專利名稱：新微生物、其產(chǎn)物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有產(chǎn)生(E)-4-(2-異氰基乙烯基)苯基α-L-鼠李吡喃糖苷(rhamnopyranoside)的能力的新微生物，上述化合物是基于酪氨酸酶抑制活性而具有黑素產(chǎn)生抑制作用，對(duì)曬傷后色素沉著、褐黃斑、雀斑、肝性褐黃斑等的預(yù)防及改善有效的新型化合物；并涉及基于該微生物產(chǎn)生的酪氨酸酶抑制活性而具有黑素產(chǎn)生抑制作用、對(duì)曬傷后色素沉著、褐黃斑、雀斑、肝性褐黃斑等的預(yù)防及改善有效的新型化合物；以及含有上述化合物的外用皮膚藥、特別是美白劑。
背景技術(shù)：
皮膚的色素沉著有褐黃斑、雀斑、肝性褐黃斑等皮膚病引起的色素沉著等多種情況。它們的作用機(jī)制通常被認(rèn)為是曬傷或激素異常等引起存在于表皮細(xì)胞中的黑素細(xì)胞所生成的黑素?cái)U(kuò)散、沉著到鄰近細(xì)胞。為抑制黑素這種色素的生成，重要的是抑制作為該黑素細(xì)胞中的黑素生成的第一階段的酪氨酸酶的生成，或者直接抑制酪氨酸酶。一直使用的曲酸和熊果苷是具有此作用的代表性藥物。此外，由酪氨酸酶的作用而生成的多巴和多巴醌通過酶或非酶的氧化作用會(huì)生成黑色，抑制這一過程對(duì)抑制黑素生成也是有效的。其代表性的藥物有抗壞血酸、氫醌等。
然而，實(shí)際情況是原來的藥物未必能得到充分的效果。作為化妝品或外用皮膚藥的原料，目前希望能創(chuàng)制安全性高、具有良好的抑制黑素產(chǎn)生的作用的美白劑。
發(fā)明的揭示本發(fā)明者對(duì)天然存在的多種微生物產(chǎn)生的物質(zhì)深入研究后發(fā)現(xiàn)，屬于腸桿菌屬的新的微生物物種能產(chǎn)生具有優(yōu)異的酪氨酸酶抑制活性和黑素產(chǎn)生抑制作用的物質(zhì)。然后，從該微生物的培養(yǎng)物成功地分離出新型的(E)-4-(2-異氰基乙烯基)苯基α-L-鼠李吡喃糖苷(以下簡(jiǎn)稱為化合物(I))。接著，發(fā)現(xiàn)該化合物(I)具有優(yōu)異的預(yù)防和改善色素沉著的效果，通過配合使用該化合物而得到能發(fā)揮良好的美白效果的安全性高的美白劑，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明首先涉及具有黑素產(chǎn)生抑制作用、作為美白劑有用的(E)-4-(2-異氰基乙烯基)苯基α-L-鼠李吡喃糖苷或其鹽，其次涉及含有該化合物的外用皮膚藥，特別是美白劑，第三涉及具有產(chǎn)生(E)-4-(2-異氰基乙烯基)苯基α-L-鼠李吡喃糖苷的能力的新微生物腸桿菌屬(Enterobacter sp.)B20株。
附圖的簡(jiǎn)單說明

