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      分離配體的方法

      文檔序號(hào):1024131閱讀:6637來源:國知局
      專利名稱:分離配體的方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種分離配體的方法,特別是分離具有結(jié)合MHC/HLA分子的能力的T細(xì)胞表位的方法。
      免疫系統(tǒng)是相關(guān)細(xì)胞型和分子的一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò),為了保護(hù)多細(xì)胞生物抵抗傳染性微生物它們已經(jīng)進(jìn)化。能夠分為進(jìn)化較早的先天(或自然)免疫和適應(yīng)性(或獲得性)免疫。先天免疫系統(tǒng)識(shí)別模式是針對(duì)病原體通常共有的和基本的模式。對(duì)于數(shù)量有限的分子結(jié)構(gòu),種系編碼的受體已經(jīng)進(jìn)化。相反,適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞——B和T淋巴細(xì)胞——能夠識(shí)別多種抗原結(jié)構(gòu)。這些受體,根據(jù)表達(dá)它們的細(xì)胞型,被命名為B細(xì)胞受體(BCR,其可溶性形式稱為抗體)和T細(xì)胞受體(TCR,只是細(xì)胞表面結(jié)合形式),通過體細(xì)胞重組產(chǎn)生,顯示克隆分布。因此,最初只有少量細(xì)胞具有某種特異性。在抗原遇到這些細(xì)胞后,開始分裂(克隆擴(kuò)增),產(chǎn)生能夠?qū)Ω对摽乖男?yīng)群體。在抗原清除后,特異識(shí)別這種抗原的特化細(xì)胞亞群仍然具有免疫記憶??傊?,適應(yīng)性免疫系統(tǒng)是緩慢的(與先天免疫相比),然而是特異的,在重復(fù)暴露于一種給定病原體/抗原后增強(qiáng)。
      T細(xì)胞在適應(yīng)性免疫中具有中心作用。它們的受體(TCR)識(shí)別細(xì)胞表面上的“主要組織相容性復(fù)合物”(MHC或HLA)肽復(fù)合物。這些肽被稱為T細(xì)胞表位,代表抗原的降解產(chǎn)物。T細(xì)胞有兩個(gè)主要類別CD8陽性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)限于MHC I類。CD4陽性輔助T細(xì)胞(HTL)限于MHC II類。HTL是適應(yīng)性免疫的多種特征所必需的所謂“專業(yè)抗原呈遞細(xì)胞”(APC)的激活,免疫球蛋白(Ig)類別轉(zhuǎn)換,生發(fā)中心反應(yīng)和Ig親和力成熟,CTL的激活,免疫記憶,免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)等。
      MHC分子收集細(xì)胞內(nèi)的肽,在細(xì)胞表面將它們呈遞給T細(xì)胞的TCR。MHC有兩個(gè)主要類別被CD8陽性CTL識(shí)別的I類,和被CD4陽性HTL識(shí)別的II類。
      MHC I類分子由45kDa的膜錨定α鏈和非共價(jià)連接的12kDa的β2-微球蛋白(b2m)組成。通過X射線結(jié)晶學(xué)解析三維結(jié)構(gòu)(Stern和Wiley 1994)顯示α鏈有一個(gè)裂口,它在兩端封閉,適應(yīng)8-11個(gè)氨基酸長度的肽。I類分子普遍表達(dá),它們呈遞的肽來源于胞質(zhì)蛋白質(zhì)。它們被蛋白酶體降解,產(chǎn)生的肽被主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)內(nèi)。在幾種侶伴蛋白的輔助下,在此形成MHC肽復(fù)合物,轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面(Heemels1995)。因此,MHC I類反映了細(xì)胞表面上的蛋白質(zhì)組,使得T細(xì)胞能夠識(shí)別細(xì)胞內(nèi)病原體或惡性細(xì)胞。
      MHC II類分子由分別為35kDa和30kDa的兩種膜錨定蛋白質(zhì)(α和β鏈)組成。它們一起構(gòu)成了一個(gè)裂口,在兩端開口,能夠適應(yīng)可變長度的肽,通常12-25個(gè)氨基酸。盡管有這些不同,但是I類和II類分子共有驚人的結(jié)構(gòu)相似性(Stern和Wiley 1994)。II類分子只在專業(yè)APC上表達(dá),包括樹突細(xì)胞(DC)、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞。這些細(xì)胞專門以內(nèi)體途徑攝取并加工抗原。在生物合成后,II類分子立即被所謂的恒定鏈(Ii)復(fù)合,阻止ER中肽的結(jié)合。當(dāng)含有II類Ii復(fù)合物的小泡(vesicles)與含有外源抗原的降解產(chǎn)物的內(nèi)體融合時(shí),Ii被降解,直到MHC結(jié)合的裂口只被所謂的CLIP肽復(fù)合。后者在侶伴蛋白如HLA-DM的幫助下,與抗原肽互換(Villadangos 2000)。最后,MHC肽復(fù)合物再次在APC表面呈遞,它們以多種方式與HTL相互作用。
      MHC系統(tǒng)是多基因和極其多態(tài)性的,是高度復(fù)雜的。人類的I類α鏈,有三個(gè)基因座,被稱為HLA-A、-B和-C。同樣,有三個(gè)II類α鏈基因座(DRA、DQA、DPA)。至于II類β鏈基因座,情況更加復(fù)雜,因?yàn)橛?個(gè)不同的DRβ鏈(DRB1、2、3、5)加DQB和DPB。除了單態(tài)的DRα鏈DRA之外,每個(gè)基因座存在于群體中的多個(gè)不同的等位基因中(幾十個(gè)到幾百個(gè))(Klein 1986)。不同的等位基因具有很大不同的肽結(jié)合特異性。例如,等位基因被命名為HLA-A*0201或HLA-DRB1*0401或HLA-DPA*0101/DPB*0401。
      T細(xì)胞表位已經(jīng)用多種方法鑒定(Van den Eynde 1997)。例如,T細(xì)胞系和克隆已經(jīng)用來在適當(dāng)HLA分子轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞中篩查cDNA表達(dá)文庫。此外,也利用生物化學(xué)方法。后者包括從靶細(xì)胞表面上的MHC分子中洗脫天然配體,通過幾個(gè)層析步驟分離這些肽,利用表位重建測(cè)定分析它們與淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性,通過質(zhì)譜法測(cè)序(Wolfel等人1994,Cox等人1994)。
      最近,高度靈敏的細(xì)胞因子檢測(cè)試驗(yàn)如IFN-γ酶聯(lián)印跡(ELIspot)的出現(xiàn),允許利用直接來自體內(nèi)的淋巴細(xì)胞篩選重疊的合成肽(Maecker 2001,Kern 2000,Tobery 2001)。首先,Kern等人(1999和2000)使用重疊的9mer肽集合的陣列在體外對(duì)CD8+T細(xì)胞表位作圖。后來,Tobery等人,2001改進(jìn)了這一方法,證實(shí)含有多達(dá)64個(gè)20mer肽的集合可以用來在小鼠中篩選CD8+和CD4+T細(xì)胞表位。這兩種方法都是基于通過細(xì)胞內(nèi)染色(Kern等人2000)或ELIspot測(cè)定(Tobery等人,2001)測(cè)定INF-γ的產(chǎn)生,監(jiān)測(cè)抗原特異的應(yīng)答。利用15-mers的混合物,CD4+T細(xì)胞應(yīng)答大約等于在使用完整可溶性蛋白作為抗原時(shí)檢測(cè)到的應(yīng)答,而CD8+T細(xì)胞應(yīng)答顯著高于利用可溶性蛋白刺激檢測(cè)到的通??梢院雎缘膽?yīng)答,這并不令人驚訝。而且,對(duì)15氨基酸肽的混合物的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答類似于利用選擇代表已知MHC I類最小表位的8-12氨基酸肽的混合物獲得的應(yīng)答。最可能的是,在這些情況下,與細(xì)胞膜結(jié)合的肽酶負(fù)責(zé)將肽“修剪”成最佳長度(Maecker等人,2001)。
      一個(gè)令人感興趣的備選方法是用特異淋巴細(xì)胞篩查合成組合肽庫。例如,由以位置掃描方式排列的200種混合物組成的十肽文庫已經(jīng)成功用于鑒定刺激T細(xì)胞的克隆型群體的肽配體(Wilson等人,J.Immunol.,1999,1636424-6434)。
      許多T細(xì)胞表位已經(jīng)用所謂的“反向免疫法”測(cè)定(Rammensee1999)。在這種情況下,產(chǎn)生可能的T細(xì)胞表位的蛋白質(zhì)已知,掃描其一級(jí)序列的HLA結(jié)合基序。一般合成幾十到幾百個(gè)候選肽,乃至全套重疊肽,檢測(cè)它與HLA分子的結(jié)合。通常選擇最佳結(jié)合劑進(jìn)一步表征它與T細(xì)胞的反應(yīng)性。例如,借助HLA轉(zhuǎn)基因小鼠,通過在體外或體內(nèi)引發(fā)T細(xì)胞,能夠?qū)崿F(xiàn)該目的。
      本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種方法,用于篩選特異MHC分子的配體,優(yōu)選地用于輸送適合且特異的T細(xì)胞表位,其選自具有對(duì)給定MHC分子的未知特異性的多種配體。
      因此,本發(fā)明提供一種方法,用于分離具有結(jié)合MHC/HLA分子的能力的配體,或含有該配體與該MHC/HLA分子的復(fù)合物,該方法包括下列步驟—提供配體集合,該集合含有可與該MHC/HLA分子結(jié)合的配體和不與該MHC/HLA分子結(jié)合的配體,—使該MHC/HLA分子接觸該配體集合,從而使具有結(jié)合該MHC/HLA分子的能力的配體與該MHC/HLA分子結(jié)合,形成含有該配體和該MHC/HLA分子的復(fù)合物,—檢測(cè)該復(fù)合物,任選地使該復(fù)合物與不與該MHC/HLA分子結(jié)合的配體分離,—任選地從該復(fù)合物中分離并表征該配體。
      本發(fā)明也提供一種方法,用于分離具有結(jié)合MHC/HLA分子的能力的T細(xì)胞表位或含有該表位與該MHC/HLA分子的復(fù)合物,該方法包括下列步驟—提供配體集合,該集合含有可與一種MHC/HLA分子結(jié)合的配體和不與該MHC/HLA分子結(jié)合的配體,—使該MHC/HLA分子接觸該配體集合,從而使具有結(jié)合該MHC/HLA分子的能力的配體與該MHC/HLA分子結(jié)合,形成含有該配體和該MHC/HLA分子的復(fù)合物,—檢測(cè)該復(fù)合物,任選地使其與不與該MHC/HLA分子結(jié)合的配體分離,—任選地從該復(fù)合物中分離并表征該配體,—用T細(xì)胞測(cè)定法測(cè)定任選地分離的該配體或該復(fù)合物的T細(xì)胞激活能力,和
      —提供具有T細(xì)胞激活能力的任選地分離的配體作為T細(xì)胞表位或復(fù)合物。
      根據(jù)本發(fā)明的方法使得一種篩選系統(tǒng)能夠篩選與特異MHC/HLA分子的結(jié)合能力。鑒定MHC結(jié)合分子是病原體、腫瘤等的分子表征的一種重要工具。因此,本發(fā)明能夠根據(jù)它們與MHC分子的功能親和力立即篩選多種(集合)可能的配體。與MHC分子的結(jié)合親和力也是旨在用作T細(xì)胞表位的配體的必要條件,盡管不是充分條件。也篩選適合的候選T細(xì)胞表位,并測(cè)定其T細(xì)胞激活能力。因此,根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合篩選方法與適合的T細(xì)胞測(cè)定的組合提供了根據(jù)本發(fā)明分離T細(xì)胞表位的方法,其中利用MHC結(jié)合測(cè)定,能夠從可能的配體集合中鑒定這些T細(xì)胞表位。
      在現(xiàn)有技術(shù)中,總是對(duì)具有已知結(jié)合/MHC特異性的配體進(jìn)行這些測(cè)定,與之不同,根據(jù)本發(fā)明的方法提供這些測(cè)定法作為對(duì)含有未知特異性的配體的集合的篩查工具。在現(xiàn)有技術(shù)中,這些測(cè)定法一般對(duì)各個(gè)單配體進(jìn)行,以檢測(cè)它們與MHC/HLA分子的結(jié)合親和力。Kwok等人(2001)利用最多可達(dá)5種重疊合成肽的集合產(chǎn)生MHC II類四聚體;然后用后者染色PBMC中對(duì)特定MHC II類肽復(fù)合物特異的T細(xì)胞,該復(fù)合物是在與5種肽的集合的結(jié)合反應(yīng)中產(chǎn)生的。然而,由于敏感性和特異性的原因,不認(rèn)為在這種方法中能夠增加每個(gè)集合的配體數(shù)量(Novak等人2001)。關(guān)于特異性的一個(gè)問題是,如果集合中存在一種以上的結(jié)合劑,則產(chǎn)生MHC四聚體,每個(gè)四聚體有一種以上的結(jié)合劑。這將排除T細(xì)胞染色,在現(xiàn)有技術(shù)所述的方法中后者可用于表位的鑒定。與它非常不同,根據(jù)本發(fā)明的方法允許從含有一種以上結(jié)合劑的高度復(fù)雜的混合物中鑒定一種以上的結(jié)合劑。
      將要用本發(fā)明篩選的集合的性質(zhì)并不重要該集合可含有任何天然或非天然存在的物質(zhì),它們a)特異結(jié)合MHC/HLA分子,和/或b)可被T細(xì)胞特異識(shí)別。該集合的這組配體與MHC分子的結(jié)合性質(zhì)未知;因此,該集合中通常含有一種給定MHC分子的結(jié)合劑和至少一種非結(jié)合劑。因此該集合含有至少10種不同的配體。實(shí)際上,根據(jù)本發(fā)明使用含有明顯更多不同配體種的集合,例如20個(gè)或更多,100個(gè)或更多,1000個(gè)或更多,或者10000個(gè)或更多。也能夠篩查更大的文庫(例如含有106以上,108以上,乃至1010以上的不同配體種)。然而,這主要取決于這些配體文庫的可用性。
      顯然,MHC肽復(fù)合物不是典型的受體-配體系統(tǒng),至今仍未被視為合適的篩選工具的基礎(chǔ)。在體內(nèi),通常只存在MHC肽復(fù)合物,而沒有空MHC分子。一種肽與空MHC分子簡單結(jié)合不會(huì)產(chǎn)生MHC肽復(fù)合物,而是通過非常復(fù)雜的、但是仍未完全理解的所謂“抗原加工和呈遞”方法產(chǎn)生。這是一種高度組織化的細(xì)胞內(nèi)方法,涉及多種酶(細(xì)胞溶質(zhì)和溶酶體蛋白酶,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,侶伴蛋白,肽-交換因子等)。實(shí)際上眾所周知,不含配體的MHC分子是不穩(wěn)定的,經(jīng)歷快速降解。
