專利名稱：靶基因用多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對靶基因有特異性RNA功能抑制活性的單鏈多核苷酸序列及一種使用該多核苷酸序列的靶基因功能抑制方法。
背景技術(shù)：
RNA干擾法(RNA interference)為基于下述現(xiàn)象的方法，所述現(xiàn)象為將與作為靶的基因(以下稱為靶基因)具有相同序列的2條鏈RNA導(dǎo)入細胞內(nèi)，由此破壞靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RNA)，所述2條鏈RNA由2條互補的RNA構(gòu)成，1條RNA具有相對于靶基因的有義序列，另一條RNA具有相對于靶基因的反義序列(Fire，A.，et al.，Nature，391，806-811(1998))。在本說明書中，將退火2條不同的互補分子的情況稱為2條鏈，將不相區(qū)別地使用退火1條分子內(nèi)互補部分或退火2條不同的互補分子的情況稱為雙鏈。已知其基因抑制效果及特異性高于反義法，有效濃度更低。對于無脊椎動物而言，已知對雙鏈RNA的構(gòu)造、特別是其長度沒有限定，雙鏈部分越長，有效度越高，使用超過30個堿基對的雙鏈RNA時，也能夠產(chǎn)生基因特異性的RNA干擾現(xiàn)象。另一方面，對于脊椎動物而言，已知導(dǎo)入具有超過30個堿基對的雙鏈部分的長鏈雙鏈RNA能夠活化干涉體系，產(chǎn)生對靶基因以外的大范圍基因的非特異性基因功能抑制(RNA的非特異性分解、mRNA的非特異性翻譯抑制)及細胞死亡等結(jié)果，對于利用RNA干擾現(xiàn)象的基因功能抑制而言，僅能獲得有限的效果。
已知將長鏈雙鏈RNA在細胞內(nèi)切成作為由約21個核苷酸長度的小型RNA構(gòu)成的2條鏈RNA的小型干涉性RNA(small interferenceRNA(以下簡稱為siRNA)，能夠作為具有靶基因抑制活性的分子發(fā)揮作用，Tuschl等(Tuschl，T.)證明了通過將與靶基因具有相同性的siRNA導(dǎo)入哺乳類細胞內(nèi)，能夠在不使干涉體系活化的條件下產(chǎn)生RNA干擾效果(Elbashir，S.M.，et al.，Nature，411，494～498(2001))。上述siRNA與長鏈雙鏈RNA不同，除了不活化干涉體系外，還具有能夠更特異性地僅抑制在約20個核苷酸長度的部分具有互補性的特定基因的優(yōu)點。該技術(shù)發(fā)現(xiàn)了哺乳類中有效的基因功能抑制體系，擴大了藥物開發(fā)及基因藥物的可能性。
本發(fā)明人等深入研究了經(jīng)由上述siRNA產(chǎn)生的靶RNA分解的RNA基因功能抑制的藥物靶基因篩選、利用基因剔除小鼠的藥物靶基因的體內(nèi)評價、對用于基因疾病的藥物組合物(基因治療劑)的更有效適用等內(nèi)容。
為了實現(xiàn)上述目的，不僅合成RNA是重要的，具有由DNA質(zhì)粒載體向siRNA轉(zhuǎn)錄的構(gòu)造也是重要的，但是，通常認(rèn)為表達2種不同的短鏈RNA和使其在細胞內(nèi)退火、在靶細胞內(nèi)發(fā)揮RNA干擾效果是困難的。
本發(fā)明人等深入研究的結(jié)果為發(fā)現(xiàn)代替小型2條鏈RNA，使用由在與靶基因互補的短鏈多核苷酸和與上述多核苷酸互補的短鏈多核苷酸之間具有任意元件的多核苷酸序列構(gòu)成的單鏈多核苷酸，將該單鏈多核苷酸導(dǎo)入細胞內(nèi)，研究靶基因活性，發(fā)現(xiàn)能夠抑制該活性，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的為提供一種能夠通過特異性分解由靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA或選擇性地抑制其翻譯來抑制并控制作為目的的RNA或蛋白質(zhì)功能表達的單鏈多核苷酸，以及一種利用該單鏈多核苷酸抑制并控制靶基因功能的方法。根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種簡單的基因功能分析方法，含有藥物靶基因的功能基因的篩選方法，使用基因剔除小鼠制作等的基因重組動物或基因重組病毒的藥物靶基因的體內(nèi)評價方法，用于包括基因疾病、感染病在內(nèi)的疾病的藥物組合物(基因治療劑)，使用基因剔除豬等的移植用器官產(chǎn)生動物。


圖1表示本發(fā)明靶基因用多核苷酸的RNA功能抑制效果。
圖2表示Lamin A/C基因功能抑制載體的RNA功能抑制效果。
圖3表示螢火蟲熒光素酶基因功能抑制載體的RNA功能抑制效果。

發(fā)明內(nèi)容
即，根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種靶基因用多核苷酸序列，所述靶基因用多核苷酸序列是由連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件構(gòu)成的經(jīng)分離或純化的單鏈多核苷酸序列，對與(I)或(III)元件中的任一種互補的RNA有RNA功能抑制活性，其中，元件(III)包含具有與靶基因互補的序列的連續(xù)15～30個或18～25個堿基長度的多核苷酸序列，元件(II)為0堿基～1萬個堿基長度的核苷酸序列(其中，0堿基表示鍵)或非核苷酸序列，元件(I)為包含與元件(III)互補的序列的多核苷酸序列，另外，上述由連續(xù)15～30或18～25個多核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列包含DNA或RNA。
另外，根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種靶基因用多核苷酸序列，其中，上述(I)或(III)元件的多核苷酸序列及/或互補多核苷酸至少在一個末端或在互補序列內(nèi)部缺失、取代、補加由1～數(shù)個U、T、G、C或A構(gòu)成的序列。靶基因可以為編碼含有mRNA的蛋白質(zhì)的RNA、tRNA、rRNA、Xist、不編碼包含腺病毒VA RNA的蛋白質(zhì)的功能性RNA、病毒基因組RNA。
而且，根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種靶基因用多核苷酸序列，上述多核苷酸序列是利用化學(xué)合成法或基因重組技術(shù)得到的單鏈多核苷酸序列，由序列號1或2的單鏈RNA構(gòu)成。
另外，根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種靶基因用序列，其中，由上述單鏈RNA構(gòu)成的靶基因用多核苷酸序列的元件(II)為核苷酸序列或非核苷酸序列中的任一種、或由它們組合而成的序列；一種靶基因用序列，其中，上述元件(II)的核苷酸序列由1個堿基或1個堿基以上的不足1萬個堿基、1個堿基長度或1個堿基長度以上不足數(shù)百個堿基長度(例如，700個堿基、500個堿基或300個堿基)的核苷酸序列、1個堿基長度～數(shù)十個堿基長度(例如70個堿基、50個堿基、30個堿基)的核苷酸序列構(gòu)成；一種由1個堿基長度～20個堿基長度的核苷酸序列或序列號3或4所示的元件(II)構(gòu)成的靶基因用序列。另外，根據(jù)本發(fā)明，可以提供上述靶基因用序列，其中，所述元件(II)的核苷酸序列或非核苷酸序列由PNA、細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移序列、具有誘導(dǎo)(decoi)活性的序列、干擾素誘導(dǎo)抑制序列、具有RNase抑制活性、反義活性、核酶活性及轉(zhuǎn)移RNA中任一種的序列或上述序列的組合構(gòu)成。
根據(jù)本發(fā)明，能夠提供上述靶基因用序列以及將該靶基因用序列插入重組載體得到的重組載體、該重組載體的制備方法。
另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種使用上述靶基因用序列篩選藥物靶基因或具有有用功能的基因的方法。
而且，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種以上述靶基因用序列或重組載體為有效成分的藥物組合物或由藥物組合物構(gòu)成的基因治療劑。
另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種靶基因用核苷酸的合成方法，所述方法包含下述步驟(i)制作由元件(I)及(II)構(gòu)成的單鏈核苷酸，使元件(II)3’末端的數(shù)個核苷酸與元件(I)或(II)的數(shù)個核苷酸互補的步驟；(ii)使用由該元件(I)及(II)構(gòu)成的單鏈核苷酸，利用核苷酸合成酶活性，合成元件(III)的步驟，或使用由該元件(I)及(II)構(gòu)成的單鏈核苷酸，導(dǎo)入細胞內(nèi)，利用存在于細胞內(nèi)的上述核苷酸合成酶活性，合成元件(III)的步驟。
另外，根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種利用上述方法得到的隨機化靶基因用核苷酸，其中，元件(I)及(III)為隨機寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種基因功能的抑制方法，在細胞或組織中，將由連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件構(gòu)成的經(jīng)分離或純化的單鏈多核苷酸序列導(dǎo)入該細胞或組織內(nèi)，利用其具有的對具有與上述(I)或(III)元件中的任一個互補的序列的RNA的RNA功能抑制活性，抑制靶基因的功能；其中，元件(III)包含具有與靶基因互補的序列的連續(xù)15～30個或18～25個堿基長度的多核苷酸序列，元件(II)為1堿基～1萬個堿基長度的核苷酸序列或非核苷酸序列，元件(I)為包含與元件(III)互補的序列的多核苷酸序列，另外，上述由連續(xù)15～30個或18～25個多核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列包含DNA或RNA。
另外，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種靶基因功能的抑制方法，其中，上述(I)或(III)元件中的任一種序列為至少在任一個末端或在內(nèi)部缺失、取代、補加1～數(shù)個U、T、G、C或A堿基的靶基因用多核苷酸序列。
而且，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種靶基因功能的抑制方法，上述多核苷酸序列為利用化學(xué)合成法或基因重組技術(shù)得到的單鏈多核苷酸序列，是由序列號1或2的單鏈RNA構(gòu)成的靶基因用多核苷酸序列。
另外，根據(jù)本發(fā)明，提供上述靶基因功能的抑制方法，上述方法中使用的由單鏈RNA構(gòu)成的靶基因用多核苷酸序列的元件(II)使用由核苷酸序列或非核苷酸序列中的任一種、或它們的組合構(gòu)成的靶基因用序列，上述元件(II)的核苷酸序列由1個堿基或1個堿基以上不足1萬個堿基、1個堿基長度或1個堿基長度以上不足數(shù)百個堿基長度(例如，700個堿基、500個堿基或300個堿基)的核苷酸序列、1個堿基長度～數(shù)十個堿基長度(例如70個堿基、50個堿基、30個堿基)的核苷酸序列構(gòu)成的靶基因用序列，由1個堿基長度～20個堿基長度的核苷酸序列或用序列號3或4表示的元件(II)構(gòu)成的靶基因用序列。
另外，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種靶基因功能的抑制方法，其中，所述元件(II)的核苷酸序列或非核苷酸序列使用由PNA、細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移序列、具有誘導(dǎo)活性的序列、干擾素誘導(dǎo)抑制序列、具有RNase抑制活性、反義活性、核酶活性、轉(zhuǎn)移RNA的序列中的任一種或它們的組合構(gòu)成的上述靶基因用序列。靶基因可以為編碼含有mRNA的蛋白質(zhì)的RNA、tRNA、rRNA、Xist、不編碼含有腺病毒VA RNA的蛋白質(zhì)的功能性RNA、病毒基因組RNA。
而且，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種靶基因功能的抑制方法，其中，由上述元件(III)的由連續(xù)15～30個或18～25個多核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列包括DNA或RNA；一種靶基因功能的抑制方法，其中，所述元件(I)或(III)的序列至少在任一個末端具有或在內(nèi)部缺失、取代或補加1個至數(shù)個堿基的U、T、G、C或A；一種靶基因功能的抑制方法，其中，上述多核苷酸序列是利用化學(xué)合成法或基因重組技術(shù)得到的。
另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種使用序列號1或2的單鏈RNA的靶基因功能抑制方法。
而且，根據(jù)本發(fā)明，提供一種上述靶基因功能的抑制方法，在所述方法中，靶基因用序列的元件(II)由核苷酸序列或非核苷酸序列中的任一種或由它們的組合構(gòu)成，該元件(II)的核苷酸序列為由1個堿基或1個堿基以上不足1萬個堿基、1個堿基長度至數(shù)百個堿基長度的核苷酸序列、1個堿基長度至數(shù)十個堿基長度的核苷酸序列構(gòu)成的靶基因用序列、1個堿基長度至20個堿基長度的核苷酸序列或用序列號3或4表示的元件(II)構(gòu)成的靶基因用序列。
另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種靶基因功能的抑制方法，其中，上述元件(II)的核苷酸序列或非核苷酸序列使用由PNA、細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移序列、具有誘導(dǎo)活性的序列、干擾素誘導(dǎo)抑制序列、具有RNase抑制活性的序列、具有反義活性的序列、具有核酶活性的序列及具有轉(zhuǎn)移RNA活性中任一種的序列或由它們的組合構(gòu)成的上述靶基因用序列。
而且，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種通過特異性地分解由靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA或作為靶基因的RNA、或選擇性地抑制其翻譯來抑制作為靶的RNA或蛋白質(zhì)功能表達的方法，一種特異性地分解靶基因的方法來抑制靶基因表達的方法，一種利用上述任一種方法產(chǎn)生培養(yǎng)基因剔除細胞、組織、非人類動物或植物。另外，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種靶基因功能的試驗方法，在細胞、組織、非人類動物或植物中，將由連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件構(gòu)成的經(jīng)分離或純化的單鏈多核苷酸序列導(dǎo)入該細胞、該組織、該非人類動物或該植物內(nèi)，利用其對具有與上述(I)或(III)元件中的任一種互補的序列的RNA具有的RNA功能抑制活性，試驗靶基因的功能；一種檢測候選化合物的方法，在將待檢化合物與細胞或組織一同培養(yǎng)后，在該細胞或組織中導(dǎo)入由連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件構(gòu)成的經(jīng)分離或純化的單鏈多核苷酸序列，與對照組比較對與上述(I)或(III)元件中的任一種互補的RNA的RNA功能抑制活性，檢測出促進靶基因的功能抑制的候選化合物(其中，元件(III)包含具有與靶基因互補的序列的連續(xù)15～30個或18～25個堿基長度的多核苷酸序列，元件(II)為1堿基～1萬個堿基長度的核苷酸序列或非核苷酸序列，元件(I)為包含與元件(III)互補的序列的多核苷酸序列，另外，上述由連續(xù)15～30個或18～25個多核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列包含DNA或RNA)。