圖1表示本發(fā)明化合物的紅外吸收光譜(νmax(KBr)cm-1)。
圖2表示本發(fā)明化合物的1H-NMR譜。
圖3表示本發(fā)明化合物的13C-NMR譜。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明。
本發(fā)明的新微生物是自土壤分離的屬于腸桿菌(Enterobacter)屬的細(xì)菌，具有如下的細(xì)菌學(xué)性狀。
1)形態(tài)學(xué)性質(zhì)本菌株為革蘭氏陰性桿菌，因極生鞭毛而具有運(yùn)動(dòng)性。細(xì)胞大小為0.8～1.1×1.0～2.2μm。未發(fā)現(xiàn)有孢子形成。
2)培養(yǎng)性質(zhì)在肉湯瓊脂培養(yǎng)基上形成淡黃茶色的菌落。菌落呈圓形，表面光滑。在肉湯液體培養(yǎng)中，在培養(yǎng)基表面形成皮膜，整個(gè)培養(yǎng)基渾濁。在肉湯明膠穿刺培養(yǎng)中，未見明膠液化。用石蕊牛奶培養(yǎng)時(shí)，1周培養(yǎng)后未見凝固和胨化。
3)生理學(xué)性質(zhì)B20株的生理學(xué)性質(zhì)(1)首先，將本菌株的生理學(xué)特性等匯總于表1。
表1