      因此,本發(fā)明的一個(gè)主要特征是提供重組“空”MHC分子并使其能夠用來從集合中“捕獲”配體的生產(chǎn)、純化和反應(yīng)條件的發(fā)展?,F(xiàn)有技術(shù)中沒有例子證明類似的可能性。以上引用的Novak等人的參考文獻(xiàn)公開了一種生產(chǎn)(昆蟲細(xì)胞)和純化策略,用來獲得重組MHC分子,隨后與少數(shù)肽溫育,并四聚化。利用MHC四聚體染色來自個(gè)體的細(xì)胞,這些個(gè)體可能含有針對(duì)這些肽代表的抗原的T細(xì)胞,從而提供了該配體也是一種真正的T細(xì)胞表位的必要證據(jù)。然而,所述現(xiàn)有技術(shù)明確地表明,只有多達(dá)5種肽能夠成功使用。這與本方法非常不同,本方法可以成功使用每個(gè)集合10、21種、甚至幾百或幾千種肽。
      根據(jù)本發(fā)明的方法使用的優(yōu)選的配體集合選自肽集合,特別是重疊肽的集合,蛋白質(zhì)片段的集合,糖脂的集合,鞘糖脂的集合,脂肽的集合,脂類的集合,聚糖的集合,修飾肽的集合,由抗原呈遞細(xì)胞獲得的集合,優(yōu)選地是其總裂解物或級(jí)分的形式,特別是從這些細(xì)胞的表面或MHC/HLA分子上洗脫的級(jí)分,包含細(xì)胞片段(特別是病原體細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或組織)的集合,包含肽庫的集合,由重組DNA文庫產(chǎn)生的(聚)肽的集合,特別是來源于病原體或腫瘤細(xì)胞的,來自特定病原體的蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)片段的集合,或其混合物。
      該集合的配體可能來自于天然來源(天然和/或衍生的形式),也可能合成產(chǎn)生(例如通過化學(xué)合成或重組技術(shù))。如果該集合中提供(聚)肽配體,優(yōu)選地用肽合成儀或通過重組技術(shù)產(chǎn)生這些肽。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,(聚)肽集合可由重組DNA文庫產(chǎn)生,例如來源于病原體或腫瘤細(xì)胞,通過體外翻譯(例如核糖體展示)或通過異種宿主如大腸桿菌等表達(dá)。
      因此,配體優(yōu)選的是肽,是能夠用作T細(xì)胞表位的抗原片段。這些肽優(yōu)選地長于6個(gè)、特別是長于8個(gè)氨基酸,優(yōu)選的最大長度為40、30、20、15乃至11或12個(gè)氨基酸。
      能夠從中獲得這些肽的優(yōu)選的病原體選自人類免疫缺陷病毒(HIV),甲型肝炎和乙型肝炎病毒,丙型肝炎病毒(HCV),勞斯肉瘤病毒(RSV),EB病毒(EBV),流感病毒,輪狀病毒,金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae),沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis),結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis),肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae),炭疽芽孢桿菌(Bacillus antracis),霍亂弧菌(Vibrio cholerae),瘧原蟲屬(Plasmodium)的種(惡性瘧原蟲(Pl.falciparum)、間日瘧原蟲(Pl.vivax)等),曲霉屬(Aspergillus)的種或白色念珠菌(Candida albicans)??乖部梢允前┘?xì)胞表達(dá)的分子(腫瘤抗原)。同樣也可以使用腫瘤抗原(癌癥疫苗)或自身免疫抗原,為本發(fā)明提供適合的(肽)配體。
      本方法所選擇的具體MHC分子(該術(shù)語當(dāng)然也包括MHC樣分子)的性質(zhì)也不重要。因此,這些分子原則上可選自任何種,特別是靈長類動(dòng)物,如人(HLA,見下文),黑猩猩,其它哺乳動(dòng)物,例如maquaques、兔、貓、狗或嚙齒動(dòng)物,如小鼠、大鼠、豚鼠等,在農(nóng)業(yè)上重要的動(dòng)物,如牛、馬、綿羊和魚,但是為人類提供疫苗當(dāng)然優(yōu)選人(或“人源化”)分子。為了為具體動(dòng)物,特別是農(nóng)業(yè)上重要的動(dòng)物,如牛、馬、綿羊和魚提供疫苗,優(yōu)選使用這些動(dòng)物特異的MHC分子。
      因此優(yōu)選的HLA分子含有I類分子,其來源于HLA-A、-B或-C基因座,具體的是A1、A2、A3、A24、A11、A23、A29、A30、A68;B7、B8、B15、B16、B27、B35、B40、B44、B46、B51、B52、B53;Cw3、Cw4、Cw6、Cw7;II類分子,來源于HLA-DP、-DQ或-DR基因座,具體的是DR1、DR2、DR3、DR4、DR7、DR8、DR9、DR11、DR12、DR13、DR51、DR52、DR53;DP2、DP3、DP4;DQ1、DQ3、DQ5、DQ6;和非傳統(tǒng)的MHC/HLA和MHC/HLA樣分子,它們能特異結(jié)合配體,特別是HLA-E、HLA-G、MICA、MICB、Qa1、Qa2、T10、T18、T22、M3和CD1家族的成員。
      根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,根據(jù)本發(fā)明的方法的特征在于該MHC/HLA分子選自HLAI類分子、HLAII類分子、非傳統(tǒng)的MHC/HLA和MHC/HLA樣分子或其混合物,或者它們的混合物。
      優(yōu)選地,使用一種方法進(jìn)行復(fù)合物的配體的任選表征步驟,該方法選自質(zhì)譜法,多肽測(cè)序,結(jié)合測(cè)定,特別是SDS-穩(wěn)定性測(cè)定,通過層析,特別是HPLC測(cè)定保留因子(retention factor)鑒定配體,或其它光譜技術(shù),特別是紫外線(UV)、紅外線(IR)、核磁共振(NMR)、圓二色性(CD)或電子自旋共振(ESR),或其組合。
      根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,本發(fā)明的方法的特征在于它與一種細(xì)胞因子分泌測(cè)定相組合,優(yōu)選地與酶聯(lián)印跡(Elispot)測(cè)定、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色、FACS或ELISA(酶聯(lián)免疫測(cè)定)(例如見《現(xiàn)代免疫學(xué)方法》)組合。
      優(yōu)選的T細(xì)胞測(cè)定法包括該復(fù)合物與分離的T細(xì)胞混合并溫育,然后測(cè)定該分離的T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌或增殖,和/或測(cè)定激活標(biāo)記(特別是CD69、CD38)的上調(diào),或表面標(biāo)記(特別是CD3、CD8或TCR)的下調(diào),和/或特別是通過實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定與T細(xì)胞激活有關(guān)的mRNAs的上調(diào)/下調(diào)(參見,例如《現(xiàn)代免疫學(xué)方法》、《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》)。根據(jù)本發(fā)明的T細(xì)胞激活能力檢測(cè)(在此稱為“T細(xì)胞測(cè)定”)優(yōu)選地也可以在小鼠中實(shí)現(xiàn),具體地使用適當(dāng)設(shè)計(jì)的人MHC/HLA設(shè)置(例如,在其基因組中整合有一種或多種人MHC/HLA分子)。
      進(jìn)一步優(yōu)選的T細(xì)胞測(cè)定選自測(cè)定T細(xì)胞受體下游成分(特別是p56lck、TCR的ITAMS和ζ鏈、ZAP70、LAT、SLP-76、fyn和lyn)的磷酸化/去磷酸化的T細(xì)胞測(cè)定,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca++濃度或Ca++-依賴的蛋白質(zhì)激活的T細(xì)胞測(cè)定,測(cè)定免疫突觸形成的T細(xì)胞測(cè)定,測(cè)定效應(yīng)分子(特別是穿孔素、粒酶或granulolysin)釋放的T細(xì)胞測(cè)定,或這些T細(xì)胞測(cè)定的組合(參見,例如,《現(xiàn)代免疫學(xué)方法》、《現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)方法》)。
      WO00/31542提出了鑒定只是來自腫瘤細(xì)胞的抗原的方法??乖膹奈挥诎肟乖揎椀膼盒约?xì)胞表面的MHC-肽復(fù)合物中提取。然后能夠通過半抗原特異的親和層析分離半抗原化的肽,并測(cè)序。本發(fā)明的實(shí)施方案是,最初從位于腫瘤細(xì)胞表面的MHC分子中分離的肽具有刺激T細(xì)胞的性質(zhì)。刺激是指添加細(xì)胞提取物引起的T細(xì)胞增殖,以及細(xì)胞因子(如INF-γ、TNF、IL-2等)的產(chǎn)生。根據(jù)分離的肽的序列,能夠鑒定抗原的來源。
      盡管該方法的最終結(jié)果也是T細(xì)胞表位,但是該方法與本發(fā)明大大不同在現(xiàn)有技術(shù)中,從細(xì)胞系統(tǒng)中分離天然MHC肽復(fù)合物,在本發(fā)明中利用純化、重組的MHC分子從任何來源(細(xì)胞或合成的,天然或人工的)中分離配體;在現(xiàn)有技術(shù)中,隨后通過半抗原親和層析的分離需要表位的半抗原化,而本發(fā)明不依賴該步驟。
      Tana等人(1998)描述了從根據(jù)MHC分子類型的已知結(jié)合基序設(shè)計(jì)的合成組合肽庫中篩選可被T細(xì)胞識(shí)別的抗原肽的方法。因此,與由209種所有可能的肽組成的“全面”文庫相比,將要篩選的肽的數(shù)量大大減少(~103)。這些肽在含有不同氨基酸的9種肽的混合物中在兩個(gè)固定位置處組合。然后檢測(cè)該混合物引發(fā)T細(xì)胞增殖反應(yīng)。因此,該方法限于檢測(cè)適于結(jié)合這組MHC分子以及被TCR受體識(shí)別的氨基酸殘基。
      Bitmansour等人(2001)稱,以前Kern等人(1999,2000)描述的矩陣方法已經(jīng)用于CMV pp65蛋白內(nèi)免疫顯性CD4+表位的鑒定。構(gòu)建24個(gè)肽集合的矩陣,每個(gè)集合含有12種肽(15-mers,重疊11個(gè)氨基酸)(共138種肽),代表整個(gè)pp65蛋白。首先,檢驗(yàn)肽集合隨后檢驗(yàn)各個(gè)肽引起特異T細(xì)胞應(yīng)答的能力。該方法與其它方法(Maeker,2001;Tobery等人,2001)的不同在于,它依賴于不同的監(jiān)測(cè)T細(xì)胞應(yīng)答的技術(shù),如流式細(xì)胞分析(表面INF-γ染色,CD4和CD69標(biāo)記)和分子方法(CMV-特異的CD4+細(xì)胞的TCR-Vβ內(nèi)容物的RT-PCR)。使用的技術(shù)被稱為細(xì)胞因子流式細(xì)胞分析,允許在抗原誘導(dǎo)的增殖或細(xì)胞死亡之前檢測(cè)CMV-特異的T細(xì)胞,因此當(dāng)其在體內(nèi)存在,不被長期體外培養(yǎng)改變時(shí),該技術(shù)提供了測(cè)定CMV-特異T細(xì)胞的克隆型內(nèi)容物的可能性。因此,在CMV血清陽性的健康受試者中發(fā)現(xiàn)了可能引起保護(hù)性CMV特異CD4+應(yīng)答的兩種pp65表位(aa489-503和aa509-523)。
      Tana等人和Bitmansour等人都描述了復(fù)雜的因此難以控制生物學(xué)細(xì)胞測(cè)定的方法,而本發(fā)明描述了特別是在可操作性和可重復(fù)性上現(xiàn)有技術(shù)根本無法比擬的直接生物化學(xué)分離。根據(jù)本發(fā)明使用“空”MHC/HLA分子使得所有使用與位于活細(xì)胞表面的MHC/HLA分子結(jié)合事件的復(fù)雜方法均已過時(shí)。
      根據(jù)本發(fā)明分離T細(xì)胞表位的一種方法,其中配體集合與(“空”)MHC/HLA分子接觸(不依賴于細(xì)胞系統(tǒng)),然后(優(yōu)選地)用T細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)合的配體的T細(xì)胞激活能力,因此該方法是一種全新的方法,特別是與描述的依賴細(xì)胞的測(cè)定相比。與“在硅片上的(insilicio)”方法相比,本發(fā)明也提供了可容易、快速處理的“真實(shí)世界”中的應(yīng)用。
      根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施和應(yīng)用在關(guān)于一種具體病原體蛋白質(zhì)——巨細(xì)胞病毒(CMV)的pp65的實(shí)施例部分得到證明。該實(shí)施例顯示了本發(fā)明的有效性和優(yōu)點(diǎn),并與現(xiàn)有技術(shù)方法進(jìn)行了比較。
      CMV是一種β皰疹病毒,是普通人群中非EB病毒(EBV)傳染性單核細(xì)胞增多癥的主要原因,是無免疫應(yīng)答的宿主中的一種重要病原體,包括感染人類免疫缺陷病毒(HIV)患獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的患者、新生兒和移植受體(Drew等人,1999)。根據(jù)所調(diào)查的人群,不同地區(qū)CMV血清陽性的普及率為40-100%。至于其它皰疹病毒,最初是CMV感染,隨后是持續(xù)感染;在某些情況下也發(fā)生再感染和重復(fù)感染(Britt,1999),然而,由于預(yù)先存在免疫,免疫活性宿主大多數(shù)沒有病理結(jié)果(Plotkin等人,1999)。CMV在人體中引起緩慢、持續(xù)的感染。這在免疫活性宿主中得到控制,但是決不會(huì)消除。其中(例如免疫抑制基因的活性表達(dá),它干擾抗原的加工和呈遞),兩個(gè)因素似乎有助于持續(xù)逃脫免疫監(jiān)視一方面,免疫特權(quán)(immunopriviliged)部位如唾液腺上皮中的復(fù)制,和CD33+單核細(xì)胞中潛在貯存庫(reservoir)的形成。這些巨噬細(xì)胞前體不支持CMV的復(fù)制,因此停止,直到細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。只有在分化后,細(xì)胞環(huán)境才似乎允許裂解性感染。免疫活性個(gè)體中90%的初次感染在臨床上未被識(shí)別(Nichols等人,2000),發(fā)展為長期免疫,控制病毒的持久性,雖然不是滅菌,但是是保護(hù)性的。