另外，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種靶基因的功能相互作用物的篩選方法，在細胞、組織、非人類動物或植物中，將由連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件構(gòu)成的經(jīng)分離或純化的單鏈多核苷酸序列導(dǎo)入該細胞、該組織、該非人類動物或該植物中，利用其對與上述(I)或(III)元件中的任一種互補的RNA具有的RNA功能抑制活性，進行篩選(其中，元件(III)包含具有與靶基因互補的序列的連續(xù)15～30個或18～25個堿基長度的多核苷酸序列，元件(II)為1堿基～1萬個堿基長度的核苷酸序列或非核苷酸序列，元件(I)為包含與元件(III)互補的序列的多核苷酸序列，另外，上述由連續(xù)15～30個或18～25個多核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列包含DNA或RNA)。
根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種篩選方法，所述篩選方法為在細胞、組織、非人類動物或植物中，將由連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件構(gòu)成的經(jīng)分離或純化的單鏈多核苷酸序列導(dǎo)入該細胞、該組織、該非人類動物或該植物中，利用其對與上述(I)或(III)元件中的任一種互補的RNA具有的RNA功能抑制活性，確定刺激或抑制與靶基因相關(guān)功能的化合物；所述篩選方法包括選自下述方法的方法
(a)利用直接或間接結(jié)合在該候選化合物上的標(biāo)記，測定候選化合物與由該靶基因編碼的氨基酸序列的多肽或靶基因表達產(chǎn)物(或攜帶由該靶基因編碼的氨基酸序列的多肽或靶基因表達產(chǎn)物的細胞或其膜)或其融合蛋白質(zhì)的結(jié)合的方法；(b)在標(biāo)記競爭物質(zhì)的存在下，測定候選化合物與導(dǎo)入了該單鏈多核苷酸序列的細胞(或攜帶該單鏈多核苷酸序列的細胞或其膜)或其融合物的結(jié)合的方法；(c)使用適用于攜帶所述多肽或靶基因表達產(chǎn)物的細胞或細胞膜的檢測體系，確定是否形成由候選化合物利用該單鏈多核苷酸序列活化或抑制由靶基因編碼的氨基酸序列的多肽或該靶基因表達產(chǎn)物而產(chǎn)生的信號的方法；(d)將候選化合物、與含有由靶基因編碼的氨基酸序列的多肽或靶基因表達產(chǎn)物的溶液同時混合，調(diào)制混合物，測定該混合物中該多肽或該靶基因表達產(chǎn)物的活性，將該混合物的活性與標(biāo)準(zhǔn)進行比較的方法；以及(e)檢測候選化合物對編碼由細胞內(nèi)的該靶基因編碼的氨基酸序列的多肽的mRNA及產(chǎn)生由該靶基因編碼的氨基酸序列的多肽的效果的方法(其中，元件(III)包含具有與靶基因互補的序列的連續(xù)15～30個或18～25個堿基長度的多核苷酸序列，元件(II)為1堿基～1萬個堿基長度的核苷酸序列或非核苷酸序列，元件(I)為包含與元件(III)互補的序列的多核苷酸序列，另外，上述由連續(xù)15～30個或18～25個多核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列包含DNA或RNA)。
以下本說明書中用氨基酸、肽、堿基序列、核酸等的省略符號的表示沿用IUPAC-IUB規(guī)定(IUPAC-IUB Communication onBiological Nomenclature，Eur.J.Biochem.，1389(1984))、“用于制作含有堿基序列或氨基酸序列的說明書等的指南”(日本專利局編)及該領(lǐng)域內(nèi)的慣用符號。另外，DNA合成、含有外源性基因的載體(表達載體)制備、利用該載體進行形質(zhì)轉(zhuǎn)換而成的宿主細胞及宿主細胞分泌的表達蛋白的制備方法等可以利用通常的基因工程方法容易地制備、取得(參見Molecular Cloning 2d Ed，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)；續(xù)生化學(xué)實驗講座“基因研究法I、II、III”，日本生化學(xué)會編(1986)等)。
作為本發(fā)明基因的一個具體例，可以舉出由下述實施例中示出的命名為“uGL3.12RNA”及“uGL3.7RNA”的靶基因用多核苷酸序列演繹而來的基因。其堿基序列如序列號1及2所示。
該多核苷酸序列為序列號1所示的52個堿基長度的多核苷酸序列的新型靶基因用多核苷酸序列，元件(I)由19個寡核苷酸序列構(gòu)成，元件(II)由12個寡核苷酸序列構(gòu)成，元件(III)由21個寡核苷酸序列構(gòu)成?；蛐蛄刑?表示的45個堿基長度的多核苷酸序列的新型靶基因用多核苷酸序列，元件(I)由19個寡核苷酸序列構(gòu)成，元件(II)由7個寡核苷酸序列構(gòu)成，元件(III)由21個寡核苷酸序列構(gòu)成。
需要說明的是本發(fā)明中，基因的含義不僅為2條鏈DNA，還包括構(gòu)成2條鏈DNA的稱為有義鏈及反義鏈的各單鏈DNA、或2條鏈及單鏈RNA，另外，對其長度也無任何限定。因此，若無特別說明，本發(fā)明的基因包括含有人基因組DNA的2條鏈DNA及含有cDNA的單鏈DNA(有義鏈)以及具有與該有義鏈互補的序列的單鏈DNA(反義鏈)、及含有病毒基因組的RNA及其片段中的任一種。
在本發(fā)明中，基因包括前導(dǎo)序列、編碼區(qū)域、外顯子、內(nèi)含子。多核苷酸可以舉出RNA、DNA、PNA(肽核酸)等。DNA包括cDNA、基因組DNA、合成DNA；RNA包括mRNA、tRNA、rRNA、UsnRNA(富含尿苷的小核RNA)、病毒基因組、病毒mRNA、5sRNA、轉(zhuǎn)移RNA、核酶及上述PNA、或能夠與天然核苷酸結(jié)合的多胺等，具有特定氨基酸序列的多肽包括其片段、同族體、衍生體、變異體。
變異體是指天然存在的等位變異體、非天然存在的變異體、經(jīng)缺欠、取代、補加及插入得到的變異體等實質(zhì)上沒有改變被編碼的多肽功能的多核苷酸序列。
需要說明的是上述氨基酸序列的改變(變異等)也包括天然地利用例如突變或翻譯后的修飾等而產(chǎn)生的變異，也可以利用來自天然的基因(例如本發(fā)明的具體例中的基因)進行人為變異。
上述多肽至少含有90％、優(yōu)選為95％、更優(yōu)選為98％、進一步優(yōu)選為99％相同的等位變異體、同系物、天然變異體。
本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列被定義為由具有由3種元件構(gòu)成的核苷酸或非核苷酸序列的單鏈構(gòu)成的序列，該元件是由連續(xù)地按照元件(I)+元件(II)+元件(III)的順序連接的單鏈構(gòu)成的多核苷酸序列。
由上述3種元件構(gòu)成的單鏈構(gòu)成的多核苷酸序列可以在獨立制作各元件后進行接合，或者也可以作為一個構(gòu)成要件進行制作。上述靶基因用多核苷酸序列可以經(jīng)化學(xué)合成，也可以采用基因重組技術(shù)進行制作。上述技術(shù)為該領(lǐng)域通常使用的方法，只要是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員，就能夠充分地獲得作為目的的靶基因用多核苷酸序列，得到經(jīng)分離或純化的單鏈多核苷酸序列。上述DNA合成可以為利用亞磷酰胺法或三酯法的化學(xué)合成，也可以使用市售的自動寡核苷酸合成裝置進行。另外，可以通過擴增本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列的長度、或為了進入表達載體而將必要的2條鏈片段合成互補鏈、在適當(dāng)條件下使該鏈一同進行退火、或使用DNA聚合酶使其與適當(dāng)?shù)囊镄蛄幸煌a加互補鏈，從而得到化學(xué)合成的單鏈產(chǎn)物。
合成后的RNA或DNA可以用PAGE或陰離子交換HPLC等進行純化。
另外，RNA合成由于在2’位具有羥基，因此與DNA合成相比更難以合成，合成中，2’位需要保護基，因生成后的脫鹽、脫保護過程而大幅度降低收量，或影響鏈的穩(wěn)定性，但是，通過使用鄰位酯(2’-ACE)來保護2’位，能夠進行穩(wěn)定的RNA合成，該方法可以在用Dharmacon公司的2’-ACE合成RNA寡核苷酸保護2’位后，通過在使用時使用揮發(fā)性緩沖劑，能夠容易地進行脫鹽、脫保護(http//dharmacon.com/sirna.html)。另外，RNA的合成也可以根據(jù)亞磷酰胺法、與市售的Applied Biosystems公司制備ABI 3900高通量DNA合成器等同時，使用RNA合成用試劑來進行合成。
而且，作為目的的多核苷酸合成優(yōu)選例如采用被保護核糖核苷酸·亞磷酰胺法，使用上述2’-ACE法及優(yōu)選的脫氧核糖核酸/RNA合成機，進行化學(xué)合成。上述多核苷酸的合成使用市售的脫氧核糖核酸/RNA合成機、并按照該機器附帶的使用說明書的順序進行自身合成，或委托受理此種多核苷酸合成的公司或部門進行合成，在該領(lǐng)域也是比較容易的。上述可委托方例如有Dharmacom Research公司(Lafayette，CO，USA)、Genset Oligos(Genset Oligos公司http//www.gensetoligos.com/)、Ambion公司、Xeragon(http//www.xeragon.com)、Peribio Science公司(http//perbio.com/)、ChemGenes公司(http//www.chemgenes.com)等，可以委托上述公司合成脫氧核糖核酸/RNA。
上述本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列的獲取方法可以舉出“Methods in Enzymology，154，350，367～382(1987)；同100，468(1983)；Nucleic Acids Res.，12，9441(1984)；續(xù)生化學(xué)實驗講座1“基因研究法II”，日本生化學(xué)會編，p105(1986)”等基因工程方法，磷酸三酯法或亞磷酰胺法等化學(xué)合成方法(J.Am.Chem.Soc.，89，4801(1967)；同91，3350(1969)；Science，150，178(1968)；Tetrahedron Lett.，22，1859(1981)；同24，245(1983))及上述方法的組合方法等。
另外，本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列的元件(I)或(III)只要部分或全部與作為靶的基因的RNA互補即可，作為靶的RNA可以以mRNA、tRNA、rRNA、病毒基因組、病毒mRNA、XistRNA等包括哺乳動物的細胞內(nèi)存在的全部RNA為對象。由此，包含與靶基因RNA互補部分的元件(III)可以為連續(xù)15～30個堿基長度的多核苷酸序列，優(yōu)選為18～25個堿基長度的多核苷酸序列，更優(yōu)選為19～21個堿基長度的多核苷酸序列。另外，以元件(III)部分或全部互補為靶進行選擇的基因區(qū)域優(yōu)選從編碼該基因的起始密碼子開始50至100個堿基的下游外顯子部位，優(yōu)選避開5’及3’UTRs。更優(yōu)選靶基因的互補部位序列的特異性高的情況。另外，作為被選擇的區(qū)域，可以舉出以在該區(qū)域中含有50％左右G或C的稱為AA(N19)TT的序列區(qū)域作為與被選擇的元件(III)的部分或全部互補的區(qū)域。在未發(fā)現(xiàn)上述序列的情況下，也可以用末端部位為AA(N21)或CA(N21)的序列代替。
另外，上述元件(III)可以為RNA，也可以為DNA。
上述本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列的元件(III)中與靶基因互補區(qū)域的確定可以利用NCBI的blast查詢來實施、確定。另外，也可以使用合成為任意序列的元件(III)，選擇抑制靶基因功能的多核苷酸序列，用于本發(fā)明的用途。
另外，本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列的元件(I)為與元件(III)序列互補的序列，或與元件(III)序列的50％超互補序列，也可以在選擇為靶的基因區(qū)域內(nèi)與元件(III)的序列同樣地互補。而且，本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列的元件(III)比元件(I)的序列長度長1個或數(shù)個堿基長度左右，例如，可以補加2個堿基的尿嘧啶(U)。另外，上述靶基因用多核苷酸序列的元件(I)或元件(III)在該序列中的任一個均至少在一個末端具有或在內(nèi)部缺失、取代或補加1個至數(shù)個堿基的U、T、G、C或A。
本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列的元件(II)可以為核苷酸序列或非核苷酸序列中的任一種，或它們的組合。對于該核苷酸序列而言，例如可以舉出核苷酸序列由1個堿基或1個堿基以上、不足1萬個堿基的核苷酸序列組成，優(yōu)選1個堿基長度至數(shù)百個堿基長度的核苷酸序列、1個堿基長度至數(shù)十個堿基長度的核苷酸序列、1個堿基長度至20個堿基長度的核苷酸序列、利用剪接等細胞內(nèi)具有的機制在細胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生上述長度的核苷酸的元件(II)或由本發(fā)明的下述實施例所示的用序列號3或4表示的序列構(gòu)成的核苷酸序列。另外，該核苷酸序列可以包含元件(I)或(III)的互補序列。另外，作為本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列的元件(II)的非核苷酸序列，可以舉出具有聚酰胺骨架的類似核酸的化學(xué)合成同系物PNA(肽核酸)。而且，作為構(gòu)成元件(II)的核苷酸序列，可以為聚A、tRNA、UsnRNA、來源于逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的CTE序列等細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移序列、NF-kappaβ結(jié)合序列、E2F結(jié)合序列、SSRE、NF-AT等具有誘導(dǎo)活性的序列、腺病毒的VA1或VA2 RNA等干擾素誘導(dǎo)抑制序列、具有RNase抑制活性、反義活性、核酶活性的序列、用于確定轉(zhuǎn)移RNA或表達部位的標(biāo)記序列、用于檢測的大腸菌中的選擇標(biāo)記序列等中的任一種，或它們的組合序列。誘導(dǎo)活性等必須部分雙鏈的功能序列可以利用含有互補核苷酸的序列制作。而且，在元件(II)的內(nèi)部具有含有內(nèi)含子的供體序列、受體序列的剪接所必需的序列，由此，可以在具有剪接機制的細胞內(nèi)將元件(II)的一部分切處進行再次連接。利用上述元件(II)的構(gòu)成，可以獲得進一步增加所希望的RNA功能抑制效果或作為靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的穩(wěn)定性。
