專利名稱：提取、純化和酶促修飾用作降低血膽固醇劑的大豆7S球蛋白α’亞基的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提取、純化和酶促修飾β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)α’亞基的方法。
根據(jù)本發(fā)明，β-伴大豆球蛋白選擇性提取自磨碎的脫脂大豆，然后用含水乙醇處理而沉淀；接下來對富集的級分在變性條件下進行金屬親和層析(MAC)以獲得α’亞基。α’亞基用胰凝乳蛋白酶處理，然后進行進一步的親和層析步驟以重新得到該多肽的氨基端區(qū)域(MW 28,000Da)。
背景技術(shù)：
大豆及其衍生物已知的膽固醇降低特性與異黃酮類的含量有關(guān)(Kirk等人，1998)并與蛋白質(zhì)的含量有關(guān)(Anderson等人，1995)。
大豆蛋白質(zhì)主要由大豆球蛋白(11S級分)和β-伴大豆球蛋白(7S級分)組成，后者由α、α’和β三個亞基組成(Thanh和Shibasaki，1976)。對大豆蛋白質(zhì)進行的研究表明7S級分(Lovati等人，1992，1996)，尤其是α’亞基(Manzoni等人，1998)能激活LDL受體，因此主要負責(zé)降低膽固醇血漿水平。事實上，用7S球蛋白處理肝細胞系造成α和α’亞基的徹底降解和對LDL受體活性的刺激，然而β亞基沒有被降解，因此受體也沒有激活。此外，7S級分缺失α’亞基的大豆突變體不能改變受體活性，甚至在高濃度下也不能改變受體活性。
基于這些實驗觀察的結(jié)果，需要一些方法用于獲得純化的β-伴大豆球蛋白、以及回收和純化α’亞基，由后者可通過酶促處理接下來可獲得特異的氨基酸序列，而不是通過多肽合成獲得的。
Than等人(1975和1976)提出，后來經(jīng)O′Keefe等人(1991)改進的一個方法是用來根據(jù)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白在不同pH值下不同的溶解度來分離它們；但是交叉污染還是很嚴(yán)重，而且需要凝膠過濾和親和層析，這些方法花費昂貴，在工業(yè)規(guī)模下實施很困難。Nagano等人(1992)改進的方法盡管允許提高級分的純度，但還是一種花費昂貴只適用于實驗室規(guī)模的方法。
最近，Wu等人(1999)描述了一種在半工業(yè)試驗規(guī)模下分離大豆球蛋白和伴大豆球蛋白的方法。大豆球蛋白經(jīng)連續(xù)兩次水提取，pH為8.5，接著將上清液用0.98g/l的亞硫酸氫鹽溶液處理而沉淀，同時，向來自大豆球蛋白沉淀的母液中加入0.25M NaCl，將pH值調(diào)到4.8而沉淀伴大豆球蛋白。這種方法用來處理大量的起始材料，也提供高蛋白質(zhì)產(chǎn)量，但是級分的純度仍然不理想；特別的是β-伴大豆球蛋白被降解，顯然是在用水滲濾期間發(fā)生的，滲濾是減少過量亞硫酸氫鹽離子并去除鹽的必要處理。
上述方法不僅沒有產(chǎn)出純的β-伴大豆球蛋白，而且最重要的是沒有考慮提取和純化α’亞基。
根據(jù)本發(fā)明，按照常規(guī)方法通過在水介質(zhì)中從磨碎的脫脂大豆提取來制備β-伴大豆球蛋白中富含的固體級分，接下來上清液用含水乙醇沉淀；所得的級分然后在變性條件下通過金屬親和層析(MAC)純化，以產(chǎn)生純的α’亞基，α’亞基用胰凝乳蛋白酶處理以得到氨基端區(qū)域，它顯然具有最高的LDL受體活化活性。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于選擇性提取、純化和酶促修飾大豆的β-伴大豆球蛋白α’亞基的方法，該方法包括以下步驟a)用亞硫酸氫鈉水溶液在弱酸性pH下從磨碎的脫脂大豆中提取得到β-伴大豆球蛋白富集的可溶性蛋白質(zhì)級分；b)用乙醇處理而沉淀來自步驟a)的β-伴大豆球蛋白級分；c)在變性劑條件下通過金屬親和層析(MAC)純化步驟b)得到的沉淀級分，以分離α’亞基；d)用蛋白水解酶酶促處理來自步驟c)的α’亞基，并進一步通過MAC層析純化；e)用有機溶劑沉淀α’亞基。