      以下幾組具有感染/再激活的高度危險(xiǎn),他們具有發(fā)展為CMV疾病的高度危險(xiǎn)a)血清陰性妊娠婦女的胎兒,b)血清陰性的移植患者,因?yàn)殡y以發(fā)現(xiàn)CMV陰性移植物,c)血清陽性的移植和HIV患者,因?yàn)樗鼈冋T導(dǎo)或獲得的免疫缺陷允許CMV從潛伏期再激活。
      先天CMV感染可能導(dǎo)致耳聾,更重要的是,象普通遺傳綜合征三體21和脆性X染色體一樣頻繁的引起智力低下的原因。根據(jù)FowlerKB,Stagno S,Pass RF等人(Fowler等人,1992)的研究能夠推斷,每年約有9000名歐洲和8000名美洲嬰兒(在美國每500名新生嬰兒有一個(gè))由于子宮內(nèi)CMV感染受到傷害,其中只有10%在出生時(shí)臨床上明顯。盡管先天CMV感染在出生時(shí)大部分沉默,但是它在臨床后遺癥和公共衛(wèi)生影響方面的累積作用較大(Plotkin等人,1999)。與較差的結(jié)果最密切相關(guān)的因素是妊娠期間的初次母親感染,這在血清陰性的母親中不易預(yù)防,因?yàn)槊芮械娜?人接觸使病毒容易擴(kuò)散,血清陽性的幼兒大量釋放病毒(Field等人,1999)。在無免疫應(yīng)答成人中,疾病在實(shí)體器官移植(SOT)患者和異體造血干細(xì)胞移植(HCT)患者以及HIV感染個(gè)體中最常見。在異體HCT患者中,大約15%的患者中仍然發(fā)生嚴(yán)重CMV疾病,死亡率約為50%。與HCT中的CMV疾病有關(guān)的危險(xiǎn)因素是CMV陽性移植物供體和未感染的移植物受體、伴隨的細(xì)菌感染、暴發(fā)型肝炎和移植物抗宿主疾病。對(duì)于SOT,如腎臟、肝臟、心臟、肺或胰的SOT,CMV疾病與移植物和患者存活率的降低有關(guān)。CMV本身引起多種傳染性疾病綜合征。CMV疾病的后果在所有移植患者中相似,盡管具體的器官累及通常對(duì)應(yīng)于移植的器官。肝臟、胰、肺、腸和心臟移植受體通常比腎移植受體有較高的CMV疾病發(fā)病率。未接受抗病毒預(yù)防的大約39-41%的心臟-肺、9-35%的心臟、22-29%的肝臟和胰、8-32%的腎移植受體發(fā)生有癥狀的感染。而且,CMV感染與免疫抑制狀態(tài)增強(qiáng)有關(guān),可以解釋移植患者頻發(fā)的機(jī)會(huì)性重復(fù)感染。此外,這似乎與同種異體移植功能障礙有關(guān),間接與患者存活率降低以及成本增加、住院時(shí)間延長有關(guān)(Sia等人,2000)。對(duì)于后三點(diǎn),一方面CMV可能與心臟移植后CMV感染患者中發(fā)現(xiàn)的進(jìn)展性冠狀動(dòng)脈粥樣硬化癥有關(guān)(Van Son等人,1999和Field等人,1999),另一方面與CMV/EBV雙陽性移植患者中EB病毒(EBV)相關(guān)移植后淋巴組織增生性疾病的危險(xiǎn)增加有關(guān)(Sia等人,2000)。CMV視網(wǎng)膜炎是AIDS患者中最常見的疾病表現(xiàn)之一,已經(jīng)報(bào)告在大約30%的患者中發(fā)生,使患者面臨失明的威脅。最近的證據(jù)表明,AIDS患者中CD4+淋巴細(xì)胞的損失與CMV疾病的發(fā)展有關(guān),因此使用HIV蛋白酶抑制劑和高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HART),CMV視網(wǎng)膜炎的發(fā)病率顯著降低(Field等人,1999)。然而,CMV疾病在HAART開始4個(gè)月之內(nèi)仍然發(fā)生,盡管HIV復(fù)制被充分抑制。此外,抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的失敗是正在出現(xiàn)的一個(gè)問題(Nichols等人,2000)。
      最近十年,利用抗病毒化學(xué)治療預(yù)防和治療CMV感染已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。目前美國已經(jīng)批準(zhǔn)了5種藥物用于CMV的治療更昔洛韋(Cytovene,用作靜脈內(nèi)和口服制劑時(shí),或者Vitrasert,用作玻璃體內(nèi)植物制劑時(shí))、膦甲酸(膦甲酸鈉)、Cidofovir(Vistide)和Fomivirsen(Vitravene)。更昔洛韋和Cidofovir的三磷酸酯相當(dāng)物(前者需要病毒和細(xì)胞酶磷酸化,后者只需要細(xì)胞酶磷酸化)是對(duì)于病毒DNA聚合酶的脫氧核糖核苷酸三磷酸的競爭性抑制劑,而焦磷酸鹽類似物膦甲酸阻斷該酶的焦磷酸鹽結(jié)合部位。Fomivirsen是獲得FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)反義設(shè)計(jì)的寡核苷酸。然而,F(xiàn)omivirsen的作用機(jī)制還未完全證實(shí),除了反義之外可能還有許多成分(Field等人,1999)。由于固有的高毒性、晚期CMV疾病的高發(fā)病率和普遍預(yù)防的高成本,抗病毒治療的先發(fā)制人(preemptive)策略是基于對(duì)具有發(fā)展CMV疾病的高危險(xiǎn)的患者的選擇性治療,這是根據(jù)HCT后再激活的CMV的早期檢測(cè)(Zaia等人,2000)。在SOT患者中,預(yù)防策略在移植物供體CMV載體和未感染的移植物受體的設(shè)置中特別有吸引力。施用三個(gè)月Valganciclovir,口服生物利用性顯著提高的活性藥物的纈氨酸酯,顯著減少腎移植患者中CMV疾病的發(fā)病率。而且,移植后6個(gè)月活組織檢查證明排斥的患者的比例也顯著減少。然而,特別是用可以獲得的口服制劑長期預(yù)防,這種治療形式比常規(guī)靜脈內(nèi)制劑更方便患者,也可提高耐藥性的發(fā)生率(Nichols等人,2000)。已經(jīng)觀察到對(duì)更昔洛韋、Cidofuvir和膦甲酸的多藥耐藥性,這都是由于病毒DNA聚合酶的改變引起的(Field等人,1999)。Fomivirsen似乎對(duì)這些突變體有效(Nichols等人,2000),但是由于除了反義作用模式之外的可能的抗病毒活性(Field等人,1999),F(xiàn)omivirsen耐藥株似乎可能出現(xiàn)。
      因此,焦點(diǎn)集中于移植后CMV特異性免疫的(重)構(gòu)建,這也可防止對(duì)血清陰性母親的嬰兒的損傷。這涉及到一個(gè)問題,免疫活性宿主如何控制CMV感染,以便了解非免疫活性宿主中什么是恢復(fù)必需的。匯集的數(shù)據(jù)證明,CMV抗體通過減少病毒血癥(無細(xì)胞病毒的傳播)是部分保護(hù)性的,但是在HCT患者中無效,在單核細(xì)胞群體內(nèi),使用抗體不能破壞的貯存庫(reservoir),病毒持續(xù)與細(xì)胞結(jié)合(Plotkin等人,1999)。這強(qiáng)烈地要求發(fā)展恢復(fù)CD8+和CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的疫苗。通過在移植后早期過繼轉(zhuǎn)移這些細(xì)胞,最終能夠建立CMV特異的alphabeta/T細(xì)胞的保護(hù)功能。在I期研究中,在過繼轉(zhuǎn)移的CD8+CMV特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的受體中,與免疫活性骨髓供體相當(dāng)?shù)募?xì)胞溶解反應(yīng)在第4次輸注后立即達(dá)到。然而,在不能恢復(fù)內(nèi)源CD4+CMV特異的T輔助反應(yīng)的患者亞組中,它們?cè)陔S后的幾周下降,這強(qiáng)調(diào)了同時(shí)產(chǎn)生CD8+和CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的重要性(Zaia等人,2000)。正常CMV血清陽性個(gè)體中極高頻率的特異性CD4+記憶細(xì)胞(總CD4+T細(xì)胞的約2.0%)也提示CMV對(duì)照中CD4+T細(xì)胞的可能的重要性(Waldrop等人,1998)。HIV感染中CD4+T細(xì)胞缺陷程度與CMV疾病的密切相關(guān)性也被認(rèn)為與CD4+T細(xì)胞在控制CMV再激活中的重要作用相一致(Komanduri等人,1998)。已經(jīng)描述了5種普通類型的CMV相關(guān)疫苗減毒活病毒疫苗、重組活病毒疫苗、DNA疫苗、全蛋白質(zhì)疫苗和肽疫苗。在二十世紀(jì)七十年代發(fā)展并在腎移植患者和分娩當(dāng)年的婦女中測(cè)試了一種減毒活病毒疫苗,“Towne株”。盡管該疫苗顯示免疫原性,但是在移植群體中使用活病毒仍具有潛在的危險(xiǎn)。較低程度上這也適用于在人體中復(fù)制能力有限的重組痘病毒(禽痘)。在動(dòng)物模型中顯示前途的方法包括導(dǎo)入編碼免疫原性蛋白質(zhì)的DNA載體,作為引發(fā)TCL的工具。DNA疫苗技術(shù)的改進(jìn),包括使用最低細(xì)胞毒性和輔助T細(xì)胞表位作為免疫原,可產(chǎn)生更加有效的疫苗(Zaia等人,2000)。
      總之,抗病毒藥物的副作用和高成本,上述用于CMV疫苗的方法的有限應(yīng)用范圍/成功,和過繼轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞克隆的良好效能,突出了發(fā)現(xiàn)新MHC I類和II類限制性T細(xì)胞表位的重要性。這些表位應(yīng)當(dāng)被最普遍的HLA分子呈遞,因此使大多數(shù)群體具有保護(hù)性,與個(gè)體HLA設(shè)置無關(guān)。CMV是已知的具有最高蛋白質(zhì)編碼能力的病毒之一,含有170-200個(gè)開放閱讀框(Reddehase,2000)。然而,對(duì)顯然成功控制病毒的無癥狀供體的T細(xì)胞應(yīng)答的分析顯示CMV pp65、pp150、IE-1和gB的免疫顯性(Zaia等人,2000)。這可能是因?yàn)閹追N免疫抑制基因的表達(dá),干擾了加載肽的MHC I類和II類分子的形成和釋放(egress)。顯著地,MHC I類分子的下調(diào)似乎很少干擾CMVpp65或pp150-特異的CTL對(duì)CMV感染的細(xì)胞的識(shí)別。在病毒進(jìn)入后的極早期,這兩種結(jié)構(gòu)蛋白被輸送到細(xì)胞質(zhì)中,這能夠用下列事實(shí)解釋在免疫抑制病毒基因表達(dá)之前,這些結(jié)構(gòu)蛋白能夠加工并呈遞。然而,在較后期,當(dāng)MHC水平已經(jīng)降低時(shí),CMV pp65或pp150特異的CTL也能有效地識(shí)別感染的細(xì)胞。這似乎是由于宿主的逆向逃避(counter evasion)策略。在CMV感染后,一種細(xì)胞基因被誘導(dǎo),甚至在靶細(xì)胞只表達(dá)低肽/MHC密度時(shí),它也與T細(xì)胞上的一種受體結(jié)合,促進(jìn)T細(xì)胞激活(Zaia等人,2000)。另一方面,有跡象表明,pp65干擾IE-1的呈遞,IE-1是隨后所有免疫抑制基因產(chǎn)物的激活劑(Reddehase,2000),這能夠解釋pp65抗原的免疫顯性。因此,pp65特異的T細(xì)胞能夠在復(fù)制周期的所有階段裂解病毒感染的細(xì)胞,可能是在體內(nèi)去除感染的細(xì)胞所必需的(Zaia等人,2000)。
      根據(jù)另一方面,本發(fā)明也提供可以利用根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定的T細(xì)胞表位,該T細(xì)胞表位選自含有序列KMQVIGDQYVK、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV、KYQEFFWDA的多肽或其組合。
      本發(fā)明也提供具有T細(xì)胞激活能力的HLA A0201結(jié)合表位,該表位可以利用HLA A0201分子作為MHC/HLA分子,通過根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定,該HLAA0201結(jié)合表位選自含有序列RLLQTGIHV、VIGDQYVKV、YLESFCEDV的多肽或其組合。盡管已知這些序列可結(jié)合HLA A0201,但是本發(fā)明提供了它們激活T細(xì)胞的可用性。
      本發(fā)明進(jìn)一步提供含有序列RPHERNGFTV的肽在制備用于在B7陰性個(gè)體中激活T細(xì)胞的組合物中的用途。
      另外,本發(fā)明也提供含有序列DDVWTSGSDSDE的肽在制備用于在B35陰性個(gè)體中激活T細(xì)胞的組合物中的用途。
      而且,本發(fā)明也提供含有序列TPRVTGGGAM的肽在制備用于在B7陰性個(gè)體中激活T細(xì)胞的組合物中的用途。
      盡管已經(jīng)描述這些序列具有特異HLA限制(RPHERNGFTVB7,DDVWTSGSDSDEB35,TPRVTGGGAMB7),但是令人吃驚的是這些序列具有不同于已知限制的特異性(RPHERNGFTV非B7,DDVWTSGSDSDE非B35,TPRVTGGGAM非B7)。這使得這些序列的有效性能夠擴(kuò)展,例如通過使這些序列作為合適的疫苗,可用于表達(dá)不同于描述的其它HLA的個(gè)體。
      本發(fā)明進(jìn)一步提供可與II類HLA分子結(jié)合的肽,選自根據(jù)實(shí)施例部分的表3肽55-64、109、383、384、421、449-454、469和470。
      優(yōu)選地,根據(jù)本發(fā)明的表位或肽在N端、C端或N端和C端還含有1-30個(gè)、優(yōu)選地2-10個(gè)、特別是2-6個(gè)天然存在的氨基酸殘基。對(duì)于本發(fā)明,術(shù)語“天然存在的”氨基酸殘基涉及在天然存在的蛋白質(zhì)中,在相對(duì)于表位或肽的特定位置處存在的氨基酸殘基。例如,對(duì)于“AMAGASTSA”表位,在N端天然存在的氨基酸殘基是Gly;在C端天然存在的3個(gè)氨基酸殘基是Gly-Arg-Lys。因此,“非天然存在的”氨基酸殘基是與相對(duì)于表位或肽的特定位置處的氨基酸殘基不同的任何氨基酸殘基。
      根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,該表位或肽還含有非天然存在的氨基酸,優(yōu)選地1-1000個(gè),更優(yōu)選地2-100個(gè),特別是2-20個(gè)非天然存在的氨基酸殘基,特別是在N端、C端或在N端和C端。在具體優(yōu)選實(shí)施方案中,非天然和天然存在的氨基酸殘基的組合也是可能的。該表位也可含有修飾的氨基酸(即不同于20種“標(biāo)準(zhǔn)”氨基酸的氨基酸殘基,如D-氨基酸或Cys的S-S結(jié)合)作為另外的氨基酸殘基或代替天然存在的氨基酸殘基。
