專利名稱：一種抗菌活性更高的改良鱟素的基因及高效表達的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗菌活性更高的改良鱟素的基因及高效表達的方法。
背景技術：
鱟是海洋里的一種節(jié)肢動物，被稱為動物界具有獨特進化地位的“活化石”，在其神奇的藍色血液中含有多種生物活性肽，其中就包括一類抗菌多肽一鱟素。自1988年Nakamura T.、Furunaka H.等在鱟的血細胞中找到第一種鱟素，迄今為止已發(fā)現(xiàn)了5種，它們組成鱟素家族(Nakamura T.J Biol Chem 1988，26316709-13；Miyata T.J Biochem 1989，106663-8)。這類抗菌多肽氨基酸序列較為保守，抗菌譜廣，不僅可以抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，對真菌生長一樣有抑制作用，而且近年來發(fā)現(xiàn)其對腫瘤和HIV等也具有一定的作用效果，故日益被研究者所關注。
天然鱟素是有17-18個氨基酸的陽離子多肽，本身帶有6-7個堿性氨基酸，其氨基端和羧基端都是堿性氨基酸，羧基端還具有一個獨特的精氨酸-酰胺結構。四個Cys形成二個二硫鍵維持鱟素折疊成發(fā)夾結構。五種鱟素的大部分氨基酸替代發(fā)生在Arg和Lys之間，其一級結構如下(MutaT.J Biochem，108261-6) 鱟素的前體有77個氨基酸殘基，經(jīng)體內(nèi)蛋白酶和酰胺化酶作用后，再與其他物質(zhì)結合形成血細胞的小顆粒。雖然大多數(shù)抗菌蛋白C末端都有酰胺化氨基酸，但在鱟素中酰胺化對其抗菌活性并無決定作用，許多化學合成的人工鱟素及其類似物未對C端的Arg酰胺化，但活性并無影響(Oishi O.Peptide Res，1991，495-101；Shieh T.C.，F(xiàn)BES Lett，1989，252121-124)。實際上其他的一些抗菌蛋白如Nisin，酰胺基對其抗菌活性也是可有可無，可能酰胺化維持多肽在體內(nèi)的穩(wěn)定，免于被羧基蛋白酶降解。另外早期的研究認為鱟素的二硫鍵對抗菌活性很重要，因為它維持著β-折疊(Tamamura H.，Chem Pharm Bull 1993，41978-80；Park N.G.，Biochemistry，1992，3112241-7)。但后來發(fā)現(xiàn)這些結論比較片面，當用甲基乙酰氨基團修飾或用Ala、Asp替代Cys，的確會引起線形多肽形成無規(guī)則卷曲，從而導致活性的降低，但用其他氨基酸替代Cys時情況則不同，抗菌活性變化不大甚至可能比原多肽還高，如芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸，特別是用Tyr替代時結構上最接近天然狀態(tài)(Tam J.P.，BiochemBiophys Res Commun 2000，267783-90；Matsuzaki K.，Biochemistry，1997，369799-806)。但二硫鍵除了穩(wěn)定結構外，可能還有其他作用。
鱟素是帶正電荷的兩親性多肽，其結構由二硫鍵形成環(huán)狀的反平行β-折疊。Ohta等發(fā)現(xiàn)Tachyplesin I能在40分鐘內(nèi)不可逆地抑制細菌的生長。抗多粘菌素的細菌仍然對鱟素敏感，這說明鱟素更易于作用外膜結構而不僅僅是脂多糖。在體外實驗中，發(fā)現(xiàn)鱟素先是通過Trp等與雙層脂膜平行結合，此過程中對膜結構的影響不大。然后一部分多肽相互集結，在膜上形成了大小不一的陰離子選擇通道。離子通道的形成破壞了膜電位，造成細胞內(nèi)外的物質(zhì)相互滲漏。但這種通道并不永久維持，逐漸地這些通道會消失，因為抗菌蛋白會轉移到膜的另一面，并與之平行結合(Matsuzaki K.Biochim Biophys Acta，1999，14621-10)。實際上許多種類的抗菌蛋白，無論是α-螺旋，還是β-折疊結構上都具有二個特點帶正電荷和雙親性，而且都會在脂膜上形成離子通道，只不過是形成的過程和方式有所差別(Matsuzaki K.Yakugaku Zasshi，1997，117253-64；Ohta M.Antimicrob Agents Chemother，1992，361460-5；Lear J.D.Science，1988，2401177-81)。
