專利名稱：檢測瘦素受體配體的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用在由瘦素(Reptin)受體和能量供體或能量受體蛋白質(zhì)組成的融合蛋白之間的能量轉(zhuǎn)移來檢測瘦素受體的方法。本發(fā)明也涉及實施本方法的融合蛋白。
瘦素受體是分子量為16kDa的蛋白質(zhì)，由脂肪細胞分泌。該蛋白質(zhì)與飽滿感有關，且在控制體重、能量消耗、骨形成和血管生成中發(fā)揮重要作用，也發(fā)揮其它生理功能，如引發(fā)青春期和控制生殖、或者調(diào)節(jié)T淋巴細胞介導的免疫反應。
瘦素受體(OBR)屬于細胞因子受體家族。如

圖1所示，它由包含跨膜結構域(Tartaglia等，J.Biol.Chem，272，6093-6096，1995)的單一多肽鏈組成。專利申請WO97/19952涉及該受體。
6種具有不同長度的C末端結構域的不同同工型的OBR得到了描述。這些同工型都來源于單一基因的備選剪接。也存在可溶形式的OBR，它含有與膜結合型的胞外結構域?qū)氖菟亟Y合位點。該可溶型發(fā)現(xiàn)于血液中，由膜結合型在質(zhì)膜通過蛋白質(zhì)水解作用的翻譯后產(chǎn)生。另一可溶型的OBR是由于在跨膜結構域之前出現(xiàn)終止密碼子而產(chǎn)生的突變，發(fā)現(xiàn)該可溶型是很少見的情況。
Lundin等(Biochemica and Biophysica Acta，1499，130-138，2000)已用由長型瘦素受體(OBRl)融合至EGFP(增強的綠色熒光蛋白)組成的融合蛋白來研究該受體的定位。OBR的激活認為是通過由2個Janus激酶2(JAK2)和2個OBR的四聚體復合體而產(chǎn)生的。瘦素誘導的受體激活將誘導OBR的構象變化，這將使它激活一個JAK2，接下來磷酸根轉(zhuǎn)移活化另一個JAK2，然后是OBR受體。
OBR的激活似乎是形成所有瘦素已知效應的原因，如體重喪失、以及所有涉及體重紊亂的現(xiàn)象。關于骨合成中瘦素的抑制特性最近因此得到證明。瘦素通過抑制成骨細胞的活性發(fā)揮作用，而這些細胞與骨的形成有關。修飾leptinemia也許使它可治療與骨密度下降相關的疾病，如骨質(zhì)疏松癥、或者相反地治療那些與嚴重的鈣化作用相關的疾病。在1999年，Xu等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，151-156)描述了一種在活細胞中檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法。該方法也是專利申請WO 99/66324的主題。該方法也稱為BRET(生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移)，它依據(jù)一種自然現(xiàn)象，即海洋生物體發(fā)出熒光。由Renilla螢光素酶(Luc)介導的可跨膜底物的酶促轉(zhuǎn)換可產(chǎn)生生物熒光，這將依次刺激能量受體，如黃色熒光蛋白質(zhì)(YFP)。該方法對應于Wang等(Mol.Gen.Genet.264578-587(2001))所述的LRET(發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移)。
能量轉(zhuǎn)移的效率取決于物理接近性以及分別的受體和供體的方向。因此，螢光素酶和YFP的共表達不足以誘導能量轉(zhuǎn)移，因為這兩種蛋白質(zhì)之間的距離必須小于100。為研究兩種潛在相互作用蛋白質(zhì)之間的相互作用，將第一種蛋白質(zhì)融合至螢光素酶，將第二種蛋白質(zhì)融合至YFP。如果兩種蛋白質(zhì)相互作用，就會觀察到能量轉(zhuǎn)移。從那以后，已將BRET方法用于具有不同于瘦素受體結構的有限數(shù)量的受體。因此，一些作者描述了在G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族，如β2-腎上腺素能受體(Angers等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10，1073)，cholesystocine型A受體(CCK，Cheng等，2001，Biol.Chem.27648040-48047)和促甲狀腺素釋放激素受體(Kroeger等，2001，J.Biol.Chem.27612736-12743)中使用該方法。這些受體體積大，顯示為包含7個跨膜結構域的復合體。
最后，Boute等(2001，Mol.Pharmacol.60640-645)描述了下述利用BRET激活胰島素受體方法。胰島素受體由共價的二聚體組成，而不是如瘦素受體那樣的非共價復合體。另外，它包含長的胞內(nèi)部分。最后，由胰島素誘導的BRET改變僅可在可溶性受體上實現(xiàn)。
幾十年來，肥胖癥已成為工業(yè)化國家主要的公共健康問題，在這些國家，20-30％的人群受到影響。在未來的時間，這些數(shù)字將令人擔憂地進一步增加。肥胖癥構成了對藥物的真正挑戰(zhàn)，這是由于多因素引起的，其中所述多因素或多或少地源于第一是環(huán)境因素(飲食特點、接近食物、能量消費等)，第二是多樣的遺傳原因。同樣地，骨疾病如骨質(zhì)疏松癥逐漸影響大量人群。
因此治療多種與瘦素受體相關的疾病的新型分子的發(fā)現(xiàn)，其中所述疾病如肥胖癥和骨質(zhì)疏松癥，代表對公共健康的高度重視。然而，沒有用于高通量特異性篩選瘦素受體激動劑或拮抗劑的方法存在。
因此，本申請人努力實現(xiàn)快速、特異和有效的用于瘦素受體激動劑或拮抗劑的篩選試驗。
令人驚訝的是，他們已表明，瘦素受體誘導的BRET改變可用于一種同工型的瘦素受體，但不能在所有同工型中實現(xiàn)。他們也表明，在瘦素受體上實現(xiàn)BRET在某些操作條件下是最佳的。
因此，本發(fā)明涉及檢測瘦素受體配體的方法，所述方法利用由瘦素受體或瘦素受體的實質(zhì)性部分、和能量供體蛋白質(zhì)或能量供體蛋白質(zhì)的實質(zhì)性和活性部分組成的第一融合蛋白以及由瘦素受體或瘦素受體的實質(zhì)性部分、和能量受體蛋白質(zhì)或能量受體蛋白質(zhì)的實質(zhì)性和活性部分組成的第二融合蛋白之間的共振能量轉(zhuǎn)移。本發(fā)明也涉及實施所述方法的融合蛋白，也涉及編碼這些蛋白質(zhì)的核酸。
本發(fā)明的一個主題也是一種用于治療或預防與瘦素相關的疾病的方法，包括給患有上述疾病的病人施用用上述方法選擇的配體。
因此，本發(fā)明的第一個主題是由瘦素受體或瘦素受體實質(zhì)性部分、和能量受體或供體蛋白質(zhì)或能量受體或供體蛋白質(zhì)的實質(zhì)性和活性部分組成的融合蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，融合蛋白本質(zhì)上由相應于所有或部分瘦素受體序列的部分、和相應于能量供體或受體蛋白質(zhì)的部分組成。然而，它們可包含其它蛋白質(zhì)的其它氨基酸序列，如信號序列。因此，SEQ ID No.4的序列由SEQID No.2的一部分和其它序列，特別是小鼠白細胞介素3的信號序列組成。
有利地，能量供體蛋白質(zhì)是Renilla螢光素酶。然而它可能是任一其它能量供體蛋白質(zhì)，這樣供體的發(fā)射光譜充分地與受體的激發(fā)光譜重疊，以允許在這兩部分之間進行高效的能量轉(zhuǎn)移。因此，如果能量轉(zhuǎn)移是FRET，它可是GFP，或者如果能量轉(zhuǎn)移是CRET，它可是水母發(fā)光蛋白。水母發(fā)光蛋白可以得到，并按專利申請EP0187519或者Inouye等的文章(PNASUSA 823154-3158(1985))中所述進行使用。
關于能量受體熒光蛋白質(zhì)，優(yōu)選的是DsRed或者GFP或者該蛋白質(zhì)的突變體，如YFP、EYFP、野生型GFP、GFPS65T或者Topaz。然而，它可能是任何其它能量受體熒光蛋白質(zhì)，只要受體的激發(fā)光譜和供體的發(fā)射光譜充分重疊，以至于可允許在這兩部分之間進行高效的能量轉(zhuǎn)移。
這些蛋白質(zhì)已為本領域技術人員熟知，可在文獻中找到這些蛋白質(zhì)的序列，特別是Blinks等的綜述(Pharmacol.Rev.281-93(1976))。特別是，Tsien(Annu.Rev.Biochem.67509-544(1998))描述了GFP，Prasher等(Gene 111229-233(1992))描述了它的克隆。關于DsRed的克隆，Matz等(Nat.Biotechnol.17969-973(1999))進行了描述。關于Rluc，本領域的技術人員可查閱Blinks等(Pharmacol.Rev.281-93(1976))或Lorenz等(PNAS 884438-4442(1991))。
有利地，完全或部分包括在融合蛋白中的瘦素受體的同工型是短的同工型，或顯示有短的胞內(nèi)結構域的同工型。這樣的同工型有利地包含Box1胞內(nèi)結構域，但不包括Box3胞內(nèi)結構域。
優(yōu)選的是，該同工型是OBRs同工型，甚至更為優(yōu)選的是人的OBRs同工型。然而，該同工型可來源于任一其它物種。它也可是任一其它同工型，優(yōu)選的是短的，甚至更為優(yōu)選的是包含至少OBR的胞外結構域，如含瘦素結合位點的OBR可溶型，如Lee等(Nature 379，632-635(1996))、Gavrilova等(JBC 27230546-30551(1997))、Maamr等(Endocrinology1424389-4393(2001))或Clement等(Nature 392398-401(1998))所述。
根據(jù)特別優(yōu)選的實施方案，同工型是序列SEQ No.2的人OBRs同工型。它也可能是該蛋白質(zhì)的變體，與SEQ No.2序列的同一性顯示為至少是65％，優(yōu)選的至少是75％，甚至更為優(yōu)選的至少是85％或95％。
融合蛋白可僅包含人OBRs同工型的一部分。有利地，它包含SEQNo.2序列的46-866位氨基酸之間的部分。因此，對應于瘦素受體的部分可具有SEQ No.4的序列，或與該序列顯示至少65％、優(yōu)選的至少75％、甚至更為優(yōu)選的至少85％或95％的同一性的變體。尤其有利地，供體融合蛋白具有SEQ No.6的序列，或與該序列顯示至少65％同一性的變體。尤其有利地，受體融合蛋白含有SEQ No.8的序列，或與該序列顯示至少65％同一性的變體。
本發(fā)明的其它主題是編碼這些蛋白質(zhì)的核酸。這些核酸可以是互補的、或基因組DNA、或RNA。這些核酸或多核苷酸可以是單鏈型，或是雙鏈型。特別有利地它們是互補DNA。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的主題是與SEQ No.5或SEQ No.7序列的核酸具有至少65％、優(yōu)選的至少75％、甚至更為優(yōu)選的至少85％或95％核苷酸同一性的核酸。
又，根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及在高嚴格雜交條件下與上述核酸雜交的核酸，更為特別地是核苷酸序列SEQ No.5和SEQ No.7的核酸、或其互補序列的核酸。
為了本發(fā)明的目的，兩個核苷酸或氨基酸序列間的“同一性百分率”可通過比較窗口，由比較兩個優(yōu)化的排列序列來確定。
因此，相對于參考序列(不包含這些添加或缺失)，比較窗口中核苷酸或多肽序列可包含添加或缺失(例如缺口)，以獲得這兩個序列的優(yōu)化排列。
通過確定比較的兩個(核酸或肽)序列同一位置上相同核苷酸堿基或氨基酸殘基的數(shù)量，然后將兩個堿基或氨基酸殘基之間具同一性的位置數(shù)除以比較窗口中的位置總數(shù)，再將結果乘以100來計算序列同一性百分率?？衫冒赪ISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE，GENETICS COMPUTER GROUP(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WISCONSIN中的已知算法在計算機上實施用于比較的序列的優(yōu)化排列。
通過闡釋，可利用BLAST程序(BLAST 1.4.9版本，1996年3月，BLAST 2.0.4版本，1998年2月和BLAST 2.0.6版本，1998年9月)、利用專一的缺省參數(shù)(S.F.Altschul等，J.Mol.Biol.1990 215403-410，S.F.Altschul等，Nucleic Acids Res.1997 253389-3402)完成序列同一性的百分率計算。利用Altschul等的算法，由Blast尋找與參照的“請求”序列類似/同源的序列。使用的請求序列和數(shù)據(jù)庫是相關的肽或核酸，也可以是它們的任何重組。
為了本發(fā)明的目的，表述“高嚴格雜交條件”用于指下述條件1膜競爭和預雜交-將40μl鮭魚精子DNA(10mg/ml)和40μl人胎盤DNA(10mg/ml)混合。
-混合物于96℃變性5分鐘，然后浸于冰中。
