專利名稱：一種用于治療皮膚缺損的可移植性產(chǎn)品的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種治療皮膚缺損的可移植性產(chǎn)品的制備方法，其產(chǎn)品為皮膚替代物，含有來源于胎膜的生物支架膜和皮膚活細(xì)胞。本發(fā)明要求6/16/03提交的臨時(shí)申請US60/478,427的權(quán)益。
背景技術(shù)：
術(shù)語皮膚替代物(skin equivalent graft)是在特定的環(huán)境或?qū)嶒?yàn)室中，將表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞按一定比例種植在鋪有膠原蛋白的載體膜上培養(yǎng)，構(gòu)成一皮膚類似結(jié)構(gòu)的替代物。
組織培養(yǎng)支架(tissue culture insert)制造一個(gè)具有三維結(jié)構(gòu)的支架，人為地將組織細(xì)胞種植在支架的不同層面上，使得細(xì)胞能夠得到充分營養(yǎng)供應(yīng)和形成具有三維構(gòu)象的組織替代物。
胎膜(extraembryonic membrane)由羊膜和絨毛膜組成。絨毛膜指的是胎膜的外層，其外表面與母體蛻膜接觸。羊膜指的是胎膜的內(nèi)層，包括羊膜上皮和基底層，羊膜可以輕易地從絨毛膜上剝離得到。(R.N.Matthews et al.Obstet Gynaecol Annu.1982，1131-58.)。
外根鞘(ORS)細(xì)胞來源于人體毛囊外根鞘部位。ORS細(xì)胞通過擴(kuò)增可不斷生成表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，這樣就可以避免采用手術(shù)或吸泡方式獲取皮膚或粘膜角質(zhì)形成細(xì)胞。而且，ORS細(xì)胞可來自患者自身并通過體外細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生患者自身的角質(zhì)形成細(xì)胞(M.A.Pham et al.J Invest Dermatol.1990，94(6)749-52.；A.Limat et al.Cell Tissue Res.1994，275(1)169-76.)。
表皮細(xì)胞來自于人體皮膚最外層的表皮層，至少含有兩種細(xì)胞類型，大多數(shù)細(xì)胞屬于角質(zhì)細(xì)胞，少數(shù)細(xì)胞屬于黑素細(xì)胞。
真皮細(xì)胞來自于表皮下的真皮層，真皮細(xì)胞的主要類型是成纖維細(xì)胞。
美國專利4,304,866公開了一種可移植的具有生物活性的角質(zhì)組織膜。美國專利4,485,096公開了一種組織替代物及其制備方法。美國專利5,106,949公開了一種膠原蛋白組分及其制造方法。美國專利5,536,656公開了一種通過成層膠原蛋白膠狀膜來構(gòu)建皮膚替代物。美國專利6,326,019公開了一種由羊膜制成的移植物，及其分離、保存的方法，并在外科手術(shù)中得到應(yīng)用。
從解剖學(xué)和功能學(xué)上來講，皮膚可分為表皮層和真皮層。表面的表皮層是抵抗感染和防止水分流失的屏障，表皮細(xì)胞多數(shù)屬于角質(zhì)細(xì)胞，表皮干細(xì)胞位于基底層，通過不斷增殖、分化，由里向外依次形成短暫擴(kuò)充細(xì)胞，即角質(zhì)形成細(xì)胞，和有絲分裂期后分化細(xì)胞，以及角質(zhì)化細(xì)胞(E.Christophers，J Invest Dermatol 1971，56165-169.；J.R.Bickenbach et al.Cell Tissue Kinet 1986，19325-333.)。表皮干細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮細(xì)胞增殖源。干細(xì)胞終生具有不斷增殖和自我更新的能力。(L.G..Lajtha Differentiation.1979，1423-34.；F.M.Watt.Curr OpinGenet Dev 2001，11(4)410-7.；G.Cotsarelis et al.Exp Dermatol，1999，880-88.)。位于深層的真皮層使皮膚具有彈性，并保持其結(jié)構(gòu)的完整，并且真皮內(nèi)還有為表皮層提供營養(yǎng)的血管。毛囊、汗腺等附屬器跨越真皮層和表皮層。皮膚感覺神經(jīng)通過真皮組織進(jìn)入表皮層。表皮的再生主要是位于基底層的表皮干細(xì)胞不斷增殖分化的結(jié)果。在創(chuàng)傷恢復(fù)過程中，新生成的表皮組織從創(chuàng)傷的邊緣開始生長，如果傷口寬度超過幾厘米時(shí)創(chuàng)面就不能夠充分愈合。這時(shí)就需要利用皮膚替代物來幫助傷口愈合。
創(chuàng)面覆蓋需要一種可以恢復(fù)表皮屏障功能的材料，并在修復(fù)過程中能與創(chuàng)面融合為一體的材料(R.G.Tompkins et al.Alternative Wound Coverings.In Herndon D，ed.Total Burn Care，1sted.PhiladelphiaW.B.Saunders Company Ltd，1996164_72.)。創(chuàng)面修復(fù)分為暫時(shí)性修復(fù)和永久性修復(fù)兩類。暫時(shí)性修復(fù)可以通過同種異體移植和異種移植來實(shí)現(xiàn)。人羊膜和其它多種人造生物膜作為暫時(shí)性創(chuàng)面覆蓋物(I.Jones et al.British Journal of Plastic Surgery.2002，55185-193.)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床，用于治療皮膚損傷。暫時(shí)性創(chuàng)面覆蓋物用于淺表性燒傷效果最佳。雖然它可以形成抵抗感染和控制水分流失的屏障，從而為表皮再生提供有利的生長環(huán)境，但在皮膚永久性移植方面卻沒有什么作用。這種利用人羊膜作為暫時(shí)性創(chuàng)面覆蓋物的方法早在1910年就已經(jīng)有了記載，之后Matthews等在1982年就此作了回顧性綜述。在皮膚缺損修復(fù)過程中，將表皮細(xì)胞移種到創(chuàng)傷區(qū)域，所移種的表皮細(xì)胞可以不斷產(chǎn)生新細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)永久性創(chuàng)面愈合。為了達(dá)到這一目的，皮膚替代物便由此而產(chǎn)生。目前臨床所使用的皮膚替代物是在人工膜上載有來源于同種異體皮膚的表皮細(xì)胞，但同種異體細(xì)胞對皮膚損傷往往沒有永久性修復(fù)的功能；同時(shí)，目前人工皮的供應(yīng)有限，臨床需要支付很高的治療費(fèi)用。另外，目前市場上還沒有用于修復(fù)皮膚缺損和損傷的真正的皮膚替代物。
人羊膜來自胎膜，由單層立方形羊膜細(xì)胞附著在富含膠原蛋白的基底膜上所形成的內(nèi)羊膜和疏松地附著在絨毛膜上的外層結(jié)締組織構(gòu)成。它可以分為三層單層的上皮層、較厚的基底膜、和無血管的結(jié)締組織層(R.N.Matthews et al.Obstet GynaecolAnnu.1982，1131-58.)。研究發(fā)現(xiàn)人羊膜含有III型和V型膠原蛋白。它還含有類似角膜上皮基底膜的IV型和VII型膠原蛋白，以及纖維結(jié)合蛋白和層粘蛋白。另外，它還含有成纖維細(xì)胞，在冷凍保存的羊膜中還發(fā)現(xiàn)了其它種類的生長因子(S.C.G.Tseng，et al.Medical and Surgical Management Ed.E.J.Holland et al.in press，2001.)。研究發(fā)現(xiàn)，羊膜有助于上皮的形成、正常表皮型的維持，并且可以防止感染、抑制疤痕形成、促進(jìn)血管形成和組織的附著。另外，人們還認(rèn)為羊膜具有非免疫原性。有關(guān)羊膜抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)未見報(bào)道，這表明羊膜具有較低的免疫原性。因而，羊膜移植中不需要使用全身性免疫抑制劑。絨毛膜的表面由滋養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)成。其表面和母體蛻膜融合在一起。在滋養(yǎng)層之下有假基底層和“結(jié)締組織”層。
本發(fā)明設(shè)計(jì)一種方法，來制備一種利用胎膜進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的支架。從而可以將同種異體或自體的表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞移種在支架固定的胎膜上，構(gòu)建與人體皮膚組織學(xué)構(gòu)造相似，而且可以永久性修復(fù)皮膚缺損的皮膚替代物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種可以用作修復(fù)皮膚缺損的皮膚替代物的制備方法。
本發(fā)明提供一種特殊支架的制作方法，支架是由母環(huán)、插環(huán)和固定在其上的胎膜三部分構(gòu)成，主要用于皮膚替代物的構(gòu)建。
本發(fā)明提供一種載有同種異體皮膚細(xì)胞與胎膜構(gòu)建異體皮膚替代物的制備方法。
本發(fā)明提供一種利用載有自體同源表皮細(xì)胞或毛囊細(xì)胞與胎膜構(gòu)建自體皮膚替代物的制備方法。
本發(fā)明提供一種根據(jù)人體皮膚組織學(xué)結(jié)構(gòu)構(gòu)建皮膚替代物的制備方法。
本發(fā)明提供一種制備胎膜并將其用于皮膚替代物構(gòu)建的制備方法。
本發(fā)明提供一種制備表皮細(xì)胞并用于皮膚替代物構(gòu)建的方法。
本發(fā)明提供一種獲得真皮細(xì)胞并用于皮膚替代物構(gòu)建的方法。
本發(fā)明提供一種利用患者自體毛囊獲得ORS細(xì)胞，用于自體皮膚替代物構(gòu)建的方法。