B20株的生理學(xué)性質(zhì)(2)下面將從各種糖產(chǎn)生酸的特性匯總于表2。
表2

B20株的生理學(xué)性質(zhì)(3)表3匯總表示碳源的利用性。
表3

歸納上述微生物學(xué)性質(zhì)，本菌株是革蘭氏陰性的兼性厭氧桿菌。生長溫度范圍為10～37℃，硝酸鹽的還原、脫氮反應(yīng)、MR試驗(yàn)、檸檬酸的利用性、過氧化氫酶試驗(yàn)均為陽性?？蓮腖-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-甘露醇、D-半乳糖、麥芽糖、海藻糖、乳糖、水楊苷、甘油、纖維二糖產(chǎn)生酸，OF試驗(yàn)的結(jié)果為發(fā)酵型。另一方面，VP試驗(yàn)、吲哚的生成、硫化氫的生成、尿素酶、氧化酶試驗(yàn)、精氨酸分解反應(yīng)的結(jié)果為陰性。
根據(jù)上述性質(zhì)，對(duì)伯捷氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)(Bergey’s Manual of SystematicBacteriology，1989)及其它文獻(xiàn)的檢索結(jié)果，認(rèn)為本菌株為屬于腸桿菌屬的細(xì)菌，命名為腸桿菌屬(Enterobacter sp.)B20株。
本菌株已于2001年12月25日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市1丁目1番地1，中央第6)，保藏編號(hào)為FERM P-18666號(hào)，并于2002年12月26日根據(jù)布達(dá)佩斯條約提出保藏的移交請(qǐng)求，以保藏編號(hào)FERM BP-8266號(hào)保藏。由于微生物容易發(fā)生人工或自然變異，所以本發(fā)明所用的腸桿菌屬(Enterobacter sp.)B20株，除了天然分離的微生物之外，當(dāng)然包括用紫外線、X線、化學(xué)試劑等使其人工變異的變異株以及天然變異株。
下面，說明培養(yǎng)腸桿菌屬B20株產(chǎn)生本發(fā)明化合物(I)的方法。
即，本發(fā)明化合物(I)或其鹽是通過培養(yǎng)屬于腸桿菌屬的具有產(chǎn)生本發(fā)明化合物(I)的能力的微生物，如腸桿菌屬B20 FERM P-1866號(hào)菌株或其變異株而得到的。培養(yǎng)按照一般微生物的培養(yǎng)方法進(jìn)行。
培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基可以是含有屬于腸桿菌屬的能產(chǎn)生本發(fā)明化合物(I)的微生物，如腸桿菌屬B20株可利用的營養(yǎng)源的培養(yǎng)基，可以用合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基。可使用公知的營養(yǎng)物作為添加于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源。培養(yǎng)基的組成中，作為碳源可列舉L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-果糖、L-鼠李糖、D-甘露醇、甘露糖、乳糖、D-半乳糖、麥芽糖、海藻糖、水楊苷、淀粉、葡萄糖、糊精、甘油、植物油等。作為氮源可用肉汁、蛋白胨、麩質(zhì)粗粉、棉子餅、大豆粉、花生粉、魚粉、玉米漿、干酵母、酵母膏、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、尿酸等有機(jī)、無機(jī)氮源。作為金屬鹽，可根據(jù)需要添加鈉、鉀、鎂、鈣、鋅、鐵、鈷等的硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽等。還可根據(jù)需要添加甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、硫代硫酸鹽、油酸甲酯、豬油、硅酮油、表面活性劑等生長促進(jìn)劑或消泡劑。
培養(yǎng)條件一般在有氧條件下培養(yǎng)有利，培養(yǎng)溫度在10～37℃(參見上述生理學(xué)性質(zhì)的說明)范圍，較好為20～32℃附近。培養(yǎng)基pH調(diào)整至約5～9，較好為約5～8的范圍，可以得到好結(jié)果。培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)培養(yǎng)基組成、溫度條件適當(dāng)確定，通常在1～7日左右，較好在2～5日左右。