另外，本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列也可以使用基因重組技術(shù)進行制備。例如，在化學(xué)合成上述由連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件構(gòu)成的單鏈多核苷酸序列后，基于能夠補加在該序列的兩個末端或其外側(cè)的任意序列(包括啟動子序列、終止子序列)制作PCR用引物，利用PCR使該序列成為2條鏈DNA后，可以進行長度擴增。如上所述，各元件可以全部采用化學(xué)合成，也可以將各元件在化學(xué)合成后進行連接。另外，對于上述啟動子而言，可以與轉(zhuǎn)錄起始點相對應(yīng)地在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄或大腸菌中適當(dāng)?shù)嘏渲肨7啟動子、在真核細胞中適當(dāng)?shù)嘏渲肅MV啟動子、在真核細胞PolIII體系內(nèi)適當(dāng)?shù)嘏渲肬6啟動子、H1啟動子等；終止子除了轉(zhuǎn)錄終止序列外，也可以利用自身切斷型核酶等在相同部位切斷轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物?；蚶媚軌蜓a加在其末端的限制酶識別位點，將擴增長度后的2條鏈DNA限制酶性地連接在載體上，進行長度擴增，可以制備并獲得作為目的的靶基因用多核苷酸序列。在該領(lǐng)域內(nèi)，就目前的技術(shù)水平而言，將其組合在各種質(zhì)粒載體中并不困難。
而且，本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列可以采用基因重組技術(shù)，利用元件(I)及(III)具有互補性的特點進行制作。例如，采用化學(xué)合成方法或基因重組技術(shù)制作元件(I)及元件(III)的互補序列，使元件(II)3’末端的數(shù)個核苷酸(元件(I)的部分序列)與元件(III)的數(shù)個核苷酸互補。利用形成了由數(shù)個堿基對構(gòu)成的互補雙鏈的元件(I)的核苷酸3’末端及元件(III)的核苷酸3’末端，使用包含含有DNA聚合酶或RNA聚合酶等核苷酸合成酶的酶，可以合成由元件(I)、(II)、(III)構(gòu)成的2條鏈多核苷酸，由此可以合成本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列。
元件(III)可以采用化學(xué)合成法或基因重組技術(shù)單獨合成，利用與元件(I)的互補性進行篩選，將由元件(I)及(II)構(gòu)成的分子的3’末端與元件(III)的5’末端化學(xué)性連接或使用連接酶等酶進行連接。
例如采用化學(xué)合成法或基因重組技術(shù)制作元件(I)及(II)，使元件(II)3’末端的數(shù)個核苷酸與元件(I)或(II)的數(shù)個核苷酸互補。將由元件(I)及(II)構(gòu)成的分子導(dǎo)入細胞內(nèi)，利用細胞內(nèi)存在的上述多核苷酸合成酶活性，可以合成元件(III)。核苷酸合成酶也可以利用基因重組或病毒感染等導(dǎo)入細胞內(nèi)。即，僅由元件(I)及(II)構(gòu)成的分子也包括在本靶基因用多核苷酸內(nèi)。
表達由上述元件(I)及(II)構(gòu)成的靶基因用多核苷酸或由元件(I)、(II)及(III)構(gòu)成的靶基因用多核苷酸的載體可以基于上述載體化方法進行合成。
而且，可以將能夠抑制各分子不同的靶基因功能的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用多核苷酸序列表達載體導(dǎo)入培養(yǎng)細胞等內(nèi)，由此可以選擇引起所希望的表達型變化的細胞等，可以分離導(dǎo)入該細胞內(nèi)的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用多核苷酸序列表達載體，利用NCBI的blast查詢等檢索與靶基因用多核苷酸序列或靶基因用多核苷酸序列表達載體的元件(I)或(III)具有互補性的基因序列，由此能夠確定引起所希望表達型變化的靶基因。為了實現(xiàn)上述目的，采用上述互補合成法、互補連接合成法或細胞內(nèi)互補鏈合成法，由此可以制作所謂的隨機化靶基因用多核苷酸。即，采用在相當(dāng)于元件(I)的各核苷酸部位隨機導(dǎo)入A、T、G、C或U中的任一種核苷酸的合成方式合成元件(I)，利用上述方法制作互補的元件(III)。由此可以制作隨機化基因靶載體，由此可以確定引起所希望的表達型變化的靶基因。
由此，能夠容易地制作將本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列插入載體及該重組載體得到的重組載體。
上述重組載體及插入了靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的重組載體制備可以基于由本發(fā)明提供的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的序列信息，根據(jù)如上所述的作為常規(guī)方法的基因重組技術(shù)(例如，參見Science，224，1431(1984)；Biochem.Biophys.Res.Comm.，130，692(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，80，5990(1983)等)進行調(diào)制。另外，只要是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員，就能夠容易地獲取、純化由如上所述地制備的重組體表達載體產(chǎn)生的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列。
另外，將導(dǎo)入了靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的載體分成2條的情況下，必須經(jīng)過由各啟動子轉(zhuǎn)錄而成的寡RNA在作為非常廣大的空間的細胞內(nèi)(寡RNA的1013倍空間)隨機結(jié)合、退火、形成雙鏈的過程，由于其效率非常低，因此推測分成2條的類型的功能弱；但是，由于含有本發(fā)明靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列等與靶基因序列互補的序列的元件(III)和作為與元件(III)的序列互補的序列的元件(I)的序列為單鏈，因此作為導(dǎo)入細胞內(nèi)的序列具有互補性的分子必須位于一側(cè)，形成非常有效地破壞RNA的雙鏈，就這一點而言，制作本發(fā)明載體的意義非常深遠。
而且，通過形成單鏈，與2條鏈相比，其結(jié)果為保護露出末端一側(cè)(本發(fā)明中為元件(I)的3’末端側(cè))，由于露出末端通常容易受到核苷酸的攻擊，因此從這一點考慮，能夠提高導(dǎo)入了本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的載體的穩(wěn)定性。但是，對于脊椎動物而言，雙鏈部分超過30個堿基對的單鏈無法特異性地誘導(dǎo)基因功能抑制，在上述優(yōu)點之前，有用性低。
另外，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種使用本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列抑制細胞、組織、非人類動物或植物中的靶基因的功能的方法。作為該方法的一個具體例，如下述實施例所示，使用本發(fā)明中用序列號1及2表示的靶基因用多核苷酸序列，對HeLa細胞給予靶基因，對熒光素酶基因給予靶基因用多核苷酸序列，結(jié)果利用該基因RNA的RNA功能抑制效果，能夠表現(xiàn)出作為靶基因的熒光素酶基因的熒光素酶活性抑制效果。
更具體而言，基于作為靶的基因的基因序列信息，利用NCBI的blast查詢等，選擇位于與靶基因的編碼區(qū)域的起始啟動子相距50～100個堿基的下游、含有50％左右G或C的AA(N19)TT序列區(qū)域作為與元件(I)部分或全部互補的區(qū)域。該區(qū)域更優(yōu)選為具有作為靶的基因特異性序列的區(qū)域。未發(fā)現(xiàn)上述序列的情況下，將末端部位設(shè)定為AA(N21)或CA，與元件(III)區(qū)域互補，例如，堿基定位為在19個寡核苷酸序列的3’末端補加2個堿基的尿嘧啶得到的21個寡核苷酸序列，然后，將與元件(III)的19個寡核苷酸序列區(qū)域互補的序列堿基定位為元件(I)的構(gòu)成序列。然后，作為元件(II)，確定為由任意7個或12個堿基的RNA序列構(gòu)成的寡核苷酸序列，組合上述序列，使用市售的自動合成機，化學(xué)合成由連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件構(gòu)成的單鏈多核苷酸序列，經(jīng)脫鹽、純化后，為了用于RNA轉(zhuǎn)染，將RNA溶解于蒸餾水中，調(diào)制緩沖液(100mM乙酸鉀，調(diào)制成pH7.4的30mM HEPES-KOH，2mM乙酸鎂)的混合液，用PBS或該緩沖液稀釋成各稀釋倍率的溶液。
然后，制作具有靶基因的調(diào)制成的基因表達載體，添加上述調(diào)制成的各RNA，例如制作在50μl的OPTI-MEM無血清培養(yǎng)基內(nèi)加入了靶基因表達載體與合成后的本發(fā)明靶基因用多核苷酸的反應(yīng)溶液，此時，如果在上述培養(yǎng)基中使用例如Lipofectamine2000等聚陽離子脂質(zhì)體系的轉(zhuǎn)染試劑，則能夠提高導(dǎo)入效率。添加上述試劑后，例如使分株后的動物細胞HeLa3細胞處于融合狀態(tài)后，使用DMEM/10培養(yǎng)基(使用添加了DMEM/10∶10％胎牛血清的D-MEM培養(yǎng)基，在5％CO2、37℃下進行預(yù)培養(yǎng)后，用PBS洗滌細胞，然后，將HeLa 3細胞按每孔0.5ml添加于24孔板的各孔內(nèi)，在5％CO2、37℃下培養(yǎng)24小時后，將上述制成的轉(zhuǎn)染用復(fù)合體添加于各孔之中，然后，再在5％CO2、37℃下培養(yǎng)24小時后，例如作為靶的基因為熒光素酶基因的情況下，使用雙熒光素酶報道基因檢測系統(tǒng)(Dual-LuciferaseReporter Assay System#E1910 Promega公司制備)，用發(fā)光計測定熒光素酶活性測定的化學(xué)發(fā)光。將添加或不添加本發(fā)明的靶基因用寡核苷酸序列時或添加非特異性寡核苷酸序列時該發(fā)光測定值的變化與對照組進行比較，利用這一結(jié)果，例如，與對照組相比，其抑制程度以50％、70％、80％、90％、95％、99％、100％等值為基準(zhǔn)，研究對靶基因的RNA、對本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的靶基因的特異性RNA功能抑制及基因功能抑制效果。由此，能夠提供一種靶基因功能的抑制方法，利用上述方法，在本發(fā)明的細胞或組織中，將具有連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件的分離或純化后的單鏈多核苷酸序列導(dǎo)入該細胞或該組織內(nèi)，利用其對與上述(I)或(III)元件的多核苷酸序列互補基因的RNA具有的RNA功能抑制活性，抑制靶基因的功能。另外，在本方法的實施中，抑制靶基因的RNA功能的結(jié)果為抑制基因表達或抑制由該基因編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)表達，由此發(fā)現(xiàn)細胞、組織中的該基因功能發(fā)生變化，因此，根據(jù)本發(fā)明，在細胞或組織內(nèi)，將具有連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件的分離或純化后的單鏈多核苷酸序列導(dǎo)入該細胞或該組織內(nèi)，利用其對與上述(I)或(III)元件的多核苷酸序列互補基因的RNA具有的RNA功能抑制活性，抑制靶基因的功能，利用上述方法，能夠提供一種該靶基因功能表達的抑制方法，以及一種抑制由該基因編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)表達的方法。上述方法中，如上所述，本發(fā)明的靶基因用寡核苷酸序列通過改變、修飾各種元件(II)的核苷酸序列或補加非核苷酸，也能夠進一步提高包括RNA功能抑制活性或細胞質(zhì)移行活性在內(nèi)的功能。
另外，上述各試驗中使用的細胞、組織、細胞溶解液、器官等材料，使用本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列，利用對靶基因的RNA的RNA功能抑制活性，表現(xiàn)出對該基因的RNA功能抑制效果或基因的功能變化，所使用的靶基因的獲取例如可以基于已知基因的具體例的序列信息，采用通常的基因工程方法，容易地制備、獲得(參見Molecular Cloning 2d Ed，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)；續(xù)生化學(xué)講座“基因研究法I、II、III”，日本生化學(xué)會編(1986)等)。具體而言，可以如下實施利用靶基因表達的適當(dāng)起源，根據(jù)常規(guī)方法，調(diào)制cDNA基因文庫，利用該基因文庫，對本發(fā)明基因使用特有的適當(dāng)探針或抗體，選擇所希望的克隆基因(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，78，6613(1981)；Science，222，778(1983)等)。
如上所述，作為cDNA的起源，可以舉出表達靶基因的各種細胞、組織、細胞溶解液或由此它們產(chǎn)生的培養(yǎng)細胞等。另外，可以根據(jù)常規(guī)方法實施來源于人體液、血液或組織的上述cDNA中全部RNA的分離、mRNA的分離或純化、cDNA的獲取及其篩選等處理的任一種。另外，cDNA基因文庫可以為市售的基因文庫，本發(fā)明中，該cDNA基因文庫也可以使用例如Clontech公司(Clontech Lab.Inc.)等市售的各種cDNA基因文庫等。或者也可以使用保藏或市售的小鼠纖維芽細胞NIH3T3、猴的COS7細胞、HeLa細胞、人胚性腎細胞的293細胞的樹立細胞株。
如上所述，本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、或上述序列組合而成的重組載體具有抑制靶基因的RNA功能的活性，利用該活性能夠提供一種抑制基因功能的基因功能抑制方法，因此，例如通過抑制基因的RNA表達或抑制由基因編碼的氨基酸的蛋白質(zhì)表達，能夠抑制該基因或蛋白質(zhì)的功能，從而，通過抑制具有由與各種疾病相關(guān)的過度表達基因或基因變異產(chǎn)生的有害功能的基因或來源于病毒的基因的表達，上述靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、或上述序列組合而成的重組載體能夠提供一種以靶基因用序列或靶基因用多核苷酸序列、或上述序列組合而成的重組載體為有效成分的藥物組合物及由該藥物組合物構(gòu)成的基因治療劑。
