專(zhuān)利名稱(chēng)：GSK－3β抑制劑在制備增加骨生成的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)抑制劑促進(jìn)骨生成和治療骨代謝疾病如骨質(zhì)疏松癥的用途。
本發(fā)明尤其涉及GSK-3β抑制劑在制備增加哺乳動(dòng)物骨生成的藥物中的應(yīng)用。
糖原合成酶激酶(GSK)是絲氨酸/蘇氨酸激酶，已經(jīng)鑒定了它的兩個(gè)同工型，α和β。最初，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)被鑒定為蛋白質(zhì)激酶，其磷酸化并滅活糖原合成酶，是調(diào)節(jié)胰島素刺激的糖原合成的關(guān)鍵酶(見(jiàn)Embi等，Eur.J.Biochem.107，519-527，(1980)；Rylatt等，Eur.J.Biochem.107，529-537，(1980)；和Vandenheede等，J.Biol.Chem.255，11768-11774，(1980))。后來(lái)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)胰島素激活后GSK-3β被抑制，因此允許糖原合成酶的激活。因此，GSK-3β的抑制刺激胰島素依賴(lài)性過(guò)程并可用于治療2型糖尿病，其特征在于降低對(duì)胰島素的敏感性并增加血糖濃度。許多藥物，如5-碘殺結(jié)核菌素、二甲雙胍、曲格列酮(troglitazonem)已經(jīng)被用來(lái)治療糖尿病。然而這些藥物的應(yīng)用受限，因?yàn)槎纂p胍會(huì)引發(fā)低血糖，曲格列酮(troglitazonem)會(huì)引起嚴(yán)重的肝毒性，5-碘殺結(jié)核菌素，已知的GSK-3抑制劑，抑制其它絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸激酶。
近來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GSK-3β在阿爾茨海默氏病((見(jiàn)Lovestone等，Current Biology，4，1077-86(1994)，Brownlees等，Neuroreport，8，3251-3255(1997)，Takashima等，PNAS 95，9637-9641(1998)，和Pei等，J Neuropathol.Exp.，56，70-78(1997))和雙相性精神障礙(見(jiàn)Chen等，J.Neurochemistry，72，1327-1330(1999))的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮作用。也已發(fā)現(xiàn)，GSK-3β?tīng)可嫱ㄟ^(guò)NF-AT阻斷早期免疫應(yīng)答基因激活和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡(見(jiàn)Beals等，Science，275，1930-33(1997)和Pap，M.等J.Biochem.273，19929-19932，(1998))。另外，據(jù)報(bào)道在牽涉對(duì)感染有促炎應(yīng)答的TNF-α信號(hào)途徑中，NF-κB介導(dǎo)的存活響應(yīng)需要GSK-3β((Hoeflich等，Nature，406，86-90(2000))。
此外，已知GSK-3β也調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(β-連環(huán)蛋白)的降解，此蛋白質(zhì)控制TCF家族轉(zhuǎn)錄因子的活性((見(jiàn)Dale，T.C.，Biochem.J.329，209-223(1998)；Clevers，H.& van de Wetering，M.，Trends inGenetics 13，485-489(1997)；Staal，F(xiàn).J.T.等，InternationalImmunology 11，317-323(1999))。此途徑已顯示調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
GSK-3β抑制劑在下述參考文獻(xiàn)中有描述WO99/65897(Chiron)、WO01/20727A1(Sanofi-Synthelabo)、EP1 136 493 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 489 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136486 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 483 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136099A1(Sanofi-Synthelabo)、WO 2000/021927(SKB)、WO2001/049709、WO 2001/056567(Novo Nordisk)、WO 2001/081345、WO2001/085685、WO 2001/009106(SKB)、WO2001/52862(Isis)、WO2001/37819、WO2001/60374、EP 1 106180A1(CNRS)和WO2000/38675(SKB)。
本發(fā)明涉及糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)促進(jìn)骨生成的用途。
一方面，本發(fā)明涉及GSK-3β抑制劑增加患者骨礦物質(zhì)密度的用途。另一方面，本發(fā)明涉及GSK-3β抑制劑降低骨折率和/或增加患者骨折愈合率的用途。另一方面，本發(fā)明涉及GSK-3β抑制劑增加骨松質(zhì)形成和/或患者新骨生成的用途。另一方面，本發(fā)明涉及GSK-3β抑制劑治療骨質(zhì)疏松癥的用途。相應(yīng)地，一方面，本發(fā)明涉及式(I)表示的3-吲哚基-4-苯基-1H-吡咯-2，5-二酮衍生物或其藥用鹽增加哺乳動(dòng)物骨生成的用途
其中R1和R2獨(dú)立地代表氫、烷基、鹵素、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基；R3代表氫、烷基、環(huán)烷基、雜烷基、-COR7(其中R7是氫或烷基)或苯基，此苯基任選地被一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立地選自氫、烷基、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基的基團(tuán)取代；R4和R5獨(dú)立地代表氫、烷基、鹵素、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基；R6是雜烷基、雜環(huán)基、雜環(huán)烷基、雜烷基取代的雜環(huán)基、雜烷基取代的環(huán)烷基、雜取代的環(huán)烷基、-OR8、-S(O)nR8(其中n是0-2；且R8是雜烷基、雜芳烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)烷基)、-NR9R10(其中R9是氫或烷基且R10是雜烷基、雜芳烷基、雜取代的環(huán)烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)烷基)或-X-(亞烷基)-Y-Z(其中X是共價(jià)鍵、-O-、-NH-或-S(O)n1其中n1是0-2且Y是-O-、-NH-或-S-且Z是雜烷基或SiR11R12R13其中R11、R12和R13獨(dú)立地是氫或烷基)或者當(dāng)R6與R4彼此相鄰時(shí)，它們一起形成亞甲二氧基或亞乙二氧基。
另一方面，本發(fā)明涉及GSK-3β抑制劑增加骨生成的用途，其中抑制劑選自在如下文獻(xiàn)中公開(kāi)的化合物WO99/65897(Chiron)、WO01/20727A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 493 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 489 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 486 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 483 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136099A1(Sanofi-Synthelabo)、WO 2000/021927(SKB)、WO2001/049709、WO 2001/056567(Novo Nordisk)、WO 2001/081345、WO2001/085685、WO2001/009106(SKB)、WO2001/52862(Isis)、WO2001/37819、WO2001/60374、EP 1 106180A1(CNRS)和WO2000/38675(SKB)。
