專利名稱：遠(yuǎn)志在制備Aβ引起的老年癡呆病的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥遠(yuǎn)志在抗老年癡呆病中的藥物應(yīng)用，具體地說是涉及中藥遠(yuǎn)志在制備抑制阿爾茨海默病的β-淀粉樣蛋白分泌的藥物和抑制β分泌酶(簡稱BACE)藥物方面的用途。
背景技術(shù)：
老年癡呆癥是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，是智能損害的綜合征。該病癥一般可分為3類1.原發(fā)性退行性癡呆，稱為阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，簡稱AD)；2.腦血管性癡呆(VD)；3.混合性癡呆(現(xiàn)命名為皮層下缺血性腦白質(zhì)病)，包括帕金森癡呆(PD)、腦葉萎縮癥、賓斯旺格爾病(Binswanger)。老年癡呆中阿爾茨海默病和血管性癡呆是兩大最主要的類型，患病率占所有癡呆的90％以上，其中AD約占半數(shù)，與另一種老年期常見的腦血管性癡呆在病因、發(fā)病機理和預(yù)后等方面有著本質(zhì)區(qū)別。AD多隱匿起病，進(jìn)行性加重，以癡呆為主要臨床表現(xiàn)，大腦主要病理改變?yōu)榈矸郯?、神?jīng)纖維纏結(jié)和選擇性神經(jīng)元及突觸丟失。國外資料表明，在世界范圍內(nèi)，每年因AD花費1000億美元。在西方國家AD已成為繼心臟病、腫瘤、腦中風(fēng)之后的第4位致死原因。我國流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)60歲以上人群的患病率達(dá)3.46％～3.9％，另有報道北京地區(qū)患病率為3.3％，上海地區(qū)患病率為4.6％。AD致殘致死率極高，由于病因不明而無有效治療措施。
AD的病因目前尚未明確，據(jù)析可能是鋁代謝異常、腦中乙酰膽堿能的生化改變、自身免疫和病毒感染等。近年來關(guān)注的病因?qū)W有淀粉樣變學(xué)說；基因?qū)W說；炎癥學(xué)說；以及膽堿能損傷學(xué)說等。越來越多的科學(xué)家相信AD的淀粉樣變的發(fā)生機制與β-淀粉樣蛋白有關(guān)。
β-淀粉樣蛋白生成機制AD患者腦中有三種異常結(jié)構(gòu)老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)和淀粉樣物質(zhì)沉積腦血管。老年斑又稱淀粉斑或神經(jīng)炎斑，是AD腦重要的特征性病理改變，所有散發(fā)性和家族性AD病人大腦均可見典型或彌散性淀粉斑。淀粉斑核心成分為β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，簡稱Aβ或βA4)。Aβ由細(xì)胞分泌，在細(xì)胞基質(zhì)沉淀聚積之后則有很強的神經(jīng)毒性，是AD腦淀粉斑周邊神經(jīng)元變性和死亡的主要原因。由于Aβ是由β-淀粉樣蛋白前體(Amyloid β-Protein Precursor，簡稱APP)經(jīng)β分泌酶和γ分泌酶水解后產(chǎn)生的，因此抑制β-分泌酶能夠減少Aβ的產(chǎn)生，故尋找有效的β-分泌酶抑制劑是AD治療研究的一個熱點。
國外的AD治療藥物主要是神經(jīng)營養(yǎng)藥、擬膽堿藥或膽堿酯酶抑制劑，均屬對證治療藥物，據(jù)研究報道并無顯著療效或能減緩AD的發(fā)展。目前為止尚無有效的抑制Aβ分泌和有效的β-分泌酶抑制劑供臨床應(yīng)用。
中醫(yī)關(guān)于老年性癡呆的診斷多包括了西醫(yī)的VD、AD或二者的混合型，即所針對的老年癡呆僅為泛指了的全部相關(guān)病癥。中藥治療老年癡呆的有效方劑為調(diào)心方(黨參、茯苓、甘草、石菖蒲、遠(yuǎn)志等)和補腎方(天冬、麥冬、生地、熟地、山茱萸等)、當(dāng)歸芍藥散、黃連解毒湯、釣藤散、抑肝散、小柴胡湯、柴胡加龍骨牡蠣湯、DX-9386(人參、遠(yuǎn)志、茯苓、石菖蒲等)等。其中臨床顯示黃連解毒湯對VD的治療更為有效。