從培養(yǎng)物分離作為目標(biāo)的本發(fā)明物質(zhì)，可適當(dāng)利用通常用于微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的提取、精制手段。例如在培養(yǎng)液、或經(jīng)離心分離得到的培養(yǎng)液、或在培養(yǎng)物中加過濾助劑過濾而得的培養(yǎng)液中，加入與水不相混的有機(jī)溶劑乙酸乙酯等提取培養(yǎng)物中的該物質(zhì)。培養(yǎng)液也可與適當(dāng)?shù)妮d體接觸，使濾液中生成的物質(zhì)被吸附，然后用適當(dāng)?shù)娜軇┨崛≡撐镔|(zhì)。例如，使之與AmberliteXAD-2、Diaion HP-20、Diaion CHP-20或Diaion SP-900等多孔吸附樹脂接觸，使該物質(zhì)被吸附。然后，用甲醇、乙醇、丙酮、丁醇、乙腈等有機(jī)溶劑與水的混合液洗脫該物質(zhì)。通過將這時(shí)的有機(jī)溶劑的混合比率階段地或連續(xù)地從低濃度提高到高濃度，可得到含該物質(zhì)的部分。用乙酸乙酯、氯仿等有機(jī)溶劑提取時(shí)，在培養(yǎng)物濾液中加這些溶劑，充分振蕩，提取該物質(zhì)。然后，通過上述各操作法所得的含該物質(zhì)的部分可通過硅膠、使用ODS等的柱色譜、離心液液分配色譜、使用ODS的高效液相色譜(HPLC)等常規(guī)方法進(jìn)一步分離精制純品。即，可以黑素生成抑制活性作指標(biāo)，采用通常用于生理活性物質(zhì)制造的手段進(jìn)行分離、精制，這些手段利用的是對(duì)適當(dāng)?shù)娜軇┑娜芙庑院腿芙舛鹊牟町惖?。根?jù)需要，這些方法可單用或按任意的順序組合，反復(fù)使用。
本發(fā)明化合物(I)和酸形成鹽。酸是無機(jī)酸或有機(jī)酸，具體可列舉與鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸或磷酸等無機(jī)酸，或與甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸或乙磺酸等的酸加成鹽。而且，本發(fā)明包括本發(fā)明化合物(I)或其鹽的水合物、各種溶劑合物、互變異構(gòu)體或基于手性碳的立體異構(gòu)體等所有關(guān)聯(lián)物質(zhì)。此外，本發(fā)明化合物(I)或其鹽有時(shí)存在多晶形，本發(fā)明也包括所有這些晶形。
本發(fā)明的外用皮膚藥可按常法調(diào)制成化妝品、外用藥、醫(yī)藥品等所有的形式。其具體例子可列舉乳霜、乳液、化妝水、粉底、潤膚膏、洗劑、凝膠物、溶液、膏藥(stick)等形式。
本發(fā)明的外用皮膚藥，較好在外用皮膚藥總量中含有本發(fā)明化合物(I)或其鹽0.00001～10重量％，特別好的是含有0.001～1重量％的量。未滿0.00001重量％時(shí)，缺乏皮膚美白效果，配比超過10重量％效果也不會(huì)隨之增加。
本發(fā)明的外用皮膚藥中除了本發(fā)明化合物(I)或其鹽之外，可適當(dāng)配合通常的化妝品、外用藥、醫(yī)藥品等所用的各種其它成分，例如，油劑、保濕劑、增粘劑、防腐劑、乳化劑、顏料、粉體、pH調(diào)節(jié)劑、藥效成分、紫外線吸收劑、防氧化劑、香料等。
(實(shí)施例)以下通過實(shí)施例具體說明本發(fā)明化合物(I)的產(chǎn)生，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例1將含葡萄糖10g、馬鈴薯淀粉20g、多種蛋白胨5g、酵母膏5g、碳酸鈣4g、蒸餾水1L的培養(yǎng)基(pH7.0)分別注入容積500ml的三角燒瓶中，每個(gè)燒瓶100ml，于120℃滅菌20分鐘。刮取在貝奈特氏(Bennett)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好的腸桿菌屬B20株接種，于28℃、220轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振蕩培養(yǎng)3日，作為種子培養(yǎng)液。然后，將含甘油40g、玉米漿30g、硝酸鈉4g、碳酸鈣2g、硫酸鎂7水合物0.2g、蒸餾水1L的培養(yǎng)基(pH5.5)分別注入容積500ml的三角燒瓶中，每個(gè)燒瓶100ml，于120℃滅菌20分鐘。在200份該培養(yǎng)基中各接種上述種子培養(yǎng)液3ml，于28℃、220轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振蕩培養(yǎng)5日。