WO01/20727A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 493 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136 489 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136486 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 483 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136 099A1(Sanofi-Synthelabo)公開(kāi)了不同的嘧啶-4(1H)-酮衍生物，WO2001/37819公開(kāi)了靛玉紅衍生物。WO2001/60374公開(kāi)了paullone衍生物。EP 1 106 180A1公開(kāi)了hymenialdisine衍生物。
在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中關(guān)于式(I)化合物的說(shuō)明的下述術(shù)語(yǔ)具有如下給出的含義。
“烷基”指具有一到六個(gè)碳原子的直鏈飽和一價(jià)烴基或具有三到六個(gè)碳原子的支鏈飽和一價(jià)烴基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基等。
“亞烷基”指具有一到六個(gè)碳原子的直鏈飽和二價(jià)烴基或具有三到六個(gè)碳原子的支鏈飽和二價(jià)烴基，例如亞甲基、亞乙基、2，2-二甲基亞乙基、亞丙基、2-甲基亞丙基、亞丁基、亞戊基等。
“烷氧基”指基團(tuán)-OR，其中R是如上定義的烷基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。
“烷硫基”指基團(tuán)-SR，其中R是如上定義的烷基，例如甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基等。
“?；敝富鶊F(tuán)-C(O)R，其中R是氫、烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、苯基或苯烷基，其中烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基和苯烷基如此處所定義。代表性的例子包括，但不限于甲酰基、乙?；?、環(huán)己基羰基、環(huán)己基甲基羰基、苯甲?；?、芐基羰基等。
“酰氨基”指基團(tuán)-NR’C(O)R，其中R’是氫或烷基，且R是氫、烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、苯基或苯烷基，其中烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基和苯烷基如此處所定義。代表性的例子包括，但不限于甲酰氨基、乙酰氨基、環(huán)己基羰基氨基、環(huán)己基甲基羰基氨基、苯甲酰基氨基、苯基羰基氨基等。
“環(huán)烷基”指具有三至七個(gè)環(huán)碳原子的飽和一價(jià)環(huán)烴基，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)己基、4-甲基環(huán)己基等。
“環(huán)烷基烷基”指基團(tuán)-RaRb，其中Ra是亞烷基且Rb是如此處所定義的環(huán)烷基，例如環(huán)己基甲基等。
“二烷基氨基”指基團(tuán)-NRR’，其中R和R’獨(dú)立地代表如此處所定義的烷基、環(huán)烷基或環(huán)烷基烷基。代表性的實(shí)例包括，但不限于二甲基氨基、甲基乙基氨基、二(1-甲基乙基)氨基、(環(huán)己基)(甲基)氨基、(環(huán)己基)(乙基)氨基、(環(huán)己基)(丙基)氨基、(環(huán)己基甲基)(甲基)氨基、(環(huán)己基甲基)(乙基)氨基等。
“GSK-3β抑制劑”指化合物，當(dāng)通過(guò)在此處生物實(shí)施例1中描述的體外GSK-3β分析測(cè)量時(shí)，其抗GSK-3β的IC50小于100nM，優(yōu)選小于50nM，最優(yōu)選小于10nM。優(yōu)選地，GSK-3β抑制劑是分子量小于1000道爾頓的有機(jī)分子。尤其有用的GSK-3β抑制劑是，與其它激酶例如PKC、cdk1、cdk2、cdk4和c-SRC相比而言，對(duì)于GSK-3β顯示選擇性的抑制劑。
“鹵素”指氟、氯、溴或碘，優(yōu)選碘和氯。
“鹵代烷基”指取代有一個(gè)或多個(gè)相同或不同鹵素原子的烷基，例如-CH2Cl、-CF3、-CH2CF3、-CH2CCl3等。
“雜烷基”指如此處所定義的烷基，其中一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氫原子獨(dú)立地被選自-ORa、-NRbRc和-S(O)nRd(其中n是從0至2的整數(shù))的取代基取代，條件是雜烷基的附著點(diǎn)是通過(guò)碳原子，其中Ra是氫、?；?、烷基、環(huán)烷基或環(huán)烷基烷基；Rb和Rc各自獨(dú)立的是氫、?；?、烷基、環(huán)烷基或環(huán)烷基烷基；和當(dāng)n是0時(shí)，Rd是氫、烷基、環(huán)烷基或環(huán)烷基烷基，且當(dāng)n是1或2時(shí)，Rd是烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、氨基、酰氨基、單烷氨基或二烷氨基。代表性的例子包括，但不限于2-羥乙基、3-羥丙基、2-羥基-1-羥甲基乙基、2，3-二羥基丙基、1-羥甲基乙基、3-羥丁基、2，3-二羥丁基、2-羥基-1-甲基丙基、2-氨基乙基、3-氨基丙基、2-甲基磺酰乙基、氨基磺酰甲基、氨基磺酰乙基、氨基磺酰丙基、甲基氨基磺酰甲基、甲基氨基磺酰乙基、甲基氨基磺酰丙基等。
“羥烷基”指如此處所定義的被一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)羥基取代的烷基，條件是同一個(gè)碳原子不攜帶超過(guò)一個(gè)羥基。代表性的例子包括，但不限于2-羥基乙基、2-羥基丙基、3-羥基丙基、1-(羥基甲基)-2-甲基丙基、2-羥基丁基、3-羥基丁基、4-羥基丁基、2，3-二羥基丙基、2-羥基-1-羥基甲基乙基、2，3-二羥基丁基、3，4-二羥基丁基和2-(羥基甲基)-3-羥基丙基，優(yōu)選2-羥基乙基、2，3-二羥基丙基和1-(羥基甲基)-2-羥基乙基。相應(yīng)地，當(dāng)在這里使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“羥烷基”被用來(lái)定義雜烷基的子集。
“雜取代的環(huán)烷基”指如此所定義的環(huán)烷基，其中在環(huán)烷基中一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氫原子獨(dú)立地被選自羥基、烷氧基、氨基、酰氨基、單烷基氨基、二烷基氨基或-S(O)nR(其中n是從0-2的整數(shù))的基團(tuán)取代，當(dāng)n是0時(shí)，R是羥基、烷基、環(huán)烷基或環(huán)烷基烷基且當(dāng)n是1或2時(shí)，R是烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基。代表性的例子包括，但不限于2-，3-或4-羥環(huán)己基、2-，3-或4-氨基環(huán)己基、2-，3-或4-磺酰氨基(sulfonamide)環(huán)己基等，優(yōu)選4-羥基環(huán)己基、2-氨基環(huán)己基、4-磺酰氨基環(huán)己基。