      顯然,通過可提高、保持或至少不顯著阻礙表位的T細(xì)胞激活能力的氨基酸交換,由該表位或肽衍生的表位或肽,也包括于根據(jù)本發(fā)明的表位或肽中。因此,該表位或肽也包括不含如來源于CMV pp65的原始序列,但是觸發(fā)相同或者優(yōu)選地提高的T細(xì)胞應(yīng)答的表位或肽。這些表位被稱為“不規(guī)則的(heteroclitic)”。包括能夠觸發(fā)與原始表位相同的T細(xì)胞,優(yōu)選地在體內(nèi)或者也在體外具有更強(qiáng)的T細(xì)胞激活能力的任何表位。
      不規(guī)則的表位能夠通過合理設(shè)計(jì)獲得,即考慮各個(gè)殘基對(duì)結(jié)合MHC/HLA的作用,如Ramensee等人1999或Sturniolo等人1999所述,結(jié)合可能與TCR相互作用的殘基的系統(tǒng)交換,用針對(duì)原始表位的T細(xì)胞檢測(cè)產(chǎn)生的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要更多實(shí)驗(yàn)即能夠使用這種設(shè)計(jì)。
      另一種可能性包括用針對(duì)原始表位的T細(xì)胞篩查肽庫。一種優(yōu)選的方法是合成肽庫的位置掃描。例如,Blake等人1996和Hemmer等人1999以及此處的參考文獻(xiàn)已經(jīng)詳細(xì)描述了這些方法。
      作為同源CMV pp65衍生的氨基酸序列代表的表位或不規(guī)則表位的備選,也能夠使用模擬這些表位的物質(zhì),例如“擬肽”或“retro-inverso-肽”。
      設(shè)計(jì)改進(jìn)的表位的另一方面是它們與可提高它們刺激T細(xì)胞的能力的物質(zhì)配制或修飾。包括T輔助細(xì)胞表位、脂類或脂質(zhì)體或優(yōu)選的修飾,如WO01/78767所述。
      提高表位的T細(xì)胞刺激能力的另一種方法是與免疫刺激物質(zhì)一起配制,例如細(xì)胞因子或趨化因子,如白介素-2、-7、-12、-18,I類和II類干擾素(IFN),特別是IFN-γ,GM-CSF,TNF-α,flt3-配體等。
      根據(jù)另一方面,本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的表位或肽在制備用于治療或預(yù)防巨細(xì)胞病毒(CMV)感染的HLA限制的疫苗中的用途。
      本發(fā)明也包括含有序列KMQVIGDQYV、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV和/或KYQEFFWDA的表位在制備用于治療或預(yù)防巨細(xì)胞病毒(CMV)感染的疫苗中的用途。
      因此,本發(fā)明也包括一種用于治療或預(yù)防巨細(xì)胞病毒(CMV)感染的疫苗,它包含含有序列KMQVIGDQYV、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV和/或KYQEFFWDA的表位。而且,用于治療或預(yù)防巨細(xì)胞病毒(CMV)感染的HLA特異的疫苗,其包含根據(jù)本發(fā)明的表位或肽,也是本發(fā)明的一個(gè)方面。編碼根據(jù)本發(fā)明的肽的相應(yīng)核酸的用途,例如用作DNA疫苗,也屬于本發(fā)明的范圍,至少是要求保護(hù)的肽疫苗的相當(dāng)物。
      Parker等人(1994)描述了根據(jù)個(gè)別肽結(jié)合的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)肽與MHC I類分子結(jié)合的方法。通過監(jiān)測(cè)肽促進(jìn)β2-微球蛋白(β2m)摻入HLA-A2/β2m/肽雜二聚復(fù)合物中的能力間接評(píng)價(jià)肽結(jié)合能力。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(測(cè)定的β2m的分解速度)允許產(chǎn)生相應(yīng)的系數(shù)值,然后用來計(jì)算與HLA-A2分子的復(fù)合物中對(duì)任何九肽的理論結(jié)合穩(wěn)定性。在該研究中,第一次顯示CMV pp65衍生的肽序列RLLQTGIHV能夠穩(wěn)定HLA-A2/β32m/肽復(fù)合物。
      Morgan等人(1998)描述了測(cè)定肽與純化HLA分子的結(jié)合親和力的方法,也是根據(jù)間接測(cè)定β2m向HLA/肽復(fù)合物中的摻入。在該研究中,RLLQTGIHV肽的體外結(jié)合已經(jīng)得到證明,并測(cè)定它與HLA-A2分子的相對(duì)結(jié)合親和力(結(jié)合及解離常數(shù))。
      盡管Parker等人和Morgan等人證實(shí)了與HLA-A2的結(jié)合,但是缺乏證明該配體也是一種真正的T細(xì)胞表位的最終證據(jù),而在本發(fā)明中,通過干擾素-γ酶聯(lián)印跡證實(shí),RLLQTGIHV不僅能結(jié)合HLA-A2,而且只能誘導(dǎo)功能性T細(xì)胞。這不是一個(gè)沒有價(jià)值的發(fā)現(xiàn)在該領(lǐng)域眾所周知,以高親和力結(jié)合的多種配體不是T細(xì)胞靶標(biāo),因?yàn)槔缤ㄟ^上述“抗原加工和呈遞途徑”它們不會(huì)產(chǎn)生或者不會(huì)高效產(chǎn)生。因此,RLLQTGIHV的HLA A0201結(jié)合活性不僅令人吃驚,而且也可選擇用于例如為某些等位基因群體具體設(shè)計(jì)的疫苗。
      優(yōu)選地,根據(jù)本發(fā)明的這種疫苗還含有一種免疫調(diào)節(jié)物,優(yōu)選地選自聚陽離子物質(zhì),特別是聚陽離子多肽,免疫調(diào)節(jié)核酸,特別是含有寡脫氧核苷酸的脫氧肌苷和/或脫氧尿苷,或其混合物。
      優(yōu)選地,該疫苗還含有一種聚陽離子聚合物,優(yōu)選地一種聚陽離子肽,特別是聚精氨酸、聚賴氨酸或抗微生物肽。
      根據(jù)本發(fā)明使用的聚陽離子化合物可以是顯示根據(jù)WO97/30721的特征的任何聚陽離子化合物。優(yōu)選的聚陽離子化合物選自堿性多肽、有機(jī)聚陽離子、堿性聚氨基酸或其混合物。這些聚氨基酸的鏈長應(yīng)當(dāng)至少為4個(gè)氨基酸殘基。特別優(yōu)選的是含有肽結(jié)合的物質(zhì),如聚賴氨酸、聚精氨酸和含有8個(gè)以上、特別是20個(gè)以上氨基酸殘基且含有20%以上、特別是50%以上堿性氨基酸的多肽,或其混合物。其它優(yōu)選的聚陽離子及其藥物組合物在WO97/30721(例如聚聚乙烯亞胺)和WO99/38528中描述。優(yōu)選地,這些多肽含有20-500個(gè)氨基酸殘基,特別是30-200個(gè)殘基。
      這些聚陽離子化合物可以化學(xué)產(chǎn)生或重組產(chǎn)生,或者可以來自于天然來源。
      陽離子(多)肽也可以是聚陽離子抗細(xì)菌微生物肽。這些(多)肽可以是原核或動(dòng)物或植物來源的,或者可以化學(xué)產(chǎn)生或重組產(chǎn)生。這些肽也可能屬于防衛(wèi)素類。這些宿主防御肽或防衛(wèi)素也是根據(jù)本發(fā)明的聚陽離子聚合物的一種優(yōu)選形式??梢宰鳛榻K產(chǎn)物激活(或者下調(diào))適應(yīng)性免疫系統(tǒng)、優(yōu)選地被APC(包括樹突細(xì)胞)介導(dǎo)的化合物,用作聚陽離子聚合物。
      本發(fā)明特別優(yōu)選的用作聚陽離子物質(zhì)的是cathelicidin衍生的抗微生物肽或其衍生物(A 1416/2000,在此引用作為參考),特別是來源于哺乳動(dòng)物cathelicidin的抗微生物肽,優(yōu)選地來源于人、?;蛐∈螅蛏窠?jīng)活性化合物,如(人)生長激素(如WO01/24822所述)。
      來自于天然來源的聚陽離子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的陽離子肽,觸角(antennapedia)肽,脫乙酰殼多糖或殼多糖的其它衍生物)或通過生物化學(xué)或重組生產(chǎn)由這些肽或蛋白質(zhì)衍生的其它肽。其它優(yōu)選的聚陽離子化合物有cathelin或者與cathelin有關(guān)的或其衍生的物質(zhì),特別是小鼠、?;蛉薱athelins,和/或cathelicidin。有關(guān)或衍生的cathelin物質(zhì)含有全部或部分cathelin序列,至少含有15-20個(gè)氨基酸殘基。衍生可包括天然氨基酸被置換或修飾為不屬于20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的氨基酸。而且,也可以向這些cathelin分子中引入其它陽離子殘基。這些cathelin分子優(yōu)選地與根據(jù)本發(fā)明的抗原/疫苗組合物組合。然而,在不添加其它佐劑的情況下,這些cathelin分子作為抗原的一種佐劑也令人吃驚地有效。因此,在使用或不使用其它免疫激活物的情況下,在疫苗制劑中使用這些cathelin分子作為有效佐劑是可能的。
      根據(jù)本發(fā)明使用的另外一種優(yōu)選聚陽離子物質(zhì)是一種合成肽,它含有至少2個(gè)KLK-基序,被一個(gè)3-7個(gè)疏水氨基酸的接頭隔開,特別是L(例如KIKL5KLK;PCT/EP01/12041,在此引用作為參考)。
      根據(jù)本發(fā)明使用的免疫調(diào)節(jié)(或免疫原性)核酸可以是合成的、原核或真核來源的。對(duì)于原核來源,根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹,DNA應(yīng)當(dāng)來源于發(fā)育較低的種(例如昆蟲等)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,免疫原性寡脫氧核苷酸(ODN)是一種合成產(chǎn)生的DNA分子或這些分子的混合物。也包括ODN的衍生物或修飾,如硫代磷酸酯取代的類似物(硫代磷酸殘基代替磷酸),如美國專利號(hào)US 5,723,335和US 5,663,153所述,以及優(yōu)選地穩(wěn)定免疫刺激組合物但不改變其免疫性質(zhì)的其它衍生物和修飾。一種優(yōu)選的序列基序是一個(gè)6堿基的DNA基序,它含有一個(gè)(非甲基化)CpG二核苷酸,側(cè)翼為兩個(gè)5′嘌呤和兩個(gè)3′嘧啶(5′-Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr-3′)。根據(jù)本發(fā)明的ODN中所含的CpG基序在微生物中比在高等脊椎動(dòng)物DNA中更常見,在甲基化模式上顯示差異。令人吃驚的是,刺激小鼠APC的序列對(duì)于人細(xì)胞不是非常有效。根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選的回文或非回文ODN例如在澳大利亞專利申請(qǐng)A 1973/2000、A 805/2001、EP 0 468 520 A2、WO96/02555、WO98/16247、WO98/18810、WO98/37919、WO98/40100、WO98/52581、WO98/52962、WO99/51259和WO99/56755中公開,均在此引用作為參考。除了刺激免疫系統(tǒng)之外,某些ODN也中和某些免疫應(yīng)答。本發(fā)明也包括這些序列,例如用于自身免疫病的治療。ODNs/DNAs可以化學(xué)產(chǎn)生或重組產(chǎn)生,或者來自于天然來源。優(yōu)選的天然來源是昆蟲。
      此外,基于肌苷和胞苷的核酸(例如PCT/EP01/06437所述)或含有脫氧肌苷和/或脫氧尿苷殘基的脫氧核酸(澳大利亞專利申請(qǐng)A1973/2000和A805/2001描述,在此引用作為參考)也可以優(yōu)選地作為免疫刺激核酸用于本發(fā)明。
      當(dāng)然,根據(jù)本發(fā)明也可以使用不同免疫原性核酸的混合物。
      優(yōu)選地,該疫苗還含有一種藥學(xué)可接受的載體。
      根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,該疫苗含有以選自下列的形式提供的表位或肽肽、肽類似物、蛋白質(zhì)、裸DNA、RNA、病毒載體、病毒樣顆粒、重組/嵌合病毒、重組細(xì)菌或用蛋白質(zhì)/肽/RNA脈沖或用含有該表位或肽的DNA轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞。
      根據(jù)另一方面,本發(fā)明涉及T細(xì)胞、T細(xì)胞克隆或T細(xì)胞群體(制品),特別是能夠識(shí)別根據(jù)本發(fā)明的任何表位或肽,尤其是如上所述的CMV表位。這些T細(xì)胞的一種優(yōu)選用途是它們的體外表達(dá)和例如通過過繼轉(zhuǎn)移對(duì)患者的治療用途。因此,本發(fā)明也提供T細(xì)胞、T細(xì)胞克隆或T細(xì)胞群體(制品)在制備用于治療CMV患者的組合物中的用途。
      根據(jù)本發(fā)明的這些T細(xì)胞(克隆或系),特別是可以識(shí)別上述CMV肽的T細(xì)胞,也可用于鑒定不規(guī)則表位,不規(guī)則表位不同于最初鑒定的表位,但是引發(fā)相同的T細(xì)胞。
      根據(jù)本發(fā)明的這些細(xì)胞、組合物或疫苗以有效的量對(duì)個(gè)體施用。
      本發(fā)明將通過下列實(shí)施例和附圖更詳細(xì)地說明,但是不限于此。


      圖1顯示肽與可溶性DR4分子的結(jié)合親和力;圖2顯示能夠結(jié)合空DR4分子的肽的鑒定(A.HLA-肽復(fù)合物的純化;B.結(jié)合的肽的MS分析);圖3顯示在過量的低親和力肽存在下,高親和力肽與DR4分子的結(jié)合;圖4顯示個(gè)別肽和肽混合物與DR4分子的結(jié)合;圖5顯示使用(5a)分離的CD4+T細(xì)胞和DR0401分子(用抗CD28共刺激),使用(5b)分離的CD8+T細(xì)胞和HLAA0201分子(用抗CD28mab共刺激)的酶聯(lián)印跡;圖6顯示CMV pp65肽集合陣列;圖7顯示(7a)來源于pp65蛋白的肽集合與DR4分子的結(jié)合,(7b)單個(gè)pp65肽與DR4分子的結(jié)合;圖8顯示用肽混合物(每個(gè)含有21種肽,供體#10736 HLA A2/3,HLA B15/35;8a)進(jìn)行的第一次篩查,和用肽混合物(每個(gè)含有21種肽,供體#10687 HLA A2/11,HLA B7/13;8b)進(jìn)行的第一次篩查;圖9顯示用單個(gè)肽(供體#10736 HLA A2/3,HLAB15/35)進(jìn)行的第二次篩查;圖10顯示來自受試者10788的PBMC,用于使用CMVpp6515mers 57、59和對(duì)照(med不含肽,HIV無關(guān)HIV衍生肽,ConA多克隆刺激)的IFN-γELIspot;