用夏普勒斯(Sharples)型離心機(jī)將以上所得的培養(yǎng)液20L的菌體與培養(yǎng)上清液進(jìn)行分離。將上清液的pH調(diào)節(jié)到7之后用乙酸乙酯10L提取。另外，向菌體添加80％丙酮水溶液20L，攪拌3小時(shí)。在其中加硅藻土進(jìn)行吸濾，將所得的丙酮溶液減壓下濃縮，蒸除丙酮。用乙酸乙酯提取該濃縮液，將提取液濃縮至干。然后，將從菌體和上清液所得的乙酸乙酯提取物(8.4g)進(jìn)行硅膠柱色譜分離(硅膠60，70-230目ASTM，默克)，依次用氯仿-甲醇(100∶1，20∶1，10∶1)洗脫。將含有黑素產(chǎn)生抑制物質(zhì)的活性部分濃縮至干，得粗品(1.2g)。該粉末裝入Oasis HLB固相萃取柱身6g/35cc，用蒸餾水(70ml)及50％甲醇(70ml)洗滌后，以100％甲醇(70ml)洗脫活性物質(zhì)，濃縮至干，得活性粉末(517mg)。將該粉末裝入HPLC(Sensyu Pack Pegasil ODS；20i.d.×250mm)，以乙腈-水(30∶70)洗脫，分出具有活性的峰，將該部分濃縮至干，得以下化1式所示的(E)-4-(2-異氰基乙烯基)苯基α-L-鼠李吡喃糖苷，白色粉末(110mg)。
即，本發(fā)明化合物(I)為(化1)表示的糖苷。
(化1) 上述化1式表示的本發(fā)明化合物(I)的物理化學(xué)性質(zhì)如下所示。
顏色及形狀白色粉末旋光度[α]D25-142°(c 0.1，甲醇)分子式C15H17O5N高分辨FAB質(zhì)譜測(cè)定值292.1187(M+H)-計(jì)算值292.1185(M+N)+紫外可見吸收光譜(λmaxMeOHnm(ε))210(15,000)，221(15,000)，281(26,000)紅外吸收光譜(νmax(KBr)cm-1)如圖1所示1H-NMR譜(400MHz，CD3OD)如圖2所示13C-NMR譜(100MHz，CD3OD)如圖3所示實(shí)施例2用以下方法確認(rèn)本發(fā)明化合物(I)對(duì)來自蘑菇的酪氨酸酶的抑制活性、對(duì)來自B16黑色瘤的酪氨酸酶的抑制活性，以及對(duì)B16黑素瘤的產(chǎn)生黑素能力的抑制效果。
對(duì)來自蘑菇的酪氨酸酶的抑制活性的測(cè)定法用0.05M磷酸緩沖液(pH6.8)溶解來自蘑菇的酪氨酸酶(Sigma)使其濃度為20U/ml。用0.05M磷酸緩沖液(pH6.8)將L-多巴配制成0.3mg/ml的溶液。將L-多巴溶液30μl和不同濃度的本發(fā)明化合物(I)溶液30μl加至96孔板中，迅速與來自蘑菇的酪氨酸酶溶液30μl混合。于25℃保溫10分鐘后用微量讀板器測(cè)定450nm處的吸光度。
對(duì)來自B16黑素瘤的酪氨酸酶的抑制活性的測(cè)定法使在液氮中冷凍保存的約2.0×105/安瓿的B16黑素瘤細(xì)胞株溶于37℃的水浴中，將其立即懸浮于培養(yǎng)基10ml中。以800rpm離心5分鐘，棄去上清液，添加新培養(yǎng)基10ml，使細(xì)胞懸浮。再以相同條件離心，棄去上清液，懸浮于新培養(yǎng)基。
在75cm2的燒瓶中接種該細(xì)胞，每個(gè)燒瓶約4.5×105個(gè)細(xì)胞。每2～3日更換培養(yǎng)基一次，于37℃、5％CO2下連續(xù)培養(yǎng)1周。將分會(huì)合(subconfluent)狀態(tài)的細(xì)胞的培養(yǎng)基棄去，以PBS(-)洗滌培養(yǎng)細(xì)胞表面后，用0.25％胰蛋白酶使細(xì)胞剝離。加入含血清的培養(yǎng)基，使胰蛋白酶的反應(yīng)中止，用吸移法使細(xì)胞分離后，將細(xì)胞懸浮液移入離心試管。以800rpm離心5分鐘后，棄去上清液，將細(xì)胞懸浮于新培養(yǎng)基。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞數(shù)。