“雜烷基取代的環(huán)烷基”指如此處所定義的環(huán)烷基，其中環(huán)烷基中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氫原子被雜烷基取代，條件是雜烷基通過(guò)碳-碳鍵與環(huán)烷基相連。代表性的例子包括，但不限于1-羥甲基環(huán)戊基、2-羥甲基環(huán)己基等。
“雜芳基”指有5-12個(gè)環(huán)原子的一價(jià)單環(huán)或二環(huán)基團(tuán)，具有至少一個(gè)包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自N、O或S的環(huán)雜原子的芳環(huán)，剩余的環(huán)原子是C，條件是雜芳基的附著點(diǎn)在芳環(huán)上。雜芳環(huán)任選地獨(dú)立地被一個(gè)或多個(gè)取代基，優(yōu)選一個(gè)或兩個(gè)取代基取代，取代基選自烷基、鹵代烷基、雜烷基、羥基、烷氧基、鹵素、硝基、氰基。更特別的，術(shù)語(yǔ)雜芳基包括，但不限于，吡啶基、呋喃基、噻吩基、異噻吩基、噻唑基、異噻唑基、三唑基、咪唑基、異噁唑基、吡咯基、吡唑基、嘧啶基、苯并呋喃基、四氫苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并異噻唑基、苯并三唑基、吲哚基、異吲哚基、苯并噁唑基、喹啉基、四氫喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、苯并異噁唑基或苯并噻吩基和它們的衍生物。
“雜芳烷基”指基團(tuán)-RaRb，其中Ra是亞烷基且Rb是如此處所定義的雜芳基，例如嘧啶-3-基甲基、咪唑基乙基、嘧啶基乙基、3-(苯并呋喃-2-基)丙基等。
“雜環(huán)基”指有5-8個(gè)環(huán)原子的飽和環(huán)基團(tuán)，其中一或兩個(gè)環(huán)原子是雜原子選自NR(其中R獨(dú)立地是氫、烷基或雜烷基)、O或S(O)n(其中n是0-2的整數(shù))，剩余的環(huán)原子是C，其中一個(gè)或兩個(gè)碳原子可以任選地被羰基基取代。雜環(huán)基環(huán)可以任選地獨(dú)立地被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)取代基取代，取代基選自烷基、鹵代烷基、雜烷基、鹵素、硝基、氰基、羥基、烷氧基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、-COR(其中R是烷基)。更特別的，術(shù)語(yǔ)雜環(huán)基包括，但不限于四氫吡喃、2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)、哌啶子基、N-甲基哌啶-3-基、哌嗪、N-甲基吡咯烷-3-基、3-吡咯烷、嗎啉、硫代嗎啉、硫代嗎啉-1-氧化物、硫代嗎啉-1，1-二氧化物、吡咯啉基、咪唑啉基和它們的衍生物。
“雜烷基取代的雜環(huán)基”指如此處所定義的雜環(huán)基，其中在雜環(huán)基團(tuán)中一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氫原子被雜烷基取代，條件是雜烷基通過(guò)碳-碳鍵與雜環(huán)基基團(tuán)相連。代表性的例子包括，但不限于4-羥基甲基哌啶-1-基、4-羥基甲基哌嗪-1-基、4-羥基乙基哌啶-1-基、4-羥基乙基哌嗪-1-基等。
“雜環(huán)烷基”、“環(huán)烷基烷基”或“苯烷基”指基團(tuán)-RaRb，其中Ra是亞烷基且Rb是如此處所定義的苯基或雜環(huán)基或環(huán)烷基，例如四氫吡喃-2-基甲基、4-甲基哌嗪-1-基乙基、3-哌啶基甲基、2，2-二甲基-1，3-dioxoxolan-4-基甲基、芐基、環(huán)己基甲基等?！皢瓮榛被敝富鶊F(tuán)-NHR，其中R是如此處所定義的烷基、環(huán)烷基或環(huán)烷基烷基，例如甲基氨基、(1-甲基乙基)氨基、環(huán)己基氨基、環(huán)己基甲基氨基、環(huán)己基乙基氨基等。
“任選的”或“任選地”指隨后描述的事件或狀況可以發(fā)生但是不是必須發(fā)生，并且此說(shuō)明包括事件或狀況發(fā)生的實(shí)例和不發(fā)生的實(shí)例。例如，“任選地被烷基單-或二取代的雜環(huán)基”指烷基可以存在但是不是必須存在，并且此說(shuō)明包括雜環(huán)基被烷基單-二取代的情況和雜環(huán)基不被烷基取代的情況。
“苯基烷基”指基團(tuán)RaRb，其中Ra是亞烷基，且Rb是如此處所定義的苯基，例如芐基等。
“羥基或氨基保護(hù)基團(tuán)”指在合成過(guò)程中，為了保護(hù)氧和氮原子防止不合需要的反應(yīng)的那些有機(jī)基團(tuán)。合適的氧和氮原子保護(hù)基是本領(lǐng)域公知的，例如三甲基甲硅烷基、二甲基-叔-丁基甲硅烷基、芐基、芐氧基-羰基(CBZ)、叔-丁氧基羰基(Boc)、三氟乙酰基、2-三甲基甲硅烷基乙磺?；?SES)等。其它在書(shū)T.W.Greene和G.M.Wuts，ProtectingGroups in Organic Synthesis，Second Edition，Wiley，New York，1991中可以找到，它們?cè)谶@里被引用作為參考。
具有相同分子式，但是性質(zhì)或它們的原子的鍵合順序或它們的原子在空間中的排列不同的化合物稱(chēng)作“異構(gòu)體”。在空間中它們的原子的排列不同的異構(gòu)體稱(chēng)作“立體異構(gòu)體”?；ハ嗖皇晴R像的立體異構(gòu)體稱(chēng)作“非對(duì)映體”，并且那些互相是非重疊鏡像的立體異構(gòu)體稱(chēng)作“對(duì)映異構(gòu)體”。當(dāng)化合物有不對(duì)稱(chēng)中心時(shí)，例如其連接四個(gè)不同的基團(tuán)，一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體是可能的。對(duì)映異構(gòu)體可以通過(guò)它的不對(duì)稱(chēng)中心的絕對(duì)構(gòu)型來(lái)表征，并且通過(guò)Cahn和Prelog的R-和S-順位規(guī)則來(lái)描述，或通過(guò)分子旋轉(zhuǎn)偏振光平面的方式來(lái)描述，并指定為右旋的或左旋的(即分別為(+)或(-)異構(gòu)體)。手性化合物可以以單獨(dú)的對(duì)映異構(gòu)體或作為它們的混合物存在。包含等比例對(duì)映異構(gòu)體的混合物稱(chēng)作“外消旋混合物”。
式(I)化合物可以有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱(chēng)中心；這種化合物因此可以作為單獨(dú)的(R)-或(S)-立體異構(gòu)體或作為它們的混合物生產(chǎn)。例如，如果式(I)化合物中的R6取代基是2-羥乙基，則連接羥基的碳是不對(duì)稱(chēng)中心并且因此式(I)化合物可以作為(R)-或(S)-對(duì)映異構(gòu)體存在。除非另有說(shuō)明，說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中的特定化合物的說(shuō)明或命名意欲包括單獨(dú)的對(duì)映異構(gòu)體和它們的混合物，外消旋物或其它。用于測(cè)定立體化學(xué)和分離立體異構(gòu)體的方法是本領(lǐng)域公知的(見(jiàn)discussion inChapter 4 of″Advanced Organic Chemistry″，4th edition J.March，John Wiley and Sons，New York，1992)。
“藥用賦形劑”指在制備藥物組合物中使用的賦形劑，其通常是安全、無(wú)毒并且不是有生物活性或其它不合需要的，并且包括獸和人可藥用的賦形劑。當(dāng)在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用時(shí)，“藥用賦形劑”包括一種和多于一種這種賦形劑。
“藥用鹽”指可藥用的并且母體化合物具有理想的藥理活性的鹽。這些鹽包括(1)酸加成鹽，與無(wú)機(jī)酸形成，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸和類(lèi)似酸；或與有機(jī)酸形成，例如醋酸、丙酸、己酸、環(huán)戊烷丙酸、羥乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、馬來(lái)酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥芐基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、3-苯丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羥基萘酸、水楊酸、硬脂酸、己二烯二酸和類(lèi)似酸；或(2)當(dāng)在母體化合物中存在酸性質(zhì)子時(shí)形成的鹽，被金屬離子取代，例如堿金屬離子、堿土金屬離子、或鋁離子；或與有機(jī)堿配位，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺和類(lèi)似有機(jī)堿。
