專利名稱：調(diào)節(jié)胰島再生基因相關(guān)蛋白表達(dá)的因子的檢測(cè)分析法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)基因表達(dá)的因子的檢測(cè)分析領(lǐng)域。具體地講，本發(fā)明涉及報(bào)告基因及鑒定可調(diào)節(jié)胰島再生基因相關(guān)蛋白基因表達(dá)的試劑的方法。
背景技術(shù)：
胰島再生基因相關(guān)蛋白(INGAP蛋白)已被鑒定為一種胰腺細(xì)胞蛋白，它能以重演正常胚胎發(fā)育期間胰島發(fā)育的方式來(lái)誘導(dǎo)胰腺內(nèi)的祖細(xì)胞再生為胰島細(xì)胞。INGAP具有一種獨(dú)特的能力，可刺激與胰腺相關(guān)的前體細(xì)胞生長(zhǎng)和分化為胰島細(xì)胞。這些胰島可轉(zhuǎn)化為成熟的具有胰島素分泌特征的細(xì)胞，生理上能夠?qū)ρ堑牟▌?dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。這種潛在的抗糖尿病治療劑已在幾種物種上證實(shí)具有同源性，并可執(zhí)行生物學(xué)應(yīng)答。
1型糖尿病的胰島細(xì)胞團(tuán)消失，此病癥的漸進(jìn)性自體免疫反應(yīng)可導(dǎo)致對(duì)胰島素產(chǎn)生β-細(xì)胞的選擇性破壞作用。雖然2型糖尿病被稱為成人發(fā)病型疾病，但在青年超重人群中的發(fā)病率越來(lái)越高，他們體內(nèi)的β-細(xì)胞團(tuán)最多可減少正常量的60％。胰腺內(nèi)功能正常的β-細(xì)胞數(shù)量對(duì)糖尿病的發(fā)展、病程和預(yù)后有重要意義。在1型糖尿病中，β-細(xì)胞團(tuán)可減少到不到正常數(shù)量的2％。即使在2型糖尿病下出現(xiàn)重度抗胰島素表現(xiàn)時(shí)，也只有在β-細(xì)胞團(tuán)的代償升高不足時(shí)才發(fā)展為糖尿病。因此，這兩種主要形式的糖尿病的發(fā)病都可認(rèn)為是由于適應(yīng)性β-細(xì)胞生長(zhǎng)的失敗以及由此引發(fā)的胰島素分泌不足而產(chǎn)生的。刺激起源于前體細(xì)胞的胰島細(xì)胞和β-細(xì)胞的生長(zhǎng)(稱作胰島再生)是一種具有吸引力的緩解糖尿病的方法。本領(lǐng)域內(nèi)需要找到能夠鑒定動(dòng)物或培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)可調(diào)節(jié)INGAP表達(dá)的試劑。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供包含來(lái)自哺乳動(dòng)物INGAP基因的5’端調(diào)控區(qū)報(bào)告基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供鑒定可調(diào)節(jié)INGAP表達(dá)的試劑的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供INGAP 5’端調(diào)控區(qū)核酸或片段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可提高INGAP表達(dá)的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供調(diào)節(jié)INGAP表達(dá)的試劑盒。
本發(fā)明的這些及其它目的均由下述一種或多種實(shí)施方案提供。
本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供報(bào)告基因。所述報(bào)告基因包括調(diào)控區(qū)核苷酸序列以及用于編碼可檢測(cè)產(chǎn)物的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)載體提供報(bào)告基因。調(diào)控區(qū)核苷酸序列連接到編碼可檢測(cè)產(chǎn)物的核苷酸序列。調(diào)控區(qū)核苷酸序列可包括一個(gè)或多個(gè)INGAP基因序列的5’端調(diào)控區(qū)片段，序列標(biāo)識(shí)號(hào)23，或可包括整段5’端調(diào)控區(qū)。在報(bào)告基因的一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子元件在調(diào)控區(qū)核苷酸序列和編碼可檢測(cè)產(chǎn)物的核苷酸序列之間插入?？稍贗NGAP調(diào)節(jié)序列上顯示的啟動(dòng)子元件中選擇啟動(dòng)子元件?？晒┻x擇地，可利用載體中的啟動(dòng)子元件組成報(bào)告基因。由所述“核苷酸序列編碼可檢測(cè)產(chǎn)物”編碼的可檢測(cè)產(chǎn)物可以是核酸或蛋白質(zhì)?？蓹z測(cè)產(chǎn)物不必是INGAP基因核酸或蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種鑒定可調(diào)節(jié)INGAP表達(dá)的試劑的方法。所述方法包括用檢測(cè)劑接觸細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包括本發(fā)明的報(bào)告基因。細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)核酸的表達(dá)或蛋白質(zhì)產(chǎn)物即被確定。如果檢測(cè)劑可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)產(chǎn)物的表達(dá)，則此檢測(cè)劑可鑒定為INGAP表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離核酸，其包括倉(cāng)鼠INGAP基因(序列標(biāo)識(shí)號(hào)2)的基因序列或其片段。
如本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案所述，提供了鑒定可調(diào)節(jié)INGAP表達(dá)的試劑的體外方法。所述方法包括在可進(jìn)行核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的無(wú)細(xì)胞體系內(nèi)，使檢測(cè)劑與本發(fā)明的報(bào)告基因接觸?？蓹z測(cè)產(chǎn)物的表達(dá)即被確定。如果檢測(cè)物可調(diào)節(jié)可檢測(cè)產(chǎn)物的表達(dá)，則此檢測(cè)物可鑒定為INGAP表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。
如本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案所述，提供了鑒定可調(diào)節(jié)INGAP表達(dá)的試劑的體外方法。所述方法包括將檢測(cè)劑與本發(fā)明的核酸接觸。檢測(cè)劑與核酸的結(jié)合即被確定。如果檢測(cè)劑可與核酸結(jié)合，則該檢測(cè)劑可鑒定為INGAP表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。
如本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案所述，提供了一種可提高INGAP表達(dá)的方法。為了提高INGAP的表達(dá)，需要對(duì)有此需要的哺乳動(dòng)物使用有效量的、可直接或間接刺激INGAP表達(dá)的因子，如細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子或藥理學(xué)制劑等。
如本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案所述，提供了一種可調(diào)節(jié)INGAP表達(dá)的試劑盒。所述試劑盒包括INGAP表達(dá)調(diào)節(jié)劑和使用INGAP表達(dá)調(diào)節(jié)劑來(lái)調(diào)節(jié)INGAP表達(dá)的使用說(shuō)明。
