專利名稱：包含環(huán)胞菌素的緩釋藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包含環(huán)胞菌素的緩釋藥物組合物。
背景技術(shù)：
迄今為止，對環(huán)胞菌素臨床研究的主要領(lǐng)域是其作為免疫抑制劑的應(yīng)用，特別是應(yīng)用于接受器官移植的患者，比如心臟、肺、心肺聯(lián)合、肝、腎、胰、骨髓、皮膚、角膜移植，特別是同種異體器官移植。在此領(lǐng)域，環(huán)胞菌素的應(yīng)用取得了非凡的成功。
與此同時，重點(diǎn)在于環(huán)胞菌素在治療各種自身免疫病和炎癥，特別是由包括關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕病中的自身免疫成分在內(nèi)的病因?qū)W因素引起的上述癥狀時的適用性。文獻(xiàn)廣泛公開了許多有關(guān)環(huán)胞菌素在體外試驗(yàn)、動物模型試驗(yàn)及臨床試驗(yàn)的報道及結(jié)果。推薦應(yīng)用或已經(jīng)應(yīng)用環(huán)胞菌素治療的特定的自身免疫疾病包括自身免疫性溶血性疾病(例如包括溶血性貧血、再生障礙性貧血、正紅血球性貧血及特發(fā)性血小板減少等)、全身性紅斑狼瘡、多軟骨炎、硬皮病、韋格納肉芽腫病、皮肌炎、慢性活動性肝炎、重癥肌無力、牛皮癬、史蒂文斯-約翰遜綜合癥、特發(fā)性口炎性腹瀉、自身免疫性炎性腸疾病(例如包括潰瘍性結(jié)腸炎、局限性回腸炎等)、內(nèi)分泌性眼病、格雷夫斯病、結(jié)節(jié)病、多發(fā)性硬化癥、原發(fā)性膽汁性肝硬變、青少年糖尿病(I型真性糖尿病)、葡萄膜炎(前部和后部)、干燥性角結(jié)膜炎、春季角膜結(jié)膜炎、間質(zhì)性肺纖維化、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎(伴隨或不伴隨腎病綜合癥，如特發(fā)性腎病綜合癥、輕微損害性腎病綜合癥)。環(huán)胞菌素的進(jìn)一步研究介紹了其潛在的作為抗寄生物藥，特別是抗原蟲藥的應(yīng)用，并推薦其用于瘧疾、球胞子菌感染及血吸蟲病的治療。最近，環(huán)胞菌素還用于逆轉(zhuǎn)或消除腫瘤對抗癌瘤藥物的耐藥性等。
盡管環(huán)胞菌素具有低生物利用度的嚴(yán)重缺點(diǎn)，但它仍是迄今為止應(yīng)用最為廣泛的一種免疫抑制劑。應(yīng)用后，占吸收總量10～27％的環(huán)胞菌素被肝臟的首過效應(yīng)消除。其分布半衰期為0.7～1.7小時，消除半衰期為6.2～23.9小時。上述藥物動力學(xué)參數(shù)顯示，隨膽酸分泌水平、病人情況及所移植器官種類的不同，環(huán)胞菌素個體差異較大。環(huán)胞菌素還具有腎臟副作用，如降低腎小球?yàn)V過率、提高近端腎小管重吸收等。有報道指出，由于其高血藥濃度，導(dǎo)致30％服用環(huán)胞菌素的患者出現(xiàn)腎毒性副作用。因此，環(huán)胞菌素被劃分為需要對患者的血藥濃度進(jìn)行周期性治療藥物監(jiān)測的藥物。
由于環(huán)胞菌素具下述特殊性質(zhì)，如溶解度非常低、生物利用度低、吸收程度個體差異大、劑量單位高和治療指數(shù)狹窄，還由于接受環(huán)胞菌素治療的患者的病癥不穩(wěn)定的事實(shí)，很難確定最佳藥物劑量方案來維持恒定有效血藥濃度在可以同時避免排異反應(yīng)及副作用的水平以挽救接受器官移植患者的生命。因?yàn)榄h(huán)胞菌素的生物利用度低且易變，根據(jù)劑型調(diào)整其日劑量對于獲得希望的血藥濃度是必須的，同時還必須對其血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測。目前，環(huán)胞菌素的劑量是在分析患者在器官移植前服用環(huán)胞菌素后的血藥濃度圖所獲得的資料的基礎(chǔ)上確定的。將來，隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展與知識的進(jìn)步，器官移植手術(shù)數(shù)量將穩(wěn)步上升并因此導(dǎo)致環(huán)胞菌素等免疫抑制劑應(yīng)用的增加。用以分析環(huán)胞菌素血藥濃度圖以確定個體每日劑量以及用于術(shù)后治療藥物監(jiān)測的醫(yī)療費(fèi)用也將隨之增加。并且，隨著病人數(shù)量的增加，醫(yī)療保健的條件可能會有所下降。