      圖11顯示通過細(xì)胞內(nèi)IFN-γ染色證實(shí)針對(duì)CMVpp65 15mers 469、470的同時(shí)的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答;圖12顯示利用IFN-γ酶聯(lián)印跡測(cè)定,在轉(zhuǎn)基因小鼠中用重疊的15mers對(duì)DRB1*0401表位的作圖最后一次接種一周后,取出脾臟,用有關(guān)的肽(編號(hào)1500-1505)來自體內(nèi)地激活細(xì)胞,重疊的15mers代表這些較長的肽和無關(guān)的流感血凝素衍生肽(編號(hào)1171),用來測(cè)定產(chǎn)生IFN-γ的特定細(xì)胞(減去培養(yǎng)基對(duì)照)。
      實(shí)施例實(shí)施例概述這些實(shí)施例顯示本發(fā)明對(duì)具體病原體蛋白CMV的pp65的實(shí)施。
      第一部分應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的方法,該方法基于使用“空HLA分子”。這些分子與可能的CMV衍生肽配體混合物一起溫育,篩查特異性結(jié)合事件。分離這樣形成的復(fù)合物,用于鑒定特異結(jié)合的配體。使用高度復(fù)雜的混合物的可能性允許從幾百乃至幾千種可能的配體中極快地鑒定出少數(shù)結(jié)合劑。使用HLA-DRB1*0401和重疊15-mers的集合證實(shí)了這一點(diǎn)。
      然而,I類分子和適當(dāng)長度(即8-11-mers)的肽能夠使用相同的方法。配體集合可以是合成的重疊肽。另一種可能性是酶或非酶消化所述抗原。后者通過堿水解實(shí)現(xiàn),產(chǎn)生所有可能的降解產(chǎn)物,已經(jīng)成功地用于鑒定T細(xì)胞表位(Gavin 1993)。酶消化能夠用蛋白酶進(jìn)行。一個(gè)合理的方法是進(jìn)一步使用參與天然抗原加工途徑的蛋白酶,如用于I類限制的表位的蛋白酶體(Heemels 1995),或者用于II類限制的表位的組織蛋白酶(Villadangos 2000)。配體集合也可能由天然存在的配體組成,這些配體例如通過攜帶各自表位的細(xì)胞的裂解或洗脫獲得。就此而言,重要地指出,也能夠使用非肽配體,例如糖脂。眾所周知,可能由MHC(例如HLA-G、HLA-E、MICA、MICB)編碼或MHC之外(例如CD1家族)的非傳統(tǒng)的I類分子,能夠?yàn)榱馨图?xì)胞呈遞多種非肽配體(Kronenberg 1999)。使用重組“空”非傳統(tǒng)I類分子將允許結(jié)合劑的結(jié)合反應(yīng)以及用與此處所述相似的方法鑒定。
      在快速鑒定能夠結(jié)合HLA分子的配體后,根據(jù)本發(fā)明的加工也提供了直接表征針對(duì)這些結(jié)合劑的特異T細(xì)胞應(yīng)答的方法。一個(gè)可能性是在所謂的“合成T細(xì)胞測(cè)定”中直接使用分離的HLA配體復(fù)合物。后者包括HLA配體復(fù)合物對(duì)T細(xì)胞的抗原特異性再刺激,以及提供共刺激如激活抗體激活CD28的第二個(gè)信號(hào)。如實(shí)施例II所證實(shí)的,該測(cè)定能夠以酶聯(lián)免疫印跡讀數(shù)進(jìn)行。
      在此,選擇合成CMV pp65作為一系列重疊的15mer肽,每個(gè)肽的15個(gè)氨基酸中的14個(gè)與其前體重疊。這些肽作為21種單個(gè)肽的集合提供,它們的構(gòu)建使得每一種肽恰好在2個(gè)集合中出現(xiàn)。矩陣形式的肽集合陣列能夠確定單個(gè)肽為行和列混合物的交叉點(diǎn)(圖6)。選擇10名表達(dá)MHC I類分子A2的CMV血清陽性的健康血液供體作為供體。由于已知pp65抗原被攜帶該MHC分子的供體特異識(shí)別,推斷出這種MHC偏性(Saulquin等人,2000;Kern等人,2000)。
      平行地使用來自CMV血清陽性個(gè)體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)(在SDS-穩(wěn)定性測(cè)定中與可溶性重組HLA II類分子結(jié)合)通過干擾素-γ(IFN-γ)酶聯(lián)免疫印跡測(cè)定篩選相同的肽(集合)。這兩種方法都產(chǎn)生表位,盡管選擇HLA沒有偏向(T細(xì)胞測(cè)定方法選擇I類HLA-A2,肽結(jié)合方法選擇II類HLA-DR4)顯示一定程度的重疊。
      材料與方法肽用Syro II合成儀(Multisyntech,Witten,Germany)合成547種15個(gè)氨基酸殘基(15mer)的肽,它們有14個(gè)氨基酸重疊,代表CMV pp65抗原的完整序列。利用標(biāo)準(zhǔn)F-moc化學(xué)法平行制備288種肽。
      每種肽均以~10mg/ml的濃度溶解于100%DMSO中。來源于pp65的42種肽集合的貯存液在100%DMSO中制備,每種肽的終濃度均為0.45mg/ml。
      其它肽用標(biāo)準(zhǔn)F-moc化學(xué)方法在Syro II合成儀或ABI 433A合成儀(Applied Biosystems,Weiterstadt,Germany)上合成,利用C18柱(來自YMC的ODS ACU或來自Vydac的218TP)通過RP-HPLC(Biocut700E,Applied Biosystems,Langen,Germany)純化。每種肽的純度和身份用Reflex III質(zhì)譜儀(Bruker,Bremen,Germany)通過MALDI-TOF表征。
      肽結(jié)合測(cè)定可溶性HLA I類A*0201和HLA II類DRA1*0101/DRB1*0101/Ii、DRA1*0101/DRB1*0401/Ii和DRA1*0101/DRB1*0404/Ii分子在SC-2細(xì)胞中表達(dá),如Aichinger等人,1997所述純化。
      在肽結(jié)合反應(yīng)中,使用濃度為0.5μM的HLA分子,如果沒有提出不同,每種單肽以10倍摩爾過量(5μM)加入。結(jié)合反應(yīng)中DMSO的濃度不超過4%。在蛋白酶抑制劑混合物(Roche)和0.1%辛基-b-D-葡糖吡喃糖苷(Sigma)存在下,該反應(yīng)在PBS緩沖液(pH7.4)中進(jìn)行,室溫下48小時(shí)。
      肽的結(jié)合通過SDS-穩(wěn)定性測(cè)定法評(píng)價(jià)(Gorga等人,1987)三聚體HLA II類ab-肽復(fù)合物耐受SDS,因此在SDS-PAGE Western印跡分析中以~60kDa的帶出現(xiàn)。中親和力到高親和力的肽結(jié)合不能穩(wěn)定的單個(gè)HLA II類α和β鏈分別作為~35kDa和~30kDa的帶遷移。
      簡言之,HLA-肽復(fù)合物用1%SDS在室溫下處理,通過20mA的SDS-PAGE電泳在室溫下分析約2.5小時(shí)。通過電印跡將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用抗-a-鏈TAL.1B5α或/和β-鏈MEM136抗體染色。為了檢測(cè)Western印跡信號(hào),使用ECL溶液(Amersham)。
      與DRB1*0701和DRB1*1101的結(jié)合親和力通過肽競爭測(cè)定法檢測(cè)(Reay等人,1992)。簡言之,生物素化的CLIP肽(參照肽)的結(jié)合用于監(jiān)測(cè)HLA肽復(fù)合物的形成。向結(jié)合反應(yīng)中加入的與CLIP肽等摩爾濃度的檢測(cè)肽當(dāng)其親和力高于CLIP的親和力時(shí)能夠競爭CLIP,或者當(dāng)其親和力等于CLIP的親和力時(shí)抑制50%的結(jié)合。對(duì)于較低親和力的肽,它們應(yīng)當(dāng)過量加入?yún)⒄针闹校愿偁幷紦?jù)HLA結(jié)合的溝槽。參照肽結(jié)合50%抑制(IC50)所需的競爭肽的濃度值能夠用來估計(jì)肽結(jié)合的親和力。此外,在存在或不存在競爭肽的情況下,比較與HLA分子結(jié)合的參照肽的量,能夠測(cè)定目的肽的結(jié)合活性。
      在該肽-競爭測(cè)定中,肽結(jié)合的條件與以上所述相似??扇苄訦LA分子以0.5μM的濃度使用,生物素化的CLIP以2μM的終濃度加入所有樣品中。以三個(gè)不同濃度加入競爭肽0.25、5、100μM。結(jié)合反應(yīng)在PBS緩沖液(pH7.4)中進(jìn)行,37℃18小時(shí)。與可溶性HLA分子結(jié)合的生物素化CLIPm的量通過ELISA測(cè)定。簡言之,MaxiSorb 96孔板(Nunc,Denmark)用小鼠抗αβ抗體L243(從ATCC HB-55中純化)包被,方法是與50μl10μg/ml PBS稀釋液4℃溫育過夜。與塑料的非特異性結(jié)合通過與含有3%BSA的T-PBS在37℃下溫育2小時(shí)阻斷,結(jié)合反應(yīng)然后在室溫下“捕獲”2小時(shí)。用T-PBS充分洗板后,使用堿性磷酸酶-鏈霉親和素偶聯(lián)物(Dako)和Sigma 104磷酸酶底物(SigmaDiagnostics,USA)以比色法檢測(cè)HLA結(jié)合的肽復(fù)合物。405nm的光密度用微孔板讀板器SUNRISE(Tecan)測(cè)量。
      來自HLA-肽復(fù)合物的肽的鑒定在肽與可溶性HLA分子的結(jié)合反應(yīng)后,在Superdex-200柱(AKTAdesign,Amersham Pharmacia Biotech)上通過凝膠過濾層析使HLA-肽復(fù)合物與游離肽分離。收集含有HLA的級(jí)分,通過加入TFA至終濃度為1%,由復(fù)合物重建結(jié)合的肽。這些肽通過Ziptip純化脫鹽,并通過MALDI-TOF質(zhì)譜法分析。
      合成酶聯(lián)免疫印跡測(cè)定來自Millipore的96孔過濾板(目錄號(hào)MAHA S4510)用1μg/孔來自Bender Med Systems的抗人IFN-γmab B140和0.5μg/孔來自Qiagen的QIAexpress五His抗體的混合物包被,4℃過夜。作為CD8+T細(xì)胞的生存力和細(xì)胞因子產(chǎn)生的陽性對(duì)照,有些孔用抗CD3抗體包被,克隆MEM-57,來自V.Horejsi,Institute of Molecular Genetics,Prag。
      用PBS(來自GIBCOBRL,目錄號(hào)14190-094)洗板2次,用下列ELISPOT培養(yǎng)基封閉來自GIBCOBRL的RPMI 1640(目錄號(hào)31870-025),補(bǔ)充有1mM來自GIBCOBRL的丙酮酸鈉(目錄號(hào)11360-039)、2mM來自GIBCOBRL的L-谷氨酰胺(目錄號(hào)25030-024)、0.1mM來自GIBCOBRL的非必需氨基酸(目錄號(hào)11140-035)、50μg/ml來自 GIBCOBRL的慶大霉素(目錄號(hào)15710-049)、50μM來自GIBCOBRL的2-巰基乙醇(目錄號(hào)31350-010)和10%來自BioWhittaker的人AB型血清(目錄號(hào)14-490E),37℃30分鐘。
      在除去封閉培養(yǎng)基后,孔與可溶性HLA DRB1*0401溫育,37℃5小時(shí),后者加載來自結(jié)核分枝桿菌的肽1242,來自流感血凝素的肽1171(HA-pepaa 306-318),或者對(duì)于陰性對(duì)照,加載來自丙型肝炎病毒的肽84(HCV-pepNS3 aa 1248-1261),用ELISPOT培養(yǎng)基稀釋為100μg/ml(10μg/孔)(圖5a)。對(duì)于圖5b,使用可溶性HLA A*0201分子,其中加載來源于EBV抗原的肽BMLF1 aa 280-88,來源于流感基質(zhì)蛋白的肽21,aa 58-66,或者對(duì)于陰性對(duì)照,加載來源于HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的肽90,aa 476-484。分子的加載基本如段落“肽結(jié)合測(cè)定”所述進(jìn)行。
      具有匹配的HLA表型、接種BCG、HIV和HCV陰性的健康供體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)用Leuco Sep試管(來自Greiner)在Lymphoprep(來自Nycomed Pharma AS,Oslo,Norway)上分離,用PBS(來自GIBCOBRL,目錄號(hào)14190-094)洗滌3次。
      利用MACS技術(shù)(Miltenyi,Germany),按照廠商說明,從PBMC中分離CD4+T細(xì)胞(圖5a)或CD8+T細(xì)胞(圖5b)。分離的T細(xì)胞重懸浮于含有10μg/ml抗CD28單克隆抗體(克隆37407.111,mab 342,來自R&amp;D systems)的ELISPOT培養(yǎng)基中,濃度為1Mio/ml。
      棄去含有可溶性HLA(sHLA)分子的溶液,將分離的T細(xì)胞接種到孔中。向各自的樣品中再添加5μM(圖5a)或10μg/ml(圖5b)相應(yīng)的肽。
      細(xì)胞與sHLA分子共培養(yǎng)20小時(shí)。通過除去內(nèi)容物并用洗滌緩沖液(PBS;0.1%Tween 20,來自SIGMA)洗滌6次,停止測(cè)定。然后,加入100μl1∶10000稀釋的生物素化抗人IFN-γmab(B308-BT2,來自BMS),相當(dāng)于0.015μg/孔,37℃溫育2小時(shí),或者4℃過夜。洗滌后,以1.2μg/ml加入來自DAKO的鏈霉親和素-ALP(目錄號(hào)D0396),37℃1小時(shí)。加入100μl/孔來自SIGMA的BCIP/NBT堿性磷酸酶底物(目錄號(hào)B-5655),使該測(cè)定顯色。
      用Elispot讀數(shù)器(Bioreader 2000,來自Biosys,Germany)計(jì)數(shù)大小為直徑130μm到2000μm的斑點(diǎn)。由陰性對(duì)照樣品(HCV或HIV肽)推斷自發(fā)誘導(dǎo)的IFN-γ斑點(diǎn)的平均數(shù)量。超過平均自發(fā)IFN-γ釋放的每個(gè)應(yīng)答,其中該值加上陰性對(duì)照樣品標(biāo)準(zhǔn)差的2倍,被認(rèn)為是顯著的。
      為了篩選9名CMV血清陽性HLA A2健康志愿者的PBMC針對(duì)CMV pp65抗原的T細(xì)胞應(yīng)答,這次篩選中包括PBMC的收集、制備和凍存。這些供體關(guān)于HLA I類A和B的HLA信息可以獲得,但是沒有關(guān)于HLA I類C或HLA II類的信息。