在鱟體內(nèi)發(fā)現(xiàn)鱟素不僅直接地還可通過另一種方式間接地參與抗菌活性。在昆蟲和甲殼動物中，酚氧化酶激活系統(tǒng)是宿主重要的防御病蟲害系統(tǒng)，特別是在感染初期，細菌細胞壁的脂多糖、肽聚糖、葡聚糖可引發(fā)酚氧化酶激活系統(tǒng)的一連串級聯(lián)放大反應。血藍蛋白本身與甲殼素并無親和性，但鱟素包裹了甲殼素后，可與之結合，然后血藍蛋白被誘導轉變成為酚氧化酶，經(jīng)過各種反應后，促進了外骨骼的傷愈。實驗發(fā)現(xiàn)，如果對鱟素的Trp和Tyr化學修飾，多肽與血藍蛋白的親和力急劇下降，說明他們的結合位點處于鱟素的疏水區(qū)域(Nagai T.J Biol Chem，2001，27627166-70)。鱟素也是一類抗脂多糖結合因子，相對磷脂，鱟素與LPS的親和力提高了280倍。LPS可誘導C因子活化，從而促進凝血過程，還可引起過敏反應，造成敗血膿腫等甚至死亡。利用鱟素可特異性阻止LPS介導的凝血過程，減輕臨床病癥(Hirakura Y.Biochim Biophys Acta，2002，156232-6)。
早在1992年人們就利用DNase I保護，硫酸二甲脂法等腳印技術發(fā)現(xiàn)鱟素的反平行β-折疊結構能與DNA的小溝結合，如果用二硫蘇糖醇處理或Ala替代Cys，影響β-折疊，則這種與DNA的結合能力就會喪失。這說明鱟素在體內(nèi)可能會影響轉錄和翻譯，從而影響細菌、細胞的生理活動。而后不斷有實驗證明鱟素促進細胞分化，抑制腫瘤細胞的生長(LiQ.F.World J Gastroenterol，2003，9454-8)。
鱟素結構簡單，分子量小，可在其氨基酸序列的基礎上進行不同的增加、刪減，替代和修飾得到新的多肽，然后對比它們之間結構和生物活性的不同。
在研究鱟素抗病毒活性時發(fā)現(xiàn)，Trp對抑制病毒復制很重要，替代它后，活性明顯喪失，從氨基端起第一個Tyr也很重要，它能提供能量到Trp。有人在polyphemusin I的Gly11和Phe12之間插入一個Arg，增加多肽的正電荷的同時也使環(huán)結構變大；為了使β-折疊兩端的電荷和疏水性更加明顯，把Tyr-Arg換成Arg-Tyr，這些改變對抗菌活性影響不大，但略有降低(Zhang L.Biochemistry，2000，3914504-14)。在Cys的替代上發(fā)現(xiàn)，Ala和Asp會使抗菌活性下降很多，甚至失活。但芳香族氨基酸Phe、Tyr和脂肪族氨基酸Leu的取代抗菌活性不僅沒喪失，對有些菌株還有所提高，特別是Tyr作用明顯。有研究表明在設計抗菌蛋白的過程中，用Lys代替Arg時，會引起對某些菌株抗性的降低，如抗大腸桿菌、沙門氏菌等，并且在高鹽環(huán)境下，這種活性的喪失可能會更嚴重。Arg看起來比Lys更適合用于設計β-折疊的小多肽，因為它能增強抗大腸桿菌的活性，并且在高鹽環(huán)境下維持穩(wěn)定(Muhle S A.Biochemistry，2001，405777-85)。
Tam J.P.等在Tachyplesin I的基礎上設計了頭尾相連在一起的18個氨基酸的環(huán)形多肽，內(nèi)部有三個二硫鍵，它與Tachyplesin I相比對人紅血球更無毒性。而且在高鹽環(huán)境下，生物活性比低鹽環(huán)境還高(Tam J.P.Biochem Biophys Res Commun，2000，267783-90)。Tamamura H等人根據(jù)polyphemusin II人工合成了T22([Tyr5，12，Lys7]-polyphemusin II)，具有很高的抗HIV活性和低的細胞毒性，此后又在T22的基礎上除去部分氨基酸，得到只有14個氨基酸的多肽T134和T140，它們表現(xiàn)出更強的抗病毒活性和更低的細胞毒性(Xu Y.AIDS Res Hum Retroviruses 1999，15419-27)。Tam J.P.和Tamamura H等人成功地改造鱟素說明有必要對鱟素的結構和作用機理進行更深一步的研究，這樣可以針對鱟素在不同方面的用途設計出更合理的抗菌蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明總的目的是通過基因工程的方法，人工合成一種TachyplesinII的類似物編碼基因，其編碼的氨基酸與Tachyplesin II(以下簡稱Ta0)相比有3個氨基酸的差異，使其殺菌/抑菌活性較Tachyplesin II更高，尤其是對多種飼料有害微生物。進一步，利用生物反應器畢赤酵母(Pichiapastoris)高效表達此基因，以解決此抗菌肽在原始天然生物中產(chǎn)量太低、難以獲得大量生產(chǎn)的問題。