-移去2×SSC，并將4ml甲酰胺混合物倒入含膜的雜交管中。
-加入兩種變性DNA的混合物。
-在42℃轉(zhuǎn)動孵育5-6小時。
2標記探針競爭-依賴于循環(huán)量，加入10-50μl Cot I DNA至經(jīng)標記和純化的探針中。
-變性在95℃進行7-10分鐘。
-孵育在65℃進行2-5小時。
3雜交-移去預雜交混合物。
-將40μl鮭魚精子DNA和40μl人胎盤DNA混合，混合物在96℃變性5分鐘，然后浸于冰中。
-將4ml甲酰胺混合物、兩種DNA和變性的標記探針/Cot I DNA混合物加入雜交管中。
-在42℃轉(zhuǎn)動孵育15-20分鐘。
4洗滌-在2×SSC、室溫中洗滌一次。
-在2×SSC和0.1％SDS、65℃中洗滌2次，每次5分鐘。
-在1×SSC和0.1％SDS、65℃中洗滌2次，每次15分鐘。膜用莎倫包裝膜包裹，并曝光。
上述的雜交條件適用于對幾百核苷酸來說，可變長度為20個核苷酸的核酸分子在高嚴格條件下的雜交。
毋庸置疑，根據(jù)本領域中技術人員公知的技術，上述的雜交條件可根據(jù)進行雜交的核酸長度、或選擇的標記類型而調(diào)整。例如，根據(jù)HAMES和HIGGINS工作中的教導(1985，“Nucleic acid hybridizationa practicalapproach”，Hames和Higgins編輯，IRL出版社，牛津)、或F.AUSUBEL等工作中的其它教導(1989，Current Protocols in Molecular Biology，GreenPublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.)，可調(diào)整合適的雜交條件。
本發(fā)明主題的蛋白質(zhì)可通過本領域技術人員公知的任何方法獲得。然而，有利的是它們可通過上述編碼這些蛋白質(zhì)的核酸的表達而獲得，任選的是將核酸插入表達載體，在有利地經(jīng)挑選的細胞中進行表達而獲得，任選的是再進行提取或純化全部或部分蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明核酸的重組載體。有利地，這樣的重組載體包含選自下述核酸的核酸a)編碼與序列SEQ No.6或SEQ No.8具有至少65％氨基酸同一性的蛋白質(zhì)、或其肽片段或其變體的核酸；b)包含的多核苷酸具有序列SEQ No.5或SEQ No.7的核酸、或其片段或其變體；c)與具有序列SEQ No.5、或SEQ No.7的核酸至少有65％核苷酸同一性的核酸、或其片段或其變體；d)在高嚴格雜交條件下，與序列SEQ No.5或SEQ No.7的核酸雜交的核酸、或其片段或其變體。
對于本發(fā)明的目的，術語“載體”意指環(huán)狀或線狀DNA或RNA分子，而與單鏈或雙鏈型無關。
根據(jù)一個實施方案，除了根據(jù)本發(fā)明的核酸外，表達載體還包含指導其轉(zhuǎn)錄和/翻譯的調(diào)節(jié)序列。根據(jù)一個有利的實施方案，根據(jù)本發(fā)明的重組載體特別包括下述元件(1)調(diào)節(jié)欲插入核酸的表達的元件，如啟動子和增強子；(2)欲插入該載體的本發(fā)明核酸中所包括的編碼序列，其中所述編碼序列與(1)中所述的調(diào)節(jié)信號相協(xié)調(diào)地連接；和(3)合適的轉(zhuǎn)錄起始和終止序列。
另外，根據(jù)本發(fā)明的重組載體可包括預期進行該載體復制或表達的細胞宿主中的一個或多個復制起點、標記或選擇性標記。
通過舉例的方式，真核細胞的啟動子包括HSV病毒胸苷激酶啟動子或小鼠金屬硫蛋白-L啟動子。
一般而言，對于合適啟動子的選擇，本領域的技術人員有利地參考SAMBROOK等的工作(1989，“Molecular CloningA LaboratoryManual”，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY)、或FULLER等所述的技術(1996，Immunology in CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel等)根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選載體是質(zhì)粒，例如pcDNA3載體(Invitrogen)、pQE70、pQE60、pQE9(Qiagen)、psiX174、pBluescript SA、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTI或pSG(Stratagene)。
它們也可是桿狀病毒類型的載體，如來源于草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的用于轉(zhuǎn)染Sf9細胞系的載體pVL1392/1393(Pharmingen)。
它們也可以是腺病毒載體，如人腺病毒2或5型。
根據(jù)本發(fā)明的重組載體也可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或備選地為腺伴隨病毒載體(AAV)。例如，F(xiàn)LOTTE等(1992，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，7349-356)所述的腺伴隨病毒載體。
本發(fā)明的主題也為包含上述蛋白質(zhì)、核酸或載體的細胞、或這些細胞碎片、這些細胞的裂解物或這些細胞的膜。
這些細胞可為從有機體中分離的細胞和在適當?shù)纳L培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞。然而，它們優(yōu)選的是細胞系。因此，特別有利地，這些細胞系是HEK293、COS(ATCC No.CRL 1650)、COS-M6和HeLa(ATCC No.CCL2)、或Cv 1(ATCC No.CCL70)、Sf-9(ATCC No.CRL 1711)、CHO(ATCCNo.CCL-61)或3T3(ATCC No.CRL-6361)。
可通過本領域技術人員公知的方法制備這些細胞的膜。優(yōu)選的是，可通過機械碾磨細胞，然后離心獲得的懸液而制備它們，如下述實施例中所述。
本發(fā)明也涉及包含上述細胞和皂甙的組合物。本發(fā)明也涉及確定化合物和瘦素受體結合的方法，其包括的步驟有-使所述化合物與上述的能量供體融合蛋白和上述的能量受體融合蛋白、或包含此類蛋白質(zhì)的細胞、或細胞碎片、或細胞裂解物、或細胞膜、以及合適的酶底物接觸，以及-測量能量轉(zhuǎn)移。
優(yōu)選的是，上述方法用于以皂甙處理的細胞。
選擇能量供體融合蛋白和能量受體融合蛋白，以便來源于激活供體的能量可有效轉(zhuǎn)移至受體。
在上述方法的一個有利的實施方案中，能量供體融合蛋白是來源于瘦素受體或瘦素受體的實質(zhì)性部分和螢光素酶或螢光素酶的實質(zhì)性部分的融合蛋白，在這種情況下，底物有利地是腔腸素(coelenterazine)。
在上述方法優(yōu)選的實施方案中，能量受體融合蛋白是來源于將瘦素受體或瘦素受體實質(zhì)性部分和YFP或YFP的實質(zhì)性部分融合的蛋白質(zhì)。
在上述方法的有利實施方案中，在受試化合物存在時測量的能量轉(zhuǎn)移與不存在受試化合物時進行了比較。
優(yōu)選的是，本方法用于上述的細胞膜。優(yōu)選的是，對本發(fā)明的供體和受體蛋白質(zhì)進行選擇，以便通過BRET或LRET共振產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移。然而，F(xiàn)RET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)或CRET(化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移)可實現(xiàn)這種能量轉(zhuǎn)移。不管能量轉(zhuǎn)移是哪種類型，需選擇能量供體融合蛋白/能量受體融合蛋白對，以允許這種轉(zhuǎn)移。CRET由水母發(fā)光蛋白(其為螢光素酶)和GFP之間的能量轉(zhuǎn)移組成。FRET由GFP家族具有不同光譜的兩種蛋白質(zhì)之間的能量轉(zhuǎn)移組成。
這些轉(zhuǎn)移的實施，對CRET，本領域技術人員可參考Baubet等(PNASUSA 977260-7265(2000))、對FRET，可參考Matyus(J.Photochem.Photobiol.B 12323-337(1992))以及Pollok和Heim(Trends Cell Biol.957-60(1999))。
本發(fā)明的另一個主題是篩選或檢測預期用于預防和/或治療與瘦素相關的病理學疾病的化合物的方法，其包括下述步驟-將所述化合物與上述的能量供體融合蛋白和上述的能量受體融合蛋白、或包含此類蛋白質(zhì)的在存在或不存在皂甙時的細胞或細胞碎片或細胞裂解物或細胞膜，以及任選地合適的酶底物接觸，并-測量能量轉(zhuǎn)移。
這種方法可用于篩選瘦素受體的激動劑或拮抗劑。根據(jù)本發(fā)明的方法與一般使用的96孔或384孔板一致。它不需使用放射性分子，敏感、可重復、迅速、結果易于閱讀。特別的是，該方法具有優(yōu)良的信號/背景噪音比，與非瘦素配體具有低的交叉反應性。在受體水平上直接檢測OBR的活性的事實至少部分解釋了這一點，這使得在信號途徑的其它水平上消除可能的交叉反應來源成為可能，這一點可在基于報告基因或細胞的生長實驗中觀察到。另外，本方法不限于具有特異信號的轉(zhuǎn)導途徑，但另一方面，它可檢測所有與OBR相互作用的分子。這種特性尤其便于實現(xiàn)大規(guī)模篩選，因為發(fā)現(xiàn)越來越多的膜受體配體可激活一些途徑而不激活其它一些途徑。
本發(fā)明也涉及利用下述方法選擇的化合物的用途-將所述化合物與上述能量供體融合蛋白和能量受體融合蛋白、或包含此類蛋白質(zhì)的細胞、或細胞碎片或細胞裂解物或細胞膜、以及任選地合適的酶底物接觸，和-測量能量轉(zhuǎn)移，用于制備治療或預防與瘦素或其受體相關疾病的醫(yī)藥產(chǎn)品。
最后，本發(fā)明的主題是治療或預防與瘦素或其受體相關的疾病的方法，其包括以下步驟
-利用下述方法選擇所述化合物+將所述化合物與能量供體融合蛋白和能量受體融合蛋白、或包含此類蛋白質(zhì)的細胞碎片、細胞裂解物或細胞膜、以及合適的酶底物接觸，和+測量能量轉(zhuǎn)移，以及-將所述化合物施與患有所述疾病的患者。
這些疾病可為與骨密度降低相關的疾病，例如骨質(zhì)疏松癥，或相反地與嚴重鈣化作用相關的疾病。它們也可能是對體重有影響的疾病，如肥胖癥、糖尿病或厭食癥。本發(fā)明的化合物可制劑為藥物組合物，以用于局部、經(jīng)口、腸胃外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、眼內(nèi)等施用。優(yōu)選的是，藥物組合物包含用于注射劑型的可藥用載體。特別的，它們可為鹽水(磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等或這些鹽的混合物)、無菌等滲溶液、或干燥特別是冷凍干燥的組合物，其中所述干燥的組合物根據(jù)需要，可加入無菌水或生理鹽水使之構成注射的溶質(zhì)。
最后，根據(jù)本發(fā)明的方法也可用于篩選來自肥胖病人的血清，用于了解無功能瘦素的存在與否，或篩選可干擾OBR二聚體化的分子。
圖1概略表示融合蛋白。Box1表示JAK2結合位點；Box3表示STAT蛋白質(zhì)結合位點；TM表示跨膜結構域。
圖2a和2b圖解了OBR構建體在COS細胞中的表達，通過放射標記實驗，使用125I-瘦素作為放射性配體進行評估。在圖2a和2b中對OBR的總細胞含量和細胞表面結合位點的百分率分別進行測量。
圖2c圖解了OBRl-YFP和OBRs-YFP構建體在存在和不存在瘦素時表達的細胞定位。
圖2d圖解了用不同OBR構建體激活JAK2。
圖2e圖解了瘦素對共表達的STAT3報告基因和不同OBR構建體的細胞的刺激效果。
圖3圖解了OBR的組成型二聚體化。將表達所示的不同OBR構建體的HEK293細胞在腔腸素存在下進行孵育。利用發(fā)光計測量能量轉(zhuǎn)移。
圖4a和4b圖解了瘦素結合對OBR的組成型BRET的影響。
圖4a表達所示的不同OBR構建體的HeLa細胞在螢光素酶反應啟動之前，在瘦素存在時進行孵育。利用發(fā)光計測量能量轉(zhuǎn)移。
圖4b在共表達OBRs-螢光素酶和OBR-YFP的全細胞、存在或不存在皂甙、總裂解液和膜制備物中比較瘦素的作用。
圖5a-5e圖解了瘦素對OBRs誘導BRET改變的優(yōu)化和特征。在螢光素酶反應啟動之前，從共表達OBRs-螢光素酶和OBRs-YFP的HeLa或COS細胞制備的膜用或不用瘦素進行預先孵育。
圖5a優(yōu)化OBRs-螢光素酶和OBRs-YFP表達的相對和絕對水平。
圖5b瘦素誘導的BRET信號改變與時間的關系。
圖5c存在皂甙(0.05％)時，BRET/瘦素濃縮物在膜和完整細胞上的劑量-反應曲線。
圖5d通過增加瘦素濃度時125I-瘦素的結合競爭。