本發(fā)明提供一種制備、儲藏和運(yùn)輸皮膚和毛囊標(biāo)本的方法，用于皮膚替代物構(gòu)建時(shí)所需種子細(xì)胞的方法。
本發(fā)明提供一種制備、儲藏和運(yùn)輸用于皮膚替代物構(gòu)建所需胎膜的方法。
本發(fā)明提供一種制備、儲藏皮膚替代物的方法。
本發(fā)明提供一種特殊培養(yǎng)液的配制方法，用于刺激皮膚替代物中的角質(zhì)細(xì)胞增殖，減緩角質(zhì)細(xì)胞分化。
本發(fā)明提供一種檢測皮膚替代物中角質(zhì)形成細(xì)胞的方法，角質(zhì)形成細(xì)胞對于皮膚缺損修復(fù)起著至關(guān)重要的作用。
本發(fā)明提供一種利用表皮細(xì)胞生長因子促進(jìn)表皮細(xì)胞在皮膚創(chuàng)面不斷增殖的方法。
本發(fā)明的其它目的可以通過附圖和實(shí)施例詳細(xì)描述看出。


圖1載體膜的組織結(jié)構(gòu)圖，其中A)所示為胎膜的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，它可以從“分界層”分為羊膜和絨毛膜兩部分；B)所示為羊膜的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，它含有表皮細(xì)胞層(1)、基底膜(2)、致密層(3)、成纖維細(xì)胞層(4)、以及部分海綿層(5)；和C)所示為絨毛膜的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，它含有部分海綿層(5)、細(xì)胞層(6)、網(wǎng)狀層(7)、假基底膜(8)、滋養(yǎng)層(9)和母體蛻膜(10)。
圖2載體膜的制備圖，其中A)和B)所示為羊膜的去上皮層的方法；和C)和D)所示為絨毛膜的去滋養(yǎng)層方法。
圖3所示為構(gòu)建皮膚替代物所用支架的制備，其中A、B、C代表的是該支架的基本組件，包括母環(huán)(A)，插環(huán)(C)和載體膜(B)；D所示為便于培養(yǎng)液進(jìn)出的小孔；E和F所示為兩個(gè)培養(yǎng)室，支架組裝后分別為A培養(yǎng)室和B培養(yǎng)室，G代表的是從支架上剪下的多余的膜。
圖4所示為利用支架構(gòu)建皮膚替代物；其中A)所示為一組裝好的支架，含有一個(gè)母環(huán)、一個(gè)插環(huán)和一張載體膜；B)、C)和D)所示為在A培養(yǎng)室中培養(yǎng)的真皮細(xì)胞B與表皮細(xì)胞C；D)所示在B培養(yǎng)室培養(yǎng)的真皮細(xì)胞；和E)所示為支架上已經(jīng)構(gòu)建好的皮膚替代物。
圖5所示為從支架上取下的構(gòu)建好的皮膚替代物；其中A)所示為仍在支架上的皮膚替代物，B)所示為從支架上取下的皮膚替代物；和C)所示在400倍相差顯微鏡下觀察到的已構(gòu)建好的皮膚替代物。構(gòu)建好的皮膚替代物包括表皮層(1)、載體膜(2)和真皮細(xì)胞層(3)。
圖6所示為載體膜和飼養(yǎng)細(xì)胞的顯微形態(tài)；其中A)所示人羊膜的表皮層(EP)(150×)和去表皮層后的羊膜(BM)；B)所示人絨毛膜的滋養(yǎng)層(TB)(150×)和去滋養(yǎng)層后的絨毛膜(150×)；C)和D)所示飼養(yǎng)細(xì)胞即3T3細(xì)胞C和大鼠胚胎成纖維細(xì)胞D的形態(tài)(225×)。
圖7所示為人毛囊的一部分(100×)，它是自體皮膚替代物的角質(zhì)形成細(xì)胞源。人毛囊分為毛干(HS)、外根鞘(ORS)和內(nèi)根鞘(IRS)。
圖8所示體外培養(yǎng)擴(kuò)增的人毛囊細(xì)胞；其中A)、B)和C)所示(400×)培養(yǎng)皿中飼養(yǎng)層細(xì)胞上的ORS細(xì)胞(A)、貼壁(B)和伸展生長(C)；D)所示(225×)外根鞘細(xì)胞不斷增殖分化，所形成的角質(zhì)細(xì)胞克隆。
圖9所示體外擴(kuò)增培養(yǎng)的人表皮細(xì)胞。其中A)、B)和C)所示(225×)為生長在飼養(yǎng)層上的表皮細(xì)胞(A)(400×)以及貼壁(B)和伸展生長(C)；D)所示(225×)去除成纖維細(xì)胞后的純表皮細(xì)胞。
圖10所示為利用載體膜構(gòu)建皮膚替代物。其中A)所示(225×)去除表皮層后的裸露羊膜；B)所示(225×)生長有真皮細(xì)胞的羊膜；C)所示(225×)生長有真皮細(xì)胞的絨毛膜；和D)所示(225×)生長有表皮細(xì)胞的羊膜。
圖11所示為皮膚替代物；其中A)所示(225×)經(jīng)胰酶-EDTA消化后的載體膜上的表皮細(xì)胞；B所示(225×)在移種皮膚細(xì)胞前人為在羊膜上造成一孔洞修復(fù)后的狀態(tài)；C)所示從支架上取下的一張皮膚替代物(約8cm.sup.2)；和D)所示為一張構(gòu)建好的皮膚替代物(約80cm.sup.2)。
圖12所示為從皮膚替代物上消化得到的表皮細(xì)胞特征；其中A所示(225×)從皮膚替代物上消化得到的表皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)；B)所示(945×)從皮膚替代物上消化得到的角質(zhì)蛋白19呈陽性的表皮細(xì)胞；C所示(945×)從皮膚替代物上消化得到的整合素β-1呈陽性的表皮細(xì)胞；D)所示為從皮膚替代物上消化得到的表皮細(xì)胞正常核型。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明所述，皮膚替代物由三層基本結(jié)構(gòu)構(gòu)成，其中包括由角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)成的表皮層；由成纖維細(xì)胞構(gòu)成的真皮層；和由來源于胎膜的載體膜。角質(zhì)形成細(xì)胞可以通過同種異體或自體皮膚或毛囊獲得。
皮膚替代物中的角質(zhì)細(xì)胞由三類基本細(xì)胞組成，干細(xì)胞、短暫擴(kuò)充細(xì)胞和有絲分裂期后細(xì)胞。干細(xì)胞和短暫擴(kuò)充細(xì)胞是表皮細(xì)胞的增殖源。干細(xì)胞終生具有不斷增殖和自我更新的能力。通過本發(fā)明的方法可以檢測到干細(xì)胞群，這可以作為皮膚替代物的質(zhì)量監(jiān)控指標(biāo)。
為生產(chǎn)此移植物特別設(shè)計(jì)了一種新型的細(xì)胞培養(yǎng)支架，這種支架可以根據(jù)需要進(jìn)行組裝和拆卸。應(yīng)用此支架可以固定如胎膜等載體膜?？梢允馆d體膜的兩個(gè)面分別暴露于兩個(gè)不同的培養(yǎng)室中。兩個(gè)面上都可以移種細(xì)胞。
本發(fā)明中的方法已經(jīng)被應(yīng)用于皮膚替代物的制備，組織工程構(gòu)建好的皮膚替代物具有與正常人體皮膚類似的結(jié)構(gòu)。在不同的培養(yǎng)階段于支架的不同培養(yǎng)室移種不同的細(xì)胞，從而形成了該移植物不同層次的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明中的這種新型細(xì)胞培養(yǎng)支架是為生產(chǎn)皮膚替代物而特別設(shè)計(jì)的。此支架由三部分組成，包括一套可以自由組裝拆卸的母環(huán)、插環(huán)，和一張載體膜。一個(gè)完整的支架有兩個(gè)培養(yǎng)室，中間由載體膜隔開。載體膜的兩個(gè)面直接暴露在兩個(gè)培養(yǎng)室中。然后將細(xì)胞移種到不同培養(yǎng)室的載體膜上進(jìn)行培養(yǎng)。
I、通過附圖將制備皮膚替代物基本工藝的簡要說明生物載體膜的制備圖1說明了載體膜的組織結(jié)構(gòu)，其中A)所示為胎膜的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，它可以從“分界層”分為羊膜和絨毛膜兩部分。B)所示為羊膜的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，它含有表皮細(xì)胞層(1)、基底膜(2)、致密層(3)、成纖維細(xì)胞層(4)、以及部分海綿層(5)。C)所示為絨毛膜的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，它含有部分海綿層(5)、細(xì)胞層(6)、網(wǎng)狀層(7)、假基底膜(8)、滋養(yǎng)層(9)和母體蛻膜(10)。
圖2所示為載體膜的制備，其中A)和B)所示為羊膜去上皮層的方法，C)和D)所示為絨毛膜去滋養(yǎng)層方法。
特殊組織培養(yǎng)支架的制備和皮膚替代物的構(gòu)建圖3所示構(gòu)建皮膚替代物所用支架的制備，其中A、B、C代表的是該支架的基本組件，包括母環(huán)(A)，插環(huán)(C)和載體膜(B)；D所示為便于培養(yǎng)液進(jìn)出的小孔；E和F所示為兩個(gè)培養(yǎng)室，支架組裝后分別為A培養(yǎng)室和B培養(yǎng)室；G代表的是從支架上剪下的多余的膜。
圖4所示為利用支架構(gòu)建皮膚替代物；其中A)所示為一組裝好的支架，含有一個(gè)母環(huán)、一個(gè)插環(huán)和一張載體膜；B)、C)和D)所示為在A培養(yǎng)室中培養(yǎng)的真皮細(xì)胞B與表皮細(xì)胞C；D)所示在B培養(yǎng)室培養(yǎng)的真皮細(xì)胞；E)所示為支架上已經(jīng)構(gòu)建好的皮膚替代物。
圖5所示為從支架上取下的構(gòu)建好的皮膚替代物；其中A)所示為仍在支架上的皮膚替代物，B)所示為從支架上取下的皮膚替代物；C)所示在400倍相差顯微鏡下觀察到的已構(gòu)建好的皮膚替代物。構(gòu)建好的皮膚替代物包括表皮層(1)、載體膜(2)’和真皮細(xì)胞層(3)。
載體膜和飼養(yǎng)細(xì)胞的制備圖6所示為載體膜和飼養(yǎng)細(xì)胞的顯微形態(tài)；其中A)所示人羊膜的表皮層(EP)(150×)和去表皮層后的羊膜(BM)；B)所示人絨毛膜的滋養(yǎng)層(TB)(150×)和去滋養(yǎng)層后的絨毛膜(150×)；C)和D)所示飼養(yǎng)細(xì)胞、3T3細(xì)胞(C)和大鼠胚胎成纖維細(xì)胞(D)的形態(tài)(225×)。