如本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案所述，提供了一種調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物體內(nèi)INGAP表達(dá)以治療與胰島細(xì)胞功能降低相關(guān)的疾病狀態(tài)的方法。所述方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物使用有效劑量的INGAP表達(dá)調(diào)節(jié)劑，以此來(lái)改變哺乳動(dòng)物體內(nèi)INGAP表達(dá)的水平。
所有引用文獻(xiàn)均引入到本文的相關(guān)部分中以供參考，任何文獻(xiàn)的引用不可解釋為對(duì)其作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)的認(rèn)可。
附圖概述

圖1顯示了有關(guān)倉(cāng)鼠INGAP基因結(jié)構(gòu)的注釋。內(nèi)含子1-5的邊界值列在表1中。
圖2顯示了倉(cāng)鼠INGAP基因(核苷酸1-3137，序列標(biāo)識(shí)號(hào)2)的5’端調(diào)控區(qū)，展示了許多熟知且可完全表征的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。最小限度的啟動(dòng)子元件包含以下劃線(CAAT-框、TATA-框和GC-框)注釋的區(qū)域。
圖3顯示了用于倉(cāng)鼠INGAP基因5’端調(diào)控區(qū)(序列標(biāo)識(shí)號(hào)1)的核苷酸1-3123的許多熟知且可完全表征的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的示意圖。表3進(jìn)一步說(shuō)明這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
圖4顯示了倉(cāng)鼠INGAP基因(序列標(biāo)識(shí)號(hào)2)的5’端調(diào)控區(qū)(序列標(biāo)識(shí)號(hào)1)內(nèi)的預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。預(yù)測(cè)的起始位點(diǎn)由黑體的核苷酸來(lái)表示。圖中指出了啟動(dòng)子序列的起始和末端核苷酸編號(hào)。此編號(hào)是指?jìng)}鼠INGAP基因(序列標(biāo)識(shí)號(hào)2)的核苷酸編號(hào)。
圖5顯示基因步移時(shí)所用的銜接子引物的結(jié)構(gòu)和序列。還顯示出銜接子引物1(AP1)和銜接子引物2(AP2)。
圖6和7顯示重組倉(cāng)鼠INGAP基因的策略。采用基因步移技術(shù)重組倉(cāng)鼠INGAP基因。圖示為基因步移的PCR擴(kuò)增所用的片段和基因特異性引物(GSP1和GSP2)。通過(guò)每一片段內(nèi)特定的限制酶切位點(diǎn)，各片段被連接到一起。表2列出了各個(gè)引物的核苷酸序列。
圖8顯示了INGAP 5’端調(diào)控區(qū)片段，它們被克隆到β-半乳糖苷酶報(bào)告基因的pβGal-basic上游。左側(cè)標(biāo)簽是指序列標(biāo)識(shí)號(hào)23的核苷酸片段，這些片段被克隆到pβGa1-basic的上游。
圖9A顯示人胚腎細(xì)胞(293T)中報(bào)告基因的活性，此細(xì)胞利用含從倉(cāng)鼠NGAP DNA克隆的β-半乳糖苷酶報(bào)告基因(pβGal-basic)上游5′端調(diào)控區(qū)(序列標(biāo)識(shí)號(hào)23)不同片段的報(bào)告基因轉(zhuǎn)染，或利用不含INGAP DNA的報(bào)告基因轉(zhuǎn)染。用豆蔻酰佛波醇乙酯刺激這些細(xì)胞。通過(guò)β-半乳糖苷酶熒光分析法確定細(xì)胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶含量，以此來(lái)評(píng)估啟動(dòng)子的活性。
圖9B顯示人胚腎細(xì)胞(293T)中報(bào)告基因的活性，此細(xì)胞利用含從倉(cāng)鼠NGAP DNA克隆的β-半乳糖苷酶報(bào)告基因上游的5′端調(diào)控區(qū)(序列標(biāo)識(shí)號(hào)23)的2030至3137核苷酸的報(bào)告基因轉(zhuǎn)染，或利用不含INGAP DNA的報(bào)告基因轉(zhuǎn)染。用白血病抑制因子刺激這些細(xì)胞。通過(guò)β-半乳糖苷酶熒光分析法確定細(xì)胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶含量，以此來(lái)評(píng)估啟動(dòng)子的活性。
圖10顯示了人胚腎細(xì)胞(293T)中的報(bào)告基因活性，此細(xì)胞利用含從倉(cāng)鼠INGAP克隆的β-半乳糖苷酶報(bào)告基因上游的5′端調(diào)控區(qū)的不同片段(請(qǐng)參閱圖8)的報(bào)告基因轉(zhuǎn)染。用豆蔻酰佛波醇乙酯刺激這些細(xì)胞。所用PMA濃度為6ng/ml、17ng/ml、50ng/ml、100ng/ml或300ng/ml。通過(guò)β-半乳糖苷酶熒光分析法確定細(xì)胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶含量，以此來(lái)評(píng)估啟動(dòng)子的活性。
圖11顯示人胚腎細(xì)胞(293T)中報(bào)告基因的活性，此細(xì)胞利用含從倉(cāng)鼠INGAP克隆的β-半乳糖苷酶報(bào)告基因上游的5′端調(diào)控區(qū)的不同片段(請(qǐng)參閱圖8)的報(bào)告基因轉(zhuǎn)染。用人類白血病抑制因子(hLIF)刺激這些細(xì)胞。所用hLIF的濃度為1ng/ml、10ng/ml或30ng/ml。通過(guò)β-半乳糖苷酶熒光分析法確定細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶的含量，以此來(lái)評(píng)估啟動(dòng)子的活性。
圖12顯示大鼠amphicrine胰腺細(xì)胞(AR42J)中INGAP基因上調(diào)的RNA分析，細(xì)胞使用或不使用細(xì)胞因子IL-6處理。INGAP基因的總RNA水平可通過(guò)Northern分析法得知。
發(fā)明詳述定義必須注意，除非上下文中有明確的不同說(shuō)明，否則本文及附加的權(quán)利要求書內(nèi)所用的單數(shù)詞“一個(gè)”和“所述...”均包含兩個(gè)以上的參考涵義。
術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”用于定義轉(zhuǎn)錄的啟始和速率均受控制的基因區(qū)域。它包含與RNA聚合酶結(jié)合的位點(diǎn)，還包含與調(diào)節(jié)蛋白(如轉(zhuǎn)錄因子、阻遏蛋白等)結(jié)合的位點(diǎn)。為了把轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與其它可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速率的位點(diǎn)加以區(qū)分，通常把啟動(dòng)子區(qū)域劃分為“啟動(dòng)子元件”和“調(diào)控區(qū)”。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子元件”(有時(shí)簡(jiǎn)稱“啟動(dòng)子”)因此可包含TATA框、富含GC序列以及CAAT框，而“調(diào)控區(qū)”通常指核苷酸序列中的某個(gè)長(zhǎng)片段，轉(zhuǎn)錄因子和其它因子在此進(jìn)行結(jié)合。大多數(shù)真核基因都有很長(zhǎng)的調(diào)控區(qū)，許多不同的轉(zhuǎn)錄因子在此區(qū)域進(jìn)行結(jié)合。給定細(xì)胞類型、組織、器官或機(jī)體的給定基因的表達(dá)或不表達(dá)由調(diào)控區(qū)域上發(fā)生的相互作用控制。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄因子”用于描述在基因的調(diào)控區(qū)中結(jié)合短鏈DNA的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄因子可彼此相互作用，還可與RNA聚合酶相互作用。因此，轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合激素或第二信使、DNA、RNA、其它轉(zhuǎn)錄因子或其它蛋白質(zhì)。它們可活化或抑制給定基因的轉(zhuǎn)錄。有時(shí)轉(zhuǎn)錄因子也指“增強(qiáng)因子”或“阻遏蛋白”。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)可用于標(biāo)識(shí)結(jié)合到基因的5’端調(diào)控區(qū)并調(diào)節(jié)基因表達(dá)的試劑。