在中醫(yī)藥文獻(xiàn)記載中，植物遠(yuǎn)志屬于益智安神類中藥，《中國藥典》(2000版)收載了2種基源植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifolia和卵葉遠(yuǎn)志P.sibirica，藥用部位為根，味苦、辛、溫，歸心、腎、脾經(jīng)，具有安神益智、祛痰、消腫等功效。據(jù)記載，中藥遠(yuǎn)志的藥理活性多為祛痰鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)靜安神、抗驚厥、抗衰老、降壓以及腦保護(hù)等方面。
遠(yuǎn)志的成分主要是皂苷類、糖及糖苷類、酮類、生物堿等。遠(yuǎn)志皂苷作為其中活性成分之一，已有一些分離、提純其單體的研究報道。矢部等進(jìn)行了遠(yuǎn)志對神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子作用的試驗，證明遠(yuǎn)志水浸膏對腦有保護(hù)作用；飯冢進(jìn)為探討遠(yuǎn)志的腦保護(hù)活性，對KCN低氧腦障礙的作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)幾種?；蔷哂锌s短正向反射消失持續(xù)時間的作用，表明遠(yuǎn)志腦保護(hù)作用出現(xiàn)的部分原因與酰基糖有關(guān)(飯冢進(jìn).國外醫(yī)學(xué)-中醫(yī)中藥分冊，1995，17(5)29)。
雖有多部醫(yī)書的統(tǒng)計表明，遠(yuǎn)志是益智藥物中出現(xiàn)幾率最高的中藥之一，并且其益智作用比較全面，但到目前為止的研究，還僅局限于對泛指的抗老年癡呆方面的研發(fā)，并且多為復(fù)方形式，具體的治病機理以及從病因?qū)W角度治療或緩解的疾病類型等研究尚未見報道。
目前國內(nèi)外有關(guān)治療或緩解Aβ導(dǎo)致的AD的藥物研究無明顯進(jìn)展，已有的藥物均屬對證治療藥物，在顯著療效或減緩AD的發(fā)展方面也未見突破性進(jìn)展；而中藥方劑只能改善癥狀，從天然中草藥中篩選治療AD的中藥提取物或有效成份成為近年來國際AD研究領(lǐng)域中的熱點和共識，但目前尚無有效的抑制Aβ分泌和有效的β-分泌酶抑制劑的研究報道，也未有針對Aβ的系統(tǒng)研究以及從病因?qū)W角度治療或緩解AD的藥物或植物提取物。隨著老齡人口的逐年增加，AD已成為嚴(yán)重威脅老年人身心健康的一種常見病，篩選和研制治療AD的藥物已成為十分迫切的任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供中藥遠(yuǎn)志在制備抑制β-淀粉樣蛋白分泌和制備抑制β-分泌酶的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明另一目的是提供了中藥遠(yuǎn)志在制備治療由于Aβ引起的AD的藥物方面的應(yīng)用。
本發(fā)明所提及的中藥遠(yuǎn)志是指遠(yuǎn)志植物原料藥的任何可藥用形式，優(yōu)選是主要包含遠(yuǎn)志總皂苷的遠(yuǎn)志原料藥有效部位。根據(jù)已有文獻(xiàn)的研究結(jié)果，遠(yuǎn)志總皂苷一般具有如下結(jié)構(gòu)通式
其中的R1可以是H、CH3、CH3CO、Glc；R2可以是H、CH3、CH3CO、各種單糖、雙糖或寡糖，糖上可以連接或不連接CH3CO、p-methoxycinnamoyl、3，4，5-trimethoxycinnamoyl、3，4-dimethoxycinnamoyl及3-hydroxy-3-methyl-glutaroyl等取代基。
所以本發(fā)明所提到的遠(yuǎn)志有效部位應(yīng)該是通過任何可行方法獲得的一類混合物，并盡可能地脫除了遠(yuǎn)志原料藥中的酮、糖等成分而保留了全部的皂苷類物質(zhì)。該遠(yuǎn)志有效部位可以是一種醇提取物，也可以是水提取物或其他形式的提取物。所述醇提取物的提取方法包括醇回流提取或醇超聲提取，所得提取物在冷藏放置中析出沉淀，該沉淀物經(jīng)過甲醇(MeOH)溶解，活性炭脫色，丙酮(Me2CO)沉淀最終得到粗制遠(yuǎn)志總皂苷提取物(楊云，中藥化學(xué)成分提取分離手冊，1998年第1版，p163-164)；或者經(jīng)過有機溶劑萃取和/或樹脂吸附法或柱層析法等精制提純方法除去其他雜質(zhì)成分最終得到遠(yuǎn)志總皂苷提取物。