種子細(xì)胞的獲得及其質(zhì)量控制圖7所示為人毛囊的一部分(100×)，它是自體皮膚替代物的角質(zhì)形成細(xì)胞源。人毛囊分為毛干(HS)、外根鞘(ORS)和內(nèi)根鞘(IRS)。
圖8所示體外培養(yǎng)擴(kuò)增人毛囊細(xì)胞；其中A)、B)和C)所示(400×)培養(yǎng)皿中飼養(yǎng)層細(xì)胞上的ORS細(xì)胞(A)、貼壁(B)和伸展生長(C)；D)所示(225×)外根鞘細(xì)胞不斷增殖分化，所形成的角質(zhì)細(xì)胞克隆。
圖9所示體外擴(kuò)增培養(yǎng)的人表皮細(xì)胞。其中A)、B)和C)所示(225×)為生長在飼養(yǎng)層上的表皮細(xì)胞(A)以及(400×)貼壁(B)和伸展生長(C)；D)所示(225×)去除成纖維細(xì)胞后的純表皮細(xì)胞。
圖10所示體外利用載體膜構(gòu)建皮膚替代物。其中A)所示(225×)去除表皮層后的裸露羊膜；B)所示(225×)生長有真皮細(xì)胞的羊膜；C)所示(225×)生長有真皮細(xì)胞的絨毛膜；D)所示(225×)生長有表皮細(xì)胞的羊膜。
圖11所示為皮膚替代物；其中A)所示(225×)經(jīng)胰酶-EDTA消化后的載體膜上的表皮細(xì)胞；B所示(225×)在移種皮膚細(xì)胞前人為在羊膜上造成一孔洞修復(fù)后的狀態(tài)；C)所示從支架上取下的一張皮膚替代物(約8cm.sup.2)；D)所示為一張構(gòu)建好的皮膚替代物(約80cm.sup.2)。
圖12所示為從皮膚替代物上消化得到的表皮細(xì)胞特征。其中A所示(225×)從皮膚替代物上消化得到的表皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)；B)所示(945×)從皮膚替代物上消化得到的角質(zhì)蛋白19呈陽性的表皮細(xì)胞；C所示(945×)從皮膚替代物上消化得到的整合素β-1呈陽性的表皮細(xì)胞；D)所示為從皮膚替代物上消化得到的表皮細(xì)胞正常核型。
II、用于皮膚替代物構(gòu)建支架的制備該支架的生產(chǎn)設(shè)計(jì)是基于所使用的細(xì)胞培養(yǎng)皿的結(jié)構(gòu)，以及皮膚替代物組織構(gòu)建的需要，并對本發(fā)明中制備的移植物進(jìn)行“組織”構(gòu)造工程設(shè)計(jì)而獲得的。市場所售的細(xì)胞培養(yǎng)皿根據(jù)直徑的大小可分為35mm、60mm、100mm和150mm等幾種。支架也可以根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)板(6孔、12孔、24孔、48孔)的大小進(jìn)行設(shè)計(jì)和制造。
該支架是為生產(chǎn)含有至少一層活細(xì)胞的可移植物而特殊設(shè)計(jì)的。它包括3個(gè)部分(見圖3)一個(gè)母環(huán)C、一個(gè)插環(huán)A和一張載體膜B。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)孔的大小，可以制造不同大小規(guī)格的支架。母環(huán)可制成5mm到200mm高、直徑5mm到150mm。母環(huán)底壁上留有小孔或V形切口，便于培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液從外部流入支架中的培養(yǎng)室中。
插環(huán)的高度為母環(huán)的一半。插環(huán)一端口頸的寬度為1到2mm粗，可以插入母環(huán)中。插環(huán)的外壁上有縱嵴。組裝后支架的縱嵴與母環(huán)的內(nèi)壁緊密接觸。兩條縱嵴之間以及母環(huán)內(nèi)表面和插環(huán)外表面之間都有狹小的間隙。
母環(huán)的頂端被一張載體膜所覆蓋。然后，用插環(huán)將載體膜插入并固定在母環(huán)上。用眼科剪將多余的載體膜剪去。將載體膜的邊緣伸展，夾在母環(huán)和插環(huán)之間。載體膜將支架分為兩個(gè)培養(yǎng)室，上面的A培養(yǎng)室以載體膜上表面為底以插環(huán)內(nèi)面為壁，下面的B培養(yǎng)室以載體膜的反面為頂以母環(huán)內(nèi)面為壁。
組裝好后完整的支架通過上述三部分構(gòu)成了兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室(A培養(yǎng)室和B培養(yǎng)室)，載體膜的兩個(gè)面分別暴露在A、B培養(yǎng)室中。
III、載體膜——胎膜的制備獲取標(biāo)本為了避免感染血液性傳染病，選擇預(yù)先進(jìn)行HIV-1、HIV-2、HTLV-1、乙肝病毒、丙肝病毒和梅毒檢查，血清反應(yīng)陰性的健康者作為胎膜捐獻(xiàn)者。剖腹產(chǎn)時(shí)所獲得的胎膜最為理想。在生產(chǎn)(正常產(chǎn)或剖腹產(chǎn))時(shí)將胎膜從胎盤上剪下。在無菌生理鹽水中清洗干凈，除去母血、胎便以及其它污染物，然后盡快轉(zhuǎn)移到盛有無菌生理鹽水的無菌塑料袋中，放入冰桶送往實(shí)驗(yàn)室。
膜的保存和運(yùn)輸將胎膜從生理鹽水中取出，瀝干膜上生理鹽水。然后，每張?zhí)ツば栌媒?jīng)過濾除菌的85％的乙醇300mL，固定24到48小時(shí)。除去乙醇，移入300ml無菌生理鹽水中漂洗10分鐘，至少重復(fù)漂洗3次，操作必須在無菌條件下進(jìn)行。將胎膜剪成所需大小，浸泡于裝有凍存液的聚乙烯試管中。凍存液含有50％的甘油(Sigma)和50％的DMEM培養(yǎng)液(ATCC)。本發(fā)明中應(yīng)用的另一種凍存液含有20(5-50)％的DMSO(Sigma)和80％的DMEM培養(yǎng)液，可以將膜保存1年以上。在凍存液中，胎膜可在4℃條件下保存1個(gè)月，或在-20℃條件下保存1年以上。
新鮮使用時(shí)，僅需將裁剪好的胎膜浸泡在添加了250U/ml青霉素、250μg/ml鏈霉素、100μg/ml卡那霉素或50μg/ml慶大霉素、和2.5μg/ml兩性霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于4℃可保存48小時(shí)。
羊膜和絨毛膜的制備將盛有凍存膜的試管放置在4℃條件下過夜。然后在無菌條件下將膜轉(zhuǎn)移到DMEM培養(yǎng)液中，至少洗滌3次，準(zhǔn)備分離羊膜和絨毛膜。
無菌鑷子和眼科剪各兩把。在超凈臺中準(zhǔn)備一火焰燈，用于操作過程中儀器受到污染時(shí)的快速滅菌。
利用兩把鑷子可以輕易將浸在DMEM培養(yǎng)液中的胎膜從海綿層部位分離為羊膜和絨毛膜兩部分(見圖1；分離)。隨后將分離后的羊膜按上述方法固定在支架中。羊膜的上皮層朝向A培養(yǎng)室，結(jié)締組織一面朝向B培養(yǎng)室。將分離后的絨毛膜再次進(jìn)行修剪，除去母體蛻膜，固定到另一個(gè)支架上。滋養(yǎng)層一面朝向A培養(yǎng)室，結(jié)締組織一面朝向B培養(yǎng)室。
利用羊膜制備載體膜如上所述，選擇羊膜作為載體膜，并將其固定到支架上。羊膜的上皮表面朝向A培養(yǎng)室，反面結(jié)締組織面朝向B培養(yǎng)室。支架組裝好后，在37℃條件下，用0.25％胰酶和EDTA(乙二胺四醋酸鹽)(Sigma)消化10到30分鐘，然后用橡膠細(xì)胞刮去羊膜的上皮層。除去附著在羊膜上的細(xì)胞碎片，并用DMEM培養(yǎng)液沖洗干凈。在除去上皮層的操作中，要避免嚴(yán)重?fù)p傷上皮層下的基底膜部分。完成上述操作后就可以進(jìn)行細(xì)胞移種或進(jìn)一步再處理(見圖2中A和B)。
利用絨毛膜制備載體膜分離開的絨毛膜也可以用作載體膜，固定到支架上。制備絨毛膜支架的方法和制備羊膜支架的方法相同。滋養(yǎng)層面朝向A培養(yǎng)室，結(jié)締組織面朝向B培養(yǎng)室。A培養(yǎng)室在37℃條件下，用0.25％的胰酶和EDTA消化10到30分鐘，然后用橡膠刮去滋養(yǎng)層。此時(shí)暴露在A培養(yǎng)室中的是假基底膜，暴露在B培養(yǎng)室中的是結(jié)締組織層。之后就可以在膜上移種和培養(yǎng)皮膚細(xì)胞(見圖2中C和D)。
通過胰酶消化和機(jī)械刮擦除去上皮層或滋養(yǎng)層后，基底膜很容易受到損傷，膜的損傷可以影響到細(xì)胞在載體膜上的粘附和生長。因此需要對膜進(jìn)行進(jìn)一步加工處理。
IV.載體膜的加工處理制備粗制膠原蛋白溶液所用膠原蛋白是大鼠尾腱和小牛跟腱膠原蛋白。但也曾應(yīng)用過其它種類的膠原蛋白，包括人胎兒皮膚膠原蛋白，而其它多種膠原蛋白也可能適用于本發(fā)明需要。制備膠原蛋白溶液并使其保持弱酸性。膠原蛋白的制備方法如下。將冷凍的450g大鼠的尾巴在70％乙醇中解凍20分鐘，在無菌條件下，在70％乙醇中將肌腱束切割開。將單個(gè)的肌腱從肌腱鞘中抽出，切碎，置于0.1M醋酸中，每條尾巴用250ml。將此溶液于4℃下靜置48小時(shí)，切碎的肌腱已經(jīng)膨脹并充滿容器。將此膠粘溶液在Sorvall離心機(jī)上以15krpm的轉(zhuǎn)速離心半小時(shí)。棄上清液，用0.1M氫氧化鈉以4∶1比例混合中和醋酸，此時(shí)膠原蛋白沉淀。將此溶液以3000rpm轉(zhuǎn)速離心15分鐘。棄上清液，加入等體積的新鮮0.01M的醋酸使膠原蛋白重新凝固，4℃保存。溶液中蛋白質(zhì)的含量約為3mg/ml。
細(xì)胞生長培養(yǎng)液的配制在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中添加了多種成分，各添加成分的最終濃度分別為胎牛血清10％、CaCl20.1mM、L-谷氨酸4mM、青霉素100U/mL、鏈霉素硫酸鹽100.umg/mL、兩性霉素B0.25μg/mL、氫化可的松0.4μg/mL、霍亂毒素10-10M、轉(zhuǎn)鐵蛋白5μg/mL、T3 2×10-11M、腺嘌呤1.8×10-4M、胰島素5μg/mL、表皮生長因子10ng/mL。將此溶液濃縮3倍，等分后保存于-80℃冰箱。