圖5e瘦素誘導的BRET改變的特異性。膜與飽和濃度的促紅細胞生成素(EPO，10U/ml)、促血小板生成素(TPO，10nM)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF，250ng/ml)、白細胞介素3(IL3，280ng/ml)、白細胞介素6(IL6，100ng/ml)、催乳素(PRL，200ng/ml)、干細胞因子α(SCFα，250ng/ml)、表皮生長因子(EGF，100ng/ml)、胰島素(Ins，100nM)、脂多糖(LPS，100ng/ml)和腫瘤壞死因子α(TNFα，50ng/ml)進行預孵育。
圖6用恒量的OB-Rs-Luc(50ng)和漸增量○200ng、●400ng、△800ng、◆1600ng和◇3200ng的OB-Rs-YFP共轉(zhuǎn)染COS細胞。BRET的測量在用或不用漸增劑量的瘦素孵育，在皂甙(0.015％)存在下的細胞上進行，并表示為mBRET。
通過下述實施例，對本發(fā)明進行了闡釋，但這些實施例不用于限制本發(fā)明。
實施例中使用的材料和方法質(zhì)粒構建、轉(zhuǎn)染和細胞培養(yǎng)通過常規(guī)分子生物學技術，將YFP和Luc連接至受體的C末端以構建OB-R-YFP和OB-R-Luc融合蛋白。將從載體pGFPtpz-N1Cytogem-Topaze(Packard，Meriden，CT)獲得的YFP編碼區(qū)插入包含有經(jīng)修飾的多接頭位點的pcDNA3/CMV(Invitrogen，Groningen，TheNetherlands)的EcoRV位點。從pRL-CMV(Promega，Madison，WI)獲得Renilla螢光素酶編碼區(qū)，并將其插入經(jīng)修飾的pcDNA3的EcoRV位點。將OBRl和OBRs的編碼區(qū)(Gainsford博士惠贈，皇家墨爾本醫(yī)院，維多利亞，澳大利亞)插入上述的兩個載體，克隆位點分別為EcoR I/BamHI和NheI。通過定點誘變?nèi)笔ЫK止密碼子，并調(diào)整融合蛋白的讀碼框架。
HEK293、COS-M6和HeLa細胞系在加有下述成分10％(v/v)FBS，4.5g/l葡萄糖，100U/ml青霉素，0.1mg/ml鏈霉素，1mM谷氨酰胺(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)的DMEM中培養(yǎng)。
利用FuGene 6轉(zhuǎn)染試劑(Roche，Basle，瑞士)實施瞬時轉(zhuǎn)染。
熒光顯微鏡檢查用YFP構建體轉(zhuǎn)染后2天，在用PBS洗滌、用含4％多聚甲醛的冷PBS溶液在室溫固定20分鐘之前，細胞用100nM瘦素孵育60分鐘，用0.01nM二芐脒孵育15分鐘。利用FITC和DAPI濾片通過熒光顯微鏡觀察切片。
膜的制備和溶解將細胞放在冰中，在冰浴中用PBS洗滌2次，并于冰的溫度下在緩沖液1(5mM Tris、2mM EDTA，pH 7.4、5mg/l大豆胰蛋白酶抑制劑、5mg/l亮抑酶肽和10mg/l芐脒)中機械分離。細胞懸液用Polytron勻漿器(Janke &Kunkel Ultra-Turrax T25)勻漿，每次5秒，共3次。裂解液于4℃450g離心5分鐘，并將上清于4℃48000g離心30分鐘。最后的沉淀用緩沖液1洗滌2次，并將其重懸于溶液(如上述，75mM Tris(pH 7.4)、12.5mMMgCl2，、5mM EDTA、蛋白酶抑制劑)中，并立即用于放射配體結合實驗或BRET實驗。
JAK2的免疫沉淀用表達HA2標記的JAK2的質(zhì)粒(Wojchowski博士惠贈，賓夕法尼亞州立大學，賓夕法尼亞，美國)和包含不同OBR構建體的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細胞。在裂解緩沖液(10mM Tris、150mM NaCl、5mM EDTA、5％甘油、0.02％NaN3、0.1％NP40、1mM原釩酸鹽、5mg/l大豆胰蛋白酶抑制劑和10mg/l芐脒)中裂解細胞，并于13000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘?？扇芗壏钟每笿AK2多克隆抗體(HR-758)(1μg/ml)(Santa-Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)免疫沉淀2小時。
SDS-PAGE免疫吸附JAK2免疫沉淀物于100℃在溶液(62.5mM Tris/HCl(pH 6.8)、5％SDS、10％甘油和0.05％溴酚藍)中變性10分鐘。通過7％聚丙烯酰胺SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素。免疫檢測用抗磷酸酪氨酸抗體4G10(2μg/ml)(Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY)實施。利用合適的偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的二抗和ECL化學發(fā)光試劑(Amersham，Aylesbury，UK)揭示免疫活性。
125I-瘦素結合實驗結合實驗前24小時，轉(zhuǎn)染細胞在DMEM(1％BSA)中耗盡血清。為測量結合至細胞表面的瘦素，細胞在冰浴中用PBS洗滌2次，在存在或不存在200nM非放射性瘦素(重組人瘦素(PeproTech Inc.，USA))時，在包含100000cpm/孔125I-瘦素(Perkin Elmer life sciences，巴黎，法國)的結合緩沖液(DMEM、25mM Hepes，pH7.4，1％BSA)中于4℃孵育4小時。在冰的溫度下用PBS洗滌細胞2次，用1N NaOH裂解，放射活性用γ放射計數(shù)器確定。為測量提取物中結合瘦素的總量，將細胞于4℃在1.5ml包含0.15％毛地黃皂甙的結合緩沖液中重懸2小時。將提取物置于Eppendorf管中在離心機中于4℃、最高轉(zhuǎn)速離心30分鐘。存在或不存在200nM瘦素時，將上清(0.2ml)與100000125I-瘦素以總體積為0.25ml，于4℃孵育，攪拌過夜。加入0.5mlγ-球蛋白(1.25mg/ml)和0.5ml PEG6000(25％w/v)，離心(17000×g，3分鐘)，沉淀獲得的受體-配體復合體。沉淀用1ml 12％(w/v)PEG6000洗滌，然后計數(shù)。
報告基因的活化HeLa細胞用2.6μg攜帶STAT3報告基因的質(zhì)粒(Levy博士惠贈，紐約大學，紐約，美國)、200pg包含Renilla螢光素酶(作為內(nèi)對照)編碼區(qū)的pcDNA3和1.4μg不同的OBR構建體共轉(zhuǎn)染或僅用其載體共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時，用1nM瘦素刺激6-8小時之前，細胞在DMEM(1％BSA)中過夜耗竭。然后洗滌細胞，于室溫在被動裂解緩沖液(PromegaCorporation，Madison，WI)中裂解15分鐘。總裂解液于15000轉(zhuǎn)/分離心2分鐘，利用Berthold發(fā)光計(Lumat LB 9507)，將上清用于測量螢光素酶(Promega Corporation，Madison，WI)的實驗。結果用螢火蟲螢光素酶/Renilla螢光素酶的活性比表示。
測量BRET轉(zhuǎn)染后48小時，刮下表達OBR的HeLa、COS和HEK293細胞，并用PBS洗滌。在存在或不存在配體時，于25℃將1-2×105細胞分配至96孔光學板(Packard Instrument Company，Meriden，CT)。從表達OBR的細胞制備的膜用于測量BRET。加入底物腔腸素h(Molecular Probes，Eugene，OR)，終濃度為5μM，利用FusionTMfluoro/發(fā)光計(Packard InstrumentCompany，Meriden，CT)進行讀數(shù)，該儀器允許連續(xù)整合用兩種濾片(Luc濾片485±10nm；YFP濾片530±12.5nm)檢測發(fā)光信號。BRET比率定義為共轉(zhuǎn)染的Luc和YFP融合蛋白與單獨轉(zhuǎn)染的Luc融合蛋白在530nm/485nm處發(fā)光的差別。結果表示為毫BRET單位(mBU)，1mBRET單位對應于BRET比值乘以1000的值。下述配體用于確定試驗的特異性重組人促紅細胞生成素(EPO)、胰島素(Ins)、脂多糖(LPS，Sigma Aldrich，St.Louis，USA)、重組人促血小板生成素(TPO)、GM-CSF、白細胞介素3(IL3)、白細胞介素6(IL6)、催乳素(PRL)、SCF、EGF和TNFα。
實施例1OBR融合蛋白的功能表達將YFP或Luc融合至OBR的長型(OBRl)和短型(OBRs)的C末端(圖1)。用125I-瘦素結合實驗在轉(zhuǎn)染的COS細胞中確認這些融合蛋白的表達(圖2a)。在轉(zhuǎn)染的HeLa細胞中獲得類似的結果。在COS細胞的細胞表面表達的融合蛋白和野生型受體的量為5-10％，這與已公知的數(shù)值一致。在表達內(nèi)源OBR(14±3％)的HEK293細胞中獲得類似數(shù)值。利用與YFP融合的蛋白質(zhì)，通過熒光顯微鏡研究OBR融合蛋白在HeLa細胞中的定位。來自OBRl-YFP的熒光在細胞中以點狀分布，而來自OBRs-YFP的熒光以斑塊狀定位。在細胞內(nèi)定位的大斑塊OBRl-YFP的瘦素刺激可能對應于內(nèi)體區(qū)室。OBRs-YFP的定位無顯著改變。通過熒光顯微鏡獲得的結果證明OBR主要定位于細胞內(nèi)區(qū)室，并與已公知的OBRl-GFP融合蛋白在COS細胞中的定位一致。
通過測量JAK-STAT途徑的激活評價融合蛋白的功能性表達。JAK2激酶與OBRs和OBRl的胞內(nèi)結構域結合。配體結合誘導JAK2的磷酸根轉(zhuǎn)移，并磷酸化OBRl，而不是OBRs。然后磷酸化的OBRl提供STAT蛋白的結合位點，其中所述STAT蛋白在所述受體結合后通過酪氨酸磷酸化而激活。然后，激活的STST蛋白質(zhì)二聚體化，并移位至細胞核，如Tartaglia(1997，J.Biol.Chem.272，6093-6096)所述，在細胞核它們通過STST反應性元件刺激基因轉(zhuǎn)錄。
如圖2c所示，所有OBRs構建體誘導JAK2磷酸化，這顯示JAK2已激活。通過OBRl-WT和OBRl融合蛋白，STAT3報告基因的活性提高2-4倍，而短的同工型對報告基因的活性無影響。這些結果表明，OBR融合蛋白在HeLa細胞中的表達產(chǎn)物是有功能的。
實施例2在活細胞中OBR的組成型二聚體化在活細胞中研究OBR-Luc和OBR-YFP的二聚體化。
在等摩爾量表達的OBRs-Luc和OBRs-YFP之間、也在OBRl-Luc和OBRl-YFP之間觀察到明顯的能量轉(zhuǎn)移，這顯示對兩種受體(圖3a，b)存在組成型二聚體。在OBRs-Luc和OBRl-YFP之間、也在OBRl-Luc和OBRs-YFP之間，通過檢測BRET證明在活細胞中存在OBRs/OBRl異二聚體。由于在OBRs-Luc和OBRl-Luc與最近描述的YFP和胰島素受體的融合蛋白(Boute等人，2001，如上所述)之間不存在明顯的轉(zhuǎn)移，這些相互作用的特異性得以闡述。這些結果表明，短和長的同工型包括在活細胞中的異型和同型復合體中。
實施例3瘦素結合對ORR的組成型BRET的影響為評價激動劑對組成型BRET的影響，在螢光素酶和其底物的反應啟動之前，將細胞與瘦素進行預孵育。用OBRl同源二聚體和OBRs/OBRl異源二聚體這兩種組合物均沒觀察到組成型BRET的變化，而用OBRs同源二聚體觀察到BRET增加(圖4a)。然后，用不同的細胞制備物測量瘦素誘導的OBRs同源二聚體的BRET的改變。細胞在低滲緩沖液中的機械破碎可顯著提高瘦素對BRET的增強，而基礎BRET保持不變。自胞質(zhì)溶膠分離的膜級分獲得了類似的結果。雖然所有的OBRs-Luc/OBRs-YFP組合對基礎BRET有作用，但瘦素僅刺激暴露于細胞表面的受體(5-10％)，其中所述瘦素不可透過完整細胞的膜。細胞膜的破碎增加可接近瘦素的OBR級分并對瘦素誘導的BRET增強起作用。
在用皂甙處理的細胞上獲得類似的結果。該組分在膜上產(chǎn)生孔，并允許蛋白質(zhì)如瘦素進入胞內(nèi)區(qū)室，在胞內(nèi)區(qū)室存在大多數(shù)的OBRs。用表達OBRl同源二聚體或OBRs/OBRl異源二聚體的細胞制備物進行的類似實驗中，未觀察到瘦素誘導的BRET改變。然后，為優(yōu)化瘦素誘導的BRET，調(diào)整OBRs-Luc和OBRs-YFP的量和比例(圖5a)。當使用500ng編碼OBRs-Luc的DNA和250ng編碼OBRs-YFP的DNA時，獲得最好的結果。在這些優(yōu)化的條件下，用飽和濃度的瘦素誘導與皂甙孵育的細胞或從表達OBRs同源二聚體的細胞制備的膜，基礎BRET信號增加2-2.5倍。這種增加是隨時間變化的。在室溫(圖5b)，與1nM瘦素孵育20分鐘后可達到最大值。對更高濃度的瘦素，在室溫孵育5分鐘后獲得最大值。