由此，根據(jù)本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、或上述序列組合而成的重組載體，能夠抑制靶基因的功能，因此，以本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、或上述序列組合而成的重組載體為有效成分的藥物組合物對下述疾病的治療是有效的，所述疾病包括作為對象的各種疾病被判斷為與具有由基因高表達或基因變異而產(chǎn)生的有害功能的基因或來源于病毒的基因相關(guān)的基因相關(guān)疾病，例如，與c-erbB、erb基因等相關(guān)的乳癌，與hst-1、src、fps、abl、myc、jun、myb等癌相關(guān)基因、白血病病毒、乳癌病毒、肉瘤病毒等RNA腫瘤病毒、HBV、HCV等肝炎病毒、與NPY基因、ANGPTL3基因相關(guān)的肥胖等已被判明了是否與基因相關(guān)的疾病。
而且，在異種間或同種間進行的器官或細胞移植中，通過使用本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列、或上述序列組合而成的重組載體，能夠抑制引起排斥反應(yīng)的基因功能，可以用于治療包括干細胞移植在內(nèi)的各種器官疾病、神經(jīng)疾病。
因此，本發(fā)明提供一種以本發(fā)明的藥物組合物或含有藥物組合物的基因治療用載體及利用該載體導(dǎo)入了本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、或上述序列組合而成的重組載體的細胞為有效成分的藥物。
即，根據(jù)本發(fā)明能夠提供一種基因治療劑，所述基因治療劑以含有本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列、或上述序列組合而成的重組載體的藥物組合物或基因治療用導(dǎo)入用載體及利用該載體導(dǎo)入了本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列、或上述序列組合而成的重組載體的細胞、及該基因治療用導(dǎo)入用載體及利用該載體導(dǎo)入了本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列、或上述序列組合而成的重組載體的細胞為有效成分。
而且，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種藥物，所述藥物含有作為有效成分的含有上述本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列、或上述序列組合而成的重組載體的基因治療用導(dǎo)入用病毒載體，特別是在用于抑制由疾病相關(guān)基因的高表達產(chǎn)生的活性的處置等過程中使用，對于與c-erbB、erb基因等相關(guān)的乳癌，與hst-1、src、fps、abl、myc、jun、myb等癌相關(guān)基因、白血病病毒、乳癌病毒、肉瘤病毒等RNA腫瘤病毒而言，所述藥物作為抗癌劑使用；對于HBV、HCV等肝炎病毒，所述藥物作為抗肝炎治療劑使用；對于與NPY基因、ANGPTL3基因、MGAT基因、DGAT基因相關(guān)的肥胖等，所述藥物作為抗肥胖劑使用。
下面，詳細說明上述基因治療。需要說明的是若無特別說明，則可以使用化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、遺傳學(xué)及免疫學(xué)的慣用方法。所述方法例如記載于Maniatis(Maniatis，T.，et al.，Molecular cloningA laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1982))、Sambrook(Sambrook，J.，et al.，Molecular cloningA laboratory manual，2nd Ed.(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York(1981))、Ausbel(Ausbel，F(xiàn).M.，et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York，New York，(1992))、Glover(Glover，D.，DNA Cloning，I andII(Oxford Press)(1985))、Anand(Anand，Techniques for the Analysis ofComplex Genomes，(Academic Press(1992))、Guthrie(Guthrie，G.，et al.，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，(AcademicPress)(1991))以及Fink(Fink et al.，Hum.Gene Ther.，3，11～19(1992))發(fā)表的文章中。
在基因治療或經(jīng)由基因功能抑制的移植治療中，本發(fā)明提供一種基因治療法，是在上述疾病相關(guān)基因表達的細胞中提供具有與細胞內(nèi)的RNA互補的序列的核苷酸，通過抑制該RNA的功能來抑制翻譯或RNA的功能、抑制上述疾病相關(guān)基因表達，通過提供用于具有上述作用的基因功能抑制藥物，抑制或惰化促進上述疾病的病態(tài)發(fā)展的活性。該治療方法為通過使本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列、或上述序列組合而成的重組載體抑制具有上述疾病相關(guān)基因的細胞本身的RNA功能，影響轉(zhuǎn)錄或翻譯過程，從而抑制靶基因表達?？梢蕴峁┮环N等位特異性功能抑制方法，在本方法中，利用核苷酸互補性的特異性，僅抑制異常RNA的功能，不抑制正常功能。因此，能夠提供一種制備含有與基因的RNA互補的本發(fā)明元件(III)的單鏈多核苷酸、將該單鏈多核苷酸供給靶細胞的方法。
只要提供抑制該疾病相關(guān)基因的功能表達作用，就能夠抑制受體細胞/靶細胞中基因功能的活性。可以使用該靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、或上述序列組合而成的重組載體或質(zhì)粒，維持在染色體外，或者也可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，插入染色體內(nèi)，進行維持，可以導(dǎo)入靶細胞內(nèi)。
利用使用上述靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、或上述序列組合而成的重組載體的癌基因治療，在來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、AAV的載體中組裝該靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列，使其被靶基因功能活性表達細胞感染，抑制靶基因的RNA功能，由此能夠獲得所希望的抗癌效果。
用于導(dǎo)入用于重組及染色體外維持兩者的所希望基因的載體為該領(lǐng)域內(nèi)已知的載體，本發(fā)明中可以使用已知的任一種載體。例如，可以舉出包含連接表達抑制元件的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的拷貝、并且在靶細胞內(nèi)能夠表達該靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的病毒載體或質(zhì)粒載體。作為該載體，通常可以利用上述表達用載體，優(yōu)選例如作為起源載體，可以舉出使用美國專利第5252479號說明書及PCT國際公開WO93/07282號說明書中公開的載體(pWP-7A、pwP-19、pWU-1、pWP-8A、pWP-21及/或pRSVL等)或pRC/CMW(Invitrogen公司制備)等調(diào)制而成的載體。更優(yōu)選下述的各種病毒·載體。
需要說明的是作為基因?qū)胫委熤惺褂玫妮d體中使用的啟動子，可以優(yōu)選利用作為各種疾病治療對象的患部組織固有的物質(zhì)。
作為其具體例，例如，對于肝臟而言，可以舉出白蛋白、α-胎兒蛋白、α1-抗胰蛋白酶、運鐵蛋白、甲狀腺素運載蛋白等。對于結(jié)腸而言，可以舉出羧酸脫氫酶I、癌胚抗原的抗原等。對于子宮及胎盤而言，可以舉出雌激素、芳香化酶P450、膽固醇側(cè)鏈裂解酶P450、17α羥化酶P450等。
對于前列腺而言，可以舉出前列腺抗原、gp91-phox基因、前列腺特異性激肽釋放酶等。對于乳房而言，可以舉出erb-B2、erb-B3、β-酪蛋白、β-乳球蛋白、乳漿蛋白等。對于肺而言，可以舉出活性劑蛋白質(zhì)C尿球蛋白等。對于皮膚而言，可以舉出K-14-角蛋白、人角蛋白1或6、喹啉等。
對于腦而言，可以舉出神經(jīng)膠纖維質(zhì)酸性蛋白質(zhì)、成熟星狀特異蛋白質(zhì)、髓磷脂、酪氨酸脫氫酶胰絨毛蛋白、胰高血糖素、胰島淀粉樣多肽等。對于甲狀腺而言，可以舉出甲狀腺球蛋白、降鈣素等。對于骨而言，可以舉出α1膠原、骨鈣蛋白、骨唾液酸糖蛋白等。對于腎臟而言，可以舉出腎素、肝臟/骨/腎臟堿性磷酸酶、促紅細胞生成素等；對于胰而言，可以舉出淀粉酶、PAP1等。
而且，需要說明的是作為可以在基因?qū)胫委熤惺褂玫妮d體中使用的啟動子，可以使用已知表達不編碼蛋白質(zhì)的短RNA的U6snRNA、7SK、tRNA等Pol III類啟動子。另外，也可以使用pol III類經(jīng)人工改變的啟動子。
需要說明的是在靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列導(dǎo)入用載體的制備中，被導(dǎo)入的靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列可以基于靶基因的堿基序列信息，利用如上所述的普通基因工程方法容易地制備、獲取。
將該靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列導(dǎo)入用載體導(dǎo)入細胞內(nèi)的操作可以根據(jù)例如以電轉(zhuǎn)法、磷酸鈣共沉淀法、病毒形質(zhì)導(dǎo)入、HVJ包膜法等代表性方法將RNA或DNA導(dǎo)入細胞內(nèi)的、該領(lǐng)域內(nèi)已知的各種方法進行。需要說明的是由靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列經(jīng)形質(zhì)轉(zhuǎn)換而成的細胞能夠以其自身分離狀態(tài)用于抑制由基因表達的功能活性的藥物或作為用于治療研究的模型體系使用。
在基因治療中，上述靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列導(dǎo)入用載體可以通過局部或全身注射給予患者的作為對象的組織部位，由此將其導(dǎo)入患者的靶細胞內(nèi)。此時，通過全身給予，能夠使其到達其他部位、甚至能夠表達癌基因或腫瘤病毒的靶基因RNA的任一種細胞。形質(zhì)導(dǎo)入后的基因沒有恒久地組裝在各靶細胞的染色體內(nèi)時，通過定期反復(fù)進行給予能夠?qū)崿F(xiàn)。也可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒等進行恒久性地導(dǎo)入。
本發(fā)明的基因治療方法包括以下兩種方法將上述靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列導(dǎo)入用材料(靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列導(dǎo)入用載體)直接給予體內(nèi)的體內(nèi)法(in vivo)和從患者體內(nèi)取出靶細胞或靶組織，在體外導(dǎo)入基因，然后，將該細胞或組織送回體內(nèi)的體外法(ex vivo)。
另外，也可以將靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列、或經(jīng)PCR法擴增了該序列的序列直接導(dǎo)入細胞內(nèi)，切斷RNA鏈。
另外，可以根據(jù)基因治療(處置)的對象，適當(dāng)選擇導(dǎo)入靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的靶細胞。例如，作為靶細胞，可以舉出確認(rèn)癌基因表達的癌細胞，特別是除了乳房、腎臟、精巢、小腸組織之外，還有淋巴細胞、纖維芽細胞、肝細胞、造血干細胞、脂肪細胞等細胞。
上述基因治療中的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列導(dǎo)入方法包括病毒性導(dǎo)入方法及非病毒性導(dǎo)入方法。
作為病毒性導(dǎo)入方法，可以舉出使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體作為載體的方法。作為其他病毒載體，可以舉出腺病毒載體、HIV(humanimmunodeficiency virus)載體、腺病毒伴隨病毒載體(AAV，adeno-associated virus)、皰疹病毒載體、單純皰疹病毒(HSV)載體及埃-巴二氏病毒(EBV，Epstein-Barr virus)載體等。
作為非病毒性基因?qū)敕椒ǎ梢允褂靡韵路椒姿徕}共沉淀法；使封入了多核苷酸的脂質(zhì)體與預(yù)先用紫外線破壞了基因的惰化仙臺病毒融和制成膜融和脂質(zhì)體，使其與細胞膜直接融和，將多核苷酸導(dǎo)入細胞內(nèi)的膜融和脂質(zhì)體法；多核苷酸的質(zhì)粒用金覆蓋，經(jīng)高壓放電，將多核苷酸物理性地導(dǎo)入細胞內(nèi)的方法；直接經(jīng)體內(nèi)將寡核苷酸的質(zhì)粒注入器官或腫瘤內(nèi)的裸(naked)寡核苷酸法；將包埋在多重膜正電荷脂質(zhì)體中的基因?qū)爰毎麅?nèi)的陽離子性脂質(zhì)體法；為了將基因僅導(dǎo)入特定的細胞內(nèi)而不導(dǎo)入其他細胞內(nèi)，使與靶細胞內(nèi)表達的受體接合的配體與本發(fā)明的多核苷酸接合，從而將其給予的配體-DNA復(fù)合體法等。
作為其中的一例，簡要說明本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列導(dǎo)入用EBV載體的制備，EB病毒(Epstein-Barr virusEBV)為1964年由Epstein等從來源于伯基特(Burkitt)淋巴腫瘤的培養(yǎng)細胞中分離出來的屬于皰疹科的病毒(Kieff，E.and Liebowitz，D.Virology，2nd ed.Raven Press，New York，1990，pp.1889～1920)。由于該EBV使細胞具有轉(zhuǎn)化活性，因此為了成為基因?qū)胗幂d體，必需調(diào)制缺少該轉(zhuǎn)化活性的病毒?？梢匀缦聦嵤?br> 即，首先，克隆組成所希望的外來基因的靶DNA附近的EBV基因組。在其中組裝具有與外來基因互補的序列的多核苷酸片段和耐藥性基因，得到重組病毒制作用載體。然后，將用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗟闹亟M病毒制作用載體轉(zhuǎn)染在EBV陽性Akata細胞內(nèi)。利用相同的重組產(chǎn)生的重組病毒經(jīng)利用抗表面免疫球蛋白處理的病毒產(chǎn)生刺激，也可以與野生型Akata EBV一同回收。使其感染EBV陰性Akata細胞，在藥劑存在下選擇耐性株，由此能夠得到不共存野生型EBV、僅感染所希望的重組病毒的Akata細胞。而且，通過誘導(dǎo)重組病毒感染Akata細胞產(chǎn)生病毒活性，能夠產(chǎn)生作為目的產(chǎn)物的大量重組病毒載體。