本發(fā)明的目的之一是根據(jù)鱟素作用的分子機理，對鱟素Ta0進行分子改良，提高它的殺菌/抑菌活性。改良的鱟素(定名為Ta1)，與原鱟素Ta0相比，有3個氨基酸的差異，分別由原來的F(+4)、G(+10)和K(+15)變?yōu)镽。此改良的鱟素對許多細菌和真菌，尤其是飼料有害微生物具有更高的殺菌/抑菌活性，如大腸桿菌(Escherichia coli)K12、沙門氏菌(Salmonellasp.)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、普通變形菌(Proteus vulgaris)、副溶血弧菌(Vibro parahaemolyticus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黃曲霉(Aspergillus flavo)、禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)、灰綠曲霉(Aspergillus glaucus)、雜色曲霉(Aspergillus versicolor)等。
本發(fā)明的目的之二是人工合成改良鱟素Ta1的編碼基因ta1，為此基因在各種外源基因表達系統(tǒng)中高效表達提供優(yōu)良的基因材料。Ta1基因全長54個核苷酸，編碼17個氨基酸。
本發(fā)明的目的之三是提供一種針對各表達系統(tǒng)的不同特點，對Ta1的編碼基因加以改造以使它能在特定的表達系統(tǒng)中高效表達的方法。依據(jù)分子生物學最新理論知識，綜合影響外源基因轉錄、翻譯及影響mRNA穩(wěn)定性等各種因素，對ta1進行改造，是大幅度提高其在表達系統(tǒng)中表達水平的有效手段。例如在基因密碼子使用頻率上，無論是原核生物還是真核生物中，同一氨基酸的不同密碼子的選擇偏向都是不同的，密碼子選擇偏向與蛋白的表達水平相關聯(lián)，特別是在一些大量表達的蛋白上，這一點尤為突出。密碼子選擇偏向可增強翻譯和維持mRNA的穩(wěn)定性?；虻母脑炜衫肞CR技術、定點突變技術、基因設計后化學合成等技術來實現(xiàn)。本發(fā)明中，為了使Ta1的編碼基因ta1能在畢赤酵母中高效表達，我們在分子水平上對基因的密碼子進行了改造。將其密碼子全部按酵母高頻使用的密碼子進行設計和基因合成(Sharp，P.M.et al.，NeucleicAcids Res.145125-5142，1986)，優(yōu)化后的tac-m基因插入到帶有α-因子信號肽序列的酵母表達載體上，經(jīng)轉化酵母細胞后，穩(wěn)定整合到酵母染色體上，此重組酵母經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，表達的鱟素蛋白在信號肽的引導下分泌到培養(yǎng)基中。經(jīng)測定，鱟素表達量達到0.2mg/mL。
本發(fā)明的目的之四是提供使優(yōu)化后的ta1基因在表達系統(tǒng)中高效表達的方法。包括整套重組表達載體的構建、受體菌的遺傳轉化方法、重組子的篩選與分子鑒定方法以及重組子中Ta1表達方法。本發(fā)明采用畢赤酵母(P.pastoris)做為ta1基因的表達受體，它為利用重組酵母工業(yè)化大規(guī)模、低成本發(fā)酵生產(chǎn)Ta1奠定了基礎。
本發(fā)明設計、合成了一種抗菌活性更高的Tachyplesin II類似物的編碼基因(ta1)，并提供了一種在真核表達系統(tǒng)中高效表達此基因的方法。
本發(fā)明的技術途徑如下1.基因合成將設計的基因序列的2條鏈分成4個單鏈片段，分別合成后，各片段等摩爾數(shù)混合退火成完整的基因，具體方法參見文獻(姚斌等.昆蟲特異性神經(jīng)蝎毒素AaIT基因的改造、人工合成及序列分析.農(nóng)業(yè)生物技術學報，Vol.3，No.3，86～92，1995)。
2.ta1基因克隆 按常規(guī)方法克隆(Maniatis T.，et al.Molecularcloning.New YorkCold Spring harbor laboratory，1982)。將退火后的基因克隆到酵母表達載體pPIC9上，同樣的方法也可克隆到大腸桿菌克隆載體或表達載體上，如pPUC18、pPGEM等，轉化大腸桿菌，獲得重組子，并進一步對此基因進行全序列分析。
3.重組高效表達體系的構建選擇高效表達系統(tǒng)—畢赤酵母作為表達ta1基因的生物反應器。通過體內(nèi)重組使ta1基因整合到酵母的基因組上，篩選出陽性重組子。別的真核表達系統(tǒng)如桿狀病毒的昆蟲表達系統(tǒng)、霉菌表達系統(tǒng)、植物表達系統(tǒng)等也適應于此ta1基因的高效表達。