將此細(xì)胞5×105個(gè)接種子175cm2的燒瓶，于37℃、5％CO2下培養(yǎng)5日。在形成會(huì)合狀態(tài)時(shí)棄去培養(yǎng)基，用PBS(-)洗滌細(xì)胞表面后，以0.25％胰蛋白酶剝離細(xì)胞，加入含血清的培養(yǎng)基，使胰蛋白酶的反應(yīng)中止。用吸移法使細(xì)胞分離，將細(xì)胞懸浮液收集在50ml的錐形管中，以800rpm離心5分鐘。棄去上清液，使細(xì)胞懸浮于PBS(-)，再次用PBS(-)洗滌。重新懸浮于0.05M磷酸緩沖液(pH6.8)，用勻化器在冰中將細(xì)胞破碎。在1.5ml的樣品管中分別注入等量細(xì)胞液，于4℃、12000rpm離心15分鐘。收集上清液，在冰中保存至使用時(shí)(粗酶液)。
用0.05M磷酸緩沖液(pH6.8)將L-多巴配制成0.8mg/ml的溶液。加入L-多巴溶液0.25ml、不同濃度的本發(fā)明化合的(I)溶液0.25ml以及粗酶液0.5ml，迅速混合，于25℃保溫2小時(shí)后，測(cè)定475nm處的吸光度。
對(duì)B16黑素瘤的產(chǎn)生黑素能力的抑制活性的測(cè)定法使在液氮中冷凍保存的約2.0×105/安瓿的B16黑素瘤細(xì)胞株溶解于37℃的水浴中，將其立即懸浮于培養(yǎng)基10ml中。以800rpm離心5分鐘，棄去上清液，添加新培養(yǎng)基10ml，使細(xì)胞懸浮。再以相同條件離心，棄去上清液，懸浮于新培養(yǎng)基。
在75cm2的燒瓶中接種該細(xì)胞，每個(gè)燒瓶約4.0×105個(gè)細(xì)胞。每2～3日更換培養(yǎng)基一次，于37℃、5％CO2下連續(xù)培養(yǎng)1周。將分會(huì)合狀態(tài)的細(xì)胞的培養(yǎng)基棄去，以PBS(-)洗滌培養(yǎng)細(xì)胞表面后，用0.25％胰蛋白酶使細(xì)胞剝離。加入含血清的培養(yǎng)基，使胰蛋白酶的反應(yīng)中止，用吸移法使細(xì)胞分離后，將細(xì)胞懸浮液移入離心試管。以800rpm離心5分鐘后，棄去上清液，將細(xì)胞懸浮于新培養(yǎng)基(不含酚紅)。用血球計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞數(shù)。
用培養(yǎng)基(不含酚紅)稀釋細(xì)胞液，使?jié)舛冗_(dá)到2×105個(gè)/ml，接種于96孔板，每孔100μl。于37℃、5％CO2下培養(yǎng)1日。用培養(yǎng)基(不含酚紅)配制不同濃度的本發(fā)明化合物(I)溶液。加至96孔板中，每孔100μl。于37℃、5％CO2下培養(yǎng)5日，用下述方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。
(評(píng)價(jià)方法)1、細(xì)胞外黑素量培養(yǎng)后移至測(cè)定平板上，每孔150μl，轉(zhuǎn)移時(shí)不讓培養(yǎng)基發(fā)泡，用微量讀板器測(cè)定OD450。
2、細(xì)胞內(nèi)黑素量將加有細(xì)胞的板翻轉(zhuǎn)，棄去殘留的培養(yǎng)基。添加0.1N的NaOH-0.1％tritonX-100，每孔150μl，用吸移法使其溶解。移至測(cè)定平板，每孔100μl，用微量讀板器測(cè)定OD450。
3、蛋白質(zhì)量在測(cè)定平板中加蒸餾水，每孔156μl，取在測(cè)定細(xì)胞內(nèi)黑素量時(shí)溶解的細(xì)胞液的殘留液添加至上述孔中，每孔4μl。添加Bio-rad protein assay diesolution，每孔40μl，振蕩2分鐘。放置5分鐘后用微量讀板器測(cè)定OD590。
上述測(cè)定結(jié)果匯總于表4。本發(fā)明化合物(I)具有良好的酪氨酸酶抑制活性以及黑素產(chǎn)生抑制作用。而且，在明顯顯示其美白作用的濃度時(shí)，未見對(duì)顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞的蛋白含量產(chǎn)生影響。
表4 本發(fā)明化合物(I)的酪氨酸酶抑制活性和黑素產(chǎn)生抑制作用