式(I)化合物可以作為前藥。前藥指當(dāng)此前藥被給予哺乳動(dòng)物患者時(shí)，釋放式(I)的活性母體藥物的任何化合物。式(I)化合物的前藥通過(guò)修飾在式(I)化合物中存在的功能基團(tuán)制備，在此方式下修飾基團(tuán)可以在體內(nèi)裂解來(lái)釋放母體化合物。前藥包括其中化合物(I)中的羥基、氨基或巰基與任何可以在體內(nèi)裂解來(lái)分別再生游離羥基、氨基或巰基的鍵相連的式(I)化合物。前藥的例子包括，但不限于式(I)化合物中羥基官能團(tuán)的酯(例如醋酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物)、氨基甲酸酯類(lèi)(例如N，N-二甲氨基-羰基)和類(lèi)似前藥。
疾病的“治療”包括(1)預(yù)防疾病，即使哺乳動(dòng)物疾病的臨床癥狀不發(fā)展，此哺乳動(dòng)物可能遭受了或易感染疾病，但是不經(jīng)歷或顯示疾病癥狀。
(2)抑制疾病，即阻止或減少疾病或其臨床癥狀的發(fā)展，或(3)緩解疾病，即使疾病或其臨床癥狀消退。
“治療有效量”指當(dāng)給予哺乳動(dòng)物來(lái)治療疾病時(shí)，對(duì)于疾病的這種治療是足夠有效的化合物的量。“治療有效量”可以隨化合物，被治療的哺乳動(dòng)物的疾病和其嚴(yán)重性、年齡、體重等變化。
命名法式(I)化合物的名稱(chēng)和編號(hào)在下面說(shuō)明。

在本申請(qǐng)中使用的命名法通常是基于IUPAC推薦的命名法。因?yàn)閲?yán)格按照這些推薦當(dāng)只有單個(gè)取代基變化時(shí)會(huì)導(dǎo)致名稱(chēng)完全變化，所以化合物以維持分子基本結(jié)構(gòu)名稱(chēng)一致性的形式命名。例如，式(I)化合物，其中R1、R2、R4和R5是氫，R3是甲基，R6是2-羥乙基氨基并且在苯環(huán)與吡咯-2，5-二酮環(huán)相連的碳的間位，命名為3-(1-甲基吲哚基)-4-[3-(2-羥乙基氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮。
式(I)化合物，其中R1、R2、R4和R5是氫，R3是甲基，R6是2-羥乙基氨基并且在苯環(huán)與吡咯-2，5-二酮環(huán)相連的碳的對(duì)位，命名為3-(1-甲基吲哚基)-4-[4-(2-羥乙基氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮。
優(yōu)選的式(I)化合物選自I.式(I)化合物，其中R1、R2、R4和R5＝氫，R3＝甲基且R6如下所定義
II.本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的化合物是式(I)化合物，其中R1、R2、R4和R5＝氫，R3＝甲基且R6如下所定義
III.進(jìn)一步優(yōu)選的式(I)化合物是其中R2、R4和R5＝氫，R1、R3和R6如下所定義的那些
IV.也優(yōu)選的是其中R1、R2、R4和R5＝氫，R3＝甲基且R6如下所定義的式(I)化合物
V.進(jìn)一步優(yōu)選的式(I)化合物是其中R4-R6中只有一個(gè)是氫的那些，并且此化合物選自3-(1-甲基-吲哚-3-基)-4-{3-((R)-2，3-二羥基-丙氧基)-2-甲基苯基}-1H-吡咯-2，5-二酮；3-(1-甲基-吲哚-3-基)-4-{3-((R)-2，3-二羥基-丙氧基)-2-硝基苯基}-1H-吡咯-2，5-二酮；和3-(1-甲基吲哚-3-基)-4-{5-((R)-2，3-二羥基-丙氧基)-2-硝基苯基}-1H-吡咯-2，5-二酮。
式(I)化合物按照共同未決美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)09/916,706(2001年7月27日申請(qǐng))的方法制備，其在這里被引入作為參考。
其它在這里描述的方法中有用的化合物包括N6-{2-[4-(2，4-二氯-苯基)-5-(1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-3-硝基-嘧啶-2，6-二鹽酸胺，如WO99/65897的描述制備。
尤其優(yōu)選的是如前面提及的用途或治療方法，其中GSK-3β抑制劑選自a)下式化合物 其中R6是2(R)3-二羥基丙氧基；b)下式化合物 其中R6是2，3-二羥基-丙基氨基；c)下式化合物 其中R1是氟，R3是甲基且R6是3-氨基丙氧基；和d)N6-{2-[4-(2，4-二氯-苯基)-5-(1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-3-硝基-吡啶-2，6-二氨基。
優(yōu)選的是GSK-3β抑制劑在制備增加哺乳動(dòng)物骨生成的藥物中的應(yīng)用。
進(jìn)一步優(yōu)選的是上述應(yīng)用，其中藥物增加哺乳動(dòng)物骨礦物質(zhì)密度。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方面是上述應(yīng)用，其中藥物減少哺乳動(dòng)物骨折發(fā)生率。
也優(yōu)選的是上述應(yīng)用，其中藥物促進(jìn)哺乳動(dòng)物骨折愈合。
進(jìn)一步優(yōu)選的是上述GSK-3β抑制劑在制備用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用。
也優(yōu)選的是治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物骨質(zhì)疏松癥的方法，通過(guò)給予哺乳動(dòng)物有效量的GSK-3β抑制劑。
尤其優(yōu)選的是上述應(yīng)用或方法，其中哺乳動(dòng)物是人。
極優(yōu)選的是上述應(yīng)用或方法，其中哺乳動(dòng)物是雌性。
優(yōu)選的是上述應(yīng)用或方法，其中GSK-3β抑制劑是式(I)代表的化合物或其藥用鹽 其中R1和R2獨(dú)立地代表氫、烷基、鹵素、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基；R3代表氫、烷基、環(huán)烷基、雜烷基、-COR7(其中R7是氫或烷基)或苯基，此苯基任選地被一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立地選自氫、烷基、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基和二烷基氨基的基團(tuán)取代；R4和R5獨(dú)立地代表氫、烷基、鹵素、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基；R6是雜烷基、雜環(huán)基、雜環(huán)烷基、雜烷基取代的雜環(huán)基、雜烷基取代的環(huán)烷基、雜取代的環(huán)烷基、-OR8、-S(O)nR8(其中n是0-2；且R8是雜烷基、雜芳烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)烷基)、-NR9R10(其中R9是氫或烷基且R10是雜烷基、雜芳烷基、雜取代的環(huán)烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)烷基)或-X-(亞烷基)-Y-Z(其中X是共價(jià)鍵、-O-、-NH-或-S(O)n1其中n1是0-2且Y是-O-、-NH-或-S-且Z是雜烷基或SiR11R12R13其中R11、R12和R13獨(dú)立地是氫或烷基)或者當(dāng)R6與R4彼此相鄰時(shí)，它們一起形成亞甲二氧基或亞乙二氧基。
尤其優(yōu)選的是上述應(yīng)用或方法，其中GSK-3β抑制劑選自a)下式化合物 其中R6是2(R)3-二羥基丙氧基；b)下式化合物 其中R6是2，3-二羥基-丙基氨基；c)下式化合物