因此，迫切需要新的具有高生物利用度并且可以避免個體差異維持恒定血藥濃度的劑型。
事實(shí)上，曾經(jīng)有過提高環(huán)胞菌素生物利用度的嘗試，結(jié)果造成了環(huán)胞菌素劑型的優(yōu)化。這些嘗試主要集中于使環(huán)胞菌素增溶的方法。這些方法的代表性的例子是應(yīng)用脂質(zhì)體、微球、以及由普通植物油及表面活性劑組成的混合溶劑系統(tǒng)，應(yīng)用吸附絡(luò)合物、包合絡(luò)合物及固體分散體等形成粉末組合物，及其他種種劑型。它們主要為用于口服給藥的劑型。
通過改變劑型以提高環(huán)胞菌素生物利用度的最重要的嘗試之一是第5,342,625號美國專利。這項(xiàng)技術(shù)公開了一種包含三相系統(tǒng)的微乳預(yù)濃縮物，即(1)水相成分、(2)油相成分和(3)表面活性劑。此組合物包含乙醇作為基本成分且提供了用水稀釋后平均粒徑小于100nm的水包油型微乳。同傳統(tǒng)劑型相比，表面積的增大提高了環(huán)胞菌素的生物利用度。第5,342,625號美國專利記載了將可用于體內(nèi)的微乳處方(第5,342,625號美國專利組合物I)同之前第4,388,307號美國專利中報道的基于乙醇與油類的常規(guī)劑型(組合物X)在健康志愿者中進(jìn)行的比較。組合物I同組合物X(其生物利用度設(shè)為100％)相比，相對生物利用度達(dá)到149.0％(±48)。盡管組合物I的平均AUC值比組合物X高40％，但由于其20％的偏差太大而不能實(shí)際應(yīng)用于藥物的制備。
第5,641,745號美國專利公開了一種環(huán)胞菌素包封于生物可降解聚合物內(nèi)的微球。此微球可于8小時內(nèi)釋放所包封環(huán)胞菌素總量的80％以上，因此可以最大限度增加環(huán)胞菌素在小腸的吸收。這項(xiàng)技術(shù)以最大限度地在環(huán)胞菌素的主要吸收部位—上端小腸釋放所包封藥物的方法來提高生物利用度。但是，對于此制劑，其能在8小時內(nèi)釋放藥物總量80％以上的現(xiàn)象被認(rèn)為是由于微球型制劑典型的藥物在起始時的突釋，而不是由于生物可降解聚合物對釋放的調(diào)節(jié)。同樣，此制劑釋放量隨聚合物內(nèi)聚丙交酯量的不同而變化。但其原因被認(rèn)為是由于環(huán)胞菌素的形態(tài)，即無定形和晶體，隨聚合物種類不同的而不同，從而導(dǎo)致環(huán)胞菌素溶解度的不同，而并非是由于生物可降解聚合物對環(huán)胞菌素的控釋作用。在實(shí)際中，起始8小時釋放后的試驗(yàn)時間內(nèi)并未觀察到更多的藥物釋放。
因此，盡管上述類型的劑型適用于制備在靶向器官(小腸上端)完成釋放的口服制劑，但并不適用于需要在較長時間段內(nèi)持續(xù)釋放藥物的控釋制劑。并且，很難預(yù)料口服給藥后藥物的長期釋放。環(huán)胞菌素低且不一致的吸收水平是口服給藥時的個體差異造成的，因此人們預(yù)期用口服之外的其他途徑給藥能夠克服上述問題。
目前，可以買到環(huán)胞菌素的注射劑。但由于其中含有可能引起過敏反應(yīng)的聚氧乙烯蓖麻油衍生物作為增溶劑，因而限制其只能應(yīng)用于不能口服給藥的患者。為解決上述問題，第5,527,537號美國專利公開了一種不含聚氧乙烯蓖麻油衍生物的靜注給藥的包含環(huán)胞菌素的藥物組合物。因?yàn)榄h(huán)胞菌素需要長期應(yīng)用，應(yīng)每天都給藥的靜注制劑并非一種口服制劑的良好替代品。
最近，幾名科研人員研制了一種用聚丙交酯或聚(丙交酯—共—乙交酯)制備的可以長時間持續(xù)釋放環(huán)胞菌素的生物可降解微球并報道了他們的成果。據(jù)報道，此環(huán)胞菌素微球在早期體外釋藥迅速，在之后的4周內(nèi)最多緩釋釋藥50％(Int.J.Pharmaceut.99(1993)263-273)。即便使用用于調(diào)節(jié)藥物釋放趨勢通常使用的改變粒徑的方法進(jìn)行調(diào)節(jié)，也只能增加起始的突釋而不能提高藥物的釋放速率。相信是由于環(huán)胞菌素與聚(丙交酯—共—乙交酯)間在釋放后期相互作用的事實(shí)限制了釋放。體外釋放后期幾乎不再釋藥的現(xiàn)象在疏水性藥物及親水性蛋白質(zhì)藥物中常見。考慮到聚合物的生物可降解特性，很難在體內(nèi)完全重現(xiàn)其體外釋放趨勢。無論如何，4周內(nèi)少于50％的釋放速率都顯示需要促進(jìn)其更多的釋放。