不使用重組病毒載體將所希望的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列導(dǎo)入靶細胞、制備非病毒載體可以利用例如采用膜融和脂質(zhì)體的基因?qū)敕椒ㄟM行實施。該方法為使膜脂質(zhì)體(由脂質(zhì)雙層膜構(gòu)成的小胞)具有對細胞膜的融合活性、由此將脂質(zhì)體的內(nèi)容物直接導(dǎo)入細胞內(nèi)的方法。
上述利用膜融合脂質(zhì)體導(dǎo)入反義·寡核苷酸可以根據(jù)例如中西等人的方法進行(Nakanishi，M.，et al.，Exp.Cell Res.，159，399～499(1985)；Nakanishi，M.，et al.，Gene introduction into animal tissues.In trends andFuture Perspectives in Peptide and Protein Drug Delivery(ed.by Lee，V.H.et al.).，Harwood Academic Publishers Gmbh.Amsterdam，1995，pp.337～349)。
另外，作為使用其他的脂質(zhì)體將靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列導(dǎo)入靶細胞內(nèi)的方法，可以舉出利用陽離子性脂質(zhì)體的反義多核苷酸導(dǎo)入法。該方法基于八木等人的方法進行實施(Yagi，K.，et al.，B.B.R.C.，196，1042～1048(1993))。該方法著眼于質(zhì)粒和細胞均帶有負(fù)電荷，在脂質(zhì)體膜的內(nèi)外兩個表面上賦予正電荷，利用靜電力增加質(zhì)粒的進入，提高與細胞的相互作用。此處使用的脂質(zhì)體為具有正電荷的多層大脂質(zhì)體(multilamellar large vesiclesMLV)時是有用的，也可以使用1張大單層脂質(zhì)體(large unilamellar vesiclesLUV)或1張小單層脂質(zhì)體(small unilamellar vesiclesSUV)與質(zhì)粒制成復(fù)合體，將所希望的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列導(dǎo)入細胞內(nèi)。
在本發(fā)明的基因治療中，將所希望的基因?qū)氚屑毎虬薪M織的方法包含有代表性的2種方法。
本發(fā)明針對基因治療領(lǐng)域，將基因?qū)氚屑毎澳繕?biāo)組織，主要包含兩種典型的方法。
第一種方法是，從治療對象的患者身上取出靶細胞后，將該細胞在體外添加例如白介素-2(IL-2)等物質(zhì)進行培養(yǎng)，并將包含在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的作為靶點的靶基因寡核苷酸序列以及靶基因用序列導(dǎo)入細胞，將得到的細胞以再移植的方法(ex vivo)再次導(dǎo)入體內(nèi)。該方法對ADA缺乏癥的發(fā)生、由基因缺陷引發(fā)的基因病及動脈硬化、癌癥、AIDS等疾病有很好的療效。
第2種方法是，將靶基因用多核苷酸序列，及靶基因用序列(含有與疾病相關(guān)的基因的RNA互補的寡核苷酸的多核苷酸)直接注入患者體內(nèi)的腦、腎臟、精巢、小腸組織等靶部位，即基因直接導(dǎo)入法。
上述基因治療的第1種方法具體例如可以按下述實施。即，使用血液分離裝置從患者體內(nèi)分離提取單核細胞，使用AIM-V等適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基并加入IL-2培養(yǎng)72小時，加入含有欲導(dǎo)入的靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列(含有與疾病相關(guān)的基因的RNA互補的寡核苷酸的多核苷酸)的載體。為了提高靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列的導(dǎo)入效率，也可以在32℃下加入魚精蛋白以2500轉(zhuǎn)速離心1小時后，在37℃及10％二氧化碳的條件下培養(yǎng)24小時。在進行此操作數(shù)次后，再以AIM-V等適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基并加入IL-2培養(yǎng)48小時，用生理鹽水洗滌細胞，計算活細胞數(shù)，并使用前述的in situ PCR等方法檢測例如作為研究對象的與疾病相關(guān)的基因的表達活性，或者其活性的程度，以此確認(rèn)靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列(含有與疾病相關(guān)的基因的RNA互補的寡核苷酸的多核苷酸)的導(dǎo)入效果。
此外，進行培養(yǎng)細胞中有無細菌和真菌生長、支原體感染、及內(nèi)毒素檢索的安全性檢查，在確認(rèn)安全性后，以導(dǎo)入預(yù)測效果劑量的靶基因用多核苷酸序列及靶基因用序列(含有與疾病相關(guān)的基因的RNA互補的寡核苷酸的多核苷酸)的培養(yǎng)細胞對患者進行點滴靜注以進行返回。以所述方法進行如數(shù)周或數(shù)月的操作，進行基因治療。
此處的病毒載體的用量根據(jù)導(dǎo)入靶細胞進行適當(dāng)?shù)倪x擇。通常，以病毒量為例，相對于細胞數(shù)1×108，采用1×103cfu至1×108cfu范圍的給予量。
作為上述第1種方法的另一種形式，使用含有靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列(含有與疾病相關(guān)的基因的RNA互補的寡核苷酸的多核苷酸)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的病毒產(chǎn)生細胞與患者細胞進行共同培養(yǎng)，向該靶細胞中導(dǎo)入靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列(含有與疾病相關(guān)的基因的RNA互補的寡核苷酸的多核苷酸)，采用此種方法也是可行的。
在實施基因治療的第2種方法(直接法)時，希望根據(jù)特別是體外預(yù)備實驗的情況及基因?qū)敕ǖ那闆r，對于靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列(含有與疾病相關(guān)的基因的RNA互補的寡核苷酸的多核苷酸)有沒有實際導(dǎo)入等狀況，用靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列的PCR法或in situ PCR法進行確認(rèn)，或者基于靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列(含有與疾病相關(guān)的基因的RNA互補的寡核苷酸的多核苷酸)的導(dǎo)入，確認(rèn)所期望的作為治療效果的特殊活性的增加，以及靶細胞的增殖或抑制等情況。此外，在采取逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的場合，用PCR法檢測有復(fù)制活性的逆轉(zhuǎn)錄病毒，進行逆轉(zhuǎn)錄酶的活性測定，以及用PCR法監(jiān)測膜蛋白(env)基因的活性，由此確認(rèn)靶基因用多核苷酸序列、或及靶基因用序列在導(dǎo)入時的安全性，這在進行基因治療時尤為重要。
本發(fā)明提供一種同時含有藥學(xué)有效量的活性成分、適當(dāng)?shù)臒o毒性藥物載體或稀釋劑的藥物組合物或藥物制劑(基因治療制劑)，所說的活性成分是導(dǎo)入了本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列或組裝了這些序列的導(dǎo)入用載體，或?qū)肓税谢蛴枚嗪塑账嵝蛄?、靶基因用序?含有與疾病相關(guān)的基因的RNA互補的寡核苷酸的多核苷酸)的細胞。
在可以與本發(fā)明的藥物組合物(藥物制劑)配合使用的藥物輔料方面，根據(jù)制劑使用情況的不同，可以舉出通常使用的填充劑、增量劑、粘合劑、增濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑等種類的稀釋劑以及賦形劑等，可根據(jù)上述材料能制得的制劑形態(tài)進行適當(dāng)?shù)倪x擇。
舉例說明，本發(fā)明中的含有靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列導(dǎo)入用載體的藥物制劑，由包含有該載體的脂質(zhì)體的形態(tài)，或者以含有所希望的靶基因用多核苷酸序列，及靶基因用序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的培養(yǎng)細胞的形態(tài)調(diào)制而成。
所述的物質(zhì)可用磷酸緩沖生理鹽水(pH 7.4)、復(fù)方生理鹽水、細胞內(nèi)組成液用注射劑形態(tài)調(diào)制而成，也可用加入魚精蛋白等提高基因?qū)胄实奈镔|(zhì)共同制備而成。
上述藥物制劑的給藥方法中沒有特殊的限制，可根據(jù)各種制劑的形態(tài)、患者的年齡、性別以及其他條件、病患的程度等等進行選擇。
上述藥物制劑中應(yīng)含有的有效成分以及給藥量沒有特殊的限制，可根據(jù)所希望的治療效果、給藥方法、治療療程，患者的年齡、性別及其他的條件等選擇適當(dāng)?shù)姆秶?br> 通常，作為藥物制劑的含有所希望的靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的給藥量為，以1日1kg為例，逆轉(zhuǎn)錄病毒的效價在1×103pfu到1×1015pfu之間為宜。
對于導(dǎo)入了所希望的靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列的細胞而言，在1×104細胞/body到1×1015細胞/body范圍之間選擇為宜。
該制劑可以每日一次或者每日數(shù)次分開給藥，也可以一周或數(shù)周為間隔進行給藥。此外，優(yōu)選同時給以魚精蛋白等提高基因?qū)胄实奈镔|(zhì)或含有該物質(zhì)的制劑。
此外，關(guān)于本發(fā)明的細胞和組織，將含有連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件的經(jīng)分離和純化的單鏈多核苷酸序列導(dǎo)入該細胞和組織，通過和上述(I)和(III)元件的多核苷酸序列的互補的基因的RNA的結(jié)合體現(xiàn)抑制RNA功能的作用，由此，本發(fā)明提供了抑制靶基因的方法，以及抑制由該基因編碼的氨基酸序列形成的蛋白質(zhì)及RNA表達的方法，以及可以容易地檢測靶基因的功能變化的方法。該方法以后面所述的實施例為例，本發(fā)明通過抑制靶基因的mRNA的RNA活性，從而抑制靶基因的功能，并可以觀察由此出現(xiàn)的基因功能的變化。該基因的功能變化可通過檢測基因表達抑制的DNA雜交分析，DNA微陣列以及由基因編碼的蛋白質(zhì)的表達的抑制來進行判斷，并用采用蛋白質(zhì)抗體的免疫印記分析，可以同時檢測出酶反應(yīng)、熒光反應(yīng)等各種活性功能的變化，本發(fā)明也提供了觀察含有檢測到的全部基因以及蛋白質(zhì)的表達量變化的細胞及組織功能變化的方法。
本發(fā)明還可以提供使用本發(fā)明的靶基因用多核苷酸的由上述方法生產(chǎn)的培養(yǎng)細胞以及組織功能低下的基因剔除(knock-down)細胞、組織、非人類動物、植物；利用本發(fā)明的基因破壞方法生產(chǎn)的培養(yǎng)細胞、組織、非人類動物、植物功能低下的基因剔除細胞、組織、非人類動物、植物。在非人基因剔除動物的制備中，可以使用本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列或組裝了這些序列的導(dǎo)入用載體，將其導(dǎo)入到受精卵中，該方法比較容易實現(xiàn)?？梢砸源朔椒ǐ@得小鼠、大鼠、兔、羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴、黑猩猩、青蛙、魚等基因剔除動物。對于植物同樣有大豆、紅花菜豆等豆科植物，水稻、小麥、玉米、白薯等谷物類，黃瓜、番茄、辣椒、茄子、蘆筍、洋蔥等蔬菜類，蘋果、葡萄、無花果、獼猴桃、柑桔類、草莓、杏、桃、甜瓜、核桃等水果及堅果類植物，絲柏、椰子、杉木、楓樹、蕨類、梔子、長春花等裝飾作物，薔薇、康乃馨、菊、日本打碗花、鳳仙花、秋海棠等觀賞性植物，上述植物都可以被容易地轉(zhuǎn)化為基因剔除植物。
通過提供功能抑制的基因剔除細胞、組織、非人類動物以及植物，使用該細胞或組織，可以檢測出可能具有對該細胞和組織的功能產(chǎn)生影響的候選化合物。如前所述，如果能綜合細胞、組織、非人類動物以及植物的功能的變化，結(jié)合疾病的病狀以及生物的發(fā)育、耐受性等等變化進行觀察，則可以使用本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列，并用前述的候選化合物對細胞、組織等進行給藥，通過觀察基因功能的變化觀測候選化合物對該細胞及組織的作用，以此可以檢驗候選化合物在藥物、農(nóng)藥等領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用價值。
如上所述，被檢化合物在與細胞及組織共同培養(yǎng)后，對于該細胞以及組織使用含有連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件的經(jīng)分離和純化的單鏈多核苷酸進行導(dǎo)入，與前述的(I)和(III)多核苷酸序列互補的基因的RNA功能受到抑制，將其活性抑制與對照組進行比較，由此可以提供檢測能促進靶基因RNA破壞的候選化合物。
此外，作為上述候選化合物的檢測方法，例如有使用本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列對藥物靶基因進行篩選的方法，在該細胞和組織中導(dǎo)入含有連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件的經(jīng)分離和純化的單鏈多核苷酸，抑制與前述的(I)和(III)多核苷酸序列互補的靶基因的mRNA的RNA功能，以此作為鑒別刺激或者抑制靶基因功能的化合物，具體詳細表述如下(a)利用直接或間接結(jié)合在該候選化合物上的標(biāo)記，測定候選化合物與具有由該靶基因編碼的氨基酸序列的多肽或靶基因表達產(chǎn)物(或攜帶由該靶基因編碼的氨基酸序列的多肽或靶基因表達產(chǎn)物的細胞或其膜)或其融合蛋白質(zhì)的結(jié)合的方法；
(b)在標(biāo)記競爭物質(zhì)的存在下，測定候選化合物與導(dǎo)入了該單鏈多核苷酸序列的細胞(或攜帶該單鏈多核苷酸序列的細胞或其膜)或其融合物的結(jié)合的方法；(c)使用適用于攜帶所述多肽或靶基因表達產(chǎn)物的細胞或細胞膜的檢測體系，確定候選化合物是否利用該單鏈多核苷酸序列活化或抑制由靶基因編碼的氨基酸序列的多肽或該靶基因表達產(chǎn)物而產(chǎn)生的信號的方法；(d)將候選化合物、與含有由靶基因編碼的氨基酸序列的多肽或靶基因表達產(chǎn)物的溶液同時混合，調(diào)制混合物，測定該混合物中該多肽或該靶基因表達產(chǎn)物的活性，將該混合物的活性與標(biāo)準(zhǔn)進行比較的方法以及(e)檢測候選化合物對細胞中產(chǎn)生編碼由該靶基因編碼的氨基酸序列的多肽的mRNA及由該靶基因編碼的氨基酸序列的多肽的效果的方法。
上述候選化合物可以為下述任何一種物質(zhì)，例如肽類、蛋白、非肽類化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細胞提取液、植物提取液、動物組織提取液、血漿等，這些化合物可以是新化合物，也可以是公知的化合物。