基底膜成分補(bǔ)充液基底膜成分補(bǔ)充液含有0.4mg/ml IV型膠原蛋白(Life Technology公司提供)、1.0mg/ml fibronactin(Life Technology公司提供)、1.0mg/ml粘蛋白(LifeTechnology公司提供)。
修復(fù)液修復(fù)載體膜10cm的區(qū)域需要100μL(從20到150μL)修復(fù)液，其中包括40μL膠原蛋白溶液、30μL細(xì)胞生長促進(jìn)液和30μL新鮮制備的基底膜成分補(bǔ)充液。
基底膜的修復(fù)為了增強(qiáng)細(xì)胞在膜上的附著，并促進(jìn)其生長，對膜的兩面按如下方法進(jìn)行修復(fù)和處理。將固定有載體膜的支架用DMEM培養(yǎng)液洗滌兩次。洗完后將支架放入一個(gè)空培養(yǎng)皿中。在37℃無菌條件下，風(fēng)干至少2小時(shí)，使膜完全干燥。
膜完全干燥后，將修復(fù)液(培養(yǎng)室表面積為0.2ml/10cm2)添加到A培養(yǎng)室一面，即基底膜表面。膜表面完全濕潤后，將膜表面剩余的修復(fù)液吸出，接著將支架倒置使另一個(gè)培養(yǎng)室或B培養(yǎng)室向上，在B培養(yǎng)室一面重復(fù)A培養(yǎng)室面的操作。將載體膜置于生物安全柜中風(fēng)干1到2小時(shí)。制備好的支架準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞移種和培養(yǎng)。
V.飼養(yǎng)細(xì)胞的制備取材皮膚取材皮膚標(biāo)本來源于同種異體和自體同源。通常可以利用外科手術(shù)收集新生兒以及青少年包皮標(biāo)本。為了獲得大量的皮膚標(biāo)本，可從尸體(48小時(shí)以內(nèi))腹部進(jìn)行取材。皮膚標(biāo)本也可以從流產(chǎn)胎兒獲得。皮下組織的厚度隨活檢部位不同而不同。包皮標(biāo)本皮下組織特別疏松因而易于剝離，而背部皮膚皮下組織非常致密，不容易剝離。對于從背部所取皮膚標(biāo)本要盡可能除去附著的結(jié)締組織。皮膚經(jīng)常有細(xì)菌或酵母或真菌污染。將皮膚標(biāo)本在乙醇中浸泡可以殺死大部分污染物。但滯留在汗孔或皮脂腺孔中的細(xì)菌可能仍然存在。包皮最容易出現(xiàn)閉塞孔。值得慶幸的是，把皮膚倒置平鋪在培養(yǎng)皿中很容易看到是否存在閉塞孔。然后小心地將被感染區(qū)域切割并棄去，特別注意不要切到閉塞孔上。
為了避免培養(yǎng)物污染，應(yīng)將皮膚標(biāo)本用含有抗生素(250U/ml青霉素、250μg/ml鏈霉素、100μg/ml卡那霉素或50μg/ml慶大霉素、2.5μg/ml兩性霉素)的DMEM培養(yǎng)液漂洗5到10次。然后將皮膚標(biāo)本置于運(yùn)輸培養(yǎng)液(如下文所述)中轉(zhuǎn)移到試驗(yàn)室。
毛囊取樣角質(zhì)細(xì)胞可以由毛囊外根鞘(ORS)細(xì)胞擴(kuò)增獲得。毛囊的外根鞘主要由未分化角質(zhì)細(xì)胞組成的多層組織，在表皮再生中起到一定作用。
毛囊獲得的最佳部位是在頭部的枕骨區(qū)，但也可以從胡須、腿和生殖器區(qū)分離得到。所選區(qū)域先用75％的酒精噴灑消毒，消毒5分鐘后，拔取毛囊。拔取毛囊時(shí)，先將相鄰毛發(fā)撥開，露出所要拔取的毛發(fā)。用無菌的鑷子夾住幾根毛發(fā)(最多8到10根)，夾得盡量靠近頭皮表面。沿著與皮膚表面垂直的方向迅速拔取。然后用無菌的眼科剪直接將毛囊部分收集到加有5ml漂洗培養(yǎng)液的60-mm平皿內(nèi)。棄去剪下的末端毛發(fā)。每毫升最終培養(yǎng)液至少需一根毛囊。在體視顯微鏡下，選擇處于毛發(fā)生長初期的毛囊，并將其轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的加有5mL漂洗培養(yǎng)液的60-mm培養(yǎng)皿中。毛發(fā)球根部分和相當(dāng)于漏斗部的末端約占毛囊1/5長的部分，可用眼科剪剪去，這樣可以保證毛囊所剩余的活細(xì)胞群僅由外根鞘細(xì)胞構(gòu)成。將制備好的毛囊移入含有5mL漂洗培養(yǎng)液的60-mm培養(yǎng)皿中連續(xù)轉(zhuǎn)移漂洗4次。漂洗培養(yǎng)液中含有PBS(磷酸鹽緩沖生理鹽水)以及250U/ml青霉素、250μg/ml鏈霉素、100μg/ml卡那霉素或50μg/ml慶大霉素、和2.5μg/ml兩性霉素。
人毛囊的運(yùn)輸將按上述方法獲取的毛囊放在一種凍存液中，這種凍存液中含30％FBS、65％含有抗生素的DMEM培養(yǎng)液和5％DMSO。標(biāo)本在-80℃干冰中逐漸冷凍，在運(yùn)輸過程中始終保持-80℃。
VI.細(xì)胞培養(yǎng)液的配制運(yùn)輸培養(yǎng)液運(yùn)輸皮膚或毛囊時(shí)，使用運(yùn)輸培養(yǎng)液。其組成是在DMEM中添加10％FCS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、0.25μg/mL兩性霉素B、50μg/mL慶大霉素。此培養(yǎng)液于4℃保存，培養(yǎng)液組成成分需在-20℃濃縮保存。
表皮細(xì)胞原代培養(yǎng)液(EPM)
表皮細(xì)胞原代培養(yǎng)液是在Minimum Essential Medium Eagle(Sigma提供)中添加了10％胎牛血清、0.1mM CaCl2、4mM L-谷氨酸、100U/mL青霉素、100.umg/mL鏈霉素硫酸鹽、0.25μg/mL兩性霉素B、0.4μg/mL氫化可的松、10-10M霍亂毒素、5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、2×10-11M碘賽羅寧、1.8×10-4M腺嘌呤、5μg/mL胰島素和10ng/mL表皮生長因子。此培養(yǎng)液盡可能新鮮使用，其儲存期約為1星期。培養(yǎng)液的添加成分在-20℃濃縮保存。
角質(zhì)細(xì)胞生長培養(yǎng)液(KGM)角質(zhì)細(xì)胞生長培養(yǎng)液由Ham F12培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液(Sigma提供)以1∶3(體積比)的比例組成，并添加了10％胎牛血清、4mM L-谷氨酸、100U/mL青霉素、100.umg/mL鏈霉素硫酸鹽、0.25μg/mL兩性霉素B、0.4μg/mL氫化可的松、10-10M霍亂毒素、5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、2×10-11M碘賽羅寧、1.8×10-4M腺嘌呤、5μg/mL胰島素和10ng/mL表皮生長因子。此培養(yǎng)液盡可能新鮮使用，但其儲存期約為1星期。添加劑-20℃濃縮保存。
ORS細(xì)胞主培養(yǎng)液(ORSM)ORS細(xì)胞主培養(yǎng)液由Ham F12培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液(Sigma提供)以25∶75(體積比)的比例組成，并添加了10％胎牛血清、4mM L-谷氨酸、100U/mL青霉素、100umg/mL鏈霉素硫酸鹽、0.25μg/mL兩性霉素B、0.4μg/mL氫化可的松、10-10M霍亂毒素、5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、2×10-11M碘賽羅寧、1.8×10-4M腺嘌呤、5μg/mL胰島素和10ng/mL表皮生長因子。此培養(yǎng)液盡可能新鮮使用，但其儲存期約為1星期。添加劑-20℃濃縮保存。
飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液(Sigma提供)，添加了10％胎牛血清、4mM L-谷氨酸、100U/mL青霉素、100.umg/mL鏈霉素硫酸鹽、0.25μg/mL兩性霉素B。
VII.飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增飼養(yǎng)細(xì)胞層的制備在此之前，已有研究人員詳細(xì)報(bào)道了角質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)((Y.Barrandon etal.Cell Size As A Determinant Of The Clone-Forming Ability Of HumanKeratinocytes.Proc Natl Acad Sci U S A.1985，82(16)5390-4.；Y.Barrandonet al.Three Clonal Types Of Keratinocyte With Different Capacities ForMultiplication.Proc Natl Acad Sci U S A.1987，84(8)2302-6.；M.B.Mathoret al.Clonal Analysis Of Stably Transduced Human Epidermal Stem Cells InCulture.Proc Natl Acad Sci U S A.1996，93(19)10371-6.；A.Rochat et al.Cell.Location Of Stem Cells Of Human Hair Dollicles By Clonal Analysis.CellLocation Of Stem Cells Of Human Hair Follicles By Clonal Analysis.Cell.1994，76(6)1063-73.；F.M.Watt et al.Epidermal Stem CellsMarkers，Patterning AndThe Control Of Stem Cell Fate.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1998，353(1370)831-7)本發(fā)明中使用了兩種飼養(yǎng)細(xì)胞，人成纖維細(xì)胞和3T3細(xì)胞系(ATCC提供)。3T3細(xì)胞屬于貼壁細(xì)胞，37℃在飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液中生長直至接近融合(約70％)，然后更換新鮮的培養(yǎng)液并加入1～10μ.g/mL絲裂霉素-C，繼續(xù)培養(yǎng)5到12小時(shí)。用絲裂霉素-C處理過的細(xì)胞可以用胰蛋白酶消化，得到的細(xì)胞懸液按2.5×104細(xì)胞/cm2的密度移種到鋪有膠原蛋白的培養(yǎng)皿中。3T3細(xì)胞貼壁后，此培養(yǎng)皿即可用來培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞。