瘦素的作用是劑量依賴的，EC50大約是100pM(圖5c)，與從OBRs-Luc(116pM)和OBRs-YFP(35pM)融合蛋白(圖5d)獲得的Ki值一致。通過配體與飽和濃度的幾種細胞因子和其它膜受體配體，如促紅細胞生成素、促血小板生成素、GM-CSF、IL3、IL6、PRL、SCFα、EGF、胰島素、LPS和TNFα結合所誘導的BRET不存在，該試驗的特異性得到證明。
受體以二聚體形式的分布遵循下列統(tǒng)計學規(guī)則并且受體數(shù)量比是1/1，如果所有受體是二聚體型，預計為下述分布1/4 Luc/Luc、1/4 YFP/YFP和1/2可產(chǎn)生BRET信號(1/4 Luc/YFP、1/4 YFP/Luc)的受體。然而，在BRET測量中，所有融合至Luc的分子產(chǎn)生發(fā)光信號，因此按1/1比例，在所有供體群中觀察到半數(shù)可BRET的受體。因此，為增加BRET信號，進行了下述實驗，實驗中將Luc用YFP分子飽和以便所有Luc分子和YFP分子(可BRET)形成二聚體。圖6的結果表明，在飽和期間基礎BRET信號增加，用瘦素進行的誘導與基礎信號成比例，是基礎BRET刺激效果的2-2.5倍。在飽和狀態(tài)，基礎和誘導的BRET可獲得更好的分辨率，使得篩選分子更容易。
序列表<110>安萬特醫(yī)藥股份有限公司<120>檢測瘦素受體配體的方法<130>瘦素受體BRET<140>
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<221>CDS<222>(1)..(2691)<400>1atg att tgt caa aaa ttc tgt gtg gtt ttg tta cat tgg gaa ttt att 48Met Ile Cys Gln Lys Phe Cys Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Ile1 5 10 15tat gtg ata act gcg ttt aac ttg tca tat cca att act cct tgg aga 96Tyr Val Ile Thr Ala Phe Asn Leu Ser Tyr Pro Ile Thr Pro Trp Arg20 25 30ttt aag ttg tct tgc atg cca cca aat tca acc tat gac tac ttc ctt 144Phe Lys Leu Ser Cys Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr Asp Tyr Phe Leu35 40 45ttg cct gct gga ctc tca aag aat act tca aat tcg aat gga cat tat 192Leu Pro Ala Gly Leu Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser Asn Gly His Tyr50 55 60gag aca gct gtt gaa cct aag ttt aat tca agt ggt act cac ttt tct 240Glu Thr Ala Val Glu Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly Thr His Phe Ser
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595 600 605gtt cag gtg cgc tgt aag agg cta gat gga ctg gga tat tgg agt aat 1872Val Gln Val Arg Cys Lys Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn610 615 620tgg agc aat cca gcc tac aca gtt gtc atg gat ata aaa gtt cct atg 1920Trp Ser Asn Pro Ala Tyr Thr Val Val Met Asp Ile Lys Val Pro Met625 630 635 640aga gga cct gaa ttt tgg aga ata att aat gga gat act atg aaa aag 1968Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg Ile Ile Asn Gly Asp Thr Met Lys Lys645 650 655gag aaa aat gtc act tta ctt tgg aag ccc ctg atg aaa aat gac tca 2016Glu Lys Asn Val Thr Leu Leu Trp Lys Pro Leu Met Lys Asn Asp Ser660 665 670ttg tgc agt gtt cag aga tat gtg ata aac cat cat act tcc tgc aat 2064Leu Cys Ser Val Gln Arg Tyr Val Ile Asn His His Thr Ser Cys Asn675 680 685gga aca tgg tca gaa gat gtg gga aat cac acg aaa ttc act ttc ctg 2112Gly Thr Trp Ser Glu Asp Val Gly Asn His Thr Lys Phe Thr Phe Leu690 695 700tgg aca gag caa gca cat act gtt acg gtt ctg gcc atc aat tca att 2160Trp Thr Glu Gln Ala His Thr Val Thr Val Leu Ala Ile Asn Ser Ile705 710 715 720ggt gct tct gtt gca aat ttt aat tta acc ttt tca tgg cct atg agc 2208Gly Ala Ser Val Ala Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser725 730 735aaa gta aat atc gtg cag tca ctc agt gct tat cct tta aac agc agt 2256Lys Val Asn Ile Val Gln Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Asn Ser Ser740 745 750tgt gtg att gtt tcc tgg ata cta tca ccc agt gat tac aag cta atg 2304Cys Val Ile Val Ser Trp Ile Leu Ser Pro Ser Asp Tyr Lys Leu Met755 760 765tat ttt att att gag tgg aaa aat ctt aat gaa gat ggt gaa ata aaa 2352Tyr Phe Ile Ile Glu Trp Lys Asn Leu Asn Glu Asp Gly Glu Ile Lys
770 775 780tgg ctt aga atc tct tca tct gtt aag aag tat tat atc cat gat cat 2400Trp Leu Arg Ile Ser Ser Ser Val Lys Lys Tyr Tyr Ile His Asp His785 790 795 800ttt atc ccc att gag aag tac cag ttc agt ctt tac cca ata ttt atg 2448Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Ile Phe Met805 810 815gaa gga gtg gga aaa cca aag ata att aat agt ttc act caa gat gat 2496Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys Ile Ile Asn Ser Phe Thr Gln Asp Asp820 825 830att gaa aaa cac cag agt gat gca ggt tta tat gta att gtg cca gta 2544Ile Glu Lys His Gln Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Val Ile Val Pro Val835 840 845att att tcc tct tcc atc tta ttg ctt gga aca tta tta ata tca cac 2592Ile Ile Ser Ser Ser Ile Leu Leu Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser His850 855 860caa aga atg aaa aag cta ttt tgg gaa gat gtt ccg aac ccc aag aat 2640Gln Arg Met Lys Lys Leu Phe Trp Glu Asp Val Pro Asn Pro Lys Asn865 870 875 880tgt tcc tgg gca caa gga ctt aat ttt cag aag aga acg gac att ctt 2688Cys Ser Trp Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys Arg Thr Asp Ile Leu885 890 895tga 2691<210>2<211>896<212>PRT<213>人<400>2Met Ile Cys Gln Lys Phe Cys Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Ile1 5 10 15Tyr Val Ile Thr Ala Phe Asn Leu Ser Tyr Pro Ile Thr Pro Trp Arg
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<221>CDS<222>(1)..(2757)<220>
<223>人工序列描述包含部分OBRs的融合蛋白<400>3atg gtt ctt gcc agc tct acc acc agc atc cac acc atg ctg ctc ctg 48Met Val Leu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Ile His Thr Met Leu Leu Leu1 5 10 15ctc ctg atg ctc ttc cac ctg gga ctc caa gct tca atc tcg gcg cgc 96Leu Leu Met Leu Phe His Leu Gly Leu Gln Ala Ser Ile Ser Ala Arg20 25 30cag gag cag aag ctt atc tcg gag gag gac ctg acg cgt tat cca att 144Gln Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Thr Arg Tyr Pro Ile35 40 45act cct tgg aga ttt aag ttg tct tgc atg cca cca aat tca acc tat 192Thr Pro Trp Arg Phe Lys Leu Ser Cys Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr50 55 60gac tac ttc ctt ttg cct gct gga ctc tca aag aat act tca aat tcg 240Asp Tyr Phe Leu Leu Pro Ala Gly Leu Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser65 70 75 80aat gga cat tat gag aca gct gtt gaa cct aag ttt aat tca agt ggt 288Asn Gly His Tyr Glu Thr Ala Val Glu Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly85 90 95act cac ttt tct aac tta tcc aaa aca act ttc cac tgt tgc ttt cgg 336Thr His Phe Ser Asn Leu Ser Lys Thr Thr Phe His Cys Cys Phe Arg100 105 110agt gag caa gat aga aac tgc tcc tta tgt gca gac aac att gaa gga 384Ser Glu Gln Asp Arg Asn Cys Ser Leu Cys Ala Asp Asn Ile Glu Gly115 120 125acg aca ttt gtt tca aca gta aat tct tta gtt ttt caa caa ata gat 432Thr Thr Phe Val Ser Thr Val Asn Ser Leu Val Phe Gln Gln Ile Asp130 135 140gca aac tgg aac ata cag tgc tgg cta aaa gga gac tta aaa tta ttc 480Ala Asn Trp Asn Ile Gln Cys Trp Leu Lys Gly Asp Leu Lys Leu Phe145 150 155 160atc tgt tat gtg gag tca tta ttt aag aat cta ttc agg aat tat aac 528