β-伴大豆球蛋白的富集在

圖1中顯示。起始材料是通過用溶劑去除脂級分而脫脂的大豆粉。在弱酸性pH下用亞硫酸氫鈉水溶液提取該起始材料。使用14-16倍起始材料重量的溶液體積，優(yōu)選14.5-15.5倍。亞硫酸氫鹽的濃度為0.80-1.20g/l，優(yōu)選地為0.90-1.10g/l，最優(yōu)選地為0.95-1.05g/l。提取在溫度-2-8℃進行14到18小時。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，提取是在0-4℃，pH值為6.4的0.98g/l 15倍體積亞硫酸氫鹽溶液中進行16小時。
在上述pH值和溫度條件下，大豆球蛋白的溶解度很低，因此它們和其它不可溶物質(zhì)一起沉淀下來。沉淀物通過離心分離，將可溶的級分在20℃-30℃的溫度，優(yōu)選地在室溫25℃，用35-60％(體積/體積)含水乙醇處理，優(yōu)選地為40％含水乙醇。將上清液離心去掉，并將主要由β-伴大豆球蛋白組成的沉淀物冷凍干燥。得到的粉末進行下一步(圖2)。
用金屬親和層析的方法(Ostrove和Weiss，1990)來分離和純化α’亞基的選擇取決于該亞基與金屬離子，如Zn2+和Ni2+的結(jié)合能力，因為該亞基比起α亞基和β亞基來組氨酸含量更高(Thanh和Shibasaki，1978)。
使用與鋅或鎳，優(yōu)選地使用與鋅結(jié)合的基質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，此基質(zhì)由亞氨基二乙酸瓊脂糖組成。將冷凍干燥的蛋白質(zhì)在由50mM Tris、0.5M NaCl、pH7.2組成的、含5-8M尿素，優(yōu)選地含5M尿素的變性緩沖液中懸浮。在這些條件下，α’亞基選擇性地結(jié)合到基質(zhì)上，α亞基和β亞基可以通過用上述緩沖液洗脫而去除；α’亞基隨后用在相同緩沖液或蒸餾水中含0.1M咪唑的溶液洗脫。
將富集α’亞基的蛋白質(zhì)級分收集起來并用有機溶劑處理，使蛋白質(zhì)沉淀，優(yōu)選地用冷丙酮處理。所使用的丙酮體積為級分體積的2-5倍，優(yōu)選地3-4倍，在-10--30℃，優(yōu)選地在-15--25℃之間的溫度。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，應(yīng)用-20℃，3倍體積的丙酮。所得的沉淀物用離心法分離，重懸在乙醇中，優(yōu)選95％的乙醇，然后進一步離心、冷凍干燥。冷凍干燥物包括94％的蛋白質(zhì)，其α’亞基富集量是起始材料的十倍。
表1顯示了從大豆粉提取出來的β-伴大豆球蛋白和α’亞基的產(chǎn)量。
表1
α’亞基的多肽片段是將來自前面步驟的冷凍干燥物用蛋白水解酶進行酶促處理制備得到的。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，蛋白水解酶是胰凝乳蛋白酶，且所得到的片段主要由分子量28,000Da的氨基端區(qū)域組成。
流程如下所述從前面幾步得到的冷凍干燥物以5mg/ml溶解于pH值7.5-8.5，含有1.6M尿素的0.2M NH4HCO3中。將胰凝乳蛋白酶以1∶10-1∶50比例，優(yōu)選地1∶25w/w加入上述底物中，在37℃攪拌溫育24小時。接下來實施前面所述的金屬親和層析這一步驟。
用咪唑洗脫下來的物質(zhì)包含三個多肽片段，主要的一個具有分子量28000Da，它組成α’亞基的N-末端區(qū)域。
將α’亞基和胰凝乳蛋白酶片段施與大鼠(表2)證明兩者都顯著降低了膽固醇和總甘油三酯血漿水平。特別是胰凝乳蛋白酶片段被證明在降低膽固醇水平方面它不僅比其他大豆成分更有效，而且比安妥明更有效，并且它還提供了不相上下的對甘油三酯的結(jié)果。