本發(fā)明所述的遠(yuǎn)志有效部位包括上述中藥遠(yuǎn)志的醇提產(chǎn)物-遠(yuǎn)志總皂苷；也包括將遠(yuǎn)志總皂苷溶解或混懸于溶劑中，采用有機溶劑萃取和/或大孔樹脂吸附法或柱層析法除雜、初步精制和提純后，利用本領(lǐng)域常規(guī)的干燥方法制備成的遠(yuǎn)志總皂苷；還包括中藥遠(yuǎn)志粗提產(chǎn)物-遠(yuǎn)志總苷，該遠(yuǎn)志總苷可以是商業(yè)購得的，也可以是用遠(yuǎn)志的根或根皮為原料，經(jīng)過溶劑提取、萃取得到的。
所述提取遠(yuǎn)志總皂苷所用的溶劑選自水、乙醇、甲醇、正丁醇或其它不超過9個C原子的低級醇中任意一種或任意兩種以上溶劑以任意比例所組成的混合溶劑，采用常規(guī)的提取方法，例如室溫下浸漬提取，或超聲波震蕩提取，或加熱狀態(tài)下浸潤提取或回流提取等，所述溶劑優(yōu)選乙醇，最終得到含遠(yuǎn)志總皂苷為主要成分的遠(yuǎn)志提取物。
所述遠(yuǎn)志有效部位優(yōu)選為遠(yuǎn)志的乙醇提取物。
所述的萃取法、大孔樹脂吸附法和柱層析法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知技術(shù)，洗脫時可以等度洗脫也可以梯度洗脫，在此不加贅述，而提取物中皂苷成分的測定也可按照任何常規(guī)方法或公知方法實現(xiàn)。
發(fā)明人通過藥效學(xué)試驗揭示了中藥遠(yuǎn)志可抑制β-淀粉樣蛋白的分泌和抑制β-分泌酶的功效，進(jìn)而提出了中藥遠(yuǎn)志在制備抑制β-淀粉樣蛋白分泌和制備抑制β-分泌酶的藥物中的應(yīng)用。
基于這樣的結(jié)果，本發(fā)明還提出了中藥遠(yuǎn)志在制備治療由于Aβ引起的AD的藥物方面的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種用于抑制β分泌酶和β-淀粉樣蛋白分泌的藥物組合物，該組合物含有上述任一形式的中藥遠(yuǎn)志和藥學(xué)可接受的載體。所述組合物包括口服給藥的劑型和非口服給藥的注射劑型。
中藥遠(yuǎn)志，尤其是所述遠(yuǎn)志總皂苷可作為抗衰老、抗老年癡呆癥，尤其是治療AD藥物的有效成分。即，可按照常規(guī)方法制成用于抑制β分泌酶和β-淀粉樣蛋白分泌的藥物組合物，該組合物含有上述任一形式的中藥遠(yuǎn)志，優(yōu)選是遠(yuǎn)志總皂苷或含有遠(yuǎn)志總皂苷的遠(yuǎn)志提取物和藥學(xué)可接受的載體。該藥物可以包括口服給藥的劑型和非口服給藥的注射劑型。所述口服給藥劑型為膠囊劑、顆粒劑、散劑、片劑、糖漿劑、酊劑注射劑等劑型，可臨床用于抗衰老、預(yù)防和治療老年癡呆癥，尤其是AD。
經(jīng)口服給藥時，首先使該組合物與常規(guī)的藥用輔劑如賦形劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、抗氧化劑、包衣劑、著色劑、芳香劑、表面活性劑等混合，將其制成顆粒劑、膠囊、片劑等形式給藥；非經(jīng)口服給藥時可以注射液、輸液劑或栓劑等形式給藥。制備上述制劑時，可使用常規(guī)的制劑技術(shù)。
發(fā)明人經(jīng)過大量的藥理學(xué)篩選工作，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志提取物能抑制A β的分泌，并有抑制β-分泌酶的作用，這兩項藥理作用在本發(fā)明以前尚無文獻(xiàn)報道。本發(fā)明還通過對中藥遠(yuǎn)志進(jìn)行醇提取，得到抗衰老、抗AD的以遠(yuǎn)志總皂苷為主要成分的遠(yuǎn)志提取物。按照本發(fā)明可以將以遠(yuǎn)志總皂苷為主要成分的遠(yuǎn)志提取物和其它植物藥一起使用。
總之，本發(fā)明從病因?qū)W的角度研究了中藥遠(yuǎn)志，尤其是遠(yuǎn)志總皂苷在抑制Aβ分泌和抑制β-分泌酶方面的功效及治療AD中的藥物用途，旨在尋找抑制Aβ分泌的有效藥物和β-分泌酶的有效抑制劑，從而尋找到治療AD的有效藥物，相信對于抗AD的研究具有積極的推進(jìn)作用。


圖1顯示遠(yuǎn)志提取物(遠(yuǎn)志總皂苷)對APP695基因轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)液總Aβ的影響。
圖中l(wèi)ane 1為對照細(xì)胞的總Aβ；lane 2為試劑對照；lane 3-5為分別采用1μg/ml、2μg/ml和4μg/ml劑量遠(yuǎn)志提取物處理細(xì)胞的總Aβ。