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Gly Ile Trp Ser Asp Trp Ser Thr Pro Arg Val Phe Thr Thr Gln Asp340 345 350gtc ata tac ttt cca cct aaa att ctg aca agt gtt ggg tct aat gtt 1104Val Ile Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Val355 360 365tct ttt cac tgc atc tat aag aag gaa aac aag att gtt ccc tca aaa 1152Ser Phe His Cys Ile Tyr Lys Lys Glu Asn Lys Ile Val Pro Ser Lys370 375 380gag att gtt tgg tgg atg aat tta gct gag aaa att cct caa agc cag 1200Glu Ile Val Trp Trp Met Asn Leu Ala Glu Lys Ile Pro Gln Ser Gln385 390 395 400tat gat gtt gtg agt gat cat gtt agc aaa gtt act ttt ttc aat ctg 1248Tyr Asp Val Val Ser Asp His Val Ser Lys Val Thr Phe Phe Asn Leu405 410 415aat gaa acc aaa cct cga gga aag ttt acc tat gat gca gtg tac tgc 1296Asn Glu Thr Lys Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys420 425 430tgc aat gaa cat gaa tgc cat cat cgc tat gct gaa tta tat gtg att 1344Cys Asn Glu His Glu Cys His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val Ile435 440 445gat gtc aat atc aat atc tca tgt gaa act gat ggg tac tta act aaa 1392Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys450 455 460atg act tgc aga tgg tca acc agt aca atc cag tca ctt gcg gaa agc 1440Met Thr Cys Arg Trp Ser Thr Ser Thr Ile Gln Ser Leu Ala Glu Ser465 470 475 480act ttg caa ttg agg tat cat agg agc agc ctt tac tgt tct gat att 1488Thr Leu Gln Leu Arg Tyr His Arg Ser Ser Leu Tyr Cys Ser Asp Ile485 490 495cca tct att cat ccc ata tct gag ccc aaa gat tgc tat ttg cag agt 1536Pro Ser Ile His Pro Ile Ser Glu Pro Lys Asp Cys Tyr Leu Gln Ser500 505 510gat ggt ttt tat gaa tgc att ttc cag cca atc ttc cta tta tct ggc 1584
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<223>人工序列描述OBRluc融合蛋白<220>
<221>CDS<222>(1)..(3705)<400>5atg gtt ctt gcc agc tct acc acc agc atc cac acc atg ctg ctc ctg 48Met Val Leu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Ile His Thr Met Leu Leu Leu1 5 10 15ctc ctg atg ctc ttc cac ctg gga ctc caa gct tca atc tcg gcg cgc 96Leu Leu Met Leu Phe His Leu Gly Leu Gln Ala Ser Ile Ser Ala Arg20 25 30
cag gag cag aag ctt atc tcg gag gag gac ctg acg cgt tat cca att 144Gln Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Thr Arg Tyr Pro Ile35 40 45act cct tgg aga ttt aag ttg tct tgc atg cca cca aat tca acc tat 192Thr Pro Trp Arg Phe Lys Leu Ser Cys Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr50 55 60gac tac ttc ctt ttg cct gct gga ctc tca aag aat act tca aat tcg 240Asp Tyr Phe Leu Leu Pro Ala Gly Leu Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser65 70 75 80aat gga cat tat gag aca gct gtt gaa cct aag ttt aat tca agt ggt 288Asn Gly His Tyr Glu Thr Ala Val Glu Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly85 90 95act cac ttt tct aac tta tcc aaa aca act ttc cac tgt tgc ttt cgg 336Thr His Phe Ser Asn Leu Ser Lys Thr Thr Phe His Cys Cys Phe Arg100 105 110agt gag caa gat aga aac tgc tcc tta tgt gca gac aac att gaa gga 384Ser Glu Gln Asp Arg Asn Cys Ser Leu Cys Ala Asp Asn Ile Glu Gly115 120 125acg aca ttt gtt tca aca gta aat tct tta gtt ttt caa caa ata gat 432Thr Thr Phe Val Ser Thr Val Asn Ser Leu Val Phe Gln Gln Ile Asp130 135 140gca aac tgg aac ata cag tgc tgg cta aaa gga gac tta aaa tta ttc 480Ala Asn Trp Asn Ile Gln Cys Trp Leu Lys Gly Asp Leu Lys Leu Phe145 150 155 160atc tgt tat gtg gag tca tta ttt aag aat cta ttc agg aat tat aac 528Ile Cys Tyr Val Glu Ser Leu Phe Lys Asn Leu Phe Arg Asn Tyr Asn165 170 175tat aag gtc cat ctt tta tat gtt ctg cct gaa gtg tta gaa gat tca 576Tyr Lys Val His Leu Leu Tyr Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Asp Ser180 185 190cct ctg gtt ccc caa aaa ggc agt ttt cag atg gtt cac tgc aat tgc 624Pro Leu Val Pro Gln Lys Gly Ser Phe Gln Met Val His Cys Asn Cys195 200 205
agt gtt cat gaa tgt tgt gaa tgt ctt gtg cct gtg cca aca gcc aaa 672Ser Val His Glu Cys Cys Glu Cys Leu Val Pro Val Pro Thr Ala Lys210 215 220ctc aac gac act ctc ctt atg tgt ttg aaa atc aca tct ggt gga gta 720Leu Asn Asp Thr Leu Leu Met Cys Leu Lys Ile Thr Ser Gly Gly Val225 230 235 240att ttc cgg tca cct cta atg tca gtt cag ccc ata aat atg gtg aag 768Ile Phe Arg Ser Pro Leu Met Ser Val Gln Pro Ile Asn Met Val Lys245 250 255cct gat cca cca tta ggt ttg cat atg gaa atc aca gat gat ggt aat 816Pro Asp Pro Pro Leu Gly Leu His Met Glu Ile Thr Asp Asp Gly Asn260 265 270tta aag att tct tgg tcc agc cca cca ttg gta cca ttt cca ctt caa 864Leu Lys Ile Ser Trp Ser Ser Pro Pro Leu Val Pro Phe Pro Leu Gln275 280 285tat caa gtg aaa tat tca gag aat tct aca aca gtt atc aga gaa gct 912Tyr Gln Val Lys Tyr Ser Glu Asn Ser Thr Thr Val Ile Arg Glu Ala290 295 300gac aag att gtc tca gct aca tcc ctg cta gta gac agt ata ctt cct 960Asp Lys Ile Val Ser Ala Thr Ser Leu Leu Val Asp Ser Ile Leu Pro305 310 315 320ggg tct tcg tat gag gtt cag gtg agg ggc aag aga ctg gat ggc cca 1008Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg Gly Lys Arg Leu Asp Gly Pro325 330 335gga atc tgg agt gac tgg agt act cct cgt gtc ttt acc aca caa gat 1056Gly Ile Trp Ser Asp Trp Ser Thr Pro Arg Val Phe Thr Thr Gln Asp340 345 350gtc ata tac ttt cca cct aaa att ctg aca agt gtt ggg tct aat gtt 1104Val Ile Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Val355 360 365tct ttt cac tgc atc tat aag aag gaa aac aag att gtt ccc tca aaa 1152Ser Phe His Cys Ile Tyr Lys Lys Glu Asn Lys Ile Val Pro Ser Lys370 375 380