T.Urata等研究了通過添加各種脂肪酸酯的方法來改善環(huán)胞菌素的體外釋藥并證實(shí)了通過添加上述物質(zhì)提高體外釋藥的可能性(J.Controlled Release 58(1999)133-141)。他們寫到，親脂性環(huán)胞菌素主要溶解在脂肪酸酯中，將脂肪酸酯分散在聚丙交酯中，溶解的藥物通過脂肪酸酯形成的水通道被釋放。除具有18個碳的硬脂酸乙酯外，所有用于上述研究的脂肪酸酯在室溫下都是液體?？捎捎谟仓嵋阴サ娜埸c(diǎn)為33～35℃，在37℃——同時是人體及體外釋放試驗(yàn)時的溫度——時也會變?yōu)橐后w。也就是說，既然只有溶解在液相中的環(huán)胞菌素可以隨時間釋放，所以只要制劑中的脂肪酸酯占制劑總量的30％或更高，環(huán)胞菌素在其中可充分溶解時就可達(dá)到提高釋放速率的目的。他們用聚丙交酯或聚(丙交酯—共—乙交酯)以溶劑揮發(fā)法制備微球，但其中存在一個問題。當(dāng)所含液相占總量30％或更高時，該液相在制備過程中容易揮發(fā)，從而使得難以確保在重復(fù)試驗(yàn)中每次都能包封所需量的脂肪酸酯。這意味著溶解在脂肪酸酯中的環(huán)胞菌素的包封率可能會受到影響，導(dǎo)致難以得到組成均一的微球。同樣，根據(jù)其機(jī)制，要提高釋放需要相對大量的脂肪酸酯，而這必然成為在生物可降解聚合物微球中包封環(huán)胞菌素的限制因素。根據(jù)研究結(jié)果，實(shí)際可以包封的環(huán)胞菌素的量不足20％?？紤]到環(huán)胞菌素的劑量較大，包封的藥物較少的事實(shí)提示其難以作為緩釋制劑應(yīng)用。應(yīng)用于人類所需的環(huán)胞菌素的日劑量為60mg/60kg到120mg/60kg。假設(shè)藥物含量為20％，則僅以維持一周所需的環(huán)胞菌素微球計(jì)算，所要服用的微球的量為2.1～4.2克。這給應(yīng)用于人體帶來了問題。至于注射給藥，這雖然是一種方便的給藥途徑，但由于上述制劑的劑量太大而不適合以注射劑的形式應(yīng)用。并且，由于含有大量的脂肪酸酯而其藥學(xué)上的可接受性尚未確定，因此不能排除引起局部刺激和壞死等副作用的可能。
因此，本發(fā)明的目的是研制出一種基于新觀念的環(huán)胞菌素制劑，其能夠最小化在口服給藥中由生物利用度不相同和個體差異可能引起的副作用、降低預(yù)監(jiān)測帶來的醫(yī)療支出、提高病人順應(yīng)性和能夠建立可靠的給藥方案。也就是說，本發(fā)明的目的是提供一種可注射的環(huán)胞菌素制劑，特別是能夠通過持續(xù)幾天甚至幾周持續(xù)釋藥從而調(diào)整、維持血藥濃度幾天甚至幾周在有效范圍內(nèi)的含環(huán)胞菌素的緩釋藥物組合物。

發(fā)明內(nèi)容
在此處所用的“環(huán)胞菌素”一詞系指環(huán)胞菌素A及具有相似物理性質(zhì)的環(huán)胞菌素A的類似物。
本發(fā)明涉及一種包含環(huán)胞菌素的緩釋藥物組合物。更具體而言，本發(fā)明涉及一種包含環(huán)胞菌素的緩釋藥物組合物，其基本上包含生物可降解聚合物、包封在該聚合物內(nèi)的環(huán)胞菌素及釋放調(diào)節(jié)劑，其中環(huán)胞菌素及釋放調(diào)節(jié)劑包封于生物可降解聚合物中，且釋放調(diào)節(jié)劑為至少一種選自以下組中的成分親水性釋放調(diào)節(jié)劑、親脂性釋放調(diào)節(jié)劑。
上述生物可降解聚合物、上述環(huán)胞菌素及上述釋放調(diào)節(jié)劑可制備微球或納米球。
本發(fā)明的藥物組合物中，環(huán)胞菌素、生物可降解聚合物及釋放調(diào)節(jié)劑的量各自優(yōu)選為15～70％、25～80％及0.01～20％，更優(yōu)選為25～60％、35～70％及0.1～10％。