該生物學(xué)實驗的結(jié)果表明了根據(jù)本發(fā)明的方法獲取的產(chǎn)品，特別是α’亞基及其片段可以用來作為藥物，特別是用于治療那些需要降低膽固醇和/或甘油三酯血漿水平的病癥。所述化合物可以單獨使用或與其它活性成分組合，并與合適的載體混和，用來制備藥物組合物，特別是用于治療高脂血癥的藥物組合物。此外，它們還可以用來在上面提到的條件下制備用于膳食療法的補充物或食品。
實施例第一步從大豆純化7S球蛋白起始材料是磨碎的大豆，根據(jù)索格利特法脫脂，使用戊烷做溶劑。
蛋白質(zhì)用0.98g/l的亞硫酸氫鈉溶液以15倍脫脂磨碎的大豆體積提取，在溫度0-4℃提取16小時，保持pH值為6.4。離心后，上清液用40％(體積/體積)乙醇溶液在室溫下處理。將得到的富集β-伴大豆球蛋白和含有起始材料雙倍濃度的α’亞基的沉淀物冷凍干燥。
第二步α’亞基的純化β-伴大豆球蛋白富集級分在變性緩沖液(50mM Tris、0.5M氯化鈉、pH值為7.2)中重懸，緩沖液中含5M尿素，并在與鋅結(jié)合的亞氨基二乙酸瓊脂糖基質(zhì)(Sigma)上進行金屬親和層析純化。未結(jié)合的蛋白質(zhì)物質(zhì)用上述相同的緩沖液洗脫，結(jié)合的蛋白質(zhì)物質(zhì)主要由α’亞基組成，被含0.1M咪唑的相同緩沖液或蒸餾水洗脫。
將富集α’亞基的級分用3-4倍體積的-20℃丙酮處理；所得的沉淀物室溫下在40％乙醇中懸浮，然后離心、冷凍干燥。所得到的粉末包含94％的蛋白質(zhì)，并且α’亞基富集量是起始材料的十倍。
第三步α’亞基的酶促處理從前面幾步得到的冷凍干燥物以5mg/ml的濃度在pH值7.5-8.5，含有1.6M尿素的0.2M NH4HCO3中溶解。將胰凝乳蛋白酶以1∶25w/w比例加入蛋白質(zhì)底物中，溫度37℃下攪動溫育24小時，然后進行上述的金屬親和層析純化。被樹脂滯留并用0.1M咪唑洗脫下來的物質(zhì)包含三個多肽片段，主要的一個具有分子量28000Da，它由α’亞基的N-末端區(qū)域組成。
生物學(xué)實驗動物使用雄性大鼠CD SPF/VAF，重量為75-100g。這些動物飼養(yǎng)在聚碳酸酯籠子里(每個籠子4-5只動物)，籠子放在自動控制光線(12小時明/12小時暗的循環(huán))、溫度(21±1℃)、濕度(60±5％)的環(huán)境里。
實驗方法飼養(yǎng)七天后，將這些動物隨機分成七組，每組20只大鼠(表2)。28天期間之內(nèi)，一組喂養(yǎng)正常飲食(cod.014RF25C；Mucedola S.r.l.，SettimoMilanese，MI，Italy)，而其他組喂養(yǎng)由1％膽固醇、0.5％膽酸和25％氫化椰子油組成的高膽固醇飲食(批號為332000，2000.09.01制備；LaboratorioDottori Piccioni，Gessate，MI，Italy)，自由獲取水。該飲食每天(40g，上午9:00)喂養(yǎng)它們，剩下沒吃的稱重。按照下面進行處理。
組1(對照)給動物喂養(yǎng)正常飲食，用0.5％的羧甲基纖維素溶液口服處理28天。
組2給動物喂養(yǎng)高膽固醇飲食，用0.5％的羧甲基纖維素溶液口服處理28天。
組3給動物喂養(yǎng)高膽固醇飲食，用200mg/kg劑量的安妥明口服處理28天。
組4給動物喂養(yǎng)高膽固醇飲食，用200mg/kg劑量的大豆總蛋白質(zhì)提取物口服處理28天。
組5給動物喂養(yǎng)高膽固醇飲食，用50mg/kg劑量的β-伴大豆球蛋白口服處理28天。
組6給動物喂養(yǎng)高膽固醇飲食，用10mg/kg劑量的α’亞基口服處理28天。
組7給動物喂養(yǎng)高膽固醇飲食，用1mg/kg劑量的α’亞基胰凝乳蛋白酶片段口服處理28天。
總膽固醇和甘油三酯血漿水平在28天的處理和16小時的禁食后進行檢測。將動物用乙醚麻醉，使血液從下腔靜脈流入含有EDTA(1mg/ml)的試管中。在4℃，3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘后，血漿回收、冷凍，并儲存在-20℃溫度，直到檢測為止。