      將全血收集到ACD Vacutainer管(BectonDickinson,Europe)中。利用Leuco Sep管(來自Greiner),在Lymphoprep(來自NycomedPharma AS,Oslo,Norway)上從全血中分離PBMC,用PBS(來自GIBCOBRL,目錄號(hào)14190-094)洗滌3次,以20Mio c/ml的濃度重懸浮于下列冷凍培養(yǎng)基中4份來自GIBCOBRL的RPMI 1640(目錄號(hào)31870-025),補(bǔ)充有1mM來自GIBCOBRL的丙酮酸鈉(目錄號(hào)11360-039)、2mM來自GIBCOBRL的L-谷氨酰胺(目錄號(hào)25030-024)、0.1mM來自GIBCOBRL的非必需氨基酸(目錄號(hào)11140-035)、50μg/ml來自GIBCOBRL的慶大霉素(目錄號(hào)15710-049)、50μM來自GIBCOBRL的2-巰基乙醇(目錄號(hào)31350-010);5份來自PAA的胎牛血清(FCS)(目錄號(hào)A11-042);使用前向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入1份來自SIGMA的DMSO(目錄號(hào)D2650)。
      PBMC在冷凍容器(Nalgene 1℃冷凍容器,目錄號(hào)5100-0001)中-80℃貯存過夜,然后轉(zhuǎn)移到液氮容器中。
      對(duì)單細(xì)胞人IFN-γ釋放的ELISPOT測(cè)定從冷凍的PBMC中檢測(cè)pp65特異的效應(yīng)細(xì)胞該測(cè)定基本如Lalvani等人所述進(jìn)行。簡言之,來自Millipore的多篩選96孔過濾板(目錄號(hào)MAHA S4510)在4℃下用10μg/ml來自Bender Med Systems的抗人IFN-γmab B140(1μg/孔)包被,過夜。用PBS(來自GIBCOBRL,目錄號(hào)14190-094)洗板2次,用下列ELISPOT培養(yǎng)基封閉來自GIBCOBRL的RPMI 1640(目錄號(hào)31870-025),補(bǔ)充有1mM來自GIBCOBRL的丙酮酸鈉(目錄號(hào)11360-039)、2mM來自GIBCOBRL的L-谷氨酰胺(目錄號(hào)25030-024)、0.1mM來自GIBCOBRL的非必需氨基酸(目錄號(hào)11140-035)、50μg/ml來自GIBCOBRL的慶大霉素(目錄號(hào)15710-049)、50μM來自GIBCOBRL的2-巰基乙醇(目錄號(hào)31350-010)和10%來自BioWhittaker的人AB型血清(目錄號(hào)14-490E)。
      凍存的PBMC在37℃水浴中快速融解,用ELISPOT培養(yǎng)基洗滌兩次。在融解后,將PBMC置入孵箱(37℃,5%CO2)中2小時(shí)。溫育后,使細(xì)胞通過70μm滲濾器(Falcon)過濾,調(diào)節(jié)到濃度為2Mio/ml,以200000個(gè)PBMC/孔平板接種。
      PBMC與肽集合(其中含有終濃度為5μg/ml的每種單種肽)或者與終濃度為10μg/ml的個(gè)別肽共培養(yǎng)20小時(shí)。使用伴刀豆球蛋白A(SIGMA)多克隆誘導(dǎo)IFN-γ的分泌作為測(cè)定對(duì)照。自發(fā)的IFN-γ釋放如下測(cè)定溫育PBMC與單獨(dú)的培養(yǎng)基,或者由于僅篩選HIV陰性的供體,加入來自HIV的HLA 0201限制的CTL表位(HIV逆轉(zhuǎn)錄酶,aa 476-484ILKEPVHGV)。該篩選中包括通常識(shí)別來自流感基質(zhì)蛋白的HLA A 0201限制的CTL表位(aa 58-65GILGFVFTL)和EBVBMLF1抗原(aa 280-288GLCTLVAML)的肽,作為陽性對(duì)照。
      測(cè)定如段落“合成酶聯(lián)免疫印跡測(cè)定”所述顯色。
      HLA轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫在第一組免疫原性實(shí)驗(yàn)中,如下將摻入候選表位序列的較長合成肽注射到HLA-DRB1*0401-轉(zhuǎn)基因小鼠中每組3只小鼠(雌性小鼠,8周齡),一次皮下注射到后足墊中(每只小鼠總共300μg肽和5納摩爾CpG1668)。
      在第二組表位作圖實(shí)驗(yàn)中,合成的CMV衍生肽在HLA-DRB1*0401轉(zhuǎn)基因小鼠中如下檢測(cè)每組6只小鼠(雌性小鼠,8周齡),以一周間隔分3次皮下注射到脅部(每只小鼠總共100μg肽和一次50μl CFA、兩次50μlIFA)。
      在第三組表位作圖實(shí)驗(yàn)中,合成的CMV衍生肽在HLA-DRB1*0401轉(zhuǎn)基因小鼠中如下檢測(cè)每組8只小鼠(雌性小鼠,8周齡),一次皮下注射到后足墊中(對(duì)于肽1500,每只小鼠總共300μg肽和5納摩爾CpG1668,對(duì)于肽1503和1504,每只小鼠相同含量的肽和50μl IFA)。
      鼠脾細(xì)胞的分離和CD4+/CD8+T細(xì)胞的分離在最后一次注射后第7天取出脾臟,每組合并在一起。為了制備單細(xì)胞懸液,脾臟在補(bǔ)充了5%FCS、2mmole L-谷氨酰胺、50μg/ml慶大霉素、1%丙酮酸鈉、0.1%2-巰基乙醇和1%非必需氨基酸(PAA Laboratories,Linz,Austria)的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中破碎,并通過70μm細(xì)胞滲濾器過濾。細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中洗滌(1200轉(zhuǎn)/分,10分鐘),沉淀重懸浮于紅細(xì)胞裂解緩沖液(Sigma-Aldrich)中,溫育2分鐘除去紅細(xì)胞。洗滌后,用KOVA Glasstic載玻片(Hycor,Biomedical INC.)計(jì)數(shù)細(xì)胞,用完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為每ml 10×107、3.3×106、1.1×106個(gè)細(xì)胞的濃度。
      為了檢測(cè)可能表位的I類或II類限制,利用包括miniMACS和midiMACS柱和抗-CD4和抗-CD8磁珠(Miltenyi Biotec,Germany)的MACS分離系統(tǒng),按照廠商推薦的程序,將來自鼠脾臟的總細(xì)胞分為CD4+和CD8+群體。染色后通過FACS分析檢查CD4+和CD8+群體的純度,簡述如下來自總脾細(xì)胞、CD4+和CD8+級(jí)分的2×105細(xì)胞等份用抗CD8-PE(53-6-7)和抗CD4-FITC(RM4.4)抗體(PharMingen)在室溫下染色15分鐘。洗滌后,用FACS CALIBUR(BactonDickinson)分析樣品。來自幼稚DRB1*0401轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞用類似于實(shí)驗(yàn)樣品的方法染色,并且另外用同型對(duì)照抗體染色,根據(jù)單染色和雙染色的樣品調(diào)節(jié)FACS CALUBUR設(shè)置。
      鼠脾細(xì)胞IFN-γ釋放的ELISPOT測(cè)定ELISpot測(cè)定板(MAHA S4510,Millipore,Germany)用PBS(200μl/孔)漂洗,用抗小鼠IFN-γ(INF-γ)mAb(克隆R46A2,購自ATCC,Manassas,VA;50μl/孔1μg/ml,溶于0.1M NaHCO3,pH9.2-9.5)包被,4℃溫育過夜。用含有0.1%Tween-20的PBS洗板4次,與補(bǔ)充1%BSA(200μl/孔)的PBS在室溫下溫育2小時(shí),阻斷非特異性結(jié)合。細(xì)胞以1×106和3.3×105和1.1×105個(gè)細(xì)胞/孔的總量接種于100μl,在37℃/5%CO2下與分別加到孔中的10μg/ml(終濃度)不同刺激劑溫育過夜,孔中含有體積為100μl的細(xì)胞,這些刺激劑是用于接種的長肽(無關(guān)肽)或來源于長肽的重疊的15-mers,或并非用于接種的無關(guān)肽HA306-318(編號(hào)1171),或培養(yǎng)基對(duì)照。隨后,洗板4次,與生物素化抗小鼠IFN-γmAb(克隆AN18.17.24,購自ATCC,Manassas,VA;100ml/孔2μg/ml,溶于PBS/1%BSA)溫育,37℃2小時(shí)。洗滌后,加入100μl/孔用PBS(Roche Diagnostics,Vienna,Austria)1∶5000稀釋的鏈霉親和素-過氧化物酶,平板在37℃下再溫育1小時(shí)。之后,用PBS/0.1%Tween-20洗板4次,加入100μl/孔底物(10ml 10mM TrispH7.5,補(bǔ)充有200μl 40mg/ml DAB、50ml 80mg/ml NiCl2和5μl30%H2O2)。20-30分鐘后用自來水洗板終止反應(yīng)。干燥的平板用BIOREADER 2000(BioSys,Karben,Germany)和MICROSOFTOFFICE EXCEL程序分析。
      實(shí)施例I.肽混合物中的表位捕獲,以及通過質(zhì)譜法鑒定在該實(shí)施例中,從相對(duì)簡單的肽混合物中捕獲與HLA II類分子結(jié)合的高親和力肽的能力得到證明。
      首先,用直接結(jié)合測(cè)定檢測(cè)某些肽與可溶性DRB1*0401分子的結(jié)合親和力(圖1)。與眾所周知的“強(qiáng)”結(jié)合劑YAR和HA306-318相比較,肽親和力被定義為高或低(Valli等人(1993),SDS-穩(wěn)定性測(cè)定(表1)。1242肽的結(jié)合親和力被認(rèn)為是最高的,與YAR肽的親和力相當(dāng)。
      其次,檢測(cè)了從兩種高親和力配體的混合物中捕獲與HLA II類分子結(jié)合的肽的能力。結(jié)合反應(yīng)含有1μM可溶性DRB1*0401分子和各5μM YAR和1242肽。在HLA-肽復(fù)合物形成后,通過過濾層析使它們與過量的游離肽分離。收集含有MHC分子的級(jí)分。從復(fù)合物中洗脫結(jié)合的肽,通過質(zhì)譜法分析。讀數(shù)后,檢測(cè)的兩種高親和力配體都在與MHC分子的復(fù)合物中顯示(圖2)。
      第三,研究了過量的低親和力肽是否影響高親和力配體的結(jié)合能力。為此,在含量恒定(100μM)的低親和力肽1236存在下,1μMDRB1*0401分子與加入的濃度為5-50μM的1242肽進(jìn)行結(jié)合反應(yīng),使得1236比1242肽過量2-20倍。肽的結(jié)合通過SDS-穩(wěn)定性測(cè)定評(píng)價(jià),通過MS分析證實(shí)(圖3)。該實(shí)驗(yàn)表明20倍摩爾過量的低親和力肽不會(huì)阻礙與高親和力配體形成穩(wěn)定的MHC-復(fù)合物。
      最后,檢測(cè)10種不同結(jié)合親和力的肽的集合的結(jié)合(見表1)。除了1236肽以55μM的濃度加入以外,結(jié)合反應(yīng)中每種肽的終濃度均為5μM,這意味著每種單個(gè)結(jié)合肽的濃度比全部肽的終濃度低20倍。DRB1*0401分子以1μM的濃度加入。利用單種肽作為對(duì)照,如上所述評(píng)價(jià)MHC-肽復(fù)合物的形成(圖4)。純化DR4捕獲的肽,通過MS分析測(cè)序。分析結(jié)果產(chǎn)生具有最高結(jié)合親和力的兩種肽1242和YAR(見表1)。復(fù)合物中沒有發(fā)現(xiàn)中親和力和低親和力的肽,這可能是由于該測(cè)定中使用了高濃度的強(qiáng)競爭劑。但是當(dāng)結(jié)合肽的濃度降至0.5μM,使得加入的DR4分子比每種肽都過量時(shí),檢測(cè)到中親和力的肽(HA306-318)。這些結(jié)果證實(shí)了從肽混合物中捕獲一種以上的高親和力肽以及中結(jié)合親和力的肽的可能性。
      表1
      #“+++”高結(jié)合親和力;“++”中結(jié)合親和力;“+”低結(jié)合親和力;“-”不結(jié)合。
      實(shí)施例II.通過合成T細(xì)胞測(cè)定法測(cè)定針對(duì)捕獲的肽的T細(xì)胞應(yīng)答在該實(shí)施例中證實(shí),如實(shí)施例I所述鑒定的肽不僅結(jié)合MHC分子,而且能夠刺激T細(xì)胞,證實(shí)它們是T細(xì)胞表位。這一問題是相關(guān)的,因?yàn)殡呐cMHC分子的結(jié)合本身不能確保該肽“在體內(nèi)”是相關(guān)的。該肽在內(nèi)體蛋白酶(CD4+T細(xì)胞的抗原)或蛋白酶體(CD8+T細(xì)胞的抗原)加工“體內(nèi)”抗原過程中可能不產(chǎn)生。甚至“在體內(nèi)”加工并呈遞的肽能夠不刺激T細(xì)胞,代之以使其無反應(yīng)性(anergize)(拮抗劑)。當(dāng)讀取T細(xì)胞刺激時(shí),選擇一種IFN-γELISPOT測(cè)定。
      對(duì)于圖5a所述的實(shí)施例,來自HCV陰性、接種BCG的健康供體的CD4+T細(xì)胞從外周血中分離,與加載p1242和p84的sHLADRB1*0401共培養(yǎng),p84是一種HCV肽,用作陰性對(duì)照。加入抗CD28單克隆抗體實(shí)現(xiàn)共刺激。圖5a顯示誘導(dǎo)的IFN-γ斑的數(shù)量,每個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)刺激的T細(xì)胞。誘導(dǎo)的數(shù)量顯著高于含陰性對(duì)照肽的樣品中檢測(cè)到的自發(fā)IFN-γ分泌。
      為了顯示這不只是適用于MHC II類限制的肽,來自最近感染流感的HIV陰性、感染EBV的健康供體的CD8+T細(xì)胞與加載來自流感基質(zhì)蛋白或EBV BMLF1抗原的肽的sHLA A0201分子一起溫育。能夠檢測(cè)到針對(duì)兩種病毒肽的顯著的T細(xì)胞應(yīng)答(圖5b)。在與CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)之前溫育加載的sHLAA0201分子與抗HLAA0201抗體證明了該應(yīng)答的特異性。這種預(yù)溫育幾乎完全消除了IFN-γ分泌,在這些樣品中只檢測(cè)到自發(fā)的IFN-γ分泌。這些實(shí)施例證明,“在體內(nèi)”存在針對(duì)捕獲的肽的功能性T細(xì)胞,因此這些肽是表位,在疫苗中可能有用,誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。
      實(shí)施例III.通過測(cè)定以矩陣形式排列的肽集合對(duì)HLA結(jié)合肽的快速鑒定在證實(shí)了使用肽集合檢測(cè)各種結(jié)合肽的能力后,利用根據(jù)本發(fā)明的方法從CMV pp65抗原中鑒定能夠結(jié)合HLA II類分子的肽。為此,直接肽結(jié)合法與以前描述的肽集合陣列法(Kern等人,1999;Tobery等人,2001)相組合。
      為了覆蓋長560個(gè)氨基酸的完整pp65序列,設(shè)計(jì)了547種15mers,它們有14個(gè)氨基酸重疊。所有肽的序列都在表2中顯示。