gag att gtt tgg tgg atg aat tta gct gag aaa att cct caa agc cag 1200Glu Ile Val Trp Trp Met Asn Leu Ala Glu Lys Ile Pro Gln Ser Gln385 390 395 400tat gat gtt gtg agt gat cat gtt agc aaa gtt act ttt ttc aat ctg 1248Tyr Asp Val Val Ser Asp His Val Ser Lys Val Thr Phe Phe Asn Leu405 410 415aat gaa acc aaa cct cga gga aag ttt acc tat gat gca gtg tac tgc 1296Asn Glu Thr Lys Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys420 425 430tgc aat gaa cat gaa tgc cat cat cgc tat gct gaa tta tat gtg att 1344Cys Asn Glu His Glu Cys His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val Ile435 440 445gat gtc aat atc aat atc tca tgt gaa act gat ggg tac tta act aaa 1392Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys450 455 460atg act tgc aga tgg tca acc agt aca atc cag tca ctt gcg gaa agc 1440Met Thr Cys Arg Trp Ser Thr Ser Thr Ile Gln Ser Leu Ala Glu Ser465 470 475 480act ttg caa ttg agg tat cat agg agc agc ctt tac tgt tct gat att 1488Thr Leu Gln Leu Arg Tyr His Arg Ser Ser Leu Tyr Cys Ser Asp Ile485 490 495cca tct att cat ccc ata tct gag ccc aaa gat tgc tat ttg cag agt 1536Pro Ser Ile His Pro Ile Ser Glu Pro Lys Asp Cys Tyr Leu Gln Ser500 505 510gat ggt ttt tat gaa tgc att ttc cag cca atc ttc cta tta tct ggc 1584Asp Gly Phe Tyr Glu Cys Ile Phe Gln Pro Ile Phe Leu Leu Ser Gly515 520 525tac aca atg tgg att agg atc aat cac tct cta ggt tca ctt gac tct 1632Tyr Thr Met Trp Ile Arg Ile Asn His Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser530 535 540cca cca aca tgt gtc ctt cct gat tct gtg gtg aag cca ctg cct cca 1680Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser Val Val Lys Pro Leu Pro Pro545 550 555 560
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atc aag agc gag gag ggc gag aag atg gtg ctg gag aac aac ttc ttc 3312Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu Glu Asn Asn Phe Phe109010951100gtg gag acc atg ctg ccc agc aag atc atg aga aag ctg gag ccc gag 3360Val Glu Thr Met Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg Lys Leu Glu Pro Glu1105 111011151120gag ttc gcc gcc tac ctg gag ccc ttc aag gag aag ggc gag gtg aga 3408Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu Lys Gly Glu Val Arg112511301135aga ccc acc ctg agc tgg ccc aga gag atc ccc ctg gtg aag ggc ggc 3456Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro Leu Val Lys Gly Gly114011451150aag ccc gac gtg gtg cag atc gtg aga aac tac aac gcc tac ctg aga 3504Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr Asn Ala Tyr Leu Arg115511601165gcc agc gac gac ctg ccc aag atg ttc atc gag agc gac ccc ggc ttc 3552Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Met Phe Ile Glu Ser Asp Pro Gly Phe117011751180ttc agc aac gcc atc gtg gag ggc gcc aag aag ttc ccc aac acc gag 3600Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys Phe Pro Asn Thr Glu1185 119011951200ttc gtg aag gtg aag ggc ctg cac ttc agc cag gag gac gcc ccc gac 3648Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Ser Gln Glu Asp Ala Pro Asp120512101215gag atg ggc aag tac atc aag agc ttc gtg gag aga gtg ctg aag aac 3696Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu Arg Val Leu Lys Asn122012251230gag cag taa 3705Glu Gln1235<210>6<211>1234<212>PRT
<213>人工序列<223>人工序列描述OBRluc融合蛋白<400>6Met Val Leu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Ile His Thr Met Leu Leu Leu15 10 15Leu Leu Met Leu Phe His Leu Gly Leu Gln Ala Ser Ile Ser Ala Arg20 25 30Gln Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Thr Arg Tyr Pro Ile35 40 45Thr Pro Trp Arg Phe Lys Leu Ser Cys Met Pro Pro ASn Ser Thr Tyr50 55 60Asp Tyr Phe Leu Leu Pro Ala Gly Leu Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser65 70 75 80Asn Gly His Tyr Glu Thr Ala Val Glu Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly85 90 95Thr His Phe Ser Asn Leu Ser Lys Thr Thr Phe His Cys Cys Phe Arg100 105 110Ser Glu Gln Asp Arg Asn Cys Ser Leu Cys Ala Asp Asn Ile Glu Gly115 120 125Thr Thr Phe Val Ser Thr Val Asn Ser Leu Val Phe Gln Gln Ile Asp130 135 140Ala Asn Trp Asn Ile Gln Cys Trp Leu Lys Gly Asp Leu Lys Leu Phe145 150 155 160Ile Cys Tyr Val Glu Ser Leu Phe Lys Asn Leu Phe Arg Asn Tyr Asn165 170 175Tyr Lys Val His Leu Leu Tyr Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Asp Ser180 185 190Pro Leu Val Pro Gln Lys Gly Ser Phe Gln Met Val His Cys Asn Cys195 200 205Ser Val His Glu Cys Cys Glu Cys Leu Val Pro Val Pro Thr Ala Lys
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<223>人工序列描述OBRyfp融合蛋白<220>
<221>CDS<222>(1)..(3486)<400>7atg gtt ctt gcc agc tct acc acc agc atc cac acc atg ctg ctc ctg 48Met Val Leu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Ile His Thr Met Leu Leu Leu1 5 10 15ctc ctg atg ctc ttc cac ctg gga ctc caa gct tca atc tcg gcg cgc 96Leu Leu Met Leu Phe His Leu Gly Leu Gln Ala Ser Ile Ser Ala Arg20 25 30cag gag cag aag ctt atc tcg gag gag gac ctg acg cgt tat cca att 144Gln Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Thr Arg Tyr Pro Ile35 40 45
act cct tgg aga ttt aag ttg tct tgc atg cca cca aat tca acc tat 192Thr Pro Trp Arg Phe Lys Leu Ser Cys Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr50 55 60gac tac ttc ctt ttg cct gct gga ctc tca aag aat act tca aat tcg 240Asp Tyr Phe Leu Leu Pro Ala Gly Leu Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser65 70 75 80aat gga cat tat gag aca gct gtt gaa cct aag ttt aat tca agt ggt 288Asn Gly His Tyr Glu Thr Ala Val Glu Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly85 90 95act cac ttt tct aac tta tcc aaa aca act ttc cac tgt tgc ttt cgg 336Thr His Phe Ser Asn Leu Ser Lys Thr Thr Phe His Cys Cys Phe Arg100 105 110agt gag caa gat aga aac tgc tcc tta tgt gca gac aac att gaa gga 384Ser Glu Gln Asp Arg Asn Cys Ser Leu Cys Ala Asp Asn Ile Glu Gly115 120 125acg aca ttt gtt tca aca gta aat tct tta gtt ttt caa caa ata gat 432Thr Thr Phe Val Ser Thr Val Asn Ser Leu Val Phe Gln Gln Ile Asp130 135 140gca aac tgg aac ata cag tgc tgg cta aaa gga gac tta aaa tta ttc 480Ala Asn Trp Asn Ile Gln Cys Trp Leu Lys Gly Asp Leu Lys Leu Phe145 150 155 160atc tgt tat gtg gag tca tta ttt aag aat cta ttc agg aat tat aac 528Ile Cys Tyr Val Glu Ser Leu Phe Lys Asn Leu Phe Arg Asn Tyr Asn165 170 175tat aag gtc cat ctt tta tat gtt ctg cct gaa gtg tta gaa gat tca 576Tyr Lys Val His Leu Leu Tyr Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Asp Ser180 185 190cct ctg gtt ccc caa aaa ggc agt ttt cag atg gtt cac tgc aat tgc 624Pro Leu Val Pro Gln Lys Gly Ser Phe Gln Met Val His Cys Asn Cys195 200 205agt gtt cat gaa tgt tgt gaa tgt ctt gtg cct gtg cca aca gcc aaa 672Ser Val His Glu Cys Cys Glu Cys Leu Val Pro Val Pro Thr Ala Lys210 215 220