具體實施方案1、遠(yuǎn)志總皂苷提取物方法一遠(yuǎn)志(Polygala tenuifolia)藥材1kg，稍加粉碎，經(jīng)石油醚脫脂，加7倍量95％乙醇回流提取3次，第1次提取2小時，后兩次各提取1小時，合并提取液，冰箱放置24小時，析出沉淀，過濾，沉淀晾干，用10倍量的MeOH溶解，活性炭脫色，過濾，濾液經(jīng)回收溶劑至原體積的1/2，加入等量Me2CO過濾，收集沉淀，用Me2CO洗滌，得粗制遠(yuǎn)志總皂苷提取物約40g。
方法二取1kg遠(yuǎn)志的95％乙醇提取浸膏，懸浮于水中，分別用石油醚脫脂，氯仿、正丁醇萃取，萃取液濃縮至近干，溶解于水中，上大孔樹脂，先用水洗，棄去洗脫液，然后用乙醇洗脫，洗脫液濃縮、冷凍干燥得總皂苷約20g。
2、藥理學(xué)研究及結(jié)果本發(fā)明以抑制基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)細(xì)胞中Aβ分泌為指標(biāo)，對遠(yuǎn)志的抗AD活性進(jìn)行了深入的研究。
1)遠(yuǎn)志提取物對人類β-淀粉樣蛋白前體(簡稱APP)基因APP695轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞Aβ分泌的抑制作用。
實驗方法用APP695基因轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞系(SH-SY5Y APP695)作篩選模型。SH-SY5Y APP695細(xì)胞的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)液MEM/F-12培養(yǎng)基，10％(V/V)滅活胎牛血清，0.4μg/ml潮霉素B，1％(V/V)非必需氨基酸，200mm的谷氨酰胺。
培養(yǎng)37℃，5％(V/V)CO2條件下培養(yǎng)。
將上述處于對數(shù)生長期的細(xì)胞等分于4個75cm2的培養(yǎng)瓶中，每瓶加入10ml培養(yǎng)基，至細(xì)胞貼壁生長密度大于95％，棄培養(yǎng)液，用PBS(PH7.4)洗滌，分別加入培養(yǎng)基10ml，其中三個實驗組分別加入1μg/l、2μg/ml和4μg/ml上述方法一得到的遠(yuǎn)志提取物，對照組加入等體積無菌超純水，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)10小時后收集細(xì)胞培養(yǎng)液。
將各組細(xì)胞培養(yǎng)液于2700r/分離心15分鐘，取上清各加入抗Aβ1-16單克隆抗體(WO-2)6μl，蛋白質(zhì)G-agarose 35μl，于4℃旋轉(zhuǎn)混合過夜，2700r/分離心10分鐘后棄上清，沉淀物用PBS(PH7.4)洗滌三次，各加入蛋白電泳上樣緩沖液25μl，于97℃變性10分鐘，離心，取上清上樣。電泳用10％Tris-Tricine凝膠，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)通過電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(385mA，40min)。電轉(zhuǎn)移結(jié)束后將硝酸纖維素膜置于PBS(PH7.4)中煮沸5min以增加蛋白信號，硝酸纖維素膜用5％的脫脂奶粉(PBS溶解)封閉1小時，PBS漂洗3次，每次5分鐘，加入單克隆抗體WO-2(用PBS稀釋，1∶2000)，室溫下孵育1小時，PBS(PH7.4)漂洗3次，加入堿性磷酸酶偶聯(lián)抗鼠IgG(用PBS稀釋，1∶2000)，室溫孵育1小時，用PBS漂洗后以BCIP/NBT系統(tǒng)染色。