其中R1是氟、R3是甲基且R6是3-氨基丙氧基；和d)N6-{2-[4-(2，4-二氯-苯基)-5-(1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-3-硝基-吡啶-2，6-二氨基。
進(jìn)一步優(yōu)選的是上面提及的應(yīng)用或方法，其中GSK-3β抑制劑是口服給藥。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方面是上述應(yīng)用或方法，其中用GSK-3β治療，然后用抗再吸收劑治療。
也優(yōu)選的是上述應(yīng)用或方法，其中GSK-3β抑制劑抗GSK-3β的IC50為低于50nM。
尤其優(yōu)選的是上述應(yīng)用或方法，其中GSK-3β抑制劑抗GSK-3β的IC50為低于10nM。
進(jìn)一步尤其優(yōu)選的是上述應(yīng)用或方法，其中GSK-3β抑制劑的分子量為低于1000道爾頓。
效用、試驗(yàn)和給藥效用申請(qǐng)人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，具有GSK-3β抑制劑共同特征的多種結(jié)構(gòu)不同的化合物能有效地增加骨生成。因此，在此公開(kāi)的方法提供用于增加骨礦物質(zhì)密度、形成新骨、增加骨折愈合率、改善骨機(jī)械性質(zhì)(即形成皮層骨和小梁骨)的治療以及治療骨質(zhì)疏松癥、醫(yī)源性的和老年骨質(zhì)疏松癥和相關(guān)的骨代謝疾病。
利用GSK-3β抑制劑的治療能用來(lái)治療I型(絕經(jīng)后的)、II型(醫(yī)源性的)和III型(老年的)骨質(zhì)疏松癥，包括與皮質(zhì)類(lèi)固醇激素治療(例如哮喘)、與化學(xué)療法有關(guān)的治療，也能用來(lái)治療由于腎透析和甲狀腺功能亢進(jìn)的骨質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良。用如在這里描述的GSK-3β抑制劑的治療產(chǎn)生增加的骨礦物質(zhì)密度，并且與常規(guī)的治療不同，提供良好質(zhì)量的骨。因此，在這里描述的治療會(huì)降低骨折發(fā)生率并且使先前存在的骨折更快地愈合。這種治療對(duì)于患有雌激素減少的患者(例如高齡女性)是特別有用的，她們有骨折率增加的風(fēng)險(xiǎn)。能治療的骨折類(lèi)型包括外傷性和骨質(zhì)疏松的骨折，例如臀、股骨的頸、腕、椎骨、脊柱、肋骨、胸骨、喉、氣管、橈骨/尺骨、脛骨、膝蓋骨、鎖骨、骨盆、肱骨、小腿、手指、腳趾、面部和踝骨折。
試驗(yàn)通過(guò)體外試驗(yàn)可以鑒定抑制GSK-3β的化合物，例如在下面生物實(shí)施例1和2中詳細(xì)描述的配體結(jié)合試驗(yàn)和β-連環(huán)蛋白降解抑制試驗(yàn)。
給藥和藥物組合物通常，GSK-3β抑制劑可以通過(guò)對(duì)于用來(lái)增加骨生成的藥劑任何可接受的給藥方式以治療有效量給予。抑制劑的實(shí)際量取決于多種因素，例如被治療疾病的嚴(yán)重性、患者的年齡和相對(duì)健康、所使用化合物的效能、給藥途徑和形式以及其它因素。抑制劑可以每天給藥超過(guò)一次，優(yōu)選一天一次或兩次。
GSK-3β抑制劑的治療有效量大約為每天接收者每千克體重1mg-50mg；優(yōu)選約3mg/kg/天。因此，對(duì)于70kg的人給藥，劑量在約70-3500mg/天范圍內(nèi)，最優(yōu)選約200mg/天。
通常，GSK-3β抑制劑通過(guò)下述途徑中的任何一種作為藥物組合物給藥口服、全身給藥(例如經(jīng)皮、鼻內(nèi)或栓劑)、或腸胃外給藥(肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)。優(yōu)選的給藥方式是口服，利用方便的日劑量服法，其可以按照痛苦的程度調(diào)整。組合物可以是片劑、丸劑、膠囊、半固體、粉劑、緩釋劑、溶液劑、混懸劑、酏劑、氣霧劑或任何其它合適的組合物。
本發(fā)明的相關(guān)的方面涉及增加骨生成的GSK-3β抑制劑與其它活性試劑例如二膦酸鹽、雌激素、SERMS(選擇性雌激素受體調(diào)制劑)、降鈣素或合成代謝療法的聯(lián)合療法。二膦酸鹽的例子包括阿侖膦酸，伊班膦酸鹽，帕米膦酸鹽，依替膦酸鹽和利塞膦酸鹽。SERMS的例子包括雷洛昔芬、二羥基雷洛昔芬和拉索昔芬。降鈣素包括人和鮭魚(yú)降鈣素。合成代謝劑包括甲狀旁腺激素(PTH)例如hPTH(1-34)、PTH(1-84)和與甲狀旁腺激素相關(guān)的蛋白質(zhì)(PTHrP)和它們的類(lèi)似物。PTHrP的具體的類(lèi)似物在″Mono-and Bicyclic Analogs of Parathyroid Hormone-Related Protein.1.Synthesis and Biological Studies，″Michael Chorev等Biochemistry，363293-3299(1997)和″Cyclic analogs of PTH andPTHrP，″WO 96/40193和U.S.專(zhuān)利5,589,452和WO 97/07815中有描述。其它活性劑可以同時(shí)地、在GSK-3β之前或之后給藥，且可以通過(guò)不同的輸送方法給藥。優(yōu)選地，GSK-3β抑制劑首先給藥。這一給藥時(shí)期可以是任何長(zhǎng)度，但是典型地在6-24個(gè)月范圍內(nèi)。然后在這一治療后用抗再吸收劑治療，例如二膦酸鹽、SERM、降鈣素或激素替代療法。
近來(lái)，已經(jīng)研發(fā)了藥物制劑，特別是用于顯示較差生物利用度的藥物，基于此規(guī)則，通過(guò)增加表面積，即減少顆粒尺寸可以增加生物利用度。例如，美國(guó)專(zhuān)利4,107,288描述了顆粒尺寸在10-1,000nm范圍內(nèi)的藥物制劑，其中活性物質(zhì)由大分子的交聯(lián)基質(zhì)承載。美國(guó)專(zhuān)利5,145,684描述了藥物制劑的生產(chǎn)，其中在表面改性劑的存在下將藥物研磨成納米顆粒(平均顆粒大小400nm)，然后將其分散在液體介質(zhì)中以得到顯示極高生物利用度的藥物制劑。
GSK-3β抑制劑的藥物組合物通常包含至少一種藥用賦形劑?？山邮艿馁x形劑是無(wú)毒的、輔助給藥并且對(duì)于抑制劑的治療益處無(wú)不利影響。這種賦形劑可以是任何固體、液體、半固體，或者當(dāng)是氣霧劑組合物時(shí)是本領(lǐng)域技術(shù)人員通?？傻玫降臍怏w賦形劑。
固體藥物賦形劑包括淀粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、氯化鈉、干燥的脫脂乳或類(lèi)似物。液體和半固體賦形劑可以選自甘油、丙二醇、水、乙醇和各種油，包括石油、動(dòng)物油、植物油或合成油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。優(yōu)選的液體載體，尤其是注射用溶液，包括水、鹽水、水性葡萄糖和乙二醇。
Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin編著(Mack PublishingCompany，18th ed.，1990)。
制劑中化合物的量可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的整個(gè)范圍內(nèi)變化。典型地，制劑包含，基于重量百分比(wt％)，基于制劑總量約0.01-99.99wt％的GSK-3β，其余是一種或多種適宜的藥用賦形劑。優(yōu)選地，化合物以約1-80wt％的水平存在。
實(shí)施例給出下面的制備和實(shí)施例以使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能更清楚的理解和實(shí)施本發(fā)明。它們不應(yīng)該被認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍，而僅僅是作為說(shuō)明性的和代表性的例子。
在實(shí)施例中使用的縮寫(xiě)詞如下所定義“HCl”指鹽酸、“DMF”指二甲基甲酰胺、“NaOH”指氫氧化鈉、“KOH”指氫氧化鉀、“DMSO”指二甲亞砜、“NaHCO3”指碳酸氫鈉、“NaCl”指氯化鈉、“K2CO3”指碳酸鉀、“NaCO3”指碳酸鈉、“LiOH”指氫氧化鋰、“Et3N”指三乙胺、“NH3(水)”指氫氧化銨、“CH2Cl2”指二氯甲烷、“MeOH”指甲醇、“Ph3P”指三苯基膦、“CsCO3”指碳酸銫、“BINAP”指2，2-雙-(二苯基膦)-1，1’-聯(lián)萘、“Pd2(dba)3”指三(聯(lián)苯亞甲基丙酮)-二鈀、“NaCNBH3”指氰基氫硼化物、“THF”指四氫呋喃、“Na2SO4”指硫酸鈉、“RT”指室溫、“PTLC”指預(yù)備的薄層色譜、“SiO2”指硅膠、“EtOAc”指乙酸乙酯、“APMA”指氨基苯基-醋酸汞、“IL-1”指白介素-1和“RPMI”指RoswellPark Memorial Institute。