      表2.覆蓋完整CMV pp65序列的重疊15-mer肽的序列肽編號(hào)序列 肽編號(hào) 序列肽編號(hào)序列1 MESRGRRCPEMISVL83 TGSEVENVSVNVHNP 165 GLAWTRQQNQWKEPD2 ESRGRRCPEMISVLG84 GSEVENVSVNVHNPT 166 LAWTRQQNQWKEPDV3 SRGRRCPEMISVLGP85 SEVENVSVNVHNPTG 167 AWTRQQNQWKEPDVY4 RGRRCPEMISVLGPI86 EVENVSVNVHNPTGR 168 WTRQQNQWKEPDVYY5 GRRCPEMISVLGPIS87 VENVSVNVHNPTGRS 169 TRQQNQWKEPDVYYT6 RRCPEMISVLGPISG88 ENVSVNVHNPTGRSI 170 RQQNQWKEPDVYYTS7 RCPEMISVLGPISGH89 NVSVNVHNPTGRSIC 171 QQNQWKEPDVYYTSA8 CPEMISVLGPISGHV90 VSVNVHNPTGRSICP 172 QNQWKEPDVYYTSAF9 PEMISVLGPISGHVL91 SVNVHNPTGRSICPS 173 NQWKEPDVYYTSAFV10EMISVLGPISGHVLK92 VNVHNPTGRSICPSQ 174 QWKEPDVYYTSAFVF11MISVLGPISGHVLKA93 NVHNPTGRSICPSQE 175 WKEPDVYYTSAFVFP12ISVLGPISGHVLKAV94 VHNPTGRSICPSQEP 176 KEPDVYYTSAFVFPT13SVLGPISGHVLKAVF95 HNPTGRSICPSQEPM 177 EPDVYYTSAFVFPTK14VLGPISGHVLKAVFS96 NPTGRSICPSQEPMS 178 PDVYYTSAFVFPTKD15LGPISGHVLKAVFSR97 PTGRSICPSQEPMSI 179 DVYYTSAFVFPTKDV16GPISGHVLKAVFSRG98 TGRSICPSQEPMSIY 180 VYYTSAFVFPTKDVA17PISGHVLKAVFSRGD99 GRSICPSQEPMSIYV 181 YYTSAFVFPTKDVAL18ISGHVLKAVFSRGDT100 RSICPSQEPMSIYVY 182 YTSAFVFPTKDVALR19SGHVLKAVFSRGDTP101 SICPSQEPMSIYVYA 183 TSAFVFPTKDVALRH20GHVLKAVFSRGDTPV102 ICPSQEPMSIYVYAL 184 SAFVFPTKDVALRHV21HVLKAVFSRGDTPVL103 CPSQEPMSIYVYALP 185 AFVFPTKDVALRHVV22VLKAVFSRGDTPVLP104 PSQEPMSIYVYALPL 186 FVFPTKDVALRHVVC23LKAVFSRGDTPVLPH105 SQEPMSIYVYALPLK 187 VFPTKDVALRHVVCA24KAVFSRGDTPVLPHE106 QEPMSIYVYALPLKM 188 FPTKDVALRHVVCAH25AVFSRGDTPVLPHET107 EPMSIYVYALPLKML 189 PTKDVALRHVVCAHE26VFSRGDTPVLPHETR108 PMSIYVYALPLKMLN 190 TKDVALRHVVCAHEL27FSRGDTPVLPHETRL109 MSIYVYALPLKMLNI 191 KDVALRHVVCAHELV28SRGDTPVLPHETRLL110 SIYVYALPLKMLNIP 192 DVALRHVVCAHELVC29RGDTPVLPHETRLLQ111 IYVYALPLKMLNIPS 193 VALRHVVCAHELVCS30GDTPVLPHETRLLQT112 YVYALPLKMLNIPSI 194 ALRHVVCAHELVCSM31DTPVLPHETRLLQTG113 VYALPLKMLNIPSIN 195 LRHVVCAHELVCSME32TPVLPHETRLLQTGI114 YALPLKMLNIPSINV 196 RHVVCAHELVCSMEN33PVLPHETRLLQTGIH115 ALPLKMLNIPSINVH 197 HVVCAHELVCSMENT34VLPHETRLLQTGIHV116 LPLKMLNIPSINVHH 198 VVCAHELVCSMENTR35LPHETRLLQTGIHVR117 PLKMLNIPSINVHHY 199 VCAHELVCSMENTRA36PHETRLLQTGIHVRV118 LKMLNIPSINVHHYP 200 CAHELVCSMENTRAT37HETRLLQTGIHVRVS119 KMLNIPSINVHHYPS 201 AHELVCSMENTRATK38ETRLLQTGIHVRVSQ120 MLNIPSINVHHYPSA 202 HELVCSMENTRATKM39TRLLQTGIHVRVSQP121 LNIPSINVHHYPSAA 203 ELVCSMENTRATKMQ40RLLQTGIHVRVSQPS122 NIPSINVHHYPSAAE 204 LVCSMENTRATKMQV41LLQTGIHVRVSQPSL123 IPSINVHHYPSAAER 205 VCSMENTRATKMQVI42LQTGIHVRVSQPSLI124 PSINVHHYPSAAERK 206 CSMENTRATKMQVIG43QTGIHVRVSQPSLIL125 SINVHHYPSAAERKH 207 SMENTRATKMQVIGD44TGIHVRVSQPSLILV126 INVHHYPSAAERKHR 208 MENTRATKMQVIGDQ45GIHVRVSQPSLILVS127 NVHHYPSAAERKHRH 209 ENTRATKMQVIGDQY46IHVRVSQPSLILVSQ128 VHHYPSAAERKHRHL 210 NTRATKMQVIGDQYV47HVRVSQPSLILVSQY129 HHYPSAAERKHRHLP 211 TRATKMQVIGDQYVK48VRVSQPSLILVSQYT130 HYPSAAERKHRHLPV 212 RATKMQVIGDQYVKV49RVSQPSLILVSQYTP131 YPSAAERKHRHLPVA 213 ATKMQVIGDQYVKVY50VSQPSLILVSQYTPD132 PSAAERKHRHLPVAD 214 TKMQVIGDQYVKVYL51SQPSLILVSQYTPDS133 SAAERKHRHLPVADA 215 KMQVIGDQYVKVYLE52QPSLILVSQYTPDST134 AAERKHRHLPVADAV 216 MQVIGDQYVKVYLES53PSLILVSQYTPDSTP135 AERKHRHLPVADAVI 217 QVIGDQYVKVYLESF54SLILVSQYTPDSTPC136 ERKHRHLPVADAVIH 218 VIGDQYVKVYLESFC55LILVSQYTPDSTPCH137 RKHRHLPVADAVIHA 219 IGDQYVKVYLESFCE56ILVSQYTPDSTPCHR138 KHRHLPVADAVIHAS 220 GDQYVKVYLESFCED57LVSQYTPDSTPCHRG139 HRHLPVADAVIHASG 221 DQYVKVYLESFCEDV58VSQYTPDSTPCHRGD140 RHLPVADAVIHASGK 222 QYVKVYLESFCEDVP
      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肽編號(hào)序列 肽編號(hào) 序列 肽編號(hào) 序列247 GSDVEEDLTMTRNPQ329EVQAIRETVELRQYD411VTTERKTPRVTGGGA248 SDVEEDLTMTRNPQP330VQAIRETVELRQYDP412TTERKTPRVTGGGAM249 DVEEDLTMTRNPQPF331QAIRETVELRQYDPV413TERKTPRVTGGGAMA250 VEEDLTMTRNPQPFM332AIRETVELRQYDPVA414ERKTPRVTGGGAMAG251 EEDLTMTRNPQPFMR333IRETVELRQYDPVAA415RKTPRVTGGGAMAGA252 EDLTMTRNPQPFMRP334RETVELRQYDPVAAL416KTPRVTGGGAMAGAS253 DLTMTRNPQPFMRPH335ETVELRQYDPVAALF417TPRVTGGGAMAGAST254 LTMTRNPQPFMRPHE336TVELRQYDPVAALFF418PRVTGGGAMAGASTS255 TMTRNPQPFMRPHER337VELRQYDPVAALFFF419RVTGGGAMAGASTSA256 MTRNPQPFMRPHERN338ELRQYDPVAALFFFD420VTGGGAMAGASTSAG257 TRNPQPFMRPHERNG339LRQYDPVAALFFFDI421TGGGAMAGASTSAGR258 RNPQPFMRPHERNGF340RQYDPVAALFFFDID422GGGAMAGASTSAGRK259 NPQPFMRPHERNGFT341QYDPVAALFFFDIDL423GGAMAGASTSAGRKR260 PQPFMRPHERNGFTV342YDPVAALFFFDIDLL424GAMAGASTSAGRKRK261 QPFMRPHERNGFTVL343DPVAALFFFDIDLLL425AMAGASTSAGRKRKS262 PFMRPHERNGFTVLC344PVAALFFFDIDLLLQ426MAGASTSAGRKRKSA263 FMRPHERNGFTVLCP345VAALFFFDIDLLLQR427AGASTSAGRKRKSAS264 MRPHERNGFTVLCPK346AALFFFDIDLLLQRG428GASTSAGRKRKSASS265 RPHERNGFTVLCPKN347ALFFFDIDLLLQRGP429ASTSAGRKRKSASSA266 PHERNGFTVLCPKNM348LFFFDIDLLLQRGPQ430STSAGRKRKSASSAT267 HERNGFTVLCPKNMI349FFFDIDLLLQRGPQY431TSAGRKRKSASSATA268 ERNGFTVLCPKNMII350FFDIDLLLQRGPQYS432SAGRKRKSASSATAC269 RNGFTVLCPKNMIIK351FDIDLLLQRGPQYSE433AGRKRKSASSATACT270 NGFTVLCPKNMIIKP352DIDLLLQRGPQYSEH434GRKRKSASSATACTS271 GFTVLCPKNMIIKPG353IDLLLQRGPQYSEHP435RKRKSASSATACTSG272 FTVLCPKNMIIKPGK354DLLLQRGPQYSEHPT436KRKSASSATACTSGV273 TVLCPKNMIIKPGKI355LLLQRGPQYSEHPTF437RKSASSATACTSGVM274 VLCPKNMIIKPGKIS356LLQRGPQYSEHPTFT438KSASSATACTSGVMT275 LCPKNMIIKPGKISH357LQRGPQYSEHPTFTS439SASSATACTSGVMTR276 CPKNMIIKPGKISHI358QRGPQYSEHPTFTSQ440ASSATACTSGVMTRG277 PKNMIIKPGKISHIM359RGPQYSEHPTFTSQY441SSATACTSGVMTRGR278 KNMIIKPGKISHIML360GPQYSEHPTFTSQYR442SATACTSGVMTRGRL279 NMIIKPGKISHIMLD361PQYSEHPTFTSQYRI443ATACTSGVMTRGRLK280 MIIKPGKISHIMLDV362QYSEHPTFTSQYRIQ444TACTSGVMTRGRLKA281 IIKPGKISHIMLDVA363YSEHPTFTSQYRIQG445ACTSGVMTRGRLKAE
      282 IKPGKISHIMLDVAF 364 SEHPTFTSQYRIQGK 446 CTSGVMTRGRLKAES283 KPGKISHIMLDVAFT 365 EHPTFTSQYRIQGKL 447 TSGVMTRGRLKAEST284 PGKISHIMLDVAFTS 366 HPTFTSQYRIQGKLE 448 SGVMTRGRLKAESTV285 GKISHIMLDVAFTSH 367 PTFTSQYRIQGKLEY 449 GVMTRGRLKAESTVA286 KISHIMLDVAFTSHE 368 TFTSQYRIQGKLEYR 450 VMTRGRLKAESTVAP287 ISHIMLDVAFTSHEH 369 FTSQYRIQGKLEYRH 451 MTRGRLKAESTVAPE288 SHIMLDVAFTSHEHF 370 TSQYRIQGKLEYRHT 452 TRGRLKAESTVAPEE289 HIMLDVAFTSHEHFG 371 SQYRIQGKLEYRHTW 453 RGRLKAESTVAPEED290 IMLDVAFTSHEHFGL 372 QYRIQGKLEYRHTWD 454 GRLKAESTVAPEEDT291 MLDVAFTSHEHFGLL 373 YRIQGKLEYRHTWDR 455 RLKAESTVAPEEDTD292 LDVAFTSHEHFGLLC 374 RIQGKLEYRHTWDRH 456 LKAESTVAPEEDTDE293 DVAFTSHEHFGLLCP 375 IQGKLEYRHTWDRHD 457 KAESTVAPEEDTDED294 VAFTSHEHFGLLCPK 376 QGKLEYRHTWDRHDE 458 AESTVAPEEDTDEDS295 AFTSHEHFGLLCPKS 377 GKLEYRHTWDRHDEG 459 ESTVAPEEDTDEDSD296 FTSHEHFGLLCPKSI 378 KLEYRHTWDRHDEGA 460 STVAPEEDTDEDSDN297 TSHEHFGLLCPKSIP 379 LEYRHTWDRHDEGAA 461 TVAPEEDTDEDSDNE298 SHEHFGLLCPKSIPG 380 EYRHTWDRHDEGAAQ 462 VAPEEDTDEDSDNEI299 HEHFGLLCPKSIPGL 381 YRHTWDRHDEGAAQG 463 APEEDTDEDSDNEIH300 EHFGLLCPKSIPGLS 382 RHTWDRHDEGAAQGD 464 PEEDTDEDSDNEIHN301 HFGLLCPKSIPGLSI 383 HTWDRHDEGAAQGDD 465 EEDTDEDSDNEIHNP302 FGLLCPKSIPGLSIS 384 TWDRHDEGAAQGDDD 466 EDTDEDSDNEIHNPA303 GLLCPKSIPGLSISG 385 WDRHDEGAAQGDDDV 467 DTDEDSDNEIHNPAV304 LLCPKSIPGLSISGN 386 DRHDEGAAQGDDDVW 468 TDEDSDNEIHNPAVF305 LCPKSIPGLSISGNL 387 RHDEGAAQGDDDVWT 469 DEDSDNEIHNPAVFT306 CPKSIPGLSISGNLL 388 HDEGAAQGDDDVWTS 470 EDSDNEIHNPAVFTW307 