實(shí)施例3本發(fā)明化合物(I)的美白效果用以下方法測(cè)定。
讓20名受試者在夏天午前11時(shí)至午后1時(shí)曬太陽光2天，共4小時(shí)。以被曬的受試者的上腕內(nèi)側(cè)部皮膚為對(duì)象，自曬太陽光之日起5天后，每日早晚各涂敷1次各供試品，共計(jì)4周，這些供試品是混合以下的表5及表6所示的處方配制的水相和醇相，使它們?nèi)芙舛渲瞥鰜淼摹?br> 表5

表6

4周后，對(duì)各受試者判定美白效果。效果的判定根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。
◎受試者中顯示顯著有效及有效的比例在80％以上。
○受試者中顯示顯著有效及有效的比例為50～80％。
△受試者中顯示顯著有效及有效的比例為30～50％。
×受試者中顯示顯著有效及有效的比例未滿30％。
判定的結(jié)果示于以下的表7。
表7

如表7所示，含有本發(fā)明化合物(I)的組合物，與對(duì)照使用的藥物比較，發(fā)現(xiàn)用較少量即具有同等甚至更好的防止黑素色素沉著的作用。而且，涂敷本發(fā)明化合物的受試者未見紅斑、水腫等皮膚異常情況，也完全未見起因于涂敷本發(fā)明化合物而產(chǎn)生的副作用。
實(shí)施例4對(duì)于本發(fā)明化合物(I)，配制由以下的表8、9及10所示成分組成的3種處方混合而成的乳液。
表8

表9

表10

將成分A加熱溶解，保持在80℃。另將成分B于80℃加熱熔解，加至成分A中，充分混合。于攪拌下冷卻，在50℃時(shí)加成分C，得乳液。
實(shí)施例5對(duì)于本發(fā)明的物質(zhì)，調(diào)制以下的表11所示處方的化妝水。
表11

在室溫將所有成分?jǐn)嚢琛⒒旌?，形成均勻溶液，調(diào)整pH至5.5，得化妝水。
實(shí)施例6對(duì)于本發(fā)明化合物(I)，調(diào)制以下的表12所示處方的乳霜。
表12

將丙二醇加至精制水中，加熱，保持在70℃(水相)。將其它成分混合，加熱溶融，保持在70℃(油相)。將油相加至水相中，進(jìn)行預(yù)乳化，再用高速混合器均勻乳化，得乳霜。
實(shí)施例4～6所得的外用皮膚藥在美白效果試驗(yàn)中都顯現(xiàn)出效果。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明提供了能產(chǎn)生具有良好的黑素產(chǎn)生抑制作用的(E)-4-(2-異氰基乙烯基)苯基α-L-鼠李吡喃糖苷的新菌株。此菌株(包括變異株)產(chǎn)生的(E)-4-(2-異氰基乙烯基)苯基α-L-鼠李吡喃糖苷是預(yù)期將成為良好的美白劑的化合物，它不僅對(duì)曬傷后的色素沉著、褐黃斑、雀斑、肝性褐黃斑等有淡化及美白的優(yōu)良效果，而且安全性也優(yōu)良。
權(quán)利要求
1.(E)-4-(2-異氰基乙烯基)苯基α-L-鼠李吡喃糖苷或其鹽。
2.外用皮膚藥，其特征在于，含有(E)-4-(2-異氰基乙烯基)苯基α-L-鼠李吡喃糖苷或其鹽。
3.如權(quán)利要求2所述的外用皮膚藥，其特征還在于，為美白劑。
4.腸桿菌屬(Enterobacter sp.)B20株。
全文摘要
本發(fā)明提供了能產(chǎn)生具有良好的黑素生成抑制作用的(E)－4－(2－異氰基乙烯基)苯基α－L－鼠李吡喃糖苷的新微生物腸桿菌屬(Enterobacter sp.)B20株及由該菌株產(chǎn)生的α－L－鼠李吡喃糖苷化合物。本發(fā)明的新微生物是從土壤分離出來的革蘭氏陰性桿菌，因極生鞭毛而具有運(yùn)動(dòng)性。在需氧條件下，以10～37℃的培養(yǎng)溫度、約5～9的培養(yǎng)基pH和一般1～7天左右的時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)而產(chǎn)生的α－L－鼠李吡喃糖苷化合物具有高安全性，可作為穩(wěn)定的美白劑使用。
文檔編號(hào)A61K8/60GK1625599SQ0380292
公開日2005年6月8日 申請(qǐng)日期2003年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月30日
發(fā)明者中川彰, 高橋宣治, 宮崎壽次, 小山內(nèi)優(yōu)子, 小坂邦男, 永井浩二, 荒尾央子, 田中幸一 申請(qǐng)人:山之內(nèi)制藥株式會(huì)社, 中川彰, 長瀨產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社