5.ta1基因的表達研究 在搖床水平上重組酵母經(jīng)培養(yǎng)24小時后加入甲醇進行誘導，取培養(yǎng)液進行SDS-PAGE及初步的殺菌活性測定，結果表明tac-m基因在重組酵母中得到了高效表達。
6.表達的改良鱟素ta1的抗菌譜測定和抗菌效率的比較 比較不同細菌之間對表達產(chǎn)物的敏感程度的不同。受試細菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、普通變形菌、枯草芽孢桿菌、乙酸鈣不動桿菌等，抗菌活性的比較方法采用濾紙片比較法、活菌記數(shù)比較法、培養(yǎng)比較法等。受試真菌包括黑曲霉(Aspergillus niger)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黃曲霉(Aspergillus flavo)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、綠色木霉(Trichoderma viride)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、腐質(zhì)霉(Pythium dissotocum)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、蠶蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)、禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)、灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)、雜色曲霉(Aspergillus versicolor)等。


圖1鱟素tac0與改良后的鱟素ta1基因的核苷酸序列，劃框部分為不一致的堿基，將導致翻譯后編碼不同的氨基酸。
圖2鱟素tac0與改良后的鱟素ta1基因編碼的氨基酸序列，劃框部分為Ta1中改變了的氨基酸。
圖3鱟素tac0與改良后的鱟素ta1基因的克隆，(1)為退火，(2)為退火基因與經(jīng)Xho I和EcoRI酶切處理載體pPIC9的連接，(3)為重組載體的篩選。
圖4表達的鱟素Ta1對細菌的抗菌活性圖5表達的鱟素Ta1對真菌孢子萌發(fā)抑制A.黑曲霉；B.煙曲霉；C.構巢曲霉；D.黃曲霉；E.棒曲霉照片中上半部分為對照，下上半部分為Ta1處理具體實施方式
1.菌株與載體大腸桿菌菌株E.coli DH5a、質(zhì)粒pUC18等自Promega公司，酵母菌株Pichia pastoris GS115(His-Mut+)購自Invitrogen公司、質(zhì)粒pPIC9的圖譜見圖3。大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、普通變形菌、枯草芽孢桿菌、乙酸鈣不動桿菌、黑曲霉、構巢曲霉、黃曲霉、溜曲霉、棒曲霉、煙曲霉、綠色木霉、米曲霉、宇佐美曲霉、腐質(zhì)霉、日本根霉、少根根霉、蠶蛹蟲草、禾谷鐮孢、灰綠曲霉、雜色曲霉等均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。
2.酶與試劑盒 限制性內(nèi)切酶、連接酶、Taq酶為Boehringer公司產(chǎn)品。PCR Kit均購于Promega公司。
3.培養(yǎng)基 大腸桿菌培養(yǎng)基為LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。酵母完全培養(yǎng)基為YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)；酵母轉化培養(yǎng)基為RDB[18.6％山梨醇、2％葡萄糖、1.34％Yeast Nitrogen BaseW/O amino acids(YNB)、0.00004％Biotin、0.005％谷氨酸、0.005％甲硫氨酸、0.005％賴氨酸、0.005％亮氨酸、0.005％異亮氨酸、2％瓊脂糖)]；酵母選擇培養(yǎng)基為MM(1.34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇、1.5％瓊脂糖)和MD(1.34％YNB、0.00004％Biotin、2％葡萄糖、1.5％瓊脂糖)；酵母誘導培養(yǎng)基BMGY[1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V)]和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相與BMGY相同)。