術(shù)語(yǔ)“報(bào)告基因”用于描述附加到異源啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件的編碼序列，而且其產(chǎn)物(核酸或蛋白質(zhì))很容易被檢測(cè)到，并且可以定量。某些常見(jiàn)的報(bào)告基因包括β-半乳糖苷酶(lacZ)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cat)、β-葡糖苷酸酶(GUS)以及綠色熒光蛋白(GFP)。
“報(bào)告基因”是一段核酸，它含有一個(gè)啟動(dòng)子元件和包含在適合的載體質(zhì)粒DNA內(nèi)的報(bào)告基因。調(diào)控區(qū)核苷酸序列的啟動(dòng)子元件的5’端可被克隆，以確定它們是否包含轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。報(bào)告基因包含的載體被引入包含許多轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞中。報(bào)告基因是否被轉(zhuǎn)錄因子激活可通過(guò)對(duì)報(bào)告基因產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和定量來(lái)監(jiān)控。
本文所用術(shù)語(yǔ)“試劑”實(shí)際上用于描述調(diào)節(jié)INGAP表達(dá)的任何方法。所述“試劑”可以是一種化合物、生物制劑或物理因素、機(jī)械裝置或者它們之間的任意組合。
INGAP啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)INGAP基因受5’端調(diào)控區(qū)的調(diào)控，而該區(qū)域易受許多已知的轉(zhuǎn)錄因子(包括PMA和LIF)的調(diào)節(jié)。
本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)INGAP基因的5’端調(diào)控區(qū)核苷酸序列可以用于進(jìn)行篩選分析，以鑒定能夠調(diào)節(jié)INGAP基因表達(dá)的試劑。這些調(diào)節(jié)劑實(shí)際上是作為治療劑來(lái)治療病理情況，包括但不限于1型和2型糖尿病、內(nèi)分泌性和非內(nèi)分泌性發(fā)育不良、肥大、腺瘤、瘤形成和胰島母細(xì)胞瘤。
與大多數(shù)基因類似，哺乳動(dòng)物的INGAP含有5’端調(diào)控區(qū)，其后有內(nèi)含子和外顯子。所提供的哺乳動(dòng)物(例如倉(cāng)鼠)的INGAP基因序列為序列標(biāo)識(shí)號(hào)2。圖1詳細(xì)地顯示了倉(cāng)鼠INGAP基因的5’端調(diào)控區(qū)、內(nèi)含子和外顯子的相對(duì)位置。表1列出了內(nèi)含子1-5的邊界值以及TATA-框和多聚腺苷酸信號(hào)的位置。
表1
哺乳動(dòng)物INGAP上包含啟動(dòng)子元件的5’端調(diào)控區(qū)核苷酸序列部分地顯示在序列標(biāo)識(shí)號(hào)1中，全部顯示在序列標(biāo)識(shí)號(hào)2和23(序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的核苷酸1-3137)。序列標(biāo)識(shí)號(hào)1的核苷酸1-3120與序列標(biāo)識(shí)號(hào)2和序列標(biāo)識(shí)號(hào)23的核苷酸1-3120相同。5’端調(diào)控區(qū)的概述顯示在圖2中。典型的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子/阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)也顯示在圖2中。5’端調(diào)控區(qū)的核苷酸1-3123的預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子/阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)顯示在圖3中。說(shuō)明書結(jié)尾處的表3詳細(xì)說(shuō)明了這些轉(zhuǎn)錄因子和它們的結(jié)合位點(diǎn)，以及它們?cè)谡{(diào)控區(qū)中的位置。潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合分析是使用MatInspectorprofessionalTM完成的，它是一個(gè)生物信息學(xué)軟件，利用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的基質(zhì)說(shuō)明庫(kù)在無(wú)限長(zhǎng)的序列內(nèi)查找匹配項(xiàng)(Quandt，K.、Frech，K.、Karas，H.、Wingender，E.、Werner，T.(1995)Nucleic Acids Res.23，4878-4884)。
表3列出了根據(jù)結(jié)合蛋白質(zhì)在功能相似的基質(zhì)家族(家族/基質(zhì))中的所屬的分類而預(yù)測(cè)的結(jié)合蛋白(詳細(xì)信息)。表中列出了預(yù)測(cè)與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列(序列)、正義或反義DNA(結(jié)構(gòu))和序列標(biāo)識(shí)號(hào)2中序列的位置(位置)。此外，還列出了基質(zhì)的連續(xù)最保守核苷酸的相似度(核心相似度)、此基質(zhì)中所有核苷酸的相似度(基質(zhì)相似度)及優(yōu)化值(優(yōu)化值)，該值通過(guò)在非調(diào)節(jié)檢測(cè)序列中找到最少匹配數(shù)目的方法定義。MatInspectorprofessionalTM中所用算法的詳細(xì)說(shuō)明請(qǐng)參閱OPT(優(yōu)化值)此基質(zhì)相似度是指優(yōu)化值，其定義方法為在非調(diào)節(jié)檢測(cè)序列中找到最少匹配數(shù)目(即，使用此基質(zhì)相似度找到最少的假陽(yáng)性匹配數(shù)目)。當(dāng)用戶選中“Optimized”(優(yōu)化)作為MatInspector professionalTM基質(zhì)相似度閾值時(shí)，使用此基質(zhì)相似度。
Family(家族)每個(gè)基質(zhì)都屬于一個(gè)所謂的“基質(zhì)家族”，功能相似的基質(zhì)會(huì)被分在一組，可通過(guò)MatInspector professionalTM排除多余的匹配項(xiàng)(如果已選擇“family”(家族)選項(xiàng))。例如，基質(zhì)家族V$NFKB包含5個(gè)與NFkappaB相似的基質(zhì)(V$NFKAPPAB.01、V$NFKAPPAB.02、V$NFKAPPAB.03、V$NFKAPPAB50.01、V$NFKAPPAB65.01)以及一個(gè)與NFkappaB相關(guān)因子c-Rel相似的基質(zhì)(V$CREL.01)。
Matrix(基質(zhì))MatInspector professionalTM基質(zhì)有一個(gè)標(biāo)識(shí)符，用以標(biāo)識(shí)以下七個(gè)組中的一個(gè)組脊椎動(dòng)物(V$)、昆蟲(I$)、植物(P$)、真菌(F$)、線蟲動(dòng)物(N$)、細(xì)菌(B$)以及其它功能單元(O$)；其后跟有基質(zhì)所引用因子的縮寫，以及一個(gè)連續(xù)編號(hào)用來(lái)區(qū)分同一因子的不同基質(zhì)。因此，V$OCT1.02表示脊椎動(dòng)物Oct-1因子的第二個(gè)基質(zhì)。