利用外科手術(shù)所采集的皮膚標(biāo)本或流產(chǎn)胎兒皮膚標(biāo)本，制備人的成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞通過消化獲得，并可多次傳代。然后利用處理后成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，提供皮膚細(xì)胞生長的環(huán)境。本發(fā)明中優(yōu)先選擇人真皮成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞。人真皮成纖維細(xì)胞在添加了10％FCS的EMEM培養(yǎng)液中增殖，每周分裂比率為1∶2，在100-mm培養(yǎng)皿中效果最好。37℃條件下，在無鈣離子和鎂離子，含有0.05％胰酶-0.02％EDTA的PBS中消化約5分鐘。加入3.5mL添加了10％FCS的DMEM終止消化。制備飼養(yǎng)細(xì)胞層時(shí)，對培養(yǎng)物以1∶4的比例而不是通常的1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第二天，在37℃時(shí)條件下用含有8μg/mL絲裂霉素-C并添加了10％FCS的DMEM對這些成纖維細(xì)胞處理5小時(shí)，使其處于有絲分裂后狀態(tài)。處理5小時(shí)后，將細(xì)胞用含有鈣和鎂離子的PBS至少洗滌4次，然后用不含鈣和鎂離子的PBS漂洗一次。37℃條件下，用無鈣、鎂離子并含有0.05％胰酶-0.02％EDTA的PBS消化約3分鐘，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，加速細(xì)胞脫壁。加入4.5mL含有10％FCS/100-mm的DMEM終止消化。對此懸浮液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。并用含有10％FCS的DMEM將細(xì)胞懸浮液進(jìn)行稀釋，得到密度為2×104細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸浮液。將此懸浮液分別移入培養(yǎng)皿(通常是35-mm的培養(yǎng)皿)中培養(yǎng)。每星期更換一次培養(yǎng)液，飼養(yǎng)細(xì)胞在使用之前，可以在37℃的CO2培養(yǎng)箱中生長20-30天。也可將飼養(yǎng)細(xì)胞移入液氮中凍存。凍存方法是將密度為1×106細(xì)胞/ml經(jīng)絲裂霉素-C處理過的成纖維細(xì)胞，懸浮在1mL含有10％FCS和10％二甲基亞砜(Sigma提供)的DMEM中，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.8-mL的凍存管中，在-80℃條件下凍存24小時(shí)，最后轉(zhuǎn)移到液氮罐中。復(fù)蘇后的細(xì)胞可以達(dá)到50％的存活率，此結(jié)果具有可重復(fù)性。制備飼養(yǎng)細(xì)胞層時(shí)，將成纖維細(xì)胞以4×104細(xì)胞/mL的密度在培養(yǎng)液中懸浮。
細(xì)胞培養(yǎng)皿的包被Fibrenestin、luminin和膠原蛋白都可以用來包被細(xì)胞培養(yǎng)皿。本發(fā)明中優(yōu)先選擇IV型膠原蛋白。
利用皮膚標(biāo)本獲得種子細(xì)胞首先將皮膚從運(yùn)輸培養(yǎng)液中取出，用PBS洗滌，在70％的乙醇中浸泡3次，無菌條件下風(fēng)干。然后將皮膚放置到一個(gè)淺的無菌容器中(10-cm的Petri培養(yǎng)皿對小片皮膚標(biāo)本正好)。用鑷子和虹膜剪刀將皮下組織除去，剩下皮膚為相對致密的真皮。將皮膚標(biāo)本平展，表皮放在Petri培養(yǎng)皿表面，用一把無菌解剖刀將皮膚標(biāo)本切成2到3mm的皮條。將標(biāo)本放在統(tǒng)一的容器中，容器中至少含有能夠覆蓋量的0.25％胰酶-EDTA(Sigma提供)，4℃條件下過夜培養(yǎng)12到48小時(shí)。然后，除去消化液，并加入含有10％FCS的DMEM培養(yǎng)液終止消化。用移液管吹打，將皮膚細(xì)胞分散開。用100目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，獲得單細(xì)胞懸浮液。在顯微鏡下利用血球計(jì)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。300g離心5分鐘，然后按2.0-5.0×106細(xì)胞/mL的密度用凍存液重新懸浮。-80℃凍存。
表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞的獲得和培養(yǎng)表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞的獲得方法與從完整皮膚中獲得皮膚細(xì)胞的過程相似。在冷胰酶-EDTA消化之前，將皮膚平展把真皮朝向Petri培養(yǎng)皿表面，用無菌解剖刀將皮膚切割成細(xì)長的條。冷胰酶消化過夜，將皮條從消化液中取出，在10-cm Petri培養(yǎng)皿蓋子內(nèi)將多余的培養(yǎng)液輕輕擦除，將皮條放在Petri培養(yǎng)皿中。在皮膚標(biāo)本邊緣可以看到表皮和真皮分離時(shí)，將其放在(真皮一面朝下)完全培養(yǎng)液中。用兩個(gè)彎鉗輕輕地將表皮剝掉，并放入到一個(gè)含有20ml完全培養(yǎng)液的50-ml離心管中。用吸管用力抽吸吹打，將有附著的角質(zhì)細(xì)胞從表皮部分分離，然后用尼龍紗布(100μm篩目)過篩。用彎鉗輕輕地刮擦真皮部分的上表面，獲得松散附著的基底細(xì)胞。將獲得的基底細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞混合，過尼龍紗布篩(100μm篩目)，100g離心10分鐘，PBS洗滌兩次，進(jìn)行總細(xì)胞計(jì)數(shù)和活細(xì)胞(臺盼藍(lán)著色法)計(jì)數(shù)。刮擦真皮表面可以得到更多的基底細(xì)胞。而在37℃用胰酶消化時(shí)，刮真皮上表面并不能顯著增加基底細(xì)胞收率，因?yàn)榛准?xì)胞主要位于真皮和表皮結(jié)合處。300g離心5分鐘后，按2.0-5.0×106細(xì)胞/ml的密度用凍存液將其重新懸浮，-80℃凍存。復(fù)蘇后可用于在載體膜移種。
分離得到的真皮層可以進(jìn)一步在37℃條件下用胰酶-EDTA溶液消化10到15分鐘。然后將真皮轉(zhuǎn)到完全培養(yǎng)液中，用Pasteru吸管不斷吹打，將細(xì)胞分散開。從真皮中分離得到的細(xì)胞用尼龍紗布(100μm篩目)過濾，100g離心10分鐘，用培養(yǎng)液洗滌兩次，進(jìn)行總細(xì)胞計(jì)數(shù)和活細(xì)胞(臺盼藍(lán)著色法)計(jì)數(shù)。300g離心5分鐘后，按2.0-5.0×106細(xì)胞/ml的密度用凍存液將其重新懸浮，-80℃凍存。用于皮膚替代物的構(gòu)建。
利用毛囊獲得種子細(xì)胞從毛囊中分離外根鞘細(xì)胞將毛囊置于一個(gè)空的35-mm培養(yǎng)皿中，使毛囊與培養(yǎng)皿貼近，但又彼此分開，這樣可以保證胰酶與毛囊充分接觸。用巴斯德吸管吸去殘余的培養(yǎng)液。滴加最少量的0.1％胰島素-EDTA溶液(50或50多根毛囊滴加的消化液的體積應(yīng)小于5mL)。然后在37℃條件下消化，直到在毛囊周圍可以看見最外層的ORS細(xì)胞脫落。消化時(shí)間約15-20分鐘，但具體時(shí)間的確定需在顯微鏡下觀察。如果外根鞘組織變得疏松，毛囊附近可以看到單個(gè)ORS細(xì)胞，則可判斷胰酶消化完全。
加入5倍的完全培養(yǎng)液(1mL胰酶用5mL培養(yǎng)液)終止胰酶消化。用巴斯德吸管將毛囊吹吸幾次，注意不要形成泡沫。然后將含有毛囊的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)到一只50mL的試管中。用1mL培養(yǎng)液將該35-mm培養(yǎng)皿沖洗兩次，沖洗液一并移入到上述50mL試管中。
將上述50mL試管中的培養(yǎng)液補(bǔ)足7mL。然后用一個(gè)5mL吸管用力吹吸至少50次，使仍附著在毛囊上的細(xì)胞脫落。然后用培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮液稀釋，使得最終體積的毫升數(shù)與所消化的毛囊數(shù)相符。如果只消化幾個(gè)毛囊，最好在該過程中減少添加的培養(yǎng)液的體積，避免再次離心。
外根鞘細(xì)胞的原代培養(yǎng)將外根鞘細(xì)胞懸浮液移入預(yù)先鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞層(3T3或成纖維細(xì)胞)的培養(yǎng)皿中，將剩余的毛囊部分用鑷子夾去。