結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)液中Aβ含量隨遠(yuǎn)志提取物濃度的增加而減少(圖1)，6次獨立實驗均得到相同結(jié)果，經(jīng)單因素方差分析和Bonferroni多重比較檢驗顯示1μg/ml、2μg/ml和4μg/ml遠(yuǎn)志提取物處理組細(xì)胞分泌Aβ的含量與對照組相比有明顯差異(p＜0.05)。實驗證明中藥遠(yuǎn)志提取物對SH-SY5Y APP695基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞Aβ分泌具有抑制作用。(見表1)表1.遠(yuǎn)志提取物對SH-SY5Y基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞Aβ分泌的抑制作用遠(yuǎn)志提取物濃度(μg/ml)對照組 12 4Aβ含量與對照組含100.00±0.00 75.75±19.89*36.33±10.26**28.86±8.42**量差異(％)*p＜0.05，**p＜0.01。
2)遠(yuǎn)志提取物對β分泌酶(BACE)的抑制作用實驗材料重組人BACE-1(購于R&D公司)；熒光底物IV(購于R&D公司)；醋酸鈉緩沖液。
儀器Fluostar galaxy微板光學(xué)測定儀及配套熒光測定384孔板(BMG公司產(chǎn)品)。
實驗步驟先于熒光測定板孔中加入0.01μg/ml、0.1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml的上述方法一得到的遠(yuǎn)志提取物，每個濃度三個復(fù)孔，另取三個孔不加遠(yuǎn)志提取物作為陰性對照，其后于每孔中加入酶和底物，酶終濃度4μg/ml，底物終濃度10μM，混勻，Ex320nm，Em 405nm處測熒光，計算熒光值變化斜率，比較酶活性。
實驗結(jié)果10μg/ml和100μg/ml的遠(yuǎn)志提取物對BACE的抑制率分別為69.64％和83.28％(見表2).IC50(μg/ml)0.2465。
表2.遠(yuǎn)志提取物β分泌酶(BACE)的抑制作用遠(yuǎn)志提取物濃度(μg/ml)對照組0.01 0.1 10 100對BACE的抑制率(％)0 45.3245.4869.6483.28
以上描述了本發(fā)明的具體實施例，然其并非用以限定本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員對在此公開的實施方案可進(jìn)行并不偏離本發(fā)明范疇和精神的改進(jìn)和變化。
權(quán)利要求
1.中藥遠(yuǎn)志在制備抑制β-淀粉樣蛋白分泌的藥物中的應(yīng)用。
2.中藥遠(yuǎn)志在制備抑制β-分泌酶的藥物中的應(yīng)用。
3.中藥遠(yuǎn)志在制備治療由于Aβ引起的老年癡呆病的藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1-3任一項中的應(yīng)用，其中所述的中藥遠(yuǎn)志為含有遠(yuǎn)志總皂苷的遠(yuǎn)志有效部位。
5.如權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述的中藥遠(yuǎn)志有效部位是經(jīng)醇提取方法得到的遠(yuǎn)志提取物。
6.如權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中所述的醇提取方法包括醇回流提取法或醇超聲提取法。
7.如權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述的醇提取方法還進(jìn)一步包括有機溶劑萃取和/或大孔吸附樹脂吸附除雜過程。
8.如權(quán)利要求5或6的應(yīng)用，其中所述的醇提取方法中所用的醇為乙醇。
9.如權(quán)利要求1-3任一項中的應(yīng)用，其中所述的藥物為含有中藥遠(yuǎn)志和藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述的藥物包括口服給藥的劑型和非口服給藥的劑型。
全文摘要
本發(fā)明提供中藥遠(yuǎn)志在抗由于Aβ引起的老年癡呆病中藥物用途，本發(fā)明還提供了中藥遠(yuǎn)志，尤其是遠(yuǎn)志總皂甙在制備抑制β－淀粉樣蛋白分泌的藥物中的應(yīng)用以及在制備抑制β－分泌酶的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P25/28GK1579468SQ03153399
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月12日
發(fā)明者張岱, 賈宏曉, 屠鵬飛, 姜勇 申請人:張岱, 北京大學(xué)精神衛(wèi)生研究所