重組酵母發(fā)酵培養(yǎng)基為10×Basal Salts(2.67％磷酸、0.093％硫酸鈣、1.82％硫酸鉀、1.49％硫酸鎂、0.413％氫氧化鉀、4％甘油或葡萄糖)；發(fā)酵中所用的微量鹽溶液PTM1(0.6％硫酸銅、0.008％碘化鈉、0.3％硫酸錳、0.02％鉬酸鈉、0.002％硼酸、0.05％氯化鈷、2％氯化鋅、6.5％硫酸亞鐵、0.025％生物素、0.5％硫酸)。真菌生長培養(yǎng)基為PDA(20％馬鈴薯、2％蔗糖、2％瓊脂)實施例1本實施例說明鱟素ta1編碼基因的設計、合成與克隆程序。
Ta1是在天然鱟素Tachyplesin II(簡稱Ta0)基礎上，對其一些氨基酸替換，把原序列氨基酸K、G、F替換成R，目的是增加其正電荷，尤其是形成β折疊后兩端的正電荷，從而提高其殺菌/抑菌活性，合成后的核苷酸序列見SEQ ID No1，氨基酸序列見SEQ ID No2。為適合連接到酵母表達載體pPIC9并整合到酵母染色體上進行分泌表達，在其前面添加了一段序列L-E-K-R*E-A-E-A。酵母KEX2基因的產(chǎn)物能識別E-K-R*E-A-E-A，并在*處切割。E-A重復對KEX2基因產(chǎn)物的切割并不是必須的，但能顯著提高其效率，隨后E-A重復可被STE13基因的產(chǎn)物進一步切割掉，從而得到正確的Ta1。L-E的堿基是CTCGAG，這是Xho I限制性內(nèi)切酶的識別切割位點，另外在基因終止密碼子后添加EcoR I識別位點，通過這兩個限制性內(nèi)切酶，可方便地連接到載體pPIC9上。為了進行活性比較，原鱟素Ta0也按此設計并在酵母中表達。進一步的克隆程序見圖3。把ta0和ta1基因單鏈進行化學合成。將合成的單鏈核苷酸片段分別磷酸化，退火后利用設計的酶切位點，分別克隆到載體pPIC9上，將重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌JM109(Promega公司)，涂布LB(含氨芐50μg/mL)平板，37℃培養(yǎng)。挑選單菌落進行振蕩培養(yǎng)，提取培養(yǎng)物的質(zhì)粒，進行酶切、電泳檢測。進一步進行序列測定，證實克隆的基因與設計的完全一致。這些重組質(zhì)粒分別命名為PITa0、PITa1。
實施例2本實施例是說明酵母轉化及篩選重組酵母株系的過程。質(zhì)粒PITa0、PITa1的DNA經(jīng)電擊轉化酵母細胞后，通過體內(nèi)重組，目的基因可以整合到受體酵母基因組中。在外源誘導物甲醇存在的條件下，AOX1啟動子可以啟動其下游基因的表達，并且信號肽可以指導表達產(chǎn)物進入酵母的分泌途徑，經(jīng)過切割，外源蛋白產(chǎn)物最終分泌至胞外。
首先用2～3倍過量的內(nèi)切酶BglII分別消化質(zhì)粒PITa0、PITa1的DNA(經(jīng)PEG法純化)，電泳檢測酶切是否完全，使之線性化。用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗兩次，冷凍干燥，無菌水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 酵母菌株GS115接種于5mLYPD中30℃培養(yǎng)過夜，取0.5mL接種于500mLYPD中30℃培養(yǎng)使O.D.600＝1.3～1.5，1500×g離心5分鐘，用500mL冰預冷的無菌水洗滌沉淀，如上離心，以20mL冰預冷的1mol/l山梨醇懸浮沉淀，如上離心，以0.5mL冰預冷的1mol/l山梨醇懸浮沉淀。取40μl酵母細胞液加入線性化DNA1～5μg，轉移到冰預冷的無菌電擊杯中冰浴5分鐘。在電擊儀MicropulserTM(BioRad公司)上進行電擊轉化酵母受體菌hisGS115，電擊參數(shù)為0.8kv，11.5μF。電擊后立即向電擊杯中加入0.5mL冰預冷的1mol/l山梨醇，然后將電擊杯中的溶液轉移到無菌的Eppendorf管中在RDB固體培養(yǎng)基上涂板，每板涂0.1mL，將培養(yǎng)皿倒置30℃培養(yǎng)至轉化子出現(xiàn)。轉化子可在基本培養(yǎng)基(不含His)生長，由于載體中沒有酵母復制子，所以his4基因必須整合進酵母基因組中才能表達。另外，由于轉化的酵母細胞中AOX1基因受到破壞，所以它就不能再利用甲醇作為碳源。這樣，在以甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基上轉化子就不會生長(或者生長極緩慢)，表現(xiàn)為甲醇利用缺陷型(Mut-)。