放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由1根毛囊獲得的外根鞘細(xì)胞移入加有1ml培養(yǎng)液的10cm2的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，細(xì)胞密度約為1×103細(xì)胞/cm2，所以在飼養(yǎng)細(xì)胞層上只能看到幾個(gè)圓形細(xì)胞。培養(yǎng)2-4天后，主要分布在飼養(yǎng)細(xì)胞之間的外根鞘細(xì)胞開始擴(kuò)增。此時(shí)，外根鞘細(xì)胞表現(xiàn)出典型的上皮樣細(xì)胞形態(tài)，有一個(gè)易于辨認(rèn)的核和一個(gè)大的細(xì)胞質(zhì)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，外根鞘細(xì)胞克隆逐漸增大，不斷將飼養(yǎng)細(xì)胞推到一邊。4天后，向培養(yǎng)皿中添加1ml新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)前7天不需更換培養(yǎng)液。之后，每星期更換3次培養(yǎng)液。更換培養(yǎng)液可以去除了已脫落的飼養(yǎng)細(xì)胞。隨著克隆的不斷增大，外根鞘細(xì)胞排列越來越緊密，看上去細(xì)胞個(gè)體減小，細(xì)胞質(zhì)也不再顯著。培養(yǎng)初期，細(xì)胞增殖較慢，細(xì)胞生長一旦進(jìn)入指數(shù)生長期，細(xì)胞數(shù)量便會迅速遞增。培養(yǎng)12-14天，細(xì)胞生長達(dá)到80％到100％融合。
外根鞘細(xì)胞的傳代培養(yǎng)外根鞘細(xì)胞傳代培養(yǎng)前，首先在37℃用含有0.02％EDTA無鈣、鎂離子的PBS消化2-3分鐘，選擇性地除去殘余的飼養(yǎng)細(xì)胞。用吸管用力吹吸，可有效地加速飼養(yǎng)細(xì)胞的去除速度。然后將EDTA溶液吸去，用不含有鈣和鎂離子的PBS沖洗外根鞘細(xì)胞3次，除去殘余的飼養(yǎng)細(xì)胞。37℃條件下，加入含有0.1％胰酶-0.02％EDTA(無鈣和鎂離子)的PBS消化外根鞘細(xì)胞，例如35-mm培養(yǎng)皿中加入0.5mL消化液，消化時(shí)間約為8-10分鐘，但具體消化時(shí)間需在倒置顯微鏡觀察后確定。在每只35-mm培養(yǎng)皿中加入1.5mL培養(yǎng)液終止消化。用一個(gè)5mL吸管用力吹吸，獲得單細(xì)胞懸浮液。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。室溫下，250g離心8分鐘。棄去上清液，選用合適的培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞。
外根鞘細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，最好選用低鈣培養(yǎng)液，并在鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞塑料培養(yǎng)皿中進(jìn)行。這樣可以得到1.0×104cells/cm2的低細(xì)胞培養(yǎng)密度，但可以3-5倍的傳代。根據(jù)移植物制備的需要，可以繼續(xù)進(jìn)行外根鞘細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。擴(kuò)增后的外根鞘細(xì)胞于-80℃凍存，復(fù)蘇后用作載體膜上種子細(xì)胞。
外根鞘細(xì)胞獲得和擴(kuò)增的其它方法另一種獲得和擴(kuò)增角質(zhì)細(xì)胞的方法是從生長在膠原蛋白膠上的人整根毛囊的周圍消化分離，獲得角質(zhì)細(xì)胞。通過一種無菌技術(shù)拔取人毛囊，然后浸入含有抗生素的DMEM培養(yǎng)液中。剩余的皮脂腺腺管是所被拔出組織的上限，因而總是缺少漏斗處的外根鞘部分。用剪刀除去毛囊球體部分，因?yàn)樗能浂藭恋K毛囊在膠原蛋白膠上的移種。將毛囊切開(通常切兩半)減少其體積，以保證毛囊的豎直方向。
將修剪好的毛囊正向移到新鮮膠原蛋白膠上。使得毛囊的一部分豎直插到膠原蛋白膠中。每個(gè)35-mm培養(yǎng)皿中，移入5個(gè)半片毛囊，添加人毛囊細(xì)胞原代培養(yǎng)液，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8-14天后，移種的毛囊擴(kuò)增得到的角質(zhì)細(xì)胞一般可以達(dá)到70％到80％融合。培養(yǎng)可以至少維持2個(gè)月。外根鞘細(xì)胞的次級培養(yǎng)如上文所述。
表皮細(xì)胞的其它來源口腔表皮細(xì)胞人體口腔黏膜由不同種類的表皮細(xì)胞構(gòu)成，一般分為襯里(非角質(zhì)化表皮細(xì)胞)、咀嚼(正角質(zhì)化或角質(zhì)化旁表皮細(xì)胞)和特殊類型細(xì)胞(舌背脊部)。齒齦黏膜(咀嚼表皮細(xì)胞)和表皮無論在形態(tài)學(xué)方面，還是生物化學(xué)方面，都非常相似。培養(yǎng)的表皮細(xì)胞可作為種子細(xì)胞，用于構(gòu)建治療口腔黏膜缺損或皮膚缺損用的皮膚替代物。
尿道表皮細(xì)胞尿道表皮細(xì)胞可以從尿道活檢時(shí)分離得到。培養(yǎng)的表皮細(xì)胞可作為種子細(xì)胞，用于構(gòu)建治療如尿道下裂等先天性病變的尿道黏膜的皮膚替代物。
結(jié)膜和角膜細(xì)胞眼球前表面覆蓋有高度特殊化的結(jié)膜和角膜表皮細(xì)胞。結(jié)膜富含血管，上皮層由角質(zhì)細(xì)胞和分泌粘液素的杯狀細(xì)胞組成。角膜表皮細(xì)胞為復(fù)層上皮，沒有杯狀細(xì)胞以及其它細(xì)胞。在沒有血管的角膜基質(zhì)上有一個(gè)立體狀的基底層。視覺的敏銳程度取決于角膜上皮的透明度，從干細(xì)胞來源出的短暫擴(kuò)充細(xì)胞向里不斷增殖、遷移來維持其結(jié)構(gòu)和功能的完整性。利用外科手術(shù)中去除的角膜邊緣，可以獲得角膜細(xì)胞，體外培養(yǎng)、擴(kuò)增后，用于人工角膜移植物的構(gòu)建，用于治療角膜疾病或損傷。
VIII.皮膚替代物的構(gòu)建表皮層的構(gòu)建準(zhǔn)備一個(gè)帶有載體膜，羊膜或絨毛膜的支架，將A培養(yǎng)室朝上，置于培養(yǎng)皿中。載體膜已除去表皮細(xì)胞或滋養(yǎng)層細(xì)胞，可以直接移種皮膚細(xì)胞。將由皮膚或毛囊中獲得的原代角質(zhì)形成細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)，然后與真皮細(xì)胞按一定比例混合，將得到的細(xì)胞混懸液移種到羊膜或絨毛膜A培養(yǎng)室的基底膜面，并添加表皮細(xì)胞原代培養(yǎng)液。培養(yǎng)前3天，使用條件培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液的混合液。培養(yǎng)3天后，每隔3天更換一次培養(yǎng)液。在載體膜上，皮膚替代物的構(gòu)建時(shí)間一般需要10-14天。
真皮層的構(gòu)建表皮細(xì)胞生長7-10天后，用無菌鑷子將支架翻轉(zhuǎn)180°，使B培養(yǎng)室朝上。復(fù)蘇凍存的真皮細(xì)胞，并移種到B培養(yǎng)室中載體膜的結(jié)締組織一面。向B培養(yǎng)室中添加用于表皮細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)3-4天后，用無菌鑷子翻轉(zhuǎn)支架180°，使A培養(yǎng)室朝上。繼續(xù)培養(yǎng)5-7天。此時(shí)，皮膚替代物已經(jīng)構(gòu)建完成，可以用于損傷皮膚的移植。
根據(jù)不同的細(xì)胞源構(gòu)建不同的皮膚替代物自體同源移植物從接受手術(shù)的患者自身皮膚或毛囊，獲得表皮細(xì)胞，從其自身結(jié)締組織中獲得真皮細(xì)胞。
半自體同源移植物從接受手術(shù)的患者自身毛囊或皮膚獲得表皮細(xì)胞，從同種異體結(jié)締組織中獲得真皮細(xì)胞。
同種異體移植物表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞都從同種異體獲得。
成纖維細(xì)胞移植物載體膜上移種的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。
其它組織替代物的構(gòu)建人體口腔黏膜替代物用人體口腔黏膜細(xì)胞作為支架中的種子細(xì)胞構(gòu)建人體口腔黏膜替代物。
人體尿道黏膜替代物用人體尿道黏膜細(xì)胞作為支架中的種子細(xì)胞構(gòu)建人體尿道黏膜替代物。
人體角膜替代物用人體角膜細(xì)胞作為支架中的種子細(xì)胞構(gòu)建人體角膜替代物。
IX.移植物上角質(zhì)形成細(xì)胞的生長潛力的檢測使用表皮細(xì)胞原代培養(yǎng)液進(jìn)行原代表皮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，形成角質(zhì)細(xì)胞克隆。培養(yǎng)14天后，一個(gè)克隆約含有1-2×105個(gè)細(xì)胞，且克隆邊緣清晰。傳代后，克隆可以產(chǎn)生大而平滑的子克隆，生成率為100％。產(chǎn)生全克隆的細(xì)胞可以生成多達(dá)1×1040后代(超過140倍)，一個(gè)成年人的皮膚細(xì)胞數(shù)約為8×1010。這樣，一個(gè)細(xì)胞可以產(chǎn)生足以覆蓋成年人全身幾次的表皮細(xì)胞。因此，能產(chǎn)生全克隆的角質(zhì)形成細(xì)胞具有干細(xì)胞的本質(zhì)特征，即巨大的自我更新的潛能。下文所述檢測方法是用來檢測細(xì)胞存活率、再生能力，和干細(xì)胞樣的細(xì)胞標(biāo)志(Y.Barrandon et al.Cell Size as A DeterminantOf The Clone-Forming Ability 0f Human Keratinocytes，Proc Natl Acad Sci U SA.1985，82(16)5390-4.；Y.Barrandon，et al.Three Colnal Types OfKeratinocyte With Different Capacities For Multiplication.Proc Natl Acad SciU S A.1987，84(8)2302-6.；M.B.Mathor et al.Clonal Analysis Of StablyTransduced Human Epidermal Stem Cells In Culture.Proc Natl Acad Sci U S A.1996，93(19)10371-6.；A.Rochat et al.Location Of Stem Cells Of Human HairFollicles By Clonal Analysis.Cell.1994，76(6)1063-73.；Barrandon and Green，1985，1987；Mathor et al，1996；Rochat et al.，1994)。