應(yīng)用于本發(fā)明組合物中的生物可降解聚合物可以是任何可用于注射或埋植的生物可降解聚合物，優(yōu)選為選自以下組中的羧基酸如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯—共—乙交酯)(PLGA)、聚β-羥基丁酸(PHB)、聚己內(nèi)酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丁酸、聚戊酸及聚丙交酯己內(nèi)酯，及其衍生物、共聚物和混合物。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可通過使用能夠阻止環(huán)胞菌素同生物可降解聚合物之間相互作用但能夠促進(jìn)環(huán)胞菌素從生物可降解聚合物中釋放的釋放調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)環(huán)胞菌素注射后在體內(nèi)的釋放，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明組合物所應(yīng)用的釋放調(diào)節(jié)劑可為至少一種選自以下組中的成分親水性釋放調(diào)節(jié)劑、親脂性釋放調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選地，親水性釋放調(diào)節(jié)劑可同親脂性釋放調(diào)節(jié)劑適當(dāng)?shù)叵嗷ソY(jié)合使用以保證藥物在體內(nèi)以恒定速率持續(xù)釋放。
可應(yīng)用于本發(fā)明的親水性釋放調(diào)節(jié)劑包括如聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、甘油一油酸、脫水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙烯醇、泊洛沙姆、聚乙二醇、甘油棕櫚硬脂酸酯、苯甲酸芐酯、油酸乙酯、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、羥丙基β-環(huán)糊精等。
親水性釋放調(diào)節(jié)劑包括親水性基團(tuán)如羥基、酯、環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷等，而且是藥物學(xué)上可接受的，但不攜帶電荷。它們可以通過在微球內(nèi)部產(chǎn)生適宜的小孔而引發(fā)藥物釋放初期的起始藥物釋放。即，它們并不影響環(huán)胞菌素的溶解度，而是在微球結(jié)構(gòu)中形成適宜的小孔，因此它們并不會導(dǎo)致過度的起始藥物釋放。用于引發(fā)起始釋放的親水性釋放調(diào)節(jié)劑的種類和用量可以根據(jù)所用生物可降解聚合物及親脂性釋放調(diào)節(jié)劑的類型而改變。
可用于本發(fā)明的親脂性釋放調(diào)節(jié)劑包括例如可藥用的天然油如(大)豆油、棉子油、芝麻油、花生油、低芥酸菜籽油、玉米油、椰子油、菜籽油、可可油等。它們可以通過減少據(jù)信為主要的阻止藥物后期釋放的原因即環(huán)胞菌素與生物可降解聚合物之間的相互作用從而使得藥物在后期持續(xù)釋放。這些天然油可在環(huán)胞菌素及生物可降解聚合物間產(chǎn)生緩沖作用，從而阻止疏水性相互作用導(dǎo)致的后期釋放障礙。同樣，它們對人體無害且現(xiàn)在廣泛用于注射劑中。親脂性釋放調(diào)節(jié)劑的種類及用量可以根據(jù)所用的生物可降解聚合物及親水性釋放調(diào)節(jié)劑的種類而改變。
親水性和親脂性釋放調(diào)節(jié)劑可以單獨(dú)或至少兩種結(jié)合使用以有效調(diào)節(jié)包封于生物可降解聚合物內(nèi)的環(huán)胞菌素的釋放。
本發(fā)明組合物可用于注射或埋植給藥。具體而言，注射法包括皮下注射、肌肉注射等。同樣，其可行的劑型實(shí)例中包括了如注射液、注射前需重新分散于注射液中的粉末等的注射用及埋植用劑型。