用無菌牙簽從轉化平板上挑取His+重組子，首先接種到MM固體培養(yǎng)基上，再接種到MD固體培養(yǎng)基上，如此挑取His+重組子，30℃培養(yǎng)2天。尋找在MD平板上生長正常但在MM平板上有一點生長或完全不生長的克隆子。
為了篩選得到高表達的重組酵母菌株，直接檢測誘導培養(yǎng)基中鱟素的表達情況。將His+Mut-轉化子首先在BMGY培養(yǎng)基(以甘油為碳源)中培養(yǎng)，待其生長至飽和狀態(tài)，移去BMGY，換入誘導培養(yǎng)基BMMY(以甲醇作為誘導物)，在誘導培養(yǎng)36小時后取上清液進行抗菌活性測定?？咕钚詼y定以大腸桿菌為指示菌，采用濾紙片法。大腸桿菌活化培養(yǎng)后，稀釋菌液至數(shù)量級為107/ml，吸取100μL稀釋液，均勻涂布平板。取30μL培養(yǎng)液讓無菌濾紙小圓片吸收，干燥后，貼于平板表面，37℃下培養(yǎng)16h，測抑菌圈直徑。挑選活性最高的菌株，命名為YS-PHPT0(含有ta0基因)、YS-PHPT1(含有改良后的ta1基因)。
實施例3
本實施例是說明重組酵母表達的鱟素抗菌活譜的測定程序。重組酵母30℃誘導培養(yǎng)(酵母誘導培養(yǎng)基BMGY)36小時后，取5～10μL上清液進行測定。主要目的是檢測Ta0和Ta1對一些常見畜禽致病細菌、病原真菌、霉腐真菌的抗菌活性，然后又針對一些生產(chǎn)用菌和有益菌測定。
鱟素對細菌的抗菌活性的測定主要用打孔法，在培養(yǎng)基平板上打孔，在孔中加入5～10μL發(fā)酵液，37℃或28℃培養(yǎng)16～24小時，測抑菌圈直徑。分別對一些革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌進行抗菌測定。其中革蘭氏陰性菌有大腸桿菌(Escherichia coli)JM1 09和K12、沙門氏菌(Salmonella sp.)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、普通變形菌(Proteus vulgaris)、副溶血弧菌(Vibro parahaemolyticus)、乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)。革蘭氏陽性菌有金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、堅實芽孢桿菌(Bacillus firmus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，這些菌株均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。結果(圖4)表明改良后的Ta1對這些菌株均有較好的抗菌活性。
鱟素對酵母菌的抗菌活性所用方法也是打孔法，受試菌株有熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、扣囊擬內(nèi)孢霉(Endomycopsis fibuligera)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地酶(Geotrichum candidum)、白球擬酵母(Torulopsis candida)、阿舒多囊霉(Crebrothecium ashbyii)、另外對幾種釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)包括面包酵母、啤酒酵母、生香酵母都做了測定。以上這些受試菌株均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。發(fā)現(xiàn)Ta1對酵母菌無抗菌作用。