合成實(shí)施例實(shí)施例1-3顯示制備式(I)的特定化合物的方法實(shí)施例1合成3-(1-甲基吲哚-3-基)-4-[3-(3-叔-丁基二甲基甲硅烷基氧基丙基氨基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮 步驟1將四丙基過(guò)釕酸銨(0.18g，5.3mmol)加入到包含3-(叔-丁基二甲基甲硅烷基氧基)-丙醇(2g，0.01mmol)、N-甲基嗎啉N-氧化物(1.76g)和4的分子篩的二氯甲烷(20mL)和乙腈(2mL)混合物中。將反應(yīng)混合物在RT攪拌過(guò)夜，然后過(guò)濾通過(guò)硅膠墊。將濾過(guò)液在真空下濃縮以提供3-(叔-丁基二甲基甲硅烷基氧基)-丙醛(1.3g，66％)。
步驟2將在CH2Cl2(10mL)和MeOH(5mL)中的3-(1-甲基吲哚-3-基)-4-(3-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮(0.2g，6mmol)和3-(叔-丁基二甲基甲硅烷基氧基)丙醛(0.25g，13mmol)在室溫?cái)嚢?5分鐘，然后加入NaCNBH3(57mg，1.5eq)。將反應(yīng)混合物在RT攪拌過(guò)夜，然后在真空下濃縮。通過(guò)預(yù)備的TLC純化殘留物，得到98mg 3-(1-甲基吲哚-3-基)-4-[3-(3-叔-丁基二甲基甲硅烷基氧基丙基氨基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮(32％)MS(LSIMS)(M+H)+490，MP58-65℃。
按照上面實(shí)施例1中的描述進(jìn)行，但是用2-(叔-丁基二苯基甲硅烷基氧基)乙醇代替3-(叔-丁基二甲基甲硅烷基氧基)丙醇，得到3-(1-甲基吲哚-3-基)-4-[3-(3-叔-丁基二苯基甲硅烷基氧基-乙基氨基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮。
實(shí)施例2合成3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-{3-[(RS)-2，3-二羥基丙基氨基]苯基}-1H-吡咯-2，5-二酮 步驟1向在干DMF(40mL)中的5-氯吲哚(4.97g)的室溫溶液中加入氫氧化鉀小球(2.76g)并攪拌1h，直到大部分固體溶解。將得到的混合物在冰浴中冷卻至0℃，并滴加吲哚甲烷(2.45mL)，稍后在氬氣下在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將反應(yīng)混合物倒入水中，并用ETOAc提取兩次。使結(jié)合的ETOAc部分結(jié)合，用水洗滌，通過(guò)硫酸鎂干燥，濃縮并用10％ETOAc/己烷快速色譜分離，得到1-甲基-5-氯吲哚，是粉紅色液體(5.43g)。
步驟2如實(shí)施例1步驟1中的描述制備1-甲基-5-氯吲哚-3-乙醛酰氯，但是用1-甲基-5-氯吲哚替換1-甲基吲哚。
步驟3如實(shí)施例1步驟2中的描述制備3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)呋喃-2，5-二酮，但是用1-甲基-5-氯吲哚-3-乙醛酰氯替代1-甲基吲哚-3-乙醛酰氯。
步驟4如實(shí)施例1步驟3中的描述制備3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮，但是用3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)呋喃-2，5-二酮替代3-(1-甲基吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)呋喃-2，5-二酮。
步驟5將3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮(865mg)、10％.碳載鈀(90mg)和冰冷的HOAc(35mL)混合物攪拌并利用球形瓶在大氣壓下氫化(2h)。將反應(yīng)混合物過(guò)濾通過(guò)硅藻土墊，冷卻至0℃并加入KOH小球直到PH8。用ETOAc提取溶液，干燥(硫酸鎂)并剝離。將粗產(chǎn)物用10％-20％的ETOAc-己烷快速色譜分離得到3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮(495mg)。
步驟6向在甲醇(250mL)中的3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮(492mg)的室溫溶液中加入溶解在水中的DL-甘油醛二聚物(15mL)，然后加入氰基氫硼化鈉(110mg)，并在氬氣下將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜。通過(guò)TLC反應(yīng)似乎只完成了30％。加入另外的二聚物(150mg)和氰基氫硼化鈉(100mg)。在另一個(gè)6小時(shí)后，反應(yīng)似乎完成了50％。移去溶液，并將粗殘留物用5％-7％-10％的MeOH/二氯甲烷快速色譜分離。獲得3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-{3-[(RS)-2，3-二羥基丙基氨基]苯基}-1H-吡咯-2，5-二酮，呈黑紅色固體(220mg)。MS(EI)(M+H)+426。M.pt.224.8-226.1℃。
實(shí)施例3合成3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-{3-[(RS)-2，3-二羥基-丙基氨基]苯基}-1H-吡咯-2，5-二酮 步驟1如實(shí)施例2步驟1中的描述制備1-甲基-5-氟吲哚，但是用5-氟吲哚替代5-氯吲哚。
步驟2如實(shí)施例2步驟2中的描述制備1-甲基-5-氟吲哚-3-乙醛酰氯，但是用1-甲基-5-氟吲哚替代1-甲基-氯吲哚。
步驟3如實(shí)施例2步驟3中的描述制備3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)呋喃-2，5-二酮，但是用1-甲基-5-氟吲哚-3-乙醛酰氯替代1-甲基-5-氯吲哚-3-乙醛酰氯。
步驟4如實(shí)施例2步驟3中的描述制備3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮，但是用3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)呋喃-2，5-二酮替代3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)呋喃-2，5-二酮。
步驟5如實(shí)施例2步驟5中的描述制備3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-(3-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮，但是用3-(1-3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮替代1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮。
步驟6如實(shí)施例2步驟5中的描述制備3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-{3-[((RS)-2，3-二羥基丙基氨基]苯基}-1H-吡咯-2，5-二酮，但是用3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-(3-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮替代3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮。MS(EI)(M+H)+410，MP223.2°-225°。
制劑實(shí)施例下面是包含式(I)化合物的代表性的藥物制劑。
實(shí)施例1片劑制劑將下述成分密切混合并壓制成有單獨(dú)劃痕的片劑。