使用本發(fā)明的靶基因用多核苷酸序列及基因序列，用候選化合物對前述細胞、組織及非人類動物等進行給藥，觀察基因功能的變化，與對照組進行比較檢測對靶基因的RNA功能具有抑制作用的化合物，作為上述方法的具體方法，在使用后述實施例中描述的靶基因用多核苷酸序列進行轉(zhuǎn)染的前后，在細胞以及組織溶液中添加候選化合物進行共同培養(yǎng)，通過對本發(fā)明的基因多核苷酸序列的功能破壞的促進或抑制情況的觀察，可檢測候選化合物的作用(其活性具有的影響)對于候選化合物的效果，舉例說明，在上述活性實驗的情況下，將測定的候選化合物的活性的影響與對照組及不加入候選化合物的組進行比較，如有大約20％以上、優(yōu)選約30％以上、更優(yōu)選約50％以上的促進作用，即可選擇該候選化合物作為促進本發(fā)明中靶基因用多核苷酸序列功能的化合物。另一方面，在上述活性實驗的情況下，將測定的候選化合物的活性的影響與對照組及不加入候選化合物的組進行比較，如有大約20％以上、優(yōu)選約30％以上、更優(yōu)選約50％以上的抑制作用，即可選擇該候選化合物作為抑制本發(fā)明中靶基因用多核苷酸序列功能的化合物。
此外，使用本發(fā)明的篩選方法得到的候選化合物作為藥物使用的情況下，可以采用常規(guī)的手段進行實施。例如，含有前述的本發(fā)明的靶基因用多核苷酸及靶基因用序列、插入了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重組載體的藥物，可以采用相同的方式制成片劑、膠囊、酏劑、微囊劑、無菌溶液、混懸劑等。這樣制得的制劑具有安全性和低毒性，可以對哺乳動物(如人、小鼠、大鼠、兔、羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴、黑猩猩等等)進行給藥。該化合物及其鹽類的給藥量根據(jù)對象的疾病、給藥對象、給藥途徑等情況的不同而有所差別，例如，以治療癌癥為目的，能夠促進本發(fā)明中靶基因用多核苷酸及靶基因用序列、插入了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重組載體對癌細胞中的靶基因的RNA的RNA功能抑制活性的化合物，其口服給藥量一般為，成人(體重60kg)每日該化合物約為0.1～100mg，優(yōu)選約為1.0～50mg，更優(yōu)選約為0.1～20mg。非口服給藥的情況下，該化合物每次的給藥量因給藥對象、對象疾病等的不同而有所差別，例如，能夠促進本發(fā)明中靶基因用多核苷酸及靶基因用序列、插入了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重組載體對癌細胞中的靶基因的RNA的RNA功能抑制活性的化合物，其注射給藥量一般為，成人(體重60kg)每日該化合物約為0.01～30mg，優(yōu)選約為0.1～20mg，更優(yōu)選為約0.1～10mg，在此范圍內(nèi)進行靜脈注射是比較好的選擇。對于其他的動物情況也相同。
此外，使用本發(fā)明中靶基因用多核苷酸及靶基因用序列、插入了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重組載體，可以提供靶基因破壞的動物。也即，本發(fā)明可以提供攜帶靶基因用多核苷酸、靶基因用序列、插入了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重組載體的非人類哺乳動物、非人類的嚙齒類動物、前述嚙齒動物為小鼠和大鼠等動物。
本發(fā)明中，攜帶靶基因用多核苷酸、靶基因用序列、插入了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重組載體的非人類哺乳動物，針對含有未受精卵、受精卵、精子以及其母細胞的胚胎細胞，較適當(dāng)?shù)淖龇ㄊ?，在非人類哺乳動物發(fā)育的胚胎發(fā)育階段(更好的做法是，在單細胞及受精卵細胞階段(一般為8細胞分裂期以前))，使用磷酸鈣法、電子脈沖法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、凝集法、微注射法、粒子槍法、DEAE-葡聚糖法等對作為目標(biāo)的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、及插入了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重組載體進行轉(zhuǎn)移。作為靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列、插入了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重組載體的轉(zhuǎn)移方法，可以體細胞、體內(nèi)器官、組織細胞等為靶點，利用靶基因用多核苷酸、靶基因用序列、插入了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重組載體進行轉(zhuǎn)移，細胞培養(yǎng)，組織培養(yǎng)，進而可以用公知的細胞融合法將上述細胞與前述胚胎細胞進行融合，得到插入靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列、插入了靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的重組載體轉(zhuǎn)基因動物。
作為該非人類哺乳動物，舉例有牛、豬、羊、山羊、兔、狗、貓、豚鼠、倉鼠、小鼠、大鼠等可供使用。其中，從制作動物疾病模型的角度出發(fā)，選擇個體發(fā)育及生命周期較短且容易繁殖的嚙齒類動物，特別是小鼠(例如純種系有C57、BL/6系、DBA2系等；雜交系有B6C3F1系、DBF1系、B6D2F1系、BALB/c系，ICR系等)以及大鼠(例如Wistar，SD等)比較適當(dāng)。同樣，在向人移植器官時，適當(dāng)選擇器官排異反應(yīng)相關(guān)基因被抑制的基因剔除豬。
本發(fā)明可提供具有靶基因的RNA功能抑制活性的單鏈多核苷酸以及使用該多核苷酸對靶基因的功能性表達進行抑制調(diào)控的方法，并且可根據(jù)對該基因的功能性表達進行選擇性抑制，提供可以抑制可能對目的蛋白質(zhì)及RNA的功能性表達具有抑制調(diào)控作用的單鏈多核苷酸及抑制其功能表達的方法。通過本發(fā)明還可提供簡便的基因功能分析方法、藥物靶基因的篩選方法、通過制作基因剔除小鼠進行藥物體內(nèi)評價(in vivo)的方法、以及針對基因疾病的藥物組合物(基因治療劑)。
具體實施例方式
實施例1本發(fā)明的靶基因用多核苷酸的合成本實施例中，靶基因以熒光素酶基因(Genbank Accession No.U47296)中434-452位的19個核苷酸的序列為RNA干擾的靶部位，合成了含有2種元件序列的靶基因用多核苷酸。
RNA序列的合成使用市售的采用磷酸氨基保護法的自動合成儀(Applied Biosystem社制ABI3900高通量DNA合成儀)與合成RNA所需試劑合成。此外，作為非特異對照組，合成了與EGFP(GenbankAccession No.U55763)的序列位置936-954互補的由21個堿基構(gòu)成的正向序列(F)和反向序列(R)的RNA。
如此得到的本發(fā)明的靶基因用多核苷酸中，元件(II)的12個堿基的序列以uGL3.12RNA命名，元件(II)的7個堿基的序列以uGL3.7RNA命名。合成得到的uGL3.12RNA及uGL3.7RNA的序列，以各自序列號1及2表示，uGL3.12RNA及uGL3.7RNA的元件序列以序列號3及4表示。
對于非特異對照組，以與EGFP的序列位置936-954互補的由21個堿基構(gòu)成的正向序列(F)和反向序列(R)的RNA序列號5及6表示，上述序列的末端各自添加2堿基的UU(尿嘧啶)。
實施例2使用本發(fā)明的靶基因用多核苷酸的RNA功能抑制活性實驗1、RNA轉(zhuǎn)染用RNA的配制將上述得到的uGL3.12RNA(142nM)及uGL3.7RNA(135nM)用蒸餾水溶解配制成100pM/μl溶液。
接著將30μl上述RNA溶解液、30μl蒸餾水以及240μl緩沖液(100mM乙酸鉀，pH7.4的30mM HEPES-KOH，2mM乙酸鎂)配制成混合溶液，作為uGL3.12RNA及uGL3.7RNA的原液(原液10pmole/μl)。5倍及10倍的稀釋均采用上述緩沖液進行稀釋。
2、非特異對照組的siRNA的制備由上述實施例1得到的與EGFP基因的序列位置936-954互補的由21個堿基構(gòu)成的單鏈正向序列(F)RNA和反向序列(R)的RNA各10皮摩爾進行混合，加入退火緩沖液至100μl，以緩沖液進行5倍稀釋，作為對照siRNA溶液(EGFPc2)。
3、轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備報道基因表達載體的制備為，將含有熒光素酶報道基因的克隆載體pGL3-對照組(pGL3-control；Promega公司制備)以及(海腎Renilla)含有熒光素酶基因的pRL/TK(pRL/TKPromega公司制備)分別與上述配制的RNA混合，配制成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。
也即，在50μl的OPTI-MEM無血清培養(yǎng)基(Gibco-BRL公司制備)中加入上述各報道基因(1μg的pGL3-control和0.1μg的pRL/TK)、本發(fā)明的靶基因用多核苷酸的uGL3.12RNA及uGL3.7RNA、以及非特異對照組siRNA，調(diào)制成溶液(EGFPc2)，作為(a)液。
在另一50μl的OPTI-MEM培養(yǎng)基里加入1.5μl的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Lipofectamine 2000Life Technology公司制備)混懸，室溫靜置5分鐘(b液)。然后將a和b兩液進行混合，反應(yīng)20分鐘，作為轉(zhuǎn)染復(fù)合物。
4、轉(zhuǎn)染首先，在將HeLa3細胞進行混懸前，使用添加了DMEM/10培養(yǎng)基(DMEM/10∶10％胎牛血清(INTERGEN公司制、#1020-90)的D-MEM培養(yǎng)基(Sigma公司制)，用直徑為10厘米的培養(yǎng)皿，在5％CO2及37℃條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)后的細胞以PBS洗滌后，以1ml胰蛋白酶-EDTA進行處理洗脫細胞，再次懸浮于10ml的DMEM/10中。用血細胞計數(shù)盤測量細胞數(shù)，用DMEM/10配制使細胞濃度達到1.2×105/0.5ml。將HeLa3細胞在24孔板中以每孔0.5ml進行添加，于5％CO2及37℃條件下培養(yǎng)24小時。
轉(zhuǎn)染過程中，將24孔板中的HeLa3細胞的培養(yǎng)上清吸去，在各孔中加入0.5ml新鮮的DMEM/10。然后在各孔中加入0.1ml的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，輕微振蕩細胞板以混勻，于5％CO2及37℃下培養(yǎng)24小時。
5、熒光素酶的活性測定使用雙熒光素酶報道基因檢測系統(tǒng)(Dual-Luciferase ReporterAssay System#E1910 Promega公司制備)，以此產(chǎn)品附帶的操作方法進行操作。在培養(yǎng)板中加入400μl試劑盒附帶的溶解緩沖液，將細胞溶解后在桌面離心機中以1500rpm離心5秒鐘，再取20μl上清，與添加的100μl反應(yīng)試劑LARII進行混合，使用熒光測試儀對第一次的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進行檢測，以GENios(TECAN公司制備)的發(fā)光測定軟件進行測定。
使用(海腎Renilla)熒光素酶(內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物)的值對螢火蟲熒光素酶的測定值進行校正，以RNA不存在時的值為1.0，計算出F-Luc/R-Luc的相對值。
結(jié)果在圖1及表1中給出。
表1

如圖1及表1所示，試驗結(jié)果經(jīng)修正值修正后，與非特異序列的對照作為1.00進行比較，元件(II)為7堿基長時，50倍稀釋、5倍稀釋、原液數(shù)值分別為0.65、0.24、0.09，隨濃度變化而減小，原液中約有90％的活性被抑制。同樣，在12個堿基長度的情況下，50倍稀釋、5倍稀釋、原液分別為0.73、0.21、0.11，隨濃度變化而減小，原液中約有90％的活性被抑制，說明無論元件(II)的大小如何，在任意一種情況下，熒光素酶的活性隨濃度變化而受到了抑制。
由圖1或表1的結(jié)果可知，通過本發(fā)明中的單鏈靶基因用多核苷酸的uGL3.12RNA及uGL3.7RNA，使熒光素酶活性隨濃度變化受到抑制，具有抑制RNA功能的活性。
此外，在本實驗中并沒有發(fā)現(xiàn)不同元件(II)的長度(7個堿基和12個堿基)的活性有所差異。
并且，確認(rèn)了元件(II)雖然具有發(fā)夾形狀的互補序列(-AATT-)，但仍然具有RNA功能抑制作用。
實施例3Lamin A/C基因功能抑制載體的RNA功能抑制效果本實施例中，通過以Lamin A/C基因(Genbank AccessionNo.X03445)的640-662位置的23個堿基的序列作為RNA干擾的靶部位制作細胞內(nèi)表達載體，以此評價其RNA功能抑制效果。
(1)Lamin A/C基因功能抑制細胞的制備1、Lamin A/C基因功能抑制載體的制備Lamin A/C基因功能抑制載體按以下方法制得。
使用以下引物(寡聚體1及2；序列號7，8)對人U6啟動子進行PCR擴增。以此PCR擴增片段作為模板，使用寡聚體1(序列號7)以及寡聚體3(序列號9)進行PCR擴增，并引入Csp45I限制性酶切部位制作改變的U6啟動子。將此擴增片段用限制性酶EcoRI及XbaI進行雙酶切，并將其克隆入同樣被限制性酶EcoRI及XbaI雙切的pUC19載體中(pUC19U6)。
使用以下引物(寡聚體4及5；序列號10，11)對小鼠H1啟動子進行PCR擴增后，擴增片段用限制性酶EcoRI及SalI進行雙酶切，并將其克隆入同樣被限制性酶EcoRI及SalI雙切的pUC19載體中(pUC19H1)。
寡聚體名稱1(序列號7)U6P.F，框內(nèi)EcoRI切斷部位TCTTTG AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTA寡聚體名稱2(序列號8)U6CSP45R，框內(nèi)Csp45I切斷部位TGCTGCCGAAGCGAGCACGGTGT CTTTCCACAAG寡聚體名稱3(序列號9)U6P.R，框內(nèi)XbaI切斷部位AAAAAT TGTAAAAATAGTGTTGTGTGCCTAGGATATGTGCTGCCGAAGCGAGCAC
寡聚體名稱4(序列號10)mH1.F，框內(nèi)EcoRI切斷部位TTTTT ATGCAAATTACGCGCTGTG寡聚體名稱5(序列號11)mH1.R，框內(nèi)SalI切斷部位CCAAGG AAAAAGATATCTGGATCCGTCTAGACCGGCCGCCACTATAAG接下來將寡聚體1(序列號12)與寡聚體2(序列號13)進行退火，使用Ex-Taq酶(寶酒公司制備)進行DNA合成后，用XbaI、SalI切斷，并將其克隆入同樣被限制性酶XbaI、SalI雙切的pUC19H1載體，命名為pUC19H1-Lamin。