在對絲狀真菌的抗菌活性測定上，對產(chǎn)孢能力強并且容易收集孢子的絲狀真菌如黑曲霉(Aspergillus niger)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黃曲霉(Aspergillus flavo)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、棒曲霉(Aspergillusclavatus)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、綠色木霉(Trichoderma viride)、采用孢子抑制法，收集真菌孢子，制成懸浮液。取該懸浮液10μL與20μL發(fā)酵液，50μL液體PDA培養(yǎng)基混合，27-30℃培養(yǎng)24到48h，觀察孢子萌發(fā)情況。檢測抗菌活性。而對不易產(chǎn)生孢子或者刨子不易收集的如米曲霉(Aspergillus oryzae)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、腐質(zhì)霉(Pythiumdissotocum)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、少根根霉(Rhizopusarrhizus)、蠶蛹蟲草(Cordyceps militaris)、禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)、灰綠曲霉(Aspergillus glaucus)、雜色曲霉(Aspergillusversicolor)采用生長抑制法，在PDA固體培養(yǎng)基凝固前，取500μL與500μL發(fā)酵液混合，做成斜面或平板。接種真菌到此斜面上，觀察生長情況。檢測抗菌活性。另外放線菌中的橄欖綠鏈霉菌(Streptomycesolivaceoviridis)，采用的方法也與不易產(chǎn)生孢子或者刨子不易收集的真菌一樣。以上這些受試菌株均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。結果表明，Ta1對以上其他的真菌都有較強的抗菌活性(圖5)。
實施例4本實施例是說明重組酵母在5升發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵生產(chǎn)鱟素的程序。重組酵母在BMGY培養(yǎng)基中30℃搖床培養(yǎng)24小時，然后按5-10％接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中開始發(fā)酵。具體方法如下1)菌株培養(yǎng)階段。發(fā)酵培養(yǎng)基接種前先加如28％氨水使培養(yǎng)基的pH達到5.0(氨水同時也做為菌株生長的氮源)，再按每升培養(yǎng)基加入4.37mL PTM1，5-10％接種種子液，通氣攪拌培養(yǎng)18-24小時，在培養(yǎng)過程中隨著菌株的生長，培養(yǎng)基中的溶氧量將由100％逐漸降低，當碳源消耗完后溶氧量將再度升高至80％以上，此時菌體濕重將達到110g/L。2)碳源飼喂階段。流加50％甘油(包含12mL/LPTM1)，流加量為18.15/hr/L，培養(yǎng)4小時。調(diào)整通氣量使溶氧量始終大于20％。此時菌體濕重將達到220g/L。3)誘導表達階段。加如甲醇(含12mL/L PTM1)，使甲醇終濃度維持在0.3％，溶氧量始終大于20％。通過此方法發(fā)酵后，鱟素Ta1的表達量達到0.2mg/mL發(fā)酵液。
實施例5本實施例說明原鱟素Ta0與改良后的鱟素Ta1抗菌活性比較的測定程序。通過上述發(fā)酵得到的鱟素Ta0和Ta1，通過電泳進行定量，然后分別測定他們抗菌所需的半殺菌/孢子半抑制濃度。對細菌的測定采用活菌記數(shù)法調(diào)整菌液濃度，按106CFU/mL把細菌與生理鹽水混合，分成分十管，每管1mL，分別加1～100μg的不同量的鱟素。37℃孵育2h，進行活菌計數(shù)。計算出細菌死亡50％時鱟素的濃度。對真菌的測定采用孢子抑制法，收集真菌孢子，制成懸浮液。取該懸浮液10μL與0.01～1μg的不同量的鱟素及50μL PDA液體培養(yǎng)基混合，27-30℃培養(yǎng)24到48h，計算萌發(fā)的孢子數(shù)，最后計算出50％孢子不能萌發(fā)時鱟素的濃度。結果(表1，表2)表明，在細菌方面，除大腸桿菌與枯草芽孢桿菌，Ta0與Ta1抗菌效率相當外，對別的菌株，Ta1的抗菌效率較Ta0有較大幅度的提高，其中對沙門氏菌、副溶血弧菌的抗菌效率提高了近一倍。在真菌方面，除黑曲霉外，對別的菌株，Ta1的抗菌效率顯著高于Ta0，其中對黃曲霉和棒曲霉，Ta1的抗菌效率較Ta0提高了一倍左右。這些結果證明，我們設計改良的鱟素Ta1較天然鱟素有更強的抗菌活性。