每種成分的量 片劑，mg本發(fā)明的化合物400玉米淀粉 50交聯(lián)羧甲基纖維素鈉25乳糖 120硬脂酸鎂 5實(shí)施例2膠囊制劑將下述成分密切混合并裝入硬殼明膠膠囊。
每種成分的量 膠囊，mg本發(fā)明的化合物200乳糖，噴霧干燥148硬脂酸鎂 2實(shí)施例3混懸制劑將下面組分混合以形成適于口服給藥的混懸劑成分 量本發(fā)明的化合物1.0g
富馬酸0.5g氯化鈉2.0g羥苯甲酸甲酯 0.15g羥苯甲酸丙酯 0.05g粒狀糖25.0g山梨醇(70％溶液) 13.00g硅酸鎂鋁K(Vanderbilt Co.) 1.0g調(diào)味劑0.035mL著色劑0.5mg蒸餾水適量至100mL實(shí)施例4注射用制劑混合下述組分以形成注射用制劑。
成分 量本發(fā)明的化合物0.2mg-20mg醋酸鈉緩沖溶液，0.4M 2.0mLHCl(1N)或NaOH(1N) 適量至合適的PH水(蒸餾的，無(wú)菌的)適量至20mL實(shí)施例5栓劑制劑通過(guò)將本發(fā)明的混合物與WitepsolH-15(飽和植物脂肪酸的甘油三酸酯；Riches-Nelson，Inc.，紐約)混合制備總重量為2.5g的栓劑，并具有下列組成本發(fā)明的化合物500mgWitepsolH-15 余量生物實(shí)施例實(shí)施例1
抑制糖原合成激酶-3β-體外試驗(yàn)用重組兔GSK-3β酶的截短形式測(cè)定本發(fā)明化合物的體外GSK-3β抑制活性。
分離GSK-3β按照在Wang，Q.M.等，J.Biol.Chem.269，14566-14574(1994)中描述的步驟在pGEX-3X載體中克隆構(gòu)建體。缺失N-端的十個(gè)氨基酸以獲得組成活性的GSK-3β(見(jiàn)Murai H.等，F(xiàn)EBS Lett.392，153-60，(1996))。GSK-3β在BL21 DE3細(xì)胞中表達(dá)。使細(xì)胞在37℃生長(zhǎng)直到它們到達(dá)對(duì)數(shù)中期，并且然后用異丙基-β-(D)-硫代吡喃半乳糖苷(最終濃度0.4mM)在30℃誘導(dǎo)2h。均化細(xì)胞并將細(xì)胞提取物上樣至谷胱甘肽瓊脂糖4B柱。將GSK-3β用谷胱甘肽緩沖液(50mM Tris pH8和10mM還原型谷胱甘肽)洗脫。在3分鐘級(jí)分中收集洗脫液并在10％SDS PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)上分析GSK-3β含量。合并20％峰高以上部分，等分并儲(chǔ)存在-80℃直至使用。
抑制GSK-3β在96孔聚丙烯板中的50μl反應(yīng)液中進(jìn)行GSK-3β結(jié)合試驗(yàn)，每一反應(yīng)液包含20mM氯化鎂、40μM ATP、2mM DTT、88.5μM生物素化的和磷?；腃REB-肽底物(biotin-KRREILSRRPS(PO4)YR-OH，見(jiàn)Wang，Q.M.等，J.Biol.Chem.269，14566-14574(1994))、[γ-32P]ATP(1μCi)和2μl在DMSO(不同濃度)中的本發(fā)明化合物。加入15μl GSK-3β(不同濃度)并將反應(yīng)混合物在30℃溫育1h。通過(guò)轉(zhuǎn)移25μl反應(yīng)混合物至包含130μl 1.85％磷酸的磷酸纖維素板來(lái)停止反應(yīng)。在真空下用1.85％的磷酸洗去膜中的游離放射核苷酸(5次)。在最后一次洗滌后，將板轉(zhuǎn)移至接收器(adoptor)板，并向?qū)?0μl閃光混合物(cocktail)(Microscint-20，Packard，cat.#20-133)加入到每個(gè)孔中，并且在頂部計(jì)數(shù)器中計(jì)算放射性的量。
在這一試驗(yàn)中，本發(fā)明的化合物是有活性的。
在表I-IV中公開(kāi)本發(fā)明的某些化合物的GSK-3β抑制活性(表示為IC50，引起對(duì)照中活性50％的抑制的抑制劑濃度)低于2μm。某些具體化合物的活性在下面給出
實(shí)施例2抑制β-連環(huán)蛋白降解-體外試驗(yàn)在用本發(fā)明的化合物治療后，如下利用ELISA通過(guò)測(cè)量JurkatT-細(xì)胞中的β-連環(huán)蛋白水平來(lái)測(cè)定本發(fā)明化合物基于細(xì)胞的GSK-3β活性。
將Jurkat細(xì)胞(5×105細(xì)胞/mL)放置在6孔板中(6mL/孔)，然后用不同濃度的本發(fā)明化合物(優(yōu)選1nM-10μM)處理24h。在溫育末期，收集細(xì)胞并用PBS洗滌一次。然后將細(xì)胞混懸在0.3mL放射免疫沉淀分析裂解(RIPA)緩沖液(Boehringer Mannheim，cat.#1 920 693)中。在3個(gè)冷凍-融化周期后，在15,000rpm離心細(xì)胞提取物10分鐘。收集上清液并如下描述利用ELISA分析進(jìn)行分析。
將96微孔板用稀釋于包被緩沖液(0.1M NaHCO3，pH 9.5)中的俘獲抗體(小鼠單克隆抗-β-連環(huán)蛋白，Zymed La.，cat.#13-8400，100μl/孔，包含250ng抗體)包被過(guò)夜。抽吸孔并用300μl洗滌緩沖液(包含0.05％土溫20的PBS)洗滌3次并用200μl分析緩沖液(PBS，10％RBS，pH 7；PharMingen)封閉，然后在室溫溫育至少72h。將孔按上面所述再次洗滌。將100μl Jurkat細(xì)胞上清液和各種濃度的β-連環(huán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)(Behrens等Nature，Vol.382，p638(1996))加入到孔中，并在室溫溫育2h。在溫育后，洗滌孔并將100μl稀釋在試驗(yàn)稀釋劑(1∶1250)中的抗-β-連環(huán)蛋白抗體(Santa Cruz，β-連環(huán)蛋白H-102，sc-7199，兔IgG)加入到每個(gè)孔中，并將細(xì)胞在室溫溫育2h。在洗滌后，將100μl稀釋在試驗(yàn)稀釋劑中的工作檢測(cè)器(Sigma B5283，小鼠單克隆抗-兔IgG-生物素)加入到每一孔中，并在室溫溫育1h。3，3’，5，5’-四甲聯(lián)苯胺(PharMingen，Cat.#2642KK)被用來(lái)顯色。通過(guò)將50μl停止溶液(2N H2SO4)加入到每一孔中來(lái)停止反應(yīng)。在停止反應(yīng)30分鐘內(nèi)用ELISA板讀出器在570nm處讀板。
通過(guò)將化合物濃度對(duì)β-連環(huán)蛋白水平度作圖來(lái)計(jì)算GSK-3β抑制的水平。結(jié)果顯示在

圖1中，確證了本發(fā)明化合物對(duì)β-連環(huán)蛋白濃度的影響。
實(shí)施例3研究用化合物II-3治療的大鼠中的GSK8-骨生成使用卵清蛋白敏化的Brown-Norway大鼠。將它們用在0.2ml明礬中的100μg OA(卵清蛋白)i.p.敏化，每星期一次，共三星期(第0、7和14天)。在最終敏化后7天(第21天)，用1％的OA攻擊大鼠45分鐘并在72小時(shí)后對(duì)其實(shí)施無(wú)痛致死術(shù)(第24天)。通過(guò)口服管飼法在第6-8天和第13-23天每天給藥兩次化合物II-3。化合物被制備成脂質(zhì)體制劑-8mg/ml脂質(zhì)體溶液，1.44g化合物和54克L-α-磷脂酰膽堿的脂質(zhì)體組合物在160ml無(wú)菌水中來(lái)注射。
將股骨標(biāo)本在10％甲酸中脫鈣，埋置在石蠟中，做5微米厚的切片，并用蘇木精和曙紅染色。當(dāng)用光學(xué)顯微鏡檢查時(shí)，在股骨的生長(zhǎng)板下，動(dòng)物骨松質(zhì)有適度的增長(zhǎng)。
實(shí)施例4研究用化合物II-9治療大鼠的MT021骨生成將化合物制成在10％w/v Solutol.中的溶液。通過(guò)口服管飼法對(duì)雄性Wistar大鼠給藥，每天一次以25、75或150mg/kg/天的劑量給藥14天，并與載體對(duì)照(10％Solutol，10ml/kg/天)相比。做完全驗(yàn)尸，并將組織保存在10％的福爾馬林中。加工股骨、胸骨和vertabra并按照實(shí)施例3中的描述進(jìn)行試驗(yàn)和分析。在所有組中觀察到了骨松質(zhì)增長(zhǎng)-在25mg/kg組中只有一只動(dòng)物。150mg/kg組6只中的5只新骨生成增加，更加增強(qiáng)和活性效應(yīng)。