Core Sim(核心相似度)基質(zhì)的“核心序列”被定義為基質(zhì)內(nèi)連續(xù)的(通常為4個(gè))最保守位點(diǎn)。核心相似度的計(jì)算如此處所述。只有當(dāng)序列內(nèi)基質(zhì)的最保守堿基完全匹配時(shí)才會(huì)達(dá)到最大核心相似度(1.0)。比核心相似度更重要的是“基質(zhì)相似度”，它會(huì)將全部基質(zhì)長(zhǎng)度的所有堿基都計(jì)算在內(nèi)。
Matrix Sim(基質(zhì)相似度)基質(zhì)相似度的計(jì)算如此處所述。與基質(zhì)“完全匹配”的得分為1.00(每個(gè)序列位置都與基質(zhì)內(nèi)該位置處的最保守核苷酸相對(duì)應(yīng))；與基質(zhì)“良好匹配”通常為相似度大于0.80的情形。基質(zhì)的高度保守位點(diǎn)與低度保守位點(diǎn)相比，前者的基質(zhì)相似度減少程度要高于后者。
本發(fā)明的另一方面是提供一種報(bào)告基因。報(bào)告基因包含序列標(biāo)識(shí)號(hào)23的5’端調(diào)控區(qū)核苷酸序列片段(例如包含增強(qiáng)子和/或阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域)、啟動(dòng)子元件(可能是也可能不是來(lái)自INGAP調(diào)控區(qū)核苷酸序列，序列標(biāo)識(shí)號(hào)23)以及一個(gè)報(bào)告基因。5’端調(diào)控區(qū)核苷酸序列被定位到報(bào)告基因的上游位置。為了確定與5’端調(diào)控區(qū)核苷酸序列結(jié)合的各種轉(zhuǎn)錄因子的身份并說(shuō)明這些因子在INGAP基因的5’端調(diào)控核苷酸序列中的結(jié)合位置，可采用缺失分析法將這些區(qū)域制圖。由于調(diào)控區(qū)核苷酸序列的一個(gè)或多個(gè)片段可對(duì)各種轉(zhuǎn)錄因子激活因子作出應(yīng)答，因此可以對(duì)這些片段進(jìn)行初始分析。一旦確定了感興趣區(qū)，便可進(jìn)行更精確的繪圖，在此區(qū)域內(nèi)，可結(jié)合調(diào)控區(qū)不同位置上的DNA，以生成更穩(wěn)固、更具應(yīng)答性的報(bào)告基因。DNA序列(如INGAP 5’端調(diào)控區(qū)DNA或其一個(gè)片段)可通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法進(jìn)行處理。這些技術(shù)的實(shí)施例包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、限制性核酸內(nèi)切酶消化、連接和基因步移。DNA的克隆片段如5’端調(diào)控區(qū)早已為本領(lǐng)域所熟知。
另一種定量基因的表達(dá)水平的方法是測(cè)量基因的轉(zhuǎn)錄。PCR-ELISA可用來(lái)將轉(zhuǎn)錄物捕捉到固相上，可以使用生物素或地高辛標(biāo)記的引物、低聚核苷酸探針(低聚探針)或直接在將地高辛引入轉(zhuǎn)錄物之后進(jìn)行(Watzinger，F(xiàn).和Lion，T.(2001)Nucleic Acids Res.，29，e52)。一旦捕捉成功，便可使用與標(biāo)準(zhǔn)ELISA相似的酶標(biāo)抗生物素蛋白或抗地高辛報(bào)告分子來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄物。另一種方法為使用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄物(Mackay，I.M.和Nitsche，A.，Nucleic Acids Res.2002 Mar 15；30(6)，1292-305)。實(shí)時(shí)PCR中使用了熒光標(biāo)記核苷酸，且聚合酶轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程會(huì)被實(shí)時(shí)監(jiān)控。
報(bào)告基因內(nèi)的啟動(dòng)子元件可以是也可以不是來(lái)自于同一基因的5’端調(diào)控區(qū)。實(shí)施例為，來(lái)自INGAP 5’端調(diào)控區(qū)的增強(qiáng)子/阻遏蛋白區(qū)域或來(lái)自于INGAP 5’端調(diào)控區(qū)的增強(qiáng)子/阻遏蛋白片段，可在異源最小啟動(dòng)子元件的上游被克隆，例如，最小CMV啟動(dòng)子(Boshart等人，1985)和TK啟動(dòng)子(Nordeen，1988)、IL-2和MMTV。
基因轉(zhuǎn)錄在最小啟動(dòng)子附近開始。圖4顯示了哺乳動(dòng)物INGAP基因(序列標(biāo)識(shí)號(hào)2)的預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)。序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的分析采用了由MartinReese設(shè)計(jì)的Neural Network Promoter Prediction(神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)啟動(dòng)子預(yù)測(cè))程序，以鑒定真核啟動(dòng)子識(shí)別元件(如TATA-框、GC-框、CAAT-框)和轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)。這些啟動(dòng)子元件以各種組合出現(xiàn)在序列上，且以不同間距分隔。此程序可在Internet上獲得，網(wǎng)址為http//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html。
可以使用報(bào)告基因鑒定可調(diào)節(jié)(單獨(dú)或聯(lián)合作用)INGAP基因表達(dá)的試劑。某些此類試劑可通過(guò)直接與調(diào)控區(qū)結(jié)合的方式調(diào)節(jié)INGAP的表達(dá)，而其它試劑則是調(diào)節(jié)與INGAP調(diào)控區(qū)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。
報(bào)告基因可經(jīng)胰管被暫時(shí)或永久轉(zhuǎn)染進(jìn)入體外或體內(nèi)宿主細(xì)胞，檢測(cè)劑被引入分析系統(tǒng)。檢測(cè)劑的實(shí)施例包括但不限于有機(jī)和無(wú)機(jī)化學(xué)試劑、碳水化合物、蛋白質(zhì)、低聚核苷酸、膽囊收縮素、機(jī)械誘導(dǎo)因素以及可造成胰管阻塞的試劑。報(bào)告基因產(chǎn)物的表達(dá)可使用適合所用報(bào)告基因的分析法來(lái)確定。此種分析法的實(shí)施例包括但不限于用于β-半乳糖苷酶或熒光素酶的熒光分析法、用于氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的酶分析法以及用于熒光蛋白的熒光分析法。這些分析法均為本領(lǐng)域所熟知，技術(shù)人員完全能夠?yàn)樗x報(bào)告基因選擇一種合適的分析法。如果一種檢測(cè)劑能夠調(diào)節(jié)報(bào)告基因產(chǎn)物的表達(dá)，那么就可以將其鑒定為一種INGAP表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選的增加或減少程度為至少50％、100％、200％、500％或1000％，但任何有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化都可以視為調(diào)節(jié)活性的指示。技術(shù)人員還可以確定未處理的細(xì)胞以及僅轉(zhuǎn)染有較少啟動(dòng)子的報(bào)告基因的經(jīng)處理和未經(jīng)處理的細(xì)胞內(nèi)的報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物。這些確定結(jié)果可用于確定表達(dá)的背景水平。