表1.對細菌抗菌活性的比較 表2.對真菌抗菌活性的比較
SEQUENCE LISTING<110> 中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所<120> 一種抗菌活性更高的改良鱟素的基因及高效表達的方法<130> I030589<160> 2<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 54<212> DNA<213> 人工合成<400> 1cgttggtgtc gtcgtgtttg ctacagacgt atctgttaca gacgttgtcg ttaa54<210> 2<211> 17<212> PRT<213> 人工合成<400> 2Arg Trp Cys Arg Arg Val Cys Tyr Arg Arg Ile Cys Tyr Arg Arg Cys1 5 10 15Arg
權利要求
1.一種抗菌活性更高的改良鱟素的基因，其特征在于，它包含SEQID NO1所示的核苷酸序列。
2.一種蛋白質(zhì)，其特征在于，它包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.一種表達載體，其特征在于，它包含權利要求1所述的基因。
4.權利要求3所述的表達載體，它是包含權利要求1所述基因的PITal。
5.一種宿主細胞，其特征在于，它包含權利要求3所述的表達載體。
6.權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，它是包含權利要求4所述表達載體的畢赤酵母GS115。
7.權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，它是包含權利要求4所述表達載體的大腸桿菌JM109。
8.一種利用畢赤酵母GS115高效表達權利要求1所述基因的方法，其包括a.培養(yǎng)菌株b.飼喂碳源c.誘導表達
9.權利要求8所述的方法，其中在培養(yǎng)菌株階段，接種菌株前將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH調(diào)至5.0，并添加4.37ml/L培養(yǎng)基的PTM1。
10.權利要求9所述的方法，其中所述的PTM1包含0.6％硫酸銅、0.008％碘化鈉、0.3％硫酸錳、0.02％鉬酸鈉、0.002％硼酸、0.05％氯化鈷、2％氯化鋅、6.5％硫酸亞鐵、0.025％生物素、0.5％硫酸。
11.權利要求8所述的方法，其中在飼喂碳源階段，流加含12mL/L權利要求10所述的PTM1的50％甘油，并調(diào)整通氣量使溶氧量始終大于20％。
12.權利要求8所述的方法，其中在誘導表達階段，使含12mL/L權利要求10所述的PTM1的甲醇的終濃度維持在0.3％，溶氧量始終大于20％。
13.權利要求2所述的蛋白質(zhì)在制備抗細菌和抗真菌藥物中的應用。
14.權利要求13所述的應用，其中所述細菌包括大腸桿菌，沙門氏菌，痢疾志賀氏菌，普通變形菌，副溶血弧菌，乙酸鈣不動桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，短小芽孢桿菌，蠟樣芽孢桿菌，堅實芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌。
15.權利要求13所述的應用，其中所述真菌包括黑曲霉，構巢曲霉，黃曲霉，溜曲霉，棒曲霉，煙曲霉，綠色木霉，米曲霉，宇佐美曲霉，腐質(zhì)霉，日本根霉，少根根霉，蠶蛹蟲草，禾谷鐮孢，灰綠曲霉，雜色曲霉和橄欖綠鏈霉菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種旨在提高其抗菌活性的鱟素基因的設計、人工合成及在表達系統(tǒng)中高效表達方法。改良后的鱟素Ta1較天然鱟素對許多有害細菌、真菌均有更高的抗菌效率，尤其是對許多飼料有害微生物。在重組酵母中Ta1的表達量可達到0.2mg/mL發(fā)酵液。此鱟素可廣泛應用于飼料、醫(yī)藥衛(wèi)生和植物病害防治等領域。
文檔編號A61P31/00GK1597691SQ0315736
公開日2005年3月23日 申請日期2003年9月18日 優(yōu)先權日2003年9月18日
發(fā)明者姚斌, 范云六, 史秀云, 王亞茹, 袁鐵錚, 徐鋒 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所