因此，本發(fā)明組合物可以根據(jù)制備前述實(shí)際應(yīng)用的劑型的要求進(jìn)一步包含賦形劑、穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、等滲調(diào)節(jié)劑等。
本發(fā)明組合物可用冷凍干燥、蒸發(fā)干燥、噴霧干燥、真空干燥等方法制備。本發(fā)明中環(huán)胞菌素微球的生產(chǎn)可為下列方法用通常應(yīng)用的適宜的攪拌器進(jìn)行W/O單乳劑的溶劑揮發(fā)及溶劑萃取或噴霧干燥。制備具有所需釋放控制效果的本發(fā)明組合物，要點(diǎn)在于應(yīng)在相對溫和的條件下短時間內(nèi)生產(chǎn)微球。
本發(fā)明組合物可由環(huán)胞菌素的緩釋而在7～28天內(nèi)維持100～500ng/ml的環(huán)胞菌素血藥濃度。
本發(fā)明組合物在均一地維持有效藥物濃度時無環(huán)胞菌素血藥濃度臨時增高的現(xiàn)象，從而減少了藥物的毒性。此臨時增高現(xiàn)象通常在其他制劑口服后隨之出現(xiàn)。同樣由于本發(fā)明組合物無吸收率個體差異，從而使得血藥濃度的預(yù)測成為可能。因此，有可能可以省略不必要的為確定環(huán)胞菌素制劑劑量的藥物管理程序及用以治療藥物監(jiān)測(TDM)的血藥濃度分析。并且，由于本組合物可以幾天甚至幾周內(nèi)恒速釋放藥物，可預(yù)期其能夠減少每天服藥的不便從而提高病人對治療的順應(yīng)性。
環(huán)胞菌素釋放度試驗(yàn)發(fā)明人證實(shí)，在環(huán)胞菌素微球制劑體外釋放試驗(yàn)中，當(dāng)釋放介質(zhì)的組成改變時，其體外釋放趨勢也隨之改變。根據(jù)此結(jié)果，考慮到本發(fā)明目標(biāo)劑型并非用于口服(而用于注射或埋植)，可以預(yù)計(jì)由傳統(tǒng)方法得到的體外釋放趨勢可能并不反映本發(fā)明劑型的體內(nèi)釋放趨勢。因此，發(fā)明人建立了適用于本發(fā)明組合物的體外釋放試驗(yàn)條件，通過對體外釋放趨勢的分析篩選了候選組合物并將其應(yīng)用于大鼠，并在血藥濃度分析結(jié)果的基礎(chǔ)上完成本發(fā)明。
在篩選不同釋放介質(zhì)以確定最優(yōu)微球體外釋放條件的試驗(yàn)中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)含有聚山梨醇酯80，即吐溫80的釋放介質(zhì)最有效。根據(jù)AAPS PharmSciTech 20012(1)中文章2所報道，當(dāng)吐溫80的濃度提高20倍時，由于吐溫80的膠束化作用環(huán)胞菌素的溶解度增大了60～160倍。因此，可以通過在0.025～0.1％范圍內(nèi)調(diào)整在含有0.01％疊氮化鈉的pH7.5的磷酸鈉緩沖鹽介質(zhì)中吐溫80的濃度來控制微球所包封環(huán)胞菌素的溶解度，進(jìn)而調(diào)節(jié)其體外釋放趨勢。將10mg包封了環(huán)胞菌素并由凍干制得的微球分散于含有0.1％(W/V)吐溫80和0.01％疊氮化鈉的pH7.5的磷酸鈉緩沖鹽溶液中，然后用于體外釋放試驗(yàn)。用于測定釋放量的試管垂直或平行于震動方向置于定向震動著的37℃水浴中。在釋放試驗(yàn)的裝置中觀察到試管垂直或平行于震動的方向放置導(dǎo)致環(huán)胞菌素釋放曲線的不同。特別地，當(dāng)試管平行于震動方向置于水浴中時，由于介質(zhì)迅速移動微球并不沉降而是依然以獨(dú)立的粒子形式存在。因此，水通道可以相對迅速地形成，微球中包封的環(huán)胞菌素可由疏水性微球的水通道中迅速溶出。另一方面，當(dāng)試管垂直于震動方向置于水浴中時，微球的重量導(dǎo)致微球由于重力作用沉降并凝聚。環(huán)胞菌素的釋放緩慢，相信這是由于凝聚的微球沉在試管底部，因此微球內(nèi)部難以形成水通道。并且，相信還是由于環(huán)胞菌素需要從這樣的凝聚物中釋放所導(dǎo)致的。
本發(fā)明中，為預(yù)測環(huán)胞菌素體內(nèi)釋放趨勢，通過在0.025～0.1％范圍內(nèi)改變體外釋放介質(zhì)中的吐溫80的濃度，建立了模擬微球在給藥后的體內(nèi)環(huán)境的系統(tǒng)，并應(yīng)用于本研究。