整合素β-1陽性細(xì)胞的檢測整合素β-1被可作為表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物(F.M.Watt.Stem Cell Fate AndPatterning In Mammalian Epidermis.Curr Opin Genet Dev 2001，11(4)410-7.；F.M.Watt.Role Of Integrins In Regulating Epidermal Adhesion，Growth AndDifferentiation.EMBO J 2002，21(15)3919-26.；C.Bagutti et al.DermalFibroblast-Derived Growth Factors Restore The Ability Of Beta(1)Integrin-Deficient Embtyonal Stem Cells To Differentiate intoKeratinocytes.Dev Biol 2001，231(2)321-33.)。本發(fā)明中抗整合素β-1抗體(Upstate Biotechnology提供)被用來檢測表皮干細(xì)胞中整合素β-1。利用載玻片培養(yǎng)皮膚替代物所使用的角質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞在載玻片上生長3天后，用PBS洗滌3次，共15分鐘，然后用95％乙醇/5％乙酸4℃下固定1分鐘。固定后的細(xì)胞用1％牛血清白蛋白室溫孵育1-2小時(shí)，后用PBS洗滌2次，共15分鐘。加入用1％牛血清白蛋白稀釋至10μg/ml的抗人整合素β-1抗體，置于4℃過夜。用PBS洗滌3次后，置于1％牛血清白蛋白稀釋的連接熒光標(biāo)記的抗鼠IgG的二抗中，室溫放置1.5小時(shí)，用PBS洗滌3次，共15分鐘。熒光顯微鏡下檢測陽性細(xì)胞(Watt，1998，2001，2002；Bagutti et al.，2001；Cotsarelis et al.，1999)。
用抗角質(zhì)蛋白19抗體檢測表皮干細(xì)胞角質(zhì)蛋白19也被看作是表皮干細(xì)胞的另一種標(biāo)志物(M.Michel et al.Keratin19 As a Biochemical marker Of Skin Cells In Vivo And In Vitrokeratin 19Expressing Cells Are Differentially Localized In Function Of Anatomic Sites，And Their Number Varies With Donor Age And Culture Stage.J Cell Sci.1996.1091017~1028.)。在本發(fā)明中，利用角質(zhì)蛋白19抗體(DAKO提供)檢測表皮干細(xì)胞中角質(zhì)蛋白19。利用載玻片培養(yǎng)皮膚替代物所使用的角質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞在載玻片上生長3天后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，共15分鐘，然后用4％多聚甲醛4℃下固定15分鐘，用PBS洗滌2次，共15分鐘。將固定好細(xì)胞的載玻片置于1％皂角苷溶液中，室溫放置1-2小時(shí)。然后加入抗人細(xì)胞角質(zhì)蛋白19抗體，4℃過夜。將載玻片上的細(xì)胞浸于1％牛血清白蛋白稀釋的連接熒光標(biāo)記的抗鼠IgG的二抗中，室溫放置1.5小時(shí)，用PBS洗滌3次，共15分鐘。熒光顯微鏡下檢測陽性細(xì)胞。
使用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞的存活率首先用0.25％ trypsin-EDTA溶液從皮膚替代物上消化得到純角質(zhì)細(xì)胞，然后用0.04％臺盼藍(lán)(Sigma提供)對細(xì)胞進(jìn)行染色，并在顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)未染色細(xì)胞和已染色細(xì)胞的數(shù)目，計(jì)算二者的比例。本發(fā)明中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到的角質(zhì)細(xì)胞(未染色)存活率約為85％(80％到95％)(如表1所示)表1臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞的存活率支架號所統(tǒng)計(jì)角質(zhì)細(xì)胞數(shù)被染色細(xì)胞％(死細(xì)胞/活細(xì)胞)168 250 2710.8169 310 3511.2176 300 289.3177 300 3110.3178 300 299.6179 300 3612.0
移植物細(xì)胞染色體組型分析移植物上載有的表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞具有正常的染色體組型，這是移植物成功構(gòu)建的標(biāo)志。XY和XX細(xì)胞是遺傳的。為了證實(shí)移植物中所載有的細(xì)胞是否具有正常的染色體組型，對按所述方法培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行檢測。檢查細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常，從所培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測出約10-20個(gè)分裂中期染色體組型。在種子細(xì)胞移種前，對來源于人毛囊ORS的細(xì)胞進(jìn)行了染色體組型檢查，分別為正常的46，XY或46，XX。
當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿中達(dá)到40％到50％融合時(shí)，加入0.02μg/ml秋水仙素(GIBCO BRL)，37℃、5％CO2，95％空氣的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；細(xì)胞用PBS沖洗數(shù)次；然后，用0.25％胰酶-EDTA 37℃條件下消化10-15分鐘；加細(xì)胞培養(yǎng)液，懸浮細(xì)胞；800g離心5分鐘；加冷Carnoy固定劑(無水甲醇和冰醋酸，體積比3∶1)固定5分鐘；用PBS洗滌，按上述方法離心；重新懸浮在0.5ml的Carnoy固定劑中；用吸管吸取1滴細(xì)胞懸浮液，轉(zhuǎn)移到用Carnoy固定液處理過的載玻片上；將玻片風(fēng)干，用Giemsa染色(GIBCO，BRL)，并用自來水漂洗；再次風(fēng)干后，蓋上蓋玻片，使用400×油鏡鏡檢。
所檢查的角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞有染色體組型正常(例如44條常染色體和2條性別染色體)。另外，未發(fā)現(xiàn)染色體斷裂、缺失、添加或其它形狀或數(shù)目異常。
X.皮膚替代物的運(yùn)輸本發(fā)明中采用了兩種方法來運(yùn)輸和/或裝運(yùn)此移植物。第一種方法是將載有移植物的支架放在一個(gè)裝滿培養(yǎng)液，并用封口膜封口的無菌容器中。這種方法適合在4℃-10℃條件下運(yùn)輸。為了在運(yùn)輸過程中減小震蕩和搖晃，避免移植物受損，容器的大小應(yīng)該在裝滿培養(yǎng)液后，正好能放入支架。當(dāng)支架和移植物送到目的地后，將移植物有移入新的培養(yǎng)皿中，并且使用同樣的培養(yǎng)液，培養(yǎng)1-2天后，即可使用。
本發(fā)明中運(yùn)輸移植物的第二種方法，需要將制成的皮膚移植替代物完全浸泡在一種凍存溶液中，浸泡時(shí)間為1-2小時(shí)，但最佳時(shí)間為1小時(shí)。這種凍存方法可以使移植物被慢慢冷凍，然后，在-70℃或更低的溫度下保存。用這種方法保存的組織，當(dāng)溫度在-70℃到-196℃間波動(dòng)時(shí)，凍存組織的各種理化性質(zhì)，能夠基本保持穩(wěn)定。短期保存可以在-76℃(干冰的溫度)條件下進(jìn)行，用于運(yùn)輸。在-120℃或-140℃(接近液氮溫度)條件下保存效果很好，但最佳凍存溫度是-196℃(液氮溫度)。本發(fā)明中所用凍存液為含2M甘油的DMEM培養(yǎng)液。
移植物復(fù)蘇時(shí)采取快速升溫法，使組織在約1-3分鐘內(nèi)解凍。快速升溫法包括水浴加熱或感應(yīng)加熱。用直接往凍存的移植物表面上滴加預(yù)熱到37℃培養(yǎng)液的方法，解凍效果最佳。
因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)試劑有毒性，解凍后15分鐘之內(nèi)應(yīng)將冷凍保護(hù)劑去除，最好在解凍后盡快去除，以避免損害組織或組織替代物的細(xì)胞的生存能力。移植物解凍后，用pH約為6.8到7.4的培養(yǎng)液替換冷凍保護(hù)溶液。
XI.動(dòng)物試驗(yàn)和臨床應(yīng)用動(dòng)物試驗(yàn)用苯巴比妥鈉將體重約為250-300g的SD大鼠麻醉。根據(jù)皮膚替代物的大小，在大鼠背部剪去整層皮膚(包括表皮和真皮)。將移植物平鋪在創(chuàng)面上后，邊緣縫合固定。然后，用涂滿凡士林的紗布墊和浸泡Earle’s鹽溶液的紗布墊覆蓋傷口，并用彈性繃帶加以固定。在移植后的9天-13個(gè)月期間，需要重新麻醉大鼠，并剪下整個(gè)移植物。剪下的移植物一半用福爾馬林磷酸鹽緩沖液固定，乙醇脫水，石蠟包埋；除去另一半中間部分下面的脂肪組織后，將其剪成2-3mm3的皮粒，利用組織塊法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。