使用以下的引物(寡聚體5及6，序列號16，17)對pUC19載體的限制性酶NdeI位點進行擴增，并插入由pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen公司)擴增的新霉素(Neomycin)抗性基因，制作名為pUC19-neo的載體。在此載體的EcoRI、HindIII的切斷部位導(dǎo)入由pUC19H1-Lamin載體的EcoRI、HindIII位點雙切得到的具有RNA抑制功能的片段，作為Lamin A/C基因功能抑制載體。
寡聚體名稱1(序列號12)hLaminAC-4.H1F，框內(nèi)XbaI切斷部位，下劃線stem區(qū)，斜體Loop區(qū)AAAGG CCCTAAAGAATAAGTCTTCTCCAGCTCCTTAAGGAG寡聚體名稱2(序列號13)hLaminAC-4.R，框內(nèi)SalI切斷部位，下劃線stem區(qū)，斜體Loop區(qū)ATTAT AAAAAGAATAAGTCTTCTCCAGCTCCTTAAGGAG寡聚體名稱3(序列號14)Neo-Nde.F，框內(nèi)NdeI切斷部位
AGAATTC TGGAATGTGTGTCAGTTAG寡聚體名稱4(序列號15)Neo-Nde.R，框內(nèi)NdeI切斷部位AGAATTC AGGTCGACGGTATACAGAC2、轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備取1μg上述1中得到的Lamin A/C基因功能抑制載體加入50μl的OPTI-MEM(Invitrogen公司制備)(A液)。另外，取3μl的Lipofectamine2000(Invitrogen公司制備)與50μl的OPTI-MEM混合，室溫靜置5分鐘(B液)。將A液與B液混合，室溫下反應(yīng)20分鐘，制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物。
3、轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染的前一天，使用加入了10％FBS的DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司)制備2×105/ml的HeLa S3細胞溶液，以每孔0.5ml的量加入24孔板。以CO2培養(yǎng)箱(三洋公司)以37℃，5％CO2進行過夜培養(yǎng)。將上述配制的轉(zhuǎn)染混合物，以每孔100μl的量加入24孔板，將培養(yǎng)板再置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)進行過夜培養(yǎng)。
4、細胞的篩選及永生化用PBS將細胞培養(yǎng)板的各孔洗凈后，使用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen公司制備)消化細胞并回收。用加入10ml的10％FBS的DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司)將回收的細胞再次懸浮，全量鋪于10cm的組織上。第二天吸去培養(yǎng)上清，加入10ml含有選擇培養(yǎng)液(含有10％FBS，500μg/ml的G418選擇性抗生素(Geneticin，Invitrogen公司制備)的DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司))。2日到3日更換一次新鮮的選擇培養(yǎng)液并于CO2培養(yǎng)箱(三洋公司)以37℃、5％CO2進行培養(yǎng)。最后得到31個G418抗性株細胞。得到的細胞株作為Lamin A/C基因功能抑制細胞株，在以下的評價中使用。
(2)Lamin A/C基因功能抑制細胞株的評價1、RNA制備將與31種Lamin A/C基因功能抑制細胞株進行共培養(yǎng)的10cm組織分別用PBS洗滌2次，每份細胞用3ml的TRIZOL試劑(Invitrogen公司制備)進行消化。消化細胞液分別移至15ml的離心管中，分別加入0.2ml氯仿劇烈振蕩混勻，于室溫靜置3分鐘，4℃、3000rpm下離心分離40分鐘。將水相(最上層部分)分別轉(zhuǎn)移至新管中后，加入0.5ml異丙醇混和，室溫靜置5-10分鐘。以4℃、3000rpm離心分離40分鐘，得到RNA沉淀，用70％乙醇洗凈后，用DW溶解。各樣品的吸光度用DU650(Beckman公司)在260nm測定，以測定值計算RNA濃度，在Northern分析中使用。
2、蛋白質(zhì)的制備將與31種Lamin A/C基因功能抑制細胞株進行共培養(yǎng)的10cm組織分別用PBS洗凈后，用胰蛋白酶EDTA溶液(Invitrogen公司制備)消化細胞并回收。回收的細胞再次用PBS洗滌后，在微量離心機上以5000rpm離心5分鐘回收細胞?；厥盏募毎苡赽oiling lysisbuffer(5％SDS，5mM sodium ortho-vanadate，50mM Tris pH7.4)后，在100℃下處理5分鐘，立即冰浴。在15000rpm、4℃下離心分離20分鐘，回收上清作為蛋白質(zhì)溶液。用蒸餾水10倍稀釋蛋白質(zhì)溶液后，測定總蛋白質(zhì)濃度。用GENios(TECAN公司)及Advanced ProteinAssay Reagent試劑(cytosleleton公司)測定反應(yīng)后的稀釋蛋白質(zhì)溶液的吸光度。用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品修正測定值，配制成終濃度為1μg/uL的樣品。
3、Lamin A/C表達的Northern Hybridization分析使用上述配制的RNA對Lamin A/C mRNA表達進行分析。
Lamin A/C表達分析將20μg的總RNA進行變性瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用毛細管描繪法(capillary ploting)轉(zhuǎn)錄至Hybond-N+membrane(AmershamPharmacia Biotech)。進一步用UV交聯(lián)法使RNA橋接于膜上。膜使用prehybridization溶液(50％甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt’s solution，0.1％SDS，100μg/ml變性大馬哈魚精子DNA)于42℃處理1小時后，用32P dCTP放射性同位素標(biāo)記的lamin A/C基因片段作為探針進行雜交過夜。使用2×SSC/0.1％SDS溶液于室溫下洗滌膜5分鐘，重復(fù)操作3次。然后于50℃洗滌10分鐘，65℃洗滌10分鐘，洗滌2次。洗凈的膜于X射線膠片上進行曝光過夜。
結(jié)果以圖2表示。Lamin A/C基因功能抑制細胞株與未導(dǎo)入載體的細胞株的對比顯示，Lamin A/C mRNA的表達功能受到抑制，說明Lamin A/C基因功能抑制載體具有基因特異性的RNA功能抑制活性。
4、蛋白印跡(Western)法分析以上述2.的濃度配制的蛋白質(zhì)樣品用SDS緩沖液進行2倍稀釋。取6μl樣品上樣于13％的SDS聚丙烯酰胺凝膠上，在300V，40mA的條件下進行80分鐘的SDS PAGE。使用半干印跡轉(zhuǎn)移裝置，以300V、140mA、60分鐘的條件將進行凝膠電泳的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(BIORAD公司)。使用1000倍稀釋的Lamin A/C抗體(BD Bioscience公司)以及對照抗體(αTubulin抗體、ZymedLaboratories公司)對印跡蛋白質(zhì)后的硝酸纖維素膜進行處理，接下來使用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體進行反應(yīng)。Lamin A/C特異性條帶的檢測使用ECL western blotting detection reagent(AmershamBioscience公司)對進行抗原抗體反應(yīng)后的硝酸纖維素膜進行處理，反應(yīng)后在X射線膠片上進行曝光。
結(jié)果以圖2表示。各樣品檢出的條帶的濃度，與Northern分析中Lamin A/C的mRNA的濃度大體一致，說明不僅對mRNA而且對翻譯后的蛋白質(zhì)都有抑制效果。
實施例4螢火蟲熒光素酶基因抑制功能載體的RNA功能抑制效果本實施例中，以熒光素酶基因(Genbank Accession No.47296)的357-381的25個核苷酸的序列作為進行RNA干擾的靶基因序列，使用靶基因用多核苷酸制成在細胞內(nèi)表達的螢火蟲熒光素酶基因功能抑制載體，對其RNA功能的抑制效果進行評價。
螢火蟲熒光素酶基因功能抑制載體的制備在U6及H1啟動子的調(diào)控下，構(gòu)建了兩種表達螢火蟲熒光素酶基因功能抑制多核苷酸的載體(U6H1 25stem-Luc，及U6H1 25stemloop-Luc)，以及不含有熒光素酶基因序列的對照載體。
對照載體使用EcoRI及SalI雙切實施例3構(gòu)建的pUC19U6，分離人U6啟動子，將片段克隆入EcoRI及SalI雙切的pBS載體(pBSU6)。接下來使用實施例3制得的pUC19H1載體以下面的引物(寡聚體1及2)進行PCR擴增，將其擴增片段用SacI及SpeI雙切，并將其克隆入用SacI及SpeI雙切的pBSU6中，制成對照載體。
寡聚體名稱1biH1pro.SacI，序列號16TTTTTGAGCTCATGCAAATTACGCGCTGTG寡聚體名稱2biH1pro.SpeI-2，序列號17TTTTTACTAGTTGGTCTAGACCGGCCGCCACLuciferase基因RNA功能抑制載體1、U6H1 25stem-luc將下述序列號為18、19的寡聚體1與寡聚體2進行退火，將其克隆入由限制性酶Csp45I及XbaI雙切得到的對照載體中。
寡聚體名稱1序列號1825s#4F，框內(nèi)Csp45I切斷末端，下劃線stem區(qū) AAAAAGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCTTTTTGGT寡聚體名稱2序列號1925s#4R，框內(nèi)XbaI切斷末端，下劃線stem區(qū) CCAAAAAGGCGTATCTCTTCATAGCCTTATGCTTTTTTT2、U6H1 25stemloop-luc將下述序列號為10、21的寡聚體1與寡聚體2進行退火后，使用Ex-Taq酶進行DNA合成得到double strand oligo。合成的doublestrand oligo用限制性酶Csp45I及XbaI雙切，并將其克隆入Csp45I及XbaI雙切的pBSU6中。
寡聚體名稱1；ST-UHGL3#4F序列號20；框內(nèi)Csp45I切斷部位，下劃線stem區(qū)，斜體loop區(qū)TGGAAAG AAAAAGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCTTAAGGCGT(鏈長52堿基)寡聚體名稱2序列號21；ST-UHGL3#4R框內(nèi)XbaI切斷部位，下劃線stem區(qū)，斜體loop區(qū)CACGGG CCAAAAAGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCTTAAGGCGT(鏈長53堿基)3、轉(zhuǎn)染復(fù)合體的制備在1.8μg的pGL3對照載體(Invitrogen公司)、0.2μg的pRL/Tk載體(Invitrogen公司)以及上述1得到的RNAi誘導(dǎo)載體中加入200μl的OPTI-MEM(Invitrogen公司)(A液)。A液由RNAi誘導(dǎo)載體和對照載體的共計3種分別制備而成。另外，在12μl的Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)中加入200μl OPTI-MEM混合，室溫下靜置5分鐘，配制成3份(B液)。A液和B液混合，室溫下反應(yīng)20分鐘，配制成轉(zhuǎn)染復(fù)合物(3種)。
轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染的前一天，使用加入了10％FBS的DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司)，配制濃度為105/ml的HeLa S3細胞溶液，以每孔0.5ml的量加入24孔板。用CO2培養(yǎng)箱(三洋公司)在37℃、5％CO2條件下進行過夜培養(yǎng)。將3種上述2配制的轉(zhuǎn)染復(fù)合物以每孔100μl的量(每種4個孔；n＝4)加入24孔板的孔中，將培養(yǎng)板放回CO2培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)1天。
熒光素酶活性檢測使用雙熒光素酶報道基因檢測系統(tǒng)(DualLuciferase reporter assay system，Promega公司)試劑盒，并以隨產(chǎn)品附帶的操作方法進行實驗。吸去培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，用PBS洗凈細胞一次。以0.2ml/孔的量加入試劑盒中附帶的溶解液，將細胞溶解后，取20μl溶解液與附帶的反應(yīng)試劑LARII100μl混合，使用GENios(TECAN公司)的發(fā)光測定程序檢測螢火蟲熒光素酶的活性。接下來，加入100μl的Stop & Gro試劑后，使用GENios的發(fā)光測定程序檢測海腎熒光素酶的活性。用螢火蟲熒光素酶的活性的測定值除以海腎熒光素酶的活性的測定值，以對照載體得到的值作為100，計算每個得到的測定值。
4、分析結(jié)果結(jié)果以圖3表示。以各自的RNAi誘導(dǎo)處理的情況下，以對照載體處理過的熒光素酶的表達量作為100，U6H125stem-Luc減少了32.8％，U6H1 25stemloop-Luc減少了16.0％。證明使用任何一種功能抑制載體都使熒光素酶活性受到了抑制。由圖3的結(jié)果可知，利用本發(fā)明的功能抑制載體，可以有效抑制作為靶基因的熒光素酶的活性，并具有RNA功能抑制活性。
序列表<110>大塚制藥株式會社<120>多核苷酸用靶基因<130>20045D<150>JP 2002-46889<151>2002-02-22<160>21<170>Patent In version 3.1<210>1<211>52<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>uGL3.12RNA<400>1cuuacgcuga guacuucgau uuguccguuc gucgaaguac ucagcguaag uu52<210>2<211>47<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>uGL3.7RNA<400>2cuuacgcuga guacuucgau uuguccucga aguacucagc guaaguu 47<210>3