讀完下面結(jié)合附圖所作的詳細(xì)敘述，本發(fā)明所要達(dá)到的上述目的及其他特征和優(yōu)點(diǎn)將更加明顯。其中圖1為實(shí)施例5所制備微球的掃描電鏡圖；圖2顯示了體外釋放試驗(yàn)中環(huán)胞菌素從對照例1(◆)及實(shí)施例1(△)、2(▲)、3(●)、4(□)和5(■)所制備微球中釋放的結(jié)果。<p>實(shí)施例7向噴霧溶液加入SAR誘導(dǎo)劑Actigard(BTH)增加煙草上植物對抗對草快除草劑損害的安全性(表8)。在兩個測試BTH比率均觀察到所述效果，并且該效果在整個實(shí)驗(yàn)過程中一直保持。

實(shí)施例8向噴霧溶液加入SAR誘導(dǎo)劑Messenger(Harpin)增加煙草上植物對抗對草快除草劑損害的安全性(表9)。在兩個測試Harpin比率均觀察到所述效果，并且該效果在整個實(shí)驗(yàn)過程中一直保持。該表證明所觀察到的影響不限于水楊酸鹽合成模擬物BTH。Pure Chemical Industry，Japan。
將直徑45mm、高30mm的槳葉固定于直徑70mm、高105mm的圓柱體容器底部，該容器在圓柱側(cè)壁表面每隔120度有一厚10mm隔板的圓柱體容器底部，由此設(shè)計(jì)出一種攪拌裝置并用于微球的制備。
環(huán)胞菌素、聚(丙交酯—共—乙交酯)、泊洛沙姆188及芝麻油各自按照表1所示稱定，加入適宜尺寸的有蓋容器中。4ml二氯甲烷加入容器中，將容器密封，然后攪拌至內(nèi)容物全部溶解形成油性溶液(溶液1)。將150ml含0.3％乙烯醇和0.3％吐溫80的水性溶液(溶液2)加入到容器中制備微球，接著將溶液1在1000rpm攪拌下加入到溶液2中，繼續(xù)1000rpm攪拌30分鐘至形成O/W乳液。所得乳液繼續(xù)在300rpm下攪拌1小時以固化微球。經(jīng)固化的微球通過0.22微米醋酸纖維素膜過濾分離，用蒸餾水洗滌3次，冷凍干燥24小時。至此，完成了對照例1和實(shí)施例1-5的制備。上述所有步驟都在凈化臺上操作，并保持盡可能高的無菌度。
實(shí)施例6-10和對照例2以PLGA 5015為生物可降解聚合物制備微球——超聲法這些例子中所使用的溶液1及溶液2與實(shí)施例1-5中所使用的相同。將溶液1加入到溶液2中。所得混懸液立刻以70mW功率超聲3分鐘，接著用磁力攪拌器在700rpm下攪拌2小時以固化微球。固化的微球通過0.22微米醋酸纖維素膜過濾分離，用蒸餾水洗滌3次，冷凍干燥24小時。上述所有步驟都在凈化臺上操作，并保持盡可能高的無菌度。
試驗(yàn)例1微球的掃描電鏡觀察圖1顯示了實(shí)施例5所制備微球的掃描電鏡圖。這證明了即使加入20％釋放調(diào)節(jié)劑后，粒徑小于30微米的均一微球仍可方便地通過本發(fā)明的方法制備。
試驗(yàn)例2環(huán)胞菌素在微球中的包封率本例中，發(fā)明人利用了甲醇的物理化學(xué)性質(zhì)，即它可以很好地溶解環(huán)胞菌素同時卻不能溶解環(huán)胞菌素的生物可降解聚合物載體如聚(丙交酯—共—乙交酯)、聚丙交酯等。該方法可以方便地、準(zhǔn)確地測定高環(huán)胞菌素包封量的微球中所包封的環(huán)胞菌素的量，是一種有效的方法。
將10mg含高比例環(huán)胞菌素(30～60％)的微球分散于50ml甲醇中。將此分散液超聲一小時使被包封的環(huán)胞菌素得以迅速、完全的提取。用反相高壓液相色譜在215nm檢測波長下分析甲醇中所提取的環(huán)胞菌素。同樣，為證實(shí)包封于微球中的環(huán)胞菌素被完全提取，將變?yōu)槟z的生物可降解聚合物用核磁共振色譜法測定。
對照例1和實(shí)施例1-5所制備微球中環(huán)胞菌素的包封率如表2所示。結(jié)果顯示在對照例1和實(shí)施例1-5中，至少95％環(huán)胞菌素被完全包封于微球中。包封率以如下方程計(jì)算(n＝3)包封率(％)＝(10mg微球中的環(huán)胞菌素含量/4mg)×100(4mg環(huán)胞菌素的理論載藥量)表2 微球的包封率

試驗(yàn)例3環(huán)胞菌素微球的體外釋放度試驗(yàn)將10mg冷凍干燥所得的環(huán)胞菌素微球分散于含有0.025～0.1％(W/V)吐溫80和0.01％疊氮化鈉的pH7.5的磷酸鈉緩沖溶液中，然后用于體外釋放試驗(yàn)。用于測定釋放量的試管與震動方向成直角置于定向震動著的37℃水浴中。