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tgg cct atg agc aaa gta aat atc gtg cag tca ctc agt gct tat cct 2304Trp Pro Met Ser Lys Val Asn Ile Val Gln Ser Leu Ser Ala Tyr Pro755 760 765tta aac agc agt tgt gtg att gtt tcc tgg ata cta tca ccc agt gat 2352Leu Asn Ser Ser Cys Val Ile Val Ser Trp Ile Leu Ser Pro Ser Asp770 775 780tac aag cta atg tat ttt att att gag tgg aaa aat ctt aat gaa gat 2400Tyr Lys Leu Met Tyr Phe Ile Ile Glu Trp Lys Asn Leu Asn Glu Asp785 790 795 800ggt gaa ata aaa tgg ctt aga atc tct tca tct gtt aag aag tat tat 2448Gly Glu Ile Lys Trp Leu Arg Ile Ser Ser Ser Val Lys Lys Tyr Tyr805 810 815atc cat gat cat ttt atc ccc att gag aag tac cag ttc agt ctt tac 2496Ile His Asp His Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr820 825 830cca ata ttt atg gaa gga gtg gga aaa cca aag ata att aat agt ttc 2544Pro Ile Phe Met Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys Ile Ile Asn Ser Phe835 840 845act caa gat gat att gaa aaa cac cag agt gat gca ggt tta tat gta 2592Thr Gln Asp Asp Ile Glu Lys His Gln Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Val850 855 860att gtg cca gta att att tcc tct tcc atc tta ttg ctt gga aca tta 2640Ile Val Pro Val Ile Ile Ser Ser Ser Ile Leu Leu Leu Gly Thr Leu865 870 875 880tta ata tca cac caa aga atg aaa aag cta ttt tgg gaa gat gtt ccg 2688Leu Ile Ser His Gln Arg Met Lys Lys Leu Phe Trp Glu Asp Val Pro885 890 895aac ccc aag aat tgt tcc tgg gca caa gga ctt aat ttt cag aag aga 2736Asn Pro Lys Asn Cys Ser Trp Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys Arg900 905 910acg gac att ctg gat cca ccg gtc gcc acc atg gtg agc aag ggc gag 2784Thr Asp Ile Leu Asp Pro Pro Val Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu915 920 925
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tac cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc ccc gtg ctg ctg ccc gac 3360Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp1105 111011151120gac cac tac ctg agc tac cag tcc gcc ctg agc aaa gac ccc aac gag 3408Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu112511301135aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc gtg acc gcc gcc ggg atc 3456Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile114011451150act ctc ggc atg gac gag ctg tac aag taa 3486Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys11551160<210>8<211>1161<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述OBRyfp融合蛋白<400>8Met Val Leu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Ile His Thr Met Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Met Leu Phe His Leu Gly Leu Gln Ala Ser Ile Ser Ala Arg20 25 30Gln Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Thr Arg Tyr Pro Ile35 40 45Thr Pro Trp Arg Phe Lys Leu Ser Cys Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr50 55 60Asp Tyr Phe Leu Leu Pro Ala Gly Leu Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser65 70 75 80Asn Gly His Tyr Glu Thr Ala Val Glu Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly85 90 95Thr His Phe Ser Asn Leu Ser Lys Thr Thr Phe His Cys Cys Phe Arg100 105 110
Ser Glu Gln Asp Arg Asn Cys Ser Leu Cys Ala Asp Asn Ile Glu Gly115 120 125Thr Thr Phe Val Ser Thr Val Asn Ser Leu Val Phe Gln Gln Ile Asp130 135 140Ala Asn Trp Asn Ile Gln Cys Trp Leu Lys Gly Asp Leu Lys Leu Phe145 150 155 160Ile Cys Tyr Val Glu Ser Leu Phe Lys Asn Leu Phe Arg Asn Tyr Asn165 170 175Tyr Lys Val His Leu Leu Tyr Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Asp Ser180 185 190Pro Leu Val Pro Gln Lys Gly Ser Phe Gln Met Val His Cys Asn Cys195 200 205Ser Val His Glu Cys Cys Glu Cys Leu Val Pro Val Pro Thr Ala Lys210 215 220Leu Asn Asp Thr Leu Leu Met Cys Leu Lys Ile Thr Ser Gly Gly Val225 230 235 240Ile Phe Arg Ser Pro Leu Met Ser Val Gln Pro Ile Asn Met Val Lys245 250 255Pro Asp Pro Pro Leu Gly Leu His Met Glu Ile Thr Asp Asp Gly Asn260 265 270Leu Lys Ile Ser Trp Ser Ser Pro Pro Leu Val Pro Phe Pro Leu Gln275 280 285Tyr Gln Val Lys Tyr Ser Glu Asn Ser Thr Thr Val Ile Arg Glu Ala290 295 300Asp Lys Ile Val Ser Ala Thr Ser Leu Leu Val Asp Ser Ile Leu Pro305 310 315 320Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg Gly Lys Arg Leu Asp Gly Pro325 330 335Gly Ile Trp Ser Asp Trp Ser Thr Pro Arg Val Phe Thr Thr Gln Asp
340 345 350Val Ile Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Val355 360 365Ser Phe His Cys Ile Tyr Lys Lys Glu Asn Lys Ile Val Pro Ser Lys370 375 380Glu Ile Val Trp Trp Met Asn Leu Ala Glu Lys Ile Pro Gln Ser Gln385 390 395 400Tyr Asp Val Val Ser Asp His Val Ser Lys Val Thr Phe Phe Asn Leu405 410 415Asn Glu Thr Lys Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys420 425 430Cys Asn Glu His Glu Cys His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val Ile435 440 445Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys450 455 460Met Thr Cys Arg Trp Ser Thr Ser Thr Ile Gln Ser Leu Ala Glu Ser465 470 475 480Thr Leu Gln Leu Arg Tyr His Arg Ser Ser Leu Tyr Cys Ser Asp Ile485 490 495Pro Ser Ile His Pro Ile Ser Glu Pro Lys Asp Cys Tyr Leu Gln Ser500 505 510Asp Gly Phe Tyr Glu Cys Ile Phe Gln Pro Ile Phe Leu Leu Ser Gly515 520 525Tyr Thr Met Trp Ile Arg Ile Asn His Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser530 535 540Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser Val Val Lys Pro Leu Pro Pro545 550 555 560Ser Ser Val Lys Ala Glu Ile Thr Ile Asn Ile Gly Leu Leu Lys Ile565 570 575