<211>12<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>uGL3.12RNA的元件序列<400>3uuuguccguu cg12<210>4<211>7<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>uGL3.7RNA的元件序列<400>4uuugucc 7<210>5<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>RGFP 936-954的正向序列<400>5gacccgcgcc gaggugaagu u 21<210>6<211>21<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>RGFP 936-954的反向序列<400>6cuucaccucg gcgcgggucu u 21<210>7<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>U6P.F<400>7tctttggaat tcaaggtcgg gcaggaagag ggccta 36<210>8<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>U6CSP45R<400>8tgctgccgaa gcgagcacgg tgtttcgaac tttccacaag 40<210>9<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>U6P.R<400>9aaaaattcta gatgtaaaaa tagtgttgtg tgcctaggat atgtgctgcc gaagcgagca60
c61<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mH1.F<400>10tttttgaatt catgcaaatt acgcgctgtg 30<210>11<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mH1.R<400>11ccaagggtcg acaaaaagat atctggatcc gtctagaccg gccgccacta taag 54<210>12<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hLaminAC-4.H1F<400>12aaaggtctag accctaaaga ataagtcttc tccagctcct taaggag 47<210>13<211>45<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>hLaminAC-4.R<400>13attatgtcga caaaaagaat aagtcttctc cagctcctta aggag45<210>14<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Neo-Nde.F<400>14agaattccat atgtggaatg tgtgtcagtt ag 32<210>15<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Neo-Nde.R<400>15agaattccat atgaggtcga cggtatacag ac 32<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>biH1pro.SacI<400>16tttttgagct catgcaaatt acgcgctgtg 30<210>17<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>biH1pro.SpeI-2<400>17tttttactag ttggtctaga ccggccgcca c 31<210>18<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>25s#4F<400>18cgaaaaaaag cataaggcta tgaagagata cgcctttttg gt 42<210>19<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>25s#4R<400>19ctagacc aaa aaggcgtatc tcttcatagc cttatgcttt tttt44
<210>20<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ST-UHGL3#4F<400>20tggaaagttc gaaaaaaagc ataaggctat gaagagatac gccttaaggc gt52<210>21<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ST-UHGL3#4R<400>21cacgggtcta gaccaaaaag cataaggcta tgaagagata cgccttaagg cgt 5權(quán)利要求
1.一種靶基因用多核苷酸序列，其構(gòu)成為由連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件構(gòu)成的經(jīng)分離或純化的單鏈多核苷酸序列，該靶基因用多核苷酸序列對具有與元件(I)或(III)中的任一個或其中的部分序列互補的序列的RNA有RNA功能抑制活性，其中，元件(III)包含具有與靶基因互補的序列的、連續(xù)15～30個堿基長度的多核苷酸序列，元件(II)為0堿基～1萬個堿基長度的核苷酸序列(其中，0堿基表示鍵)或非核苷酸序列，元件(I)為包含與元件(III)互補的序列的多核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述元件(III)的多核苷酸序列包括DNA或RNA。
3.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，元件(I)或(III)至少在任一個末端或在互補序列內(nèi)部缺失、取代、補加由1～數(shù)個U、T、G、C或A堿基構(gòu)成的序列。
4.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，多核苷酸序列利用化學(xué)合成法或基因重組技術(shù)獲得。
5.一種靶基因用多核苷酸序列，由序列號1或2的單鏈RNA構(gòu)成。
6.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列，其中元件(II)為核苷酸序列或非核苷酸序列中的任一種或是由它們組合而成。
7.如權(quán)利要求6所述的多核苷酸序列，其中元件(II)的核苷酸序列由1個堿基或1個堿基以上、不足1萬個堿基的核苷酸序列構(gòu)成。
8.如權(quán)利要求7所述的多核苷酸序列，其中元件(II)的核苷酸序列由1個堿基長度至數(shù)百個堿基長度的核苷酸序列構(gòu)成。
9.如權(quán)利要求8所述的多核苷酸序列，其中元件(II)的核苷酸序列由1個堿基長度至數(shù)十個堿基長度的核苷酸序列構(gòu)成。
10.如權(quán)利要求9所述的多核苷酸序列，其中元件(II)的核苷酸序列由1個堿基長度至20個堿基長度的核苷酸序列構(gòu)成。
11.如權(quán)利要求10所述的多核苷酸序列，其特征在于，元件(II)如序列號3或4所示。
12.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，元件(II)的核苷酸序列或非核苷酸序列由PNA、細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移序列、具有誘導(dǎo)活性的序列、干擾素誘導(dǎo)抑制序列、具有RNase抑制活性、反義活性、核酶活性及轉(zhuǎn)移RNA中任一種的序列或所述序列的組合構(gòu)成。
13.權(quán)利要求1～12任一項所述的多核苷酸的制備方法，利用化學(xué)合成法或基因重組技術(shù)。
14.一種重組載體，是將權(quán)利要求1～12任一項所述的靶基因用多核苷酸序列插入載體中而得到的。
15.如權(quán)利要求14所述的重組載體的制備方法，其特征在于，將權(quán)利要求1～12任一項所述的靶基因用多核苷酸序列插入載體中。
16.一種使用權(quán)利要求1～12的靶基因用多核苷酸序列篩選藥物靶基因的方法，該方法是將由連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件構(gòu)成的經(jīng)分離或純化的單鏈多核苷酸序列導(dǎo)入細胞或組織中，通過增減具有與所述(I)或(III)元件的多核苷酸序列互補的序列的基因的、由單鏈多核苷酸序列產(chǎn)生的RNA功能抑制活性，確定刺激或抑制與靶基因相關(guān)的功能的化合物，其特征在于，所述篩選方法使用選自下述方法中的任一種方法(a)利用直接或間接結(jié)合在該候選化合物上的標(biāo)記，測定候選化合物與具有由該靶基因編碼的氨基酸序列的多肽或靶基因表達產(chǎn)物(或攜帶由該靶基因編碼的氨基酸序列的多肽或靶基因表達產(chǎn)物的細胞或其膜)或其融合蛋白質(zhì)的結(jié)合的方法；(b)在標(biāo)記競爭物質(zhì)的存在下，測定候選化合物與導(dǎo)入了該單鏈多核苷酸序列的細胞(或攜帶該單鏈多核苷酸序列的細胞或其膜)或其融合物的結(jié)合的方法；(c)使用適用于攜帶所述多肽或靶基因表達產(chǎn)物的細胞或細胞膜的檢測體系，確定候選化合物是否利用該單鏈多核苷酸序列活化或抑制由靶基因編碼的氨基酸序列的多肽或該靶基因表達產(chǎn)物而產(chǎn)生的信號的方法；(d)將候選化合物、與含有由靶基因編碼的氨基酸序列的多肽或靶基因表達產(chǎn)物的溶液同時混合，調(diào)制混合物，測定該混合物中該多肽或該靶基因表達產(chǎn)物的活性，將該混合物的活性與標(biāo)準(zhǔn)進行比較的方法；以及(e)檢測候選化合物對細胞中產(chǎn)生編碼由該靶基因編碼的氨基酸序列的多肽的mRNA及由該靶基因編碼的氨基酸序列的多肽的效果的方法。
17.一種藥物組合物，以權(quán)利要求1～12任一項所述的靶基因用多核苷酸序列為有效成分。
18.一種藥物組合物，以權(quán)利要求14所述的重組載體為有效成分。
19.一種抑制靶基因功能的方法，所述方法為將具有連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件的經(jīng)分離或純化的單鏈多核苷酸序列導(dǎo)入細胞或組織內(nèi)，利用具有與所述(I)或(III)元件的多核苷酸序列互補序列的基因的RNA功能抑制活性，抑制靶基因的功能；其中，元件(III)包含具有與靶基因互補序列的、連續(xù)15～30個堿基長度的多核苷酸序列，元件(II)為0堿基～1萬個堿基長度的核苷酸序列(其中，0堿基表示鍵)或非核苷酸序列，元件(I)為包含與元件(III)互補的序列的多核苷酸序列。
20.如權(quán)利要求19所述的抑制方法，其特征在于，由所述元件(III)的多核苷酸序列構(gòu)成的核苷酸序列包括DNA或RNA。
21.如權(quán)利要求19所述的抑制方法，其特征在于，元件(I)或(III)為至少在任一個末端或在內(nèi)部缺失、取代、補加由1～數(shù)個U、T、G、C或A堿基構(gòu)成的序列的DNA或RNA。
22.如權(quán)利要求19所述的抑制方法，其特征在于，多核苷酸序列利用化學(xué)合成法或基因重組技術(shù)獲得。
23.如權(quán)利要求19所述的抑制方法，其中，單鏈多核苷酸序列由序列號1或2的單鏈RNA構(gòu)成。
24.如權(quán)利要求19所述的抑制方法，其中，元件(II)為核苷酸序列或非核苷酸序列中的任一種或由它們的組合構(gòu)成。
25.如權(quán)利要求24所述的抑制方法，其中，元件(II)的核苷酸序列由1個堿基或1個堿基以上、不足1萬個堿基的核苷酸序列構(gòu)成。
26.如權(quán)利要求25所述的抑制方法，其中，元件(II)的核苷酸序列由1個堿基長度至數(shù)百個堿基長度的核苷酸序列構(gòu)成。
27.如權(quán)利要求26所述的抑制方法，其中，元件(II)的核苷酸序列由1個堿基長度至數(shù)十個堿基長度的核苷酸序列構(gòu)成。
28.如權(quán)利要求27所述的抑制方法，其中，元件(II)的核苷酸序列由1個堿基長度至20個堿基長度的核苷酸序列構(gòu)成。
29.如權(quán)利要求28所述的抑制方法，其特征在于，元件(II)用序列號3或4表示。
30.如權(quán)利要求18所述的抑制方法，其特征在于，元件(II)的核苷酸序列或非核苷酸序列由PNA、細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移序列、具有誘導(dǎo)活性的序列、干擾素誘導(dǎo)抑制序列、具有RNase抑制活性、反義活性、核酶活性及轉(zhuǎn)移RNA的任一種的序列或所述序列的組合構(gòu)成。
31.一種抑制靶基因蛋白質(zhì)表達的方法，所述方法利用了權(quán)利要求19～30所述的抑制靶基因功能的方法。
32.一種抑制靶基因轉(zhuǎn)錄子活性的方法，所述方法利用了權(quán)利要求19～30所述的抑制靶基因功能的方法。
33.一種基因剔除細胞或組織、非人類基因剔除動物或基因剔除植物，是利用權(quán)利要求31或32的方法產(chǎn)生并培養(yǎng)的。
34.如權(quán)利要求33所述的基因剔除細胞或組織、非人類基因剔除動物，用于器官移植。
35.一種基因治療劑，由權(quán)利要求17或18所述的藥物組合物構(gòu)成。
36.一種試驗靶基因功能的方法，所述方法為將具有連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件的經(jīng)分離或純化的單鏈多核苷酸序列導(dǎo)入細胞、組織、非人動物或植物內(nèi)，利用具有與所述(I)或(III)元件的多核苷酸序列互補序列的基因的RNA功能抑制活性，試驗靶基因的功能；其中，元件(III)包含具有與靶基因互補序列的連續(xù)15～30個堿基長度的多核苷酸序列，元件(II)為0堿基～1萬個堿基長度的核苷酸序列(其中，0堿基表示鍵)或非核苷酸序列，元件(I)為包含與元件(III)互補的序列的多核苷酸序列。
37.一種檢測增強靶基因功能的候選化合物的方法，所述方法包括下述步驟將待檢化合物與細胞、組織、非人類動物或植物共同培養(yǎng)后，將具有連續(xù)的(I)+(II)+(III)元件的經(jīng)分離或純化的單鏈多核苷酸序列導(dǎo)入細胞、組織、非人類動物或植物內(nèi)的步驟；將具有與所述(I)或(III)元件的多核苷酸序列互補序列的基因中RNA的RNA功能抑制活性與對照組進行比較的步驟；其中，元件(III)包含具有與靶基因互補序列的、連續(xù)15～30個堿基長度的多核苷酸序列，元件(II)為0堿基～1萬個堿基長度的核苷酸序列(其中，0堿基表示鍵)或非核苷酸序列，元件(I)為包含與元件(III)互補序列的多核苷酸序列。
38.如權(quán)利要求1～4任一項所述的靶基因用多核苷酸序列，其中，元件(III)由連接與靶基因互補的18～25個核糖核苷酸的任意種類的1～5個核糖核苷酸構(gòu)成，元件(I)由與元件(III)的18～25個核苷酸互補的18～25個核糖核苷酸構(gòu)成。
39.一種靶基因用核苷酸的合成方法，所述方法包括以下步驟(i)制作由元件(I)及元件(II)構(gòu)成的單鏈核苷酸，使元件(II)3’末端的數(shù)個核苷酸與元件(I)或(II)的數(shù)個核苷酸互補的步驟；(ii)使用由該元件(I)及(II)構(gòu)成的單鏈核苷酸，利用核苷酸合成酶活性，合成元件(III)的步驟，或使用由該元件(I)及(II)構(gòu)成的單鏈核苷酸，導(dǎo)入細胞內(nèi)，利用存在于細胞內(nèi)的所述核苷酸合成酶活性，合成元件(III)的步驟。
40.一種隨機化靶基因用核苷酸，是利用權(quán)利要求39所述的方法得到的，其中，元件(I)及(III)為隨機的寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種由靶基因的互補鏈核酸序列與元件序列構(gòu)成的單鏈多核苷酸序列。
文檔編號A61K38/00GK1639332SQ0380440
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月22日
發(fā)明者鈴木干生, 百田裕, 渡邊武 申請人:大塚制藥株式會社