋度。
把Vero-E6細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)，SARS病毒感染細(xì)胞后，分別加入不同稀釋濃度的樣品，設(shè)病毒對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照和樣品對(duì)照。每日鏡下觀察結(jié)果，記錄CPE，并用中性紅染色測(cè)定OD值，參照對(duì)照進(jìn)行樣品抗SARS病毒活性作用的計(jì)算和評(píng)估。
測(cè)試結(jié)果見表1。
表1 細(xì)胞病變反應(yīng)和感染細(xì)胞保護(hù)率檢測(cè)結(jié)果最終濃度 CPE 細(xì)胞保護(hù)率 細(xì)胞毒性率(μg/ml) (EC_)％ (CC_)％100 ++ 78 2320+++ 14 334 ++++ 8 16細(xì)胞病變法(CPE)以“+”表示細(xì)胞病變程度，＞25％+，25％-50％++，50％-75％+++，＞75％++++。
被感染細(xì)胞保護(hù)率通過比較病毒對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照和樣品對(duì)照的OD值，計(jì)算樣品對(duì)病毒感染細(xì)胞的保護(hù)活性，保護(hù)率＞EC20初步被認(rèn)為樣品對(duì)病毒感染的細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，有抗病毒活性。
樣品細(xì)胞毒性如果樣品的細(xì)胞毒性與細(xì)胞對(duì)照比大于50(＞CC50)時(shí)，不給評(píng)價(jià)和保護(hù)率計(jì)算。
可見，槐果堿樣品在體外篩選模型中，在100μg/ml以上濃度時(shí)顯示明顯的抗SARS病毒、保護(hù)感染細(xì)胞的活性。
2.復(fù)試實(shí)驗(yàn)(復(fù)篩)通過細(xì)胞培養(yǎng)，連續(xù)觀察多個(gè)不同劑量的槐果堿樣品抗SARS病毒的藥效。步驟為(1)以Vero-E6作為宿主細(xì)胞；(2)感染病毒；(3)細(xì)胞病變(CPE)直接顯微鏡觀察；(4)細(xì)胞活性染色法染色，直接用中性紅染色。
所測(cè)樣品在體外抗SARS病變活性篩選中，經(jīng)再次實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果表明，在100μg/ml以上濃度時(shí)顯示有明顯的抗SARS病毒、保護(hù)被感染細(xì)胞的活性作用，其EC50約為127μg/ml，并在上述的實(shí)驗(yàn)濃度中對(duì)Vero-E6細(xì)胞未見明顯的細(xì)胞毒性作用。
采用細(xì)胞抑制病變法顯示，槐果堿高濃度(如312μg/ml)時(shí)，病毒對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的毒性消失。低于毒性濃度的槐果堿也能抑制病毒對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的致病變作用，用微量細(xì)胞測(cè)定法證實(shí)當(dāng)槐果堿在200μg/ml時(shí)對(duì)體內(nèi)病毒的抑制率為99％，25μg/ml時(shí)對(duì)病毒的抑制率為67％。
另外，當(dāng)病毒感染復(fù)數(shù)為5時(shí)(MOI＝5)，通過3H-TdR滲入法證實(shí)，槐果堿在200-3.125μg/ml時(shí)，以及MTT微量檢測(cè)法、結(jié)晶紫染色法證實(shí)槐果堿在200μg/ml-1.5625μg/ml時(shí)，對(duì)感染病毒后培養(yǎng)細(xì)胞的DNA合成、能量代謝以及細(xì)胞存活數(shù)均有影響，其測(cè)定值隨藥物濃度的增加呈正相關(guān)，γ分別為0.9818，0.9727，0.9219。
實(shí)施例3 動(dòng)物的槐果堿藥理實(shí)驗(yàn)1.犬在犬類動(dòng)物中，用漂浮導(dǎo)管經(jīng)頭頸或股靜脈插入肺動(dòng)脈，進(jìn)入肺毛細(xì)血管，連續(xù)監(jiān)測(cè)肺毛楔壓，動(dòng)態(tài)觀察槐果堿對(duì)肺毛楔壓變化的影響，測(cè)試結(jié)果證實(shí)，槐果堿能使已經(jīng)升高的肺毛楔壓下降至正常水平。
將A犬經(jīng)麻醉并作氣管插管后測(cè)血壓為149/89mmHg，HR(EKG)示148/分，PCWP為17-18mmHg并保持平穩(wěn)。將6mg/kg槐果堿注射液加入5％GS20ml中，以每分鐘1ml速度緩慢推注，PCWP由17mmHg降至9mmHg，10分鐘后回升至13mmHg，相隔20分鐘后再以8mg/kg槐果堿注射液加入5％GS20ml以每分鐘1ml速度緩慢推注，未見PCWP繼續(xù)下降，而穩(wěn)定于12-13mmHg水平，此時(shí)血壓119/70mmHg，HR130/分左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明A犬注射后血壓下降，使已升高的PCWP逐漸下降至一定水平時(shí)即穩(wěn)定，不再下降。