總膽固醇和甘油三酯血漿濃度(表2中報道)由常規(guī)的酶促鑒定法來確定。
表2
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權(quán)利要求
1.用于選擇性提取、純化和酶促修飾大豆的β-伴大豆球蛋白α′亞基的方法，該方法包括下列步驟a)用亞硫酸氫鈉水溶液在弱酸性pH下提取磨碎的脫脂大豆，以獲得β-伴大豆球蛋白富集的可溶性蛋白質(zhì)級分；b)通過用乙醇處理而沉淀來自步驟a)的β-伴大豆球蛋白級分；c)在變性劑條件下通過金屬親和層析(MAC)純化來自步驟b)的沉淀級分，以分離α’亞基；d)用蛋白水解酶酶促處理來自步驟c)的α’亞基，并進一步通過MAC層析純化；e)用有機溶劑沉淀α’亞基。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中提取是用15倍體積的0.98g/l亞硫酸氫鈉溶液于pH6.4進行。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b)的沉淀用40％乙醇進行。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟c)中的MAC在連接有鋅或鎳的基質(zhì)上進行。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中基質(zhì)上連接有鋅。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中基質(zhì)由瓊脂糖亞氨基二乙酸組成。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟c)的MAC中所用的變性劑是尿素。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟d)的酶促處理所用的蛋白水解酶是胰凝乳蛋白酶。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟e)中用于α’亞基的沉淀溶劑是丙酮。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中β-伴大豆球蛋白富集級分和α’亞基通過冷凍干燥而穩(wěn)定。
11.來自大豆的β-伴大豆球蛋白富集級分和α’亞基，可由權(quán)利要求1-10所述的方法獲得。
12.大豆β-伴大豆球蛋白α’亞基的多肽片段，其可由權(quán)利要求1-10所述的方法獲得。
13.氨基端多肽片段，其可根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法得到。
14.用作藥物的權(quán)利要求12的大豆β-伴大豆球蛋白α’亞基的多肽片段。
15.用作藥物的權(quán)利要求12的氨基端多肽片段。
16.權(quán)利要求12的大豆β-伴大豆球蛋白α’亞基的多肽片段的用途，用來制備治療高脂血癥的藥物。
17.權(quán)利要求12的多肽片段的用途，用來制備治療高脂血癥的藥物。
18.藥物組合物，其含有與合適載體混和的、單獨或與其他活性成分組合的權(quán)利要求12或13的多肽片段。
19.含有權(quán)利要求12或13的多肽片段的補充物或食品。
全文摘要
提取、純化和酶促修飾β－伴大豆球蛋白α’亞基的方法，其中β－伴大豆球蛋白選擇性提取自磨碎的脫脂大豆，然后用含水乙醇處理而沉淀；接下來對富集的級分在變性條件下進行金屬親和層析(MAC)以獲得α’亞基，該α’亞基用胰凝乳蛋白酶處理，然后進行進一步的親和層析步驟以重新得到該多肽的氨基端區(qū)域(MW 28,000Da)。
文檔編號A61P3/06GK1622760SQ03802805
公開日2005年6月1日 申請日期2003年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月29日
發(fā)明者M·杜蘭蒂, P·莫拉佐尼 申請人:因德納有限公司