檢測(cè)劑也可以通過(guò)分餾胰腺分泌液而獲得。胰管阻塞法可用作收集胰腺分泌液的經(jīng)典方法。胰腺分泌液可采用本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的方法分餾。實(shí)施例包括高效液相色譜法(HPLC)、尺寸排除色譜法、疏水作用柱和密度梯度離心法。各種鎦分均可用本文所述方法來(lái)檢測(cè)可調(diào)節(jié)報(bào)告基因表達(dá)的試劑。各種鎦分可進(jìn)一步分餾，以鑒定可調(diào)節(jié)報(bào)告基因表達(dá)的試劑。經(jīng)鑒定的檢測(cè)劑可用于調(diào)節(jié)INGAP的表達(dá)。
宿主細(xì)胞可以是適于在合適的分析體系內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染和維護(hù)的任何細(xì)胞。合適細(xì)胞的實(shí)施例包括但不限于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞、人類細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、猴細(xì)胞、狗細(xì)胞、牛細(xì)胞和豬細(xì)胞。優(yōu)選為使用人類細(xì)胞。這些細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或原代細(xì)胞。也可使用完整的器官分離塊，但需要對(duì)一些不同類型細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)監(jiān)控。本領(lǐng)域內(nèi)有許多用報(bào)告基因DNA轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞的方法。這些方法包括但不限于lipofection(微脂粒感染)、電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE葡聚糖、基因槍、改良病毒技術(shù)(如重組腺病毒或重組逆轉(zhuǎn)錄病毒)。技術(shù)人員可以很容易地選擇適于給定細(xì)胞類型和分析體系使用的方法。
報(bào)告基因也可以在體內(nèi)直接引入胰腺細(xì)胞。將報(bào)告基因引入胰腺細(xì)胞體內(nèi)的方法的實(shí)施例包括胰管逆行灌注法和體內(nèi)電穿孔(Mir，2001)。編碼報(bào)告基因產(chǎn)物的報(bào)告基因體內(nèi)測(cè)量很容易?？梢詫?duì)全身或局部使用檢測(cè)劑，體內(nèi)報(bào)告基因的表達(dá)可通過(guò)適于所用特定報(bào)告基因的分析法來(lái)確定。這些方法的實(shí)施例包括用于綠色熒光蛋白的熒光分析法。
用于鑒定可調(diào)節(jié)INGAP表達(dá)的試劑的方法也可以在體外實(shí)行。在條件完全允許報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯時(shí)，報(bào)告基因可以在體外與檢測(cè)劑接觸。各種組分如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液或麥芽精提取物都可在所述方法中被利用。隨后，可按如上所述方法利用適于給定報(bào)告基因的分析方法來(lái)確定報(bào)告基因的表達(dá)水平。如果一種檢測(cè)劑能夠調(diào)節(jié)報(bào)告基因的表達(dá)，則可將其鑒定為一種INGAP表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。變化的閾值水平可由專業(yè)人員按上述內(nèi)容進(jìn)行設(shè)定。
檢測(cè)劑也可與分離的純化INGAP 5’端調(diào)控DNA分子接觸，這樣可以確定此檢測(cè)劑是否可與DNA分子結(jié)合。檢測(cè)劑可以是化學(xué)試劑、蛋白質(zhì)或核酸。合適的INGAP 5’端調(diào)控DNA分子可包括序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的核苷酸1-6586、5’端調(diào)控區(qū)DNA(序列標(biāo)識(shí)號(hào)1或序列標(biāo)識(shí)號(hào)23)或者5’端調(diào)控區(qū)的任意片段，優(yōu)選為包含一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)子/阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)的片段。確定檢測(cè)劑與DNA片段結(jié)合的方法早已為本領(lǐng)域所熟知，例如電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)。實(shí)施例可參閱Sambrook等人，MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL，第2版，1989，第9.50至9.51頁(yè)。5’端調(diào)控區(qū)的片段可使用已公開序列(序列標(biāo)識(shí)號(hào)2)通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的方法獲得。這些方法的實(shí)施例包括PCR、限制性酶切和化學(xué)合成。5’端調(diào)控區(qū)(序列標(biāo)識(shí)號(hào)1或23)內(nèi)的DNA片段均可使用。試劑結(jié)合的精確位置可通過(guò)如為檢測(cè)劑選用較短片段對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行精確繪圖來(lái)確定。在分析中結(jié)合的檢測(cè)劑還可在其它需要調(diào)節(jié)活性的分析中進(jìn)一步檢測(cè)。
可引起報(bào)告基因表達(dá)增加或減少的試劑可用作INGAP表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。在需要進(jìn)行這種調(diào)節(jié)時(shí)可對(duì)哺乳動(dòng)物使用此調(diào)節(jié)劑?？赡苄枰狪NGAP表達(dá)調(diào)節(jié)的哺乳動(dòng)物實(shí)施例為胰腺功能減退尤其是胰島細(xì)胞功能減退者。包括患有糖尿病、葡萄糖耐受性異常、空腹血糖耐受性異常、高血糖、肥胖癥和胰腺功能不全的哺乳動(dòng)物。
被鑒定為INGAP表達(dá)調(diào)節(jié)劑的試劑可在試劑盒內(nèi)提供，以治療與胰島細(xì)胞功能減退相關(guān)的疾病。此試劑盒可包括單個(gè)或分隔的槽，其中為單一或多個(gè)分開劑量的INGAP表達(dá)調(diào)節(jié)劑。還包含有關(guān)如何使用INGAP表達(dá)調(diào)節(jié)劑的書面說(shuō)明。此說(shuō)明可能只是讓讀者參閱其它位置如網(wǎng)站或其它信息來(lái)源。
可引起報(bào)告基因表達(dá)增加的試劑可用于增加INGAP表達(dá)，以治療與胰島細(xì)胞功能減退相關(guān)的疾病。可引起報(bào)告基因表達(dá)減少的試劑可用于減少INGAP表達(dá)，以治療與胰島細(xì)胞過(guò)度活躍相關(guān)的疾病或需要減少INGAP表達(dá)的疾病。這些試劑的實(shí)施例包括但不限于PMA、LIF、白介素-6、制瘤素M和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。試劑的多種給藥途徑包括但不限于口服、靜脈注射、肌內(nèi)注射、動(dòng)脈-內(nèi)注射、髓內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、心室內(nèi)給藥、透皮注射、皮下注射、腹膜內(nèi)注射、鼻內(nèi)給藥、腸胃外給藥、局部用藥、舌下給藥、直腸給藥或胰管逆行灌注?？蛇x用本領(lǐng)域熟知的可藥用的載體將口服試劑配制成適合口服的劑量。這些載體使得藥物組合物可配制成哺乳動(dòng)物可攝入的片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、混懸液、懸浮液等。靜脈內(nèi)注射、肌肉注射、動(dòng)脈內(nèi)注射、透皮注射及皮下注射用藥的試劑可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的可藥用載體進(jìn)行配制，劑量為哺乳動(dòng)物的合適劑量。鼻內(nèi)、局部和直腸用藥的藥劑可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的可藥用載體進(jìn)行配制，劑量為適于哺乳動(dòng)物的體表給藥的劑量。需要增加INGAP表達(dá)的哺乳動(dòng)物包括患有糖尿病、葡萄糖耐受性異常、空腹血糖耐受性異常、高血糖癥、肥胖癥及胰腺功能不全者。需要減少INGAP表達(dá)的哺乳動(dòng)物包括患有低血糖癥的哺乳動(dòng)物。