將B犬經(jīng)麻醉并作氣管插管后，由右側(cè)股靜脈插入光纖Swan-Ganz漂浮導(dǎo)管測(cè)毛楔壓，待犬的心率及血壓穩(wěn)定后，測(cè)其PCWP，麻醉后發(fā)現(xiàn)該犬有高血壓心力衰竭，并同時(shí)呼吸道分泌物增多，開胸后發(fā)現(xiàn)心臟增大，第一次測(cè)血壓為270/206mmHg，PCWP為23mmHg。將槐果堿注射液6mg/kg(11.5kg，總量為69mg)加入5％GS250ml中，以每分鐘1ml(含槐果堿0.27mg)的速度持續(xù)靜脈點(diǎn)滴，90分鐘后，該犬血壓下降至154/114mmHg，PCWP為12mmHg，心率下降至116次/分。結(jié)果表明注射后血壓下降的同時(shí)使已經(jīng)升高的PCWP也逐漸下降，但降至穩(wěn)定趨勢(shì)后即保持平穩(wěn)，不再下降。
2.大鼠在大鼠離體心臟冠狀動(dòng)脈灌流的實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)槐果堿能增加冠狀動(dòng)脈流量，在低氧灌流情況下，提高對(duì)心肌的耐缺氧作用。
槐果堿的在Wistar大鼠藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)中，證實(shí)在肺臟內(nèi)藥物濃度遠(yuǎn)超過血濃度，且維持時(shí)間較長(zhǎng)。當(dāng)血藥濃度為7.3350μg/ml時(shí)，肺臟組織中的藥濃度為13.104μg/ml；當(dāng)血藥濃度為4.7870μg/ml時(shí)，肺臟中的藥濃度為10.402μg/ml；當(dāng)血藥濃度為2.8479μg/ml時(shí)，肺臟中的藥濃度為5.1240μg/ml；當(dāng)血藥濃度為1.222μg/ml時(shí)，肺臟中的藥濃度為2.5091μg/ml；并且，藥濃度在9-15小時(shí)內(nèi)能測(cè)到。
權(quán)利要求
1.槐果堿在制備由冠狀病毒引起的疾病的藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的槐果堿在制備由冠狀病毒引起的疾病的藥物中的用途，其特征在于，槐果堿在制備由冠狀病毒引起的嚴(yán)重急性呼吸綜合癥的藥物中的用途。
3.槐果堿在制備由冠狀病毒引起的嚴(yán)重急性呼吸綜合癥的藥物的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)將苦豆子粉碎，加入5-10％的氫氧化氨濕潤(rùn)，經(jīng)氯仿回流加熱提取，加入7-15％的硫酸萃取，獲得總生物堿；(2)總生物堿通過加入甲苯萃取，然后加入5-10％的鹽酸提取槐果堿；(3)調(diào)節(jié)pH5-10，抽濾，再以丙酮重結(jié)晶，獲得槐果堿精品；(4)將槐果堿精品溶解于注射用水中，過濾，含量測(cè)定，調(diào)節(jié)pH4.0-4.5；(5)通過0.65um微孔濾膜灌裝、封口，經(jīng)流通蒸汽100℃滅菌30分鐘即可制得注射針劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的槐果堿在制備由冠狀病毒引起的嚴(yán)重急性呼吸綜合癥藥物的制備方法，其特征在于，注射針劑中槐果堿的濃度介于100-800μg/ml之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的槐果堿在制備由冠狀病毒引起的嚴(yán)重急性呼吸綜合癥藥物的制備方法，其特征在于，注射針劑中槐果堿的濃度介于100-600μg/ml之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的槐果堿在制備由冠狀病毒引起的疾病的藥物中的用途，其特征在于，所述的藥物的劑型為藥劑學(xué)上認(rèn)可的任何一種劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種槐果堿在制備由冠狀病毒引起的疾病的藥物中的用途，具體地，本發(fā)明還公開了一種槐果堿在制備嚴(yán)重急性呼吸綜合癥藥物中的用途?；惫麎A能有效阻止冠狀病毒的生物合成，并進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗病毒作用。本發(fā)明還公開了槐果堿作為制備嚴(yán)重急性呼吸綜合癥的藥物的制備方法。應(yīng)用槐果堿作為嚴(yán)重急性呼吸綜合癥的藥物，可有效提高SARS的治療率、減少死亡率，而且沒有明顯的細(xì)胞毒性作用?；惫麎A的藥源豐富，且制備簡(jiǎn)便，成本低廉，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P11/00GK1600308SQ03151269
公開日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2003年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月28日
發(fā)明者陳曙霞 申請(qǐng)人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院, 陳曙霞