Ser Trp Glu Lys Pro Val Phe Pro Glu Asn Asn Leu Gln Phe Gln Ile580 585 590Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Lys Glu Val Gln Trp Lys Met Tyr Glu Val595 600 605Tyr Asp Ala Lys Ser Lys Ser Val Ser Leu Pro Val Pro Asp Leu Cys610 615 620Ala Val Tyr Ala Val Gln Val Arg Cys Lys Arg Leu Asp Gly Leu Gly625 630 635 640Tyr Trp Ser Asn Trp Ser Asn Pro Ala Tyr Thr Val Val Met Asp Ile645 650 655Lys Val Pro Met Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg Ile Ile Asn Gly Asp660 665 670Thr Met Lys Lys Glu Lys Asn Val Thr Leu Leu Trp Lys Pro Leu Met675 680 685Lys Asn Asp Ser Leu Cys Ser Val Gln Arg Tyr Val Ile Asn His His690 695 700Thr Ser Cys Asn Gly Thr Trp Ser Glu Asp Val Gly Asn His Thr Lys705 710 715 720Phe Thr Phe Leu Trp Thr Glu Gln Ala His Thr Val Thr Val Leu Ala725 730 735Ile Asn Ser Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser740 745 750Trp Pro Met Ser Lys Val Asn Ile Val Gln Ser Leu Ser Ala Tyr Pro755 760 765Leu Asn Ser Ser Cys Val Ile Val Ser Trp Ile Leu Ser Pro Ser Asp770 775 780Tyr Lys Leu Met Tyr Phe Ile Ile Glu Trp Lys Asn Leu Asn Glu Asp785 790 795 800Gly Glu Ile Lys Trp Leu Arg Ile Ser Ser Ser Val Lys Lys Tyr Tyr805 810 815
Ile His Asp His Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr820 825 830Pro Ile Phe Met Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys Ile Ile Asn Ser Phe835 840 845Thr Gln Asp Asp Ile Glu Lys His Gln Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Val850 855 860Ile Val Pro Val Ile Ile Ser Ser Ser Ile Leu Leu Leu Gly Thr Leu865 870 875 880Leu Ile Ser His Gln Arg Met Lys Lys Leu Phe Trp Glu Asp Val Pro885 890 895Asn Pro Lys Asn Cys Ser Trp Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys Arg900 905 910Thr Asp Ile Leu Asp Pro Pro Val Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu915 920 925Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp930 935 940Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala945 950 955 960Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu965 970 975Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Val Gln980 985 990Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Arg Gln His Asp Phe Phe Lys99510001005Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys101010151020Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp025103010351040Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp
104510501055Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn106010651070Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe107510801085Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His109010951100Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp105111011151120Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu112511301135Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile114011451150Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys11551160
權利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于由具有短胞內(nèi)結構域的瘦素受體、或這種受體的含有瘦素結合位點的可溶形式、或這種瘦素受體的實質(zhì)性部分、和能量供體或能量受體蛋白質(zhì)、或能量供體或能量受體蛋白質(zhì)的實質(zhì)性和活性部分組成。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述瘦素受體為短的同工型。
3.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述瘦素受體是包含Box1胞內(nèi)結構域、但不包含Box3胞內(nèi)結構域的同工型。
4.如權利要求1-3中任意一項所述的融合蛋白，其特征在于所述瘦素受體是OBRs同工型。
5.如權利要求1-4中任意一項所述的融合蛋白，其特征在于所述瘦素受體是序列SEQ ID No.2的人OBRs同工型、或與序列SEQ ID No.2顯示至少65％同一性的該受體變體。
6.如權利要求1-4中任意一項所述的融合蛋白，其特征在于所述瘦素受體的序列是序列SEQ ID No.2的人OBRs同工型的46-866位氨基酸序列、或顯示至少65％同一性的該序列變體。
7.如權利要求1-4中任意一項所述的融合蛋白，其特征在于所述瘦素受體具有序列SEQ ID No.4、或顯示至少65％同一性的該序列變體。
8.如權利要求1-7中任意一項所述的融合蛋白，其特征在于所述蛋白質(zhì)是螢光素酶。
9.如權利要求1-7中任意一項所述的融合蛋白，其特征在于所述蛋白質(zhì)是GFP或該蛋白質(zhì)的突變體或DsRed。
10.如權利要求1-7中任意一項所述的融合蛋白，其特征在于GFP突變體是YFP、EYFP、野生型GFP、GFPS65T或Topaz。
11.如權利要求1-7中任意一項所述的融合蛋白，其特征在于其具有序列SEQ ID No.6、或顯示至少65％同一性的該序列變體。
12.如權利要求1-7中任意一項所述的融合蛋白，其特征在于其具有序列SEQ ID No.8、或顯示至少65％同一性的該序列變體。
13.編碼如權利要求1-12中任意一項所述的一種蛋白質(zhì)的核酸。
14.如權利要求13所述的核酸，其特征在于其具有序列SEQ ID No.5。
15.如權利要求13所述的核酸，其特征在于其具有序列SEQ ID No.7。
16.與如權利要求14或15中所述的序列顯示至少65％同一性的核酸。
17.與權利要求14或15中所述的序列在高嚴格條件下雜交的核酸。
18.包含如權利要求13-17中任意一項所述的核酸的細胞。
19.表達如權利要求1-12中任意一項所述的蛋白質(zhì)的細胞。
20.如權利要求18或19中所述細胞的碎片。
21.如權利要求18或19中所述細胞的裂解物。
22.如權利要求18或19中所述細胞的膜。
23.組合物，其包含如權利要求18或19中所述的細胞和皂甙。
24.確定化合物與瘦素受體結合的方法，其包括下述步驟-使所述化合物與如權利要求1-12中任意一項所述的能量供體融合蛋白和如權利要求1-12中任意一項所述的能量受體融合蛋白、或包含此類蛋白質(zhì)的細胞或細胞碎片或細胞裂解物或細胞膜，以及任選地合適的酶底物接觸，和-測量能量轉(zhuǎn)移。
25 如權利要求24所述的方法，其特征在于能量供體融合蛋白是瘦素受體或瘦素受體的實質(zhì)性部分和螢光素酶或螢光素酶的實質(zhì)性部分融合的蛋白質(zhì)。
26 如權利要求24所述的方法，其特征在于使用經(jīng)皂甙處理的細胞。
27 如權利要求24所述的方法，其特征在于能量受體融合蛋白是瘦素受體或瘦素受體的實質(zhì)性部分和YFP或YFP的實質(zhì)性部分融合的蛋白質(zhì)。
28 如權利要求24所述的方法，其特征在于底物是腔腸素。
29 如權利要求24所述的方法，其特征在于將受試化合物存在時測量的能量轉(zhuǎn)移與受試化合物不存在時測量的能量轉(zhuǎn)移進行比較。
30 篩選或檢測用于預防和/或治療與瘦素相關的病理性疾病的化合物的方法，其包括下述步驟-使所述化合物與如權利要求1-12中任意一項所述的能量供體融合蛋白和如權利要求1-12中任意一項所述的能量受體融合蛋白、或包含此類蛋白質(zhì)的細胞或細胞碎片或細胞裂解物或細胞膜，以及任選地合適的酶底物接觸，和-測量能量轉(zhuǎn)移。
31 篩選瘦素受體激動劑或拮抗劑的方法，其包括下述步驟-使?jié)撛诘募觿┗蜣卓箘┡c如權利要求1-12中任意一項所述的能量供體融合蛋白和如權利要求1-12中任意一項所述的能量受體融合蛋白、或包含此類蛋白質(zhì)的細胞或細胞碎片或細胞裂解物或細胞膜，以及任選地合適的酶底物接觸，和-測量能量轉(zhuǎn)移。
32 利用下述方法所選擇的化合物的用途-將所述化合物與如權利要求1-12中任意一項所述的能量供體融合蛋白和如權利要求1-12中任意一項所述的能量受體融合蛋白、或包含此類蛋白質(zhì)的細胞或細胞碎片或細胞裂解物或細胞膜，和任選地合適的酶底物接觸，和-測量能量轉(zhuǎn)移；用于制備治療性治療或預防性治療與瘦素或其受體相關的疾病的醫(yī)藥產(chǎn)品。
33 治療性治療或預防性治療與瘦素或其受體相關的疾病的方法，其包括以下步驟-利用下述方法選擇所述化合物+將所述化合物與如權利要求1-12中任意一項所述的能量供體融合蛋白和如權利要求1-12中任意一項所述的能量受體融合蛋白、或包含此類蛋白質(zhì)的細胞或細胞碎片或細胞裂解物或細胞膜，以及任選地合適的酶底物接觸，和+測量能量轉(zhuǎn)移，以及-將所述化合物施與患有所述疾病的患者。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測瘦素受體配體與在包含瘦素受體和能量供體蛋白的融合蛋白及包含瘦素受體和能量受體蛋白的融合蛋白之間進行的能量轉(zhuǎn)移間的關系的方法。本發(fā)明還涉及融合蛋白在所述方法中的應用。
文檔編號A61K45/00GK1639343SQ03804456
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月25日 優(yōu)先權日2002年2月26日
發(fā)明者R·約克斯, C·庫蒂里耶 申請人:安萬特醫(yī)藥股份有限公司, 健康和醫(yī)學國家研究院, 科學研究國家中心