以下提供的實(shí)施例僅作說(shuō)明之用，并不限制在此公開的發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1倉(cāng)鼠INGAP基因序列和結(jié)構(gòu)倉(cāng)鼠INGAP基因序列和結(jié)構(gòu)由基因步移(Clontech)和DNA序列測(cè)定來(lái)確定?；虿揭剖菑囊阎蛄腥鏲DNA向著啟動(dòng)子上游步移或在基因組DNA中下游步移的方法。所述方法利用四個(gè)非克隆的銜接子綁定的基因片段庫(kù)。制造商建議使用的程序后附有一個(gè)值得注意的例外事項(xiàng)；倉(cāng)鼠基因組DNA被用來(lái)產(chǎn)生非克隆的銜接子綁定的基因片段庫(kù)。
為產(chǎn)生非克隆的銜接子綁定基因片段庫(kù)，從倉(cāng)鼠細(xì)胞中凈化出基因組DNA。四份單獨(dú)的等分試樣通過(guò)PvuII、StuI、DraI或EcoRV被完全酶切。酶切后，滅活限制性內(nèi)切酶并脫磷，將每個(gè)單獨(dú)的DNA片段組分連接到銜接子上，見(jiàn)圖5。銜接子被磷酸化以提供必需的磷酸組用于絡(luò)合反應(yīng)。還應(yīng)注意短銜接子的3個(gè)主要側(cè)面均包含胺基，以防止銜接子形成連環(huán)體。
為已知序列的每個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)了兩個(gè)基因特異性引物(GSP1和GSP2)(即INGAP基因的外顯子)。請(qǐng)參見(jiàn)圖6查看片段位置及GSP1和GSP2位置。基因特異性引物是為除片段1_2和14_5外的所有片段設(shè)計(jì)的反向PCR引物。片段1_2和14_5的基因特異性引物設(shè)計(jì)為正向引物。銜接子引物1(AP1)和銜接子引物2(AP2)(圖5)是序列1_2和14_5(均為反向PCR引物)之外的所有序列的正向PCR引物。在PCR反應(yīng)中，對(duì)銜接子引物1使用外部基因特異性引物(GSP1)。為增加特異性，使用內(nèi)部基因特異性引物(GSP2)和銜接子引物2建立另一個(gè)套式PCR。第一次反應(yīng)的小量等分試樣作為第二次反應(yīng)的模板。用于基因步移的基因特異性PCR引物列在表2中，用于建立INGAP基因序列的策略顯示在圖6和7中。圖6中的箭頭表示銜接子引物(AP1和AP2)，而圓圈則表示基因特異性引物(GSP1和GSP2)。
表2
PCR片段被排成序列以確定INGAP 5′端調(diào)控區(qū)、內(nèi)含子、內(nèi)含子/外顯子接合及3個(gè)主要多聚腺苷化區(qū)域的核苷酸序列。倉(cāng)鼠INGAP基因組DNA的核苷酸序列在序列標(biāo)識(shí)號(hào)2中顯示。
實(shí)施例2將倉(cāng)鼠INGAP 5′端調(diào)控區(qū)片段克隆到報(bào)告基因中為構(gòu)建INGAP 5′端調(diào)控區(qū)，將在兩個(gè)相鄰片段中的唯一限制位點(diǎn)將單個(gè)PCR片段連接在一起。圖6和7詳細(xì)說(shuō)明了將INGAP 5′端調(diào)控區(qū)連接在一起的策略。片段8_3和2_3在唯一的SphI位點(diǎn)連接；14_3和8_3在唯一的BbsI位點(diǎn)連接；16_3和14_3在唯一的PstI位點(diǎn)連接。倉(cāng)鼠INGAP5′端調(diào)控區(qū)的核苷酸序列在序列列表中以序列標(biāo)識(shí)號(hào)1和23顯示。
倉(cāng)鼠INGAP 5′端調(diào)控區(qū)或5′端調(diào)控區(qū)的片段被克隆到報(bào)告基因質(zhì)粒pβGal-Basic(Clontech)上。5′端調(diào)控區(qū)或片段利用基因步移銜接子引物唯一的XmaI位點(diǎn)及位于調(diào)控區(qū)的3個(gè)主要側(cè)的唯一BglII位點(diǎn)進(jìn)行克隆。圖8詳細(xì)說(shuō)明了克隆到pβGal-Basic中的片段。片段的大小顯示在片段的右側(cè)并以該片段的核苷酸數(shù)表達(dá)。
實(shí)施例3用于篩選可調(diào)節(jié)INGAP表達(dá)的因子的檢測(cè)體系INGAP的啟動(dòng)子分析確定了一些可能的啟動(dòng)子近端調(diào)節(jié)位點(diǎn)，包括合意的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；cAMP應(yīng)答元件(CRE)、AP-1和STAT。啟動(dòng)子片段報(bào)告基因被暫時(shí)轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，分泌腺堿性磷酸酶的共轉(zhuǎn)染用于規(guī)范化轉(zhuǎn)染率。
包含INGAP 5’端調(diào)控區(qū)片段2_3sP(序列標(biāo)識(shí)37)、2_3dP(序列標(biāo)識(shí)號(hào)38)、2_3pP(序列標(biāo)識(shí)號(hào)36)、14_3P(序列標(biāo)識(shí)號(hào)34)、16_3P(序列標(biāo)識(shí)號(hào)31)或19_3P(序列標(biāo)識(shí)號(hào)23)的報(bào)告基因被轉(zhuǎn)染到人類細(xì)胞中。不合倉(cāng)鼠INGAP DNA的pβGal-Basic質(zhì)粒也作為測(cè)量?jī)?nèi)源報(bào)告基因活性等級(jí)的對(duì)照物而轉(zhuǎn)染到人類細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后兩天，用PMA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行24小時(shí)的處理或不進(jìn)行處理。為確定啟動(dòng)子活性的等級(jí)，將使用β-半乳糖苷酶熒光分析法確定β-半乳糖苷酶基因產(chǎn)物的數(shù)量。圖9A顯示出結(jié)構(gòu)14_3P最大程度活化了INGAP表達(dá)，接下來(lái)是2_3pP和16_3P。
包含INGAP 5′端調(diào)控區(qū)DNA核苷酸2030-3120的報(bào)告基因被轉(zhuǎn)染到人類細(xì)胞中。不含倉(cāng)鼠INGAP DNA的pβGal-Basic質(zhì)粒也作為測(cè)量?jī)?nèi)源報(bào)告基因活性等級(jí)的對(duì)照物而轉(zhuǎn)染到人類細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后兩天，用LIF對(duì)細(xì)胞進(jìn)行24小時(shí)處理或不進(jìn)行處理。為確定啟動(dòng)子活性的等級(jí)，將使用β-半乳糖苷酶熒光分析法確定β-半乳糖苷酶基因產(chǎn)物的數(shù)量。圖9B顯示出這些結(jié)果。LIF被確定為將增加哺乳動(dòng)物INGAP的5′端調(diào)控區(qū)的活性。而Forskolin(cAMP/CREB/CRE的激活因子)不調(diào)節(jié)基因表達(dá)(未顯示數(shù)據(jù))。
請(qǐng)務(wù)必注意，如果存在于人類細(xì)胞中，倉(cāng)鼠INGAP 5′端調(diào)控區(qū)會(huì)被人類轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)激活。因此，連接到報(bào)告基因的倉(cāng)鼠INGAP的5’端調(diào)控區(qū)可產(chǎn)生靈敏的檢測(cè)體系，以篩選出可調(diào)節(jié)INGAP表達(dá)的因子。