為測定環(huán)胞菌素的釋放量，將試管在3000rpm速度下間隔固定時間離心15分鐘，取上清液50ml，迅速向試管中加入等量新鮮介質(zhì)。利用從上清液中得到的釋放介質(zhì)，通過反相高效液相色譜法測定環(huán)胞菌素釋放量及穩(wěn)定性，其中紫外檢測器波長為215nm。反相高效液相色譜系統(tǒng)如下所述Waters 510HPLC泵系統(tǒng)，連接Waters 484紫外監(jiān)測器，柱溫保持在70℃，流動相為乙腈與水的混合溶液(80∶20)。所用色譜柱為Phenomenex Column-Luna，RP-18(4.6×250mm，粒徑5微米，美國)。
查看圖2a與圖2b所示的體外藥物釋放曲線，在吐溫濃度為0.025％條件下，試驗(yàn)的第三天時，含有釋放調(diào)節(jié)劑的實(shí)施例1-5的組合物比不含釋放調(diào)節(jié)劑的對照例1的組合物環(huán)胞菌素釋放量有15％的差異?？墒遣⑽疵鞔_顯示由于釋放調(diào)節(jié)劑含量不同而導(dǎo)致的釋放趨勢的差異。并且，在第三天后再也不曾觀察到環(huán)胞菌素釋放量的提高。另一方面，當(dāng)吐溫80的濃度增高到0.05％時，在第三天時可觀察到由于釋放調(diào)節(jié)劑含量不同而導(dǎo)致的釋放趨勢差異最大達(dá)到40％。本發(fā)明中，選擇吐溫80濃度為0.05％作為體外釋放介質(zhì)應(yīng)用于處方的篩選。
試驗(yàn)例4環(huán)胞菌素微球的體內(nèi)釋放試驗(yàn)在體內(nèi)藥物釋放試驗(yàn)中，向200g雄性Spraque-Dawley大鼠皮下注射37.5mg/kg懸浮于注射用溶劑中的環(huán)胞菌素微球。該注射用溶劑為含有0.9氯化鈉及0.1％吐溫20的1.5％羧甲基纖維素鈉的注射用蒸餾水溶液。氯化鈉用于使注射液等滲以減輕注射部位的疼痛。羧甲基纖維素鈉用作增稠劑，維持注射液的粘度在200-400cps以使微球可有效懸浮于注射液中，從而在注射過程中維持注射液為均一混懸狀態(tài)，使得微球可在注射后滯留于注射部位附近?？蓱?yīng)用任何可用于注射的、無毒的增稠劑，但必須保證所得注射液在上述粘度范圍內(nèi)。該注射用溶液在應(yīng)用前滅菌。應(yīng)用前將環(huán)胞菌素微球以50mg/ml濃度混懸，然后按照根據(jù)大鼠體重計(jì)算的劑量對大鼠注射。此處應(yīng)用22號針頭。白鼠血液中環(huán)胞菌素的的濃度用單克隆全血分析法(TDx系統(tǒng)，Abbott Lab.，USA)與熒光偏振免疫分析法(FPIA)對全血進(jìn)行分析可得。
給藥含環(huán)胞菌素的微球后，結(jié)果顯示由于釋放調(diào)節(jié)劑的用量不同，環(huán)胞菌素的血藥濃度也有相當(dāng)大的不同(圖3)。不含釋放調(diào)節(jié)劑的一組血藥濃度維持在100ng/ml左右，低于有效血藥濃度(對照例1◆)。另一方面，含有釋放調(diào)節(jié)劑的實(shí)施例3(●)和5(■)顯示出基本上維持了高得多的血藥濃度。
此外還觀察到在含有泊洛沙姆188和芝麻油各10％為釋放調(diào)節(jié)劑的實(shí)施例5具有最高的血藥濃度，為500ng/ml或更高；而釋放調(diào)節(jié)劑含量調(diào)整到2％的實(shí)施例3(RP2S2)則維持有效且恒定的血藥濃度在150ng～350ng/ml。這些結(jié)果提示，血藥濃度可由釋放調(diào)節(jié)劑的含量進(jìn)行調(diào)節(jié)。釋放調(diào)節(jié)劑的種類及用量可根據(jù)所用生物可降解聚合物的種類及環(huán)胞菌素的含量而改變。
工業(yè)應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明所制備的高濃度環(huán)胞菌素緩釋微球可在幾天甚至幾周內(nèi)將所有包封于微球內(nèi)的環(huán)胞菌素以恒定速率釋放，同時維持環(huán)胞菌素制劑所需的治療有效濃度，并且有可能減少由于口服生物利用度差異可能帶來的副作用，從而降低預(yù)監(jiān)測帶來的醫(yī)療費(fèi)用，提高病人對治療的順應(yīng)性。