實(shí)施例5大鼠中的骨合成代謝在骨質(zhì)稀少的大鼠模型中，試驗(yàn)兩種結(jié)構(gòu)不同的GSK-3β抑制劑III-2和N6-{2-[4-(2，4-二氯-苯基)-5-(1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-3-硝基-吡啶-2，6-二胺(化合物X)的骨合成代謝活性。將三個(gè)月大的大鼠切除卵巢(Ovx)并給予牛甲狀旁腺激素(氨基酸1-34)(表中的bPTH)或本發(fā)明化合物中的一種，一天一次，通過(guò)口給藥，開(kāi)始于卵巢切除后至少4星期并且持續(xù)至每天治療3星期后最終死亡。對(duì)照組，假的(未切除卵巢的大鼠)和Ovx，每天給載體。牛甲狀旁腺激素(bPTH)在40μg/kg(最佳劑量)試驗(yàn)作為合成代謝活性的內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照。也在完整假動(dòng)物中試驗(yàn)III-2作用。在治療開(kāi)始后2-3星期收集血和尿樣本并測(cè)定血清和尿中鈣的量。
利用QDR-4500W骨光密度計(jì)TM(Hologic，Waltham，MA)上的HighResolution Software測(cè)定右股骨的骨礦物質(zhì)密度。通過(guò)將動(dòng)物以仰臥位置放置在有機(jī)玻璃塊上掃描，這樣右腿與主體垂直并且脛骨與股骨垂直。化合物引起的骨礦物質(zhì)密度增長(zhǎng)和尿和血清中鈣量的增長(zhǎng)在下面的表中給出。在與血鈣過(guò)多或高鈣尿無(wú)關(guān)的劑量觀察化合物的功效。在脛骨中觀察到了相似的結(jié)果。
下表中顯示在實(shí)施例3-5中使用的GSK-3β抑制劑和它們?cè)谏飳?shí)施例1的GSK-3β分析中的IC50。
化合物編號(hào) 結(jié)構(gòu) IC50(nM)III-2 0.7II-33.2R6是2(R)3-二羥基丙氧基
II-9 1.5化合物X 1.7為了清楚和理解的目的，通過(guò)舉例說(shuō)明和實(shí)施例的方式詳細(xì)地描述了前述發(fā)明。在后附的權(quán)利要求范圍內(nèi)可進(jìn)行改變和修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。因此，應(yīng)該理解上述說(shuō)明是為了說(shuō)明而不是限制。本發(fā)明的范圍，因此不應(yīng)該參考上述說(shuō)明確定，而是應(yīng)該參考下述后附的權(quán)利要求以及與這些權(quán)利要求授權(quán)的同等的完整范圍確定。
在這一申請(qǐng)中所有引用的專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和出版物因此為了所有目的被完整地引入作為參考，引用的程度是似乎每一個(gè)單獨(dú)的專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)或出版物是這樣單獨(dú)地表示的。
權(quán)利要求
1.GSK-3β抑制劑在制備用于增加哺乳動(dòng)物骨生成的藥物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述藥物增加哺乳動(dòng)物骨礦物質(zhì)密度。
3.權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中所述藥物減少哺乳動(dòng)物骨折發(fā)生率。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述藥物促進(jìn)哺乳動(dòng)物骨折愈合。
5.GSK-3β抑制劑在制備用于預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用。
6.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物骨質(zhì)疏松癥的方法，其通過(guò)給予哺乳動(dòng)物有效量的GSK-3β抑制劑。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的應(yīng)用或方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的應(yīng)用或方法，其中所述哺乳動(dòng)物是雌性。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的應(yīng)用或方法，其中所述GSK-3β是式(I)代表的化合物或其藥用鹽 其中R1和R2獨(dú)立地代表氫、烷基、鹵素、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基；R3代表氫、烷基、環(huán)烷基、雜烷基、-COR7(其中R7是氫或烷基)或苯基，此苯基任選地被一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立地選自氫、烷基、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基的取代基取代；R4和R5獨(dú)立地表示氫、烷基、鹵素、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基；R6是雜烷基、雜環(huán)基、雜環(huán)烷基、雜烷基取代的雜環(huán)基、雜烷基取代的環(huán)烷基、雜取代的環(huán)烷基、-OR8、-S(O)nR8(其中n是0-2；且R8是雜烷基、雜芳烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)烷基)、-NR9R10(其中R9是氫或烷基且R10是雜烷基、雜芳烷基、雜取代的環(huán)烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)烷基)或-X-(亞烷基)-Y-Z(其中X是共價(jià)鍵、-O-、-NH-或-S(O)n1其中n1是0-2且Y是-O-、-NH-或-S-且Z是雜烷基或SiR11R12R13其中R11、R12和R13獨(dú)立地是氫或烷基)或者當(dāng)R6與R4彼此相鄰時(shí)，它們一起形成亞甲二氧基或亞乙二氧基；或它們的藥用鹽。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的應(yīng)用或方法，其中所述GSK-3β抑制劑選自a)下式化合物 其中R6是2(R)3-二羥基丙氧基；b)下式化合物 其中R6是2，3-二羥基-丙基氨基；c)下式化合物 其中R1是氟、R3是甲基且R6是3-氨基丙氧基；和d)N6-{2-[4-(2，4-二氯-苯基)-5-(1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-3-硝基-吡啶-2，6-二胺。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的應(yīng)用或方法，其中所述GSK-3β抑制劑是通過(guò)口服給藥。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的應(yīng)用或方法，其中用所述GSK-3β抑制劑治療，然后用抗再吸收劑治療。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的應(yīng)用或方法，其中所述GSK-3β抑制劑抗GSK-3β的IC50值為低于50nM。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的應(yīng)用或方法，其中所述GSK-3β抑制劑抗GSK-3β的IC50值為低于10nM。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的應(yīng)用或方法，其中所述GSK-3β抑制劑的分子量為低于1000道爾頓。
16.在上文中描述的發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明涉及糖原合成酶激酶－3β增加骨生成的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/405GK1703207SQ03802126
公開(kāi)日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2003年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月10日
發(fā)明者P·A·戴-洛利尼, 龔樂(lè)一 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司