實(shí)施例4確定5′端調(diào)控區(qū)中PMA和LIF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的大致位置為繪出PMA啟始或LIF啟始的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的大致位置，將倉(cāng)鼠INGAP 5′端調(diào)控區(qū)的不同片段克隆到pβGal-Basic中。請(qǐng)參見(jiàn)圖8?？寺〉綀?bào)告基因中的片段為2_3sP(序列標(biāo)識(shí)號(hào)37)、2_3dP(序列標(biāo)識(shí)號(hào)38)、2_3pP(序列標(biāo)識(shí)號(hào)36)、14_3P(序列標(biāo)識(shí)號(hào)34)、16_3P(序列標(biāo)識(shí)號(hào)31)或19_3P(序列標(biāo)識(shí)號(hào)23)。報(bào)告基因被轉(zhuǎn)染到人類細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后兩天，用不同濃度的PMA或LIF對(duì)細(xì)胞進(jìn)行24小時(shí)處理。所用PMA濃度為6ng/ml、17ng/ml、50ng/ml、100ng/ml或300ng/ml。所用LIF濃度為1ng/ml、10ng/ml或30ng/ml。為確定啟動(dòng)子活性的水平，使用β-半乳糖苷酶熒光分析法確定β-半乳糖苷酶基因產(chǎn)物的量。圖10和11分別顯示了PMA和LIF處理的結(jié)果。PMA和LIF均活化了細(xì)胞報(bào)告基因?？赏ㄟ^(guò)克隆倉(cāng)鼠INGAP 5’端調(diào)控區(qū)的較小片段及通過(guò)點(diǎn)突變或缺失來(lái)進(jìn)一步限定DNA接觸位點(diǎn)的準(zhǔn)確位置。
實(shí)施例5INGAP基因上調(diào)的RNA分析為確定利用通過(guò)STAT發(fā)出信號(hào)的細(xì)胞因子刺激后INGAP RNA水平是否升高，使用IL-6(1000U/ml)處理大鼠的amphocrine胰腺細(xì)胞AR42J，時(shí)間為24小時(shí)。全體RNA均用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)從已處理和未處理的細(xì)胞中提取，例如使用TRIzol_試劑。
將等量的總RNA(10μg)加入到2.5％的甲醛凝膠中，并通過(guò)使用循環(huán)泵的恒定循環(huán)緩沖劑以70V的電壓電泳4小時(shí)。拍照凝膠并在室溫下用水沖洗兩次，然后浸入20X SSC。按標(biāo)準(zhǔn)操作步驟在20X SSC中過(guò)夜，將該凝膠轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Amersham)。該膜用20X SSC進(jìn)行沖洗以除去可能附著在該膜上的瓊脂，并在80℃下烘烤4個(gè)小時(shí)。
使用“隨機(jī)引物標(biāo)記”試劑盒(Roche-BMB)和α-P32dCTP(ICN)標(biāo)記一百納克的倉(cāng)鼠INGAP cDNA。在20ml雜交緩沖液中使用約2000萬(wàn)次計(jì)數(shù)值進(jìn)行雜交，然后按標(biāo)準(zhǔn)操作步驟在42℃過(guò)夜。印跡的沖洗方式如下室溫下用2X SSC沖洗2次，每次10分鐘；在42℃下用2X SSC沖洗2次，每次10分鐘；在55℃下用1X SSC沖洗2次，每次10分鐘。該膜用膠片(XOMAT-Kodak)曝光，并且沖洗前在-80℃的溫度下過(guò)夜。
使用IL-6進(jìn)行處理會(huì)導(dǎo)致INGAP基因表達(dá)的增加(圖12)。這些數(shù)據(jù)證明，使AP-1結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子和STAT結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子增加的細(xì)胞外因子與INGAP基因表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)。這些研究表明增加INGAP表達(dá)，將其作為誘導(dǎo)胰島再生的方法是可行的。
盡管已用具體實(shí)施方案來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，但顯而易見(jiàn)的是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可在不背離本發(fā)明的精神和保護(hù)范圍的情況下作出許多其它的變化和修改。因此有意識(shí)地在附加的權(quán)利要求書中包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。
表3
序列表<110>GMP內(nèi)治療學(xué)股份有限公司(GMP Endotherapeutics，Inc.)D.A.泰勒-費(fèi)希維克(Taylor-Fishwick，David A)A.I.維尼克(Vinik，Aaron I)<120>調(diào)節(jié)胰島再生基因相關(guān)蛋白表達(dá)的因子的檢測(cè)分析法<130>9061X#L$<140>未知<141>2003-01-08<150>US 60/388,315<151>2002-06-14<150>US 60/361,073<151>2002-03-01<150>US 60/346,898<151>2002-01-11<160>38<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>3120<212>DNA<213>倉(cāng)鼠屬<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3120)<223>n＝A，C，G或T<400>1ccttctatgg aggaccatca aagtctgtca tgtcatttgg gggagggcct atgccctcct60ctgtgtatct gggcttaaat agcatacctc cataggaaat gggctcccaa attccatata120tgcactaggg aaaaatacag gttctactgt tagagatccc atagactgcc ctggtctttt180agctggcacc catccatatt cagagggttt ggttcagttc aatgttggtt cctcagcttt240
ataactaggg tctctctgct ttcactatgt caggtcaact gtygttgrgg gttctccagc300acagtcttga ctccttttct aatccctctt ccctctctac rattggattc catgagtatg360gctcagtgtt tagctgtasg tacctgcttc tgcttccatc agctactgga tgaaggctct420aagatgacaa ttaaggtaat cgtcgatcct cattatagtg gaagggcttc aaaggcagtc480tctccactac tgcctatctg aacatttccc taatgccaga tgtctcttta aacctatcct540ggctcccttc attaaggtat ctcatttttt gctctcctct gttccnccac tgattcagtt600tttctgatcc ctcttgttct ccacatmatc ttcccttctc tttttcctcc ttccctccac660cctcccaccc ccatgctccc aatttgctca ggagttcttc tccctttccc cttcctcaga720ggaccatgca tttctattac gattctcctt atttcctatt ttctctgggg gtgtggattt780tatggtggaa gcccttctgt gcatatgttg tcttattggt tgataaataa agcactgttg840tccaataggg aaacaagata ggtgggacta ggagttgaag aaaagtcttg gaaatgtagt900aaagagtaga gggttgccat gtgatcctag gaggaattga cacatgagaa tggggtcctc960agaaagataa