臨床應(yīng)用此處所述的皮膚替代物適合用于人體或其它哺乳動(dòng)物皮膚創(chuàng)傷或缺損的治療。它尤其適用于治療大面積燒傷等皮膚損傷或潰瘍。
用于燒傷治療。皮膚替代物的移植應(yīng)充分考慮到移植的位置，以及燒傷的程度，如部分皮膚損傷，還是全層皮膚損傷。
用于腿部潰瘍治療。大多數(shù)的腿部潰瘍都源于靜脈。移植前，需要對傷口進(jìn)行處理。
用于皮膚外傷和慢性皮膚潰瘍治療。本發(fā)明中制備的皮膚替代物修復(fù)傷口效果顯著。
用于醫(yī)源性創(chuàng)傷和潰瘍的治療。瘢痕形成的原因多種多樣，可能由于常規(guī)手術(shù)造成的，也可能是偶然形成的。在這種情況下，表面容易形成顆粒，并且進(jìn)一步表皮化(例如切除藏毛竇之后)。而在其它一些情況下，可能考慮適當(dāng)?shù)赝七t移植。這兩種情況時(shí)都可以使用皮膚替代物，能使創(chuàng)面迅速愈合，或?yàn)橐浦蔡峁┮粋€(gè)無感染創(chuàng)面。
用于外科手術(shù)所致皮膚缺損的治療。
在婦產(chǎn)科方面的應(yīng)用。本發(fā)明所制備的皮膚替代物可以用來構(gòu)建人造陰道，以及修復(fù)陰道缺損。
用于白癜風(fēng)治療。研究顯示，本發(fā)明所制備的皮膚替代物含有可以在與角質(zhì)細(xì)胞相同的培養(yǎng)條件下迅速增生的黑素細(xì)胞。白癜風(fēng)患者熱切期望能夠得到長久、有效地治療。
XII.工業(yè)生產(chǎn)相關(guān)技術(shù)人員通過一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)，就可識別或確定發(fā)明中所述特殊試劑、催化劑、實(shí)驗(yàn)步驟和操作技術(shù)等的等效物或過程。所有這些都被包括在本發(fā)明權(quán)利要求之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種可移植的組織替代物的制備方法，此組織替代物可用于人體組織缺損的修復(fù)，包括a)制備一種用于構(gòu)建載有活細(xì)胞的皮膚替代物的組織培養(yǎng)支架，支架可以自由裝配，所述支架包括以下部分i)母環(huán)為一圓筒狀結(jié)構(gòu)，底壁四周有孔洞，當(dāng)將支架放入培養(yǎng)容器中時(shí)，培養(yǎng)液可自由通過孔洞進(jìn)出支架腔；ii)插環(huán)為一圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可插入母環(huán)內(nèi)。用插環(huán)將一生物載體膜固定在上述母環(huán)內(nèi)，從而生物載體膜和插環(huán)環(huán)壁形成上培養(yǎng)室；和iii)生物載體膜來源于胎膜，將母環(huán)分隔成上下兩個(gè)獨(dú)立的培養(yǎng)空間；b)種子細(xì)胞的制備，包括功能細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的制備；c)將上述種子細(xì)胞通過支架內(nèi)不同的培養(yǎng)腔室移種到制備好的生物載體膜上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，和組織替代物的構(gòu)建；d)從支架上將構(gòu)建好的組織替代物取下，用于組織缺損的修復(fù)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的組織替代物包括以下之一a)皮膚替代物；b)粘膜替代物；c)角膜替代物；和d)其它人體膜性組織替代物。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的組織替代物用于以下目的之一a)皮膚缺損的修復(fù)；b)粘膜缺損的修復(fù)；c)眼結(jié)合膜缺損的修復(fù)；d)人工角膜缺損的修復(fù)；e)人體其它膜性組織缺損的修復(fù)。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中a)所述的組織替代物是一種組織工程皮膚替代物，用于皮膚缺損的修復(fù)。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的組織工程皮膚替代物的組織結(jié)構(gòu)與正常皮膚相似，即表皮層由表皮細(xì)胞構(gòu)成，真皮層由結(jié)締組織細(xì)胞和組織基質(zhì)構(gòu)成。
6.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的組織工程皮膚替代物是以下所述之一a)自體皮膚替代物含有所述的生物載體膜、自體表皮細(xì)胞和自體真皮細(xì)胞；b)半自體皮膚替代物含有所述的生物載體膜、自體表皮細(xì)胞和異體真皮細(xì)胞；c)異體皮膚替代物含有所述的生物載體膜、異體表皮細(xì)胞和異體真皮細(xì)胞；d)皮膚替代物含有所述的生物載體膜和成纖維細(xì)胞。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的表皮細(xì)胞源于皮膚表皮層的活的角質(zhì)形成細(xì)胞。
8.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的表皮細(xì)胞源于毛囊外根鞘層活的角質(zhì)形成細(xì)胞。
9.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的結(jié)締組織細(xì)胞源于皮膚真皮層活的成纖維細(xì)胞。
10.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的組織基質(zhì)由結(jié)締組織纖維構(gòu)成。
11.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的皮膚缺損是指由各種慢性疾病所引起的皮膚潰瘍。
12.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的皮膚缺損是指由各種不同皮膚損傷所導(dǎo)致。
13.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的皮膚缺損是由外科手術(shù)所導(dǎo)致。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的生物載體膜是去掉上皮層、保留基底膜和結(jié)締組織層的羊膜。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的生物載體膜是去掉滋養(yǎng)層細(xì)胞、保留假基底膜和結(jié)締組織層的絨毛膜。
16.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器指的是細(xì)胞培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)板。
17.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的組織替代物構(gòu)建過程包括a)安裝支架，并放置在上述培養(yǎng)容器內(nèi)；b)將羊膜上皮去掉，暴露基底膜；c)將活細(xì)胞分別移種到支架兩面的不同培養(yǎng)室內(nèi)的基底膜面和結(jié)締組織面上；d)加入培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；和e)拆卸支架，取下組織替代物。
18.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的組織替代物構(gòu)建過程包括a)安裝支架，并放置在上述培養(yǎng)容器內(nèi)；b)將絨毛膜去掉滋養(yǎng)層細(xì)胞，暴露假基底膜；c)將種子細(xì)胞分別移種到支架兩面的不同培養(yǎng)腔室內(nèi)的假基底膜面和結(jié)締組織面上；d)加入培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；和e)拆卸支架，取下組織替代物。
19.權(quán)利要求1所述的方法，其中活細(xì)胞在生物載體膜上/內(nèi)通過以下方法進(jìn)行增殖a)配制膠原蛋白的酸性溶液；b)將上述的膠原蛋白酸性溶液滴加到支架培養(yǎng)室內(nèi)的胎膜表面，調(diào)節(jié)溶液PH值，使膠原蛋白沉積到生物載體膜的表面；c)在移種細(xì)胞前，將上述膠原蛋白溶液和載體膜進(jìn)行孵育；和d)配制添加多種因子的細(xì)胞培養(yǎng)液。
20.一種抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞分化的方法，包括a)配制低鈣濃度的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基，和b)用所述培養(yǎng)基培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞。
全文摘要
以來源于胎膜的生物載體膜為支架，用組織細(xì)胞工程的方法，將具有活性的功能細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和組織基質(zhì)成分構(gòu)建成機(jī)體組織替代物，用于治療人體組織缺損性疾病。
文檔編號A61L27/60GK1630715SQ03803624
公開日2005年6月22日 申請日期2003年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月16日
發(fā)明者王正品 申請人:華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司