權(quán)利要求
1.一種包含環(huán)胞菌素的緩釋藥物組合物，其含有生物可降解聚合物、包封在該聚合物中的環(huán)胞菌素和釋放調(diào)節(jié)劑，其中環(huán)胞菌素和釋放調(diào)節(jié)劑包封于上述生物可降解聚合物中且上述釋放調(diào)節(jié)劑包含至少一種選自以下組中的成分親水性釋放調(diào)節(jié)劑、親脂性釋放調(diào)節(jié)劑。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述生物可降解聚合物、所述環(huán)胞菌素和所述釋放調(diào)節(jié)劑構(gòu)成微球或納米球。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中環(huán)胞菌素、生物可降解聚合物和釋放調(diào)節(jié)劑的含量各自為15～70％、25～80％和0.01～20％。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中環(huán)胞菌素、生物可降解聚合物和釋放調(diào)節(jié)劑的含量各自為25～60％、35～70％和0.1～10％。
5.如權(quán)利要求1所述組合物，其中生物可降解聚合物選自含有下類聚合物的組中聚丙交酯和聚乙交酯；聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚β-羥基丁酸、聚己內(nèi)酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丁酸、聚戊酸及聚丙交酯己內(nèi)酯，及其衍生物、共聚物和混合物。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中親水性釋放調(diào)節(jié)劑為至少一種選自以下組中的成分聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、甘油一油酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙烯醇、泊洛沙姆、聚乙二醇、甘油棕櫚硬脂酸酯、苯甲酸芐酯、油酸乙酯、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、羥丙基β-環(huán)糊精。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中親脂性釋放調(diào)節(jié)劑為至少一種選自以下組中的成分豆油、棉子油、芝麻油、花生油、低芥酸菜籽油、玉米油、椰子油、菜籽油和可可油。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中該組合物為注射制劑。
9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中該組合物為埋植制劑。
10.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物在7到28天內(nèi)維持血液中環(huán)胞菌素濃度在100～500ng/ml以達(dá)到緩釋效果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種環(huán)胞菌素緩釋藥物組合物。具體而言，本發(fā)明設(shè)計(jì)基本上含有生物可降解聚合物、包封在該聚合物中的環(huán)胞菌素及釋放調(diào)節(jié)劑的含環(huán)胞菌素的緩釋藥物組合物，其中環(huán)胞菌素與釋放調(diào)節(jié)劑包封于生物可降解聚合物中，并且釋放調(diào)節(jié)劑為至少一種選自以下組中的成分親水性釋放調(diào)節(jié)劑、親脂性釋放調(diào)節(jié)劑。
文檔編號A61K47/40GK1625391SQ03803163
公開日2005年6月8日 申請日期2003年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月1日
發(fā)明者楊貞華, 樸咸龍, 林東佑, 金正鑄 申請人:株式會社太平洋