gtccttataa aaatatatat tagtaattat gggttaataa ttaagtcaga1020gctagccatt aagaaacact agcaaacagc aaacagcttc ataattaata tagtatcctg1080tatgttcatt tggggctgac acagttctgg gaccaggcag gcaggaagay tacttggtac1140atggattgta ggatggtagt cctttgctct atgtctaaat ccatatatga atgagtacat1200accatgtttr tctttctgtg atggggttac ctcactcagg atggtttctt ctagttccat1260tcatttgcct gcgaatttta agattccatt gttttattcc tctgagtaat actccattgt1320gtaatgtacc acattttctc catacattct tcagttgagg gggatctagg tttcttccag1380gttctggcta ttgcaaataa ccctgctatg aacatagctg aacatatgtc attattgtat1440gaatctgttt tacatatttt aaaccatctc tagattgctt gtaatattgt taaacataga1500gagtaataat gctataaaaa ttaaaaataa tgataagaaa gatcctatac atgttcagta1560
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<221>misc_feature<222>(1)..(6586)<223>n＝A，C，G或T<400>2ccttctatgg aggaccatca aagtctgtca tgtcatttgg gggagggcct atgccctcct60ctgtgtatct gggcttaaat agcatacctc cataggaaat gggctcccaa attccatata120tgcactaggg aaaaatacag gttctactgt tagagatccc atagactgcc ctggtctttt180agctggcacc catccatatt cagagggttt ggttcagttc aatgttggtt cctcagcttt240ataactaggg tctctctgct ttcactatgt caggtcaact gtygttgrgg gttctccagc300acagtcttga ctccttttct aatccctctt ccctctctac rattggattc catgagtatg360gctcagtgtt tagctgtasg tacctgcttc tgcttccatc agctactgga tgaaggctct420aagatgacaa ttaaggtaat cgtcgatcct cattatagtg gaagggcttc aaaggcagtc480tctccactac tgcctatctg aacatttccc taatgccaga tgtctcttta aacctatcct540ggctcccttc attaaggtat ctcatttttt gctctcctct gttccnccac tgattcagtt600tttctgatcc ctcttgttct ccacatmatc ttcccttctc tttttcctcc ttccctccac660cctcccaccc ccatgctccc aatttgctca ggagttcttc tccctttccc cttcctcaga720ggaccatgca tttctattac gattctcctt atttcctatt ttctctgggg gtgtggattt780
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1.分離獲得的序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的核酸序列。
2.報(bào)告基因，所述報(bào)告基因包括a.編碼可檢測(cè)產(chǎn)物的核苷酸序列；和b.連接到編碼可檢測(cè)產(chǎn)物的核苷酸序列的5′端的調(diào)控區(qū)核苷酸序列，其中所述調(diào)控區(qū)核苷酸序列包括一個(gè)或多個(gè)從序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的1-3137個(gè)核苷酸中選擇的區(qū)域。
3.權(quán)利要求3的報(bào)告基因，所述報(bào)告基因還包括a.介于所述調(diào)控區(qū)核苷酸序列和編碼所述可檢測(cè)產(chǎn)物的核苷酸序列之間的啟動(dòng)子元件。
4.權(quán)利要求3或4的報(bào)告基因，其中所述調(diào)控區(qū)核苷酸序列選自下列序列標(biāo)識(shí)號(hào)1、2、23、32、35、37、28、24、25、26、27、29、30、31、33、34、38和36。
5.權(quán)利要求4的報(bào)告基因，其中所述啟動(dòng)子元件選自序列標(biāo)識(shí)號(hào)2。
6.宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包括前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的報(bào)告基因。
7.用于鑒定可調(diào)節(jié)INGAP表達(dá)的試劑的方法，所述方法包括a.通過(guò)檢測(cè)劑與權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞接觸；b.確定所述細(xì)胞中可檢測(cè)蛋白質(zhì)或核酸產(chǎn)物的表達(dá)；和c.如果所述檢測(cè)劑可調(diào)節(jié)所述細(xì)胞中可檢測(cè)產(chǎn)物的表達(dá)，則所述檢測(cè)劑可鑒定為INGAP表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。
8.用于鑒定可調(diào)節(jié)INGAP表達(dá)的試劑的體外方法，所述方法包括a.在能夠充分轉(zhuǎn)錄和翻譯所述核苷酸序列的條件下，通過(guò)測(cè)檢物與權(quán)利要求3或4的報(bào)告基因接觸；b.確定所述可檢測(cè)蛋白質(zhì)或核酸產(chǎn)物的表達(dá)；和如果所述檢測(cè)物可調(diào)節(jié)所述可檢測(cè)產(chǎn)物的表達(dá)，則所述檢測(cè)物可鑒定為INGAP表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。
9.用于鑒定可調(diào)節(jié)INGAP表達(dá)的試劑的體外方法，所述方法包括a.通過(guò)檢測(cè)劑與權(quán)利要求2的核酸或其片段接觸；b.確定所述檢測(cè)劑與所述核酸的結(jié)合；和c.如果所述檢測(cè)劑與所述核酸相結(jié)合，則所述檢測(cè)劑可鑒定為INGAP表達(dá)的潛在調(diào)節(jié)劑。
10.用于調(diào)節(jié)有此需要的哺乳動(dòng)物INGAP表達(dá)的方法，所述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物使用可刺激所述哺乳動(dòng)物INGAP表達(dá)的有效量的因子。
全文摘要
報(bào)告基因包含哺乳動(dòng)物的INGAP 5′端調(diào)控區(qū)或其片段、哺乳動(dòng)物INGAP的啟動(dòng)子元件或異源啟動(dòng)子以及報(bào)告基因。所述報(bào)告基因可用作試劑的篩選，這些試劑以單獨(dú)或組合方式上調(diào)或下調(diào)報(bào)告基因表達(dá)?？晒┻x擇地，可將報(bào)告基因用作與倉(cāng)鼠INGAP 5′端調(diào)控區(qū)或序列結(jié)合的試劑的篩選。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1615150SQ03802145
公開日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2003年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月11日
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