PKSIPGLSISGNLLM 389 DEGAAQGDDDVWTSG 471 DSDNEIHNPAVFTWP308 KSIPGLSISGNLLMN 390 EGAAQGDDDVWTSGS 472 SDNEIHNPAVFTWPP309 SIPGLSISGNLLMNG 391 GAAQGDDDVWTSGSD 473 DNEIHNPAVFTWPPW310 IPGLSISGNLLMNGQ 392 AAQGDDDVWTSGSDS 474 NEIHNPAVFTWPPWQ311 PGLSISGNLLMNGQQ 393 AQGDDDVWTSGSDSD 475 EIHNPAVFTWPPWQA312 GLSISGNLLMNGQQI 394 QGDDDVWTSGSDSDE 476 IHNPAVFTWPPWQAG313 LSISGNLLMNGQQIF 395 GDDDVWTSGSDSDEE 477 HNPAVFTWPPWQAGI314 SISGNLLMNGQQIFL 396 DDDVWTSGSDSDEEL 478 NPAVFTWPPWQAGIL315 ISGNLLMNGQQIFLE 397 DDVWTSGSDSDEELV 479 PAVFTWPPWQAGILA316 SGNLLMNGQQIFLEV 398 DVWTSGSDSDEELVT 480 AVFTWPPWQAGILAR317 GNLLMNGQQIFLEVQ 399 VWTSGSDSDEELVTT 481 VFTWPPWQAGILARN318 NLLMNGQQIFLEVQA 400 WTSGSDSDEELVTTE 482 FTWPPWQAGILARNL319 LLMNGQQIFLEVQAI 401 TSGSDSDEELVTTER 483 TWPPWQAGILARNLV320 LMNGQQIFLEVQAIR 402 SGSDSDEELVTTERK 484 WPPWQAGILARNLVP321 MNGQQIFLEVQAIRE 403 GSDSDEELVTTERKT 485 PPWQAGILARNLVPM322 NGQQIFLEVQAIRET 404 SDSDEELVTTERKTP 486 PWQAGILARNLVPMV323 GQQIFLEVQAIRETV 405 DSDEELVTTERKTPR 487 WQAGILARNLVPMVA324 QQIFLEVQAIRETVE 406 SDEELVTTERKTPRV 488 QAGILARNLVPMVAT325 QIFLEVQAIRETVEL 407 DEELVTTERKTPRVT 489 AGILARNLVPMVATV326 IFLEVQAIRETVELR 408 EELVTTERKTPRVTG 490 GILARNLVPMVATVQ327 FLEVQAIRETVELRQ 409 ELVTTERKTPRVTGG 491 ILARNLVPMVATVQG328 LEVQAIRETVELRQY 410 LVTTERKTPRVTGGG 492 LARNLVPMVATVQGQ肽編號(hào)序列 肽編號(hào)序列 肽編號(hào)序列493 ARNLVPMVATVQGQN 520 IYRIFAELEGVWQPA 544 QDALPGPCIASTPKK494 RNLVPMVATVQGQNL 521 YRIFAELEGVWQPAA 545 DALPGPCIASTPKKH495 NLVPMVATVQGQNLK 522 RIFAELEGVWQPAAQ 546 ALPGPCIASTPKKHR496 LVPMVATVQGQNLKY 523 IFAELEGVWQPAAQP 547 LPGPCIASTPKKHRG497 VPMVATVQGQNLKYQ 524 FAELEGVWQPAAQPK498 PMVATVQGQNLKYQE 525 AELEGVWQPAAQPKR499 MVATVQGQNLKYQEF 526 ELEGVWQPAAQPKRR500 VATVQGQNLKYQEFF 527 LEGVWQPAAQPKRRR501 ATVQGQNLKYQEFFW 528 EGVWQPAAQPKRRRH502 TVQGQNLKYQEFFWD 529 GVWQPAAQPKRRRHR503 VQGQNLKYQEFFWDA 530 VWQPAAQPKRRRHRQ
      504 QGQNLKYQEFFWDAN 531 WQPAAQPKRRRHRQD505 GQNLKYQEFFWDAND 532 QPAAQPKRRRHRQDA506 QNLKYQEFFWDANDI 533 PAAQPKRRRHRQDAL507 NLKYQEFFWDANDIY 534 AAQPKRRRHRQDALP508 LKYQEFFWDANDIYR 535 AQPKRRRHRQDALPG509 KYQEFFWDANDIYRI 536 QPKRRRHRQDALPGP510 YQEFFWDANDIYRIF 537 PKRRRHRQDALPGPC511 QEFFWDANDIYRIFA 538 KRRRHRQDALPGPCI512 EFFWDANDIYRIFAE 539 RRRHRQDALPGPCIA513 FFWDANDIYRIFAEL 540 RRHRQDALPGPCIAS514 FWDANDIYRIFAELE 541 RHRQDALPGPCIAST515 WDANDIYRIFAELEG 542 HRQDALPGPCIASTP516 DANDIYRIFAELEGV 543 RQDALPGPCIASTPK517 ANDIYRIFAELEGVW 544 QDALPGPCIASTPKK518 NDIYRIFAELEGVWQ 545 DALPGPCIASTPKKH519 DIYRIFAELEGVWQP 546 ALPGPCIASTPKKHR520 IYRIFAELEGVWQPA 547 LPGPCIASTPKKHRG521 YRIFAELEGVWQPAA 519 DIYRIFAELEGVWQP522 RIFAELEGVWQPAAQ 520 IYRIFAELEGVWQPA523 IFAELEGVWQPAAQP 521 YRIFAELEGVWQPAA524 FAELEGVWQPAAQPK 522 RIFAELEGVWQPAAQ525 AELEGVWQPAAQPKR 523 IFAELEGVWQPAAQP526 ELEGVWQPAAQPKRR 524 FAELEGVWQPAAQPK527 LEGVWQPAAQPKRRR 525 AELEGVWQPAAQPKR528 EGVWQPAAQPKRRRH 526 ELEGVWQPAAQPKRR529 GVWQPAAQPKRRRHR 527 LEGVWQPAAQPKRRR530 VWQPAAQPKRRRHRQ 528 EGVWQPAAQPKRRRH531 WQPAAQPKRRRHRQD 529 GVWQPAAQPKRRRHR532 QPAAQPKRRRHRQDA 530 VWQPAAQPKRRRHRQ533 PAAQPKRRRHRQDAL 531 WQPAAQPKRRRHRQD534 AAQPKRRRHRQDALP 532 QPAAQPKRRRHRQDA535 AQPKRRRHRQDALPG 533 PAAQPKRRRHRQDAL536 QPKRRRHRQDALPGP 534 AAQPKRRRHRQDALP537 PKRRRHRQDALPGPC 535 AQPKRRRHRQDALPG538 KRRRHRQDALPGPCI 536 QPKRRRHRQDALPGP539 RRRHRQDALPGPCIA 537 PKRRRHRQDALPGPC540 RRHRQDALPGPCIAS 538 KRRRHRQDALPGPCI541 RHRQDALPGPCIAST 539 RRRHRQDALPGPCIA542 HRQDALPGPCIASTP 540 RRHRQDALPGPCIAS543 RQDALPGPCIASTPK 541 RHRQDALPGPCIAST544 QDALPGPCIASTPKK 542 HRQDALPGPCIASTP545 DALPGPCIASTPKKH 543 RQDALPGPCIASTPK546 ALPGPCIASTPKKHR 544 QDALPGPCIASTPKK547 LPGPCIASTPKKHRG 545 DALPGPCIASTPKKH493 ARNLVPMVATVQGQN 546 ALPGPCIASTPKKHR494 RNLVPMVATVQGQNL 547 LPGPCIASTPKKHRG495 NLVPMVATVQGQNLK 519 DIYRIFAELEGVWQP496 LVPMVATVQGQNLKY 520 IYRIFAELEGVWQPA497 VPMVATVQGQNLKYQ 521 YRIFAELEGVWQPAA498 PMVATVQGQNLKYQE 522 RIFAELEGVWQPAAQ499 MVATVQGQNLKYQEF 523 IFAELEGVWQPAAQP500 VATVQGQNLKYQEFF 524 FAELEGVWQPAAQPK501 ATVQGQNLKYQEFFW 525 AELEGVWQPAAQPKR502 TVQGQNLKYQEFFWD 526 ELEGVWQPAAQPKRR503 VQGQNLKYQEFFWDA 527 LEGVWQPAAQPKRRR504 QGQNLKYQEFFWDAN 528 EGVWQPAAQPKRRRH505 GQNLKYQEFTWDAND 529 GVWQPAAQPKRRRHR506 QNLKYQEFFWDANDI 530 VWQPAAQPKRRRHRQ507 NLKYQEFFWDANDIY 531 WQPAAQPKRRRHRQD508 LKYQEFFWDANDIYR 532 QPAAQPKRRRHRQDA509 KYQEFFWDANDIYRI 533 PAAQPKRRRHRQDAL510 YQEFFWDANDIYRIF 534 AAQPKRRRHRQDALP
      511 QEFFWDANDIYRIFA535 AQPKRRRHRQDALPG512 EFFWDANDIYRIFAE536 QPKRRRHRQDALPGP513 FFWDANDIYRIFAEL537 PKRRRHRQDALPGPC514 FWDANDIYRIFAELE538 KRRRHRQDALPGPCI515 WDANDIYRIFAELEG539 RRRHRQDALPGPCIA516 DANDIYRIFAELEGV540 RRHRQDALPGPCIAS517 ANDIYRIFAELEGVW541 RHRQDALPGPCIAST518 NDIYRIFAELEGVWQ542 HRQDALPGPCIASTP519 DIYRIFAELEGVWQP543 RQDALPGPCIASTPK由于要檢測(cè)大量的肽,這些肽組合成42個(gè)集合,每個(gè)集合含有以矩陣形式排列的21種肽,如圖6所示。制備混合物,使得每一種肽恰好包含于一“行”集合和一“列”集合中。
      通過SDS-穩(wěn)定性測(cè)定檢測(cè)每個(gè)矩陣集合與DR4分子的結(jié)合親和力;HA306-318用作參照肽(圖7a)。在第一次篩選中,發(fā)現(xiàn)42個(gè)陽性肽集合中的18個(gè)來自“行”集合的2、3、6、15、16、19、20號(hào)和來自“列”集合的28-38號(hào)(參見圖6)。通過發(fā)現(xiàn)陣列中反應(yīng)性集合的交叉,確定77種肽為可能的結(jié)合劑。然后檢測(cè)每個(gè)15mer分別與DR4分子的結(jié)合(圖7b,表3)。因此,在第一次篩選中選擇的20種肽在第二次篩選中證實(shí)是結(jié)合劑。在陣列的行中通常發(fā)現(xiàn)一種以上的陽性肽。這些重疊14個(gè)氨基酸的肽可能代表被CD4+T細(xì)胞上TCR受體識(shí)別的較長的表位。
      以前描述了4種含有部分或全部相同序列的肽(肽177、361、507、508),能夠在暴露于CMV的健康人類受試者中引發(fā)特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答(Khattab等人,1997;Bitmansour等人,2001)。這證實(shí)了我們的方法的有效性。
      一些鑒定的DRB1*0401結(jié)合肽,以及通過預(yù)測(cè)算法選擇的其它肽,也檢測(cè)它們與下列不同等位基因的可溶性HLA分子的結(jié)合DRB1*0101、DRB1*0404、DRB1*0701和DRB1*1101(表3)。證明有7種肽(58、177、559、360、452、470和496)具有對(duì)至少兩種HLA分子的親和力,這支持這些表位的混雜性(promiscuity)。
      也發(fā)現(xiàn)與DRB1*0404結(jié)合的3種肽(421、469和470)能誘導(dǎo)來自CMV血清陽性供體的T細(xì)胞分泌IFN-γ(參見實(shí)施例IV),再次表明這第二種反向免疫學(xué)方法也能鑒定真正的T細(xì)胞表位。
      總之,鑒定了來源于CMV pp65抗原的幾個(gè)新序列,它們能夠與HLA II類分子結(jié)合,考慮作為II類表位的候選物(表3中帶陰影的)。包含所述表位的肽的免疫原性,以及它們的CD4+特異性,通過檢測(cè)它們?cè)趤碜泽w內(nèi)地刺激CMV血清陽性供體和/或HLA-DRB1*0401轉(zhuǎn)基因小鼠的T細(xì)胞后誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生的能力得到證實(shí)(參見實(shí)施例V、VI和VII)。
      表3.CMV pp65蛋白的各種15mer肽與可溶性HLA分子的結(jié)合。新鑒定的結(jié)合劑帶有陰影。
      #“-”未結(jié)合;“+/-”弱結(jié)合;“+”中度結(jié)合;“++”強(qiáng)結(jié)合;“nd”未測(cè)定。肽不溶于水。
      實(shí)施例IV通過測(cè)定對(duì)排列為矩陣的15-mer肽集合的細(xì)胞因子應(yīng)答對(duì)T細(xì)胞表位的鑒定,以及各種肽的證實(shí)設(shè)計(jì)547種肽,每種肽由15個(gè)氨基酸組成,15個(gè)氨基酸中的14個(gè)與其前體重疊,覆蓋CMV pp65抗原的完整序列。所有肽的序列都在表2中顯示。
      因?yàn)榭梢垣@得的用于篩選T細(xì)胞應(yīng)答的PBMC的數(shù)量通常有限,肽不單個(gè)使用,而是與以矩陣形式排列的列集合或行集合組合(圖6)。首先,各種肽以5mg/ml的濃度溶解于100%DMSO中。然后制備21種肽的混合物,使得每種肽恰好包含于2個(gè)集合中。為了再刺激人PBMC,肽混合物用測(cè)定培養(yǎng)基稀釋,使得每種肽的終濃度為5μg/ml。該濃度高于Maecker等人(Maecker論文)發(fā)現(xiàn)對(duì)于CD4和CD8陽性T細(xì)胞應(yīng)答而言飽和的1.75μg/ml的濃度。每個(gè)樣品中DMSO的終濃度為2.1%。
      總之,來自10名CMV血清陽性、HLA-A2陽性的健康供體的PBMC用于篩查圖6所示的42個(gè)肽集合。為了證實(shí)通常短于15個(gè)氨基酸的I類表位是否在15mer肽內(nèi)被適當(dāng)識(shí)別,以及高DMSO含量不損害T細(xì)胞的激活和功能,在每次篩選中包含一種良好表征的來自CMV pp65的免疫顯性CD8限制的9-mer表位(NLVPMVATV,位點(diǎn)495-503),其濃度為10μg/ml(DMSO終濃度為0.1%)。
      當(dāng)讀取T細(xì)胞再激活時(shí),使用人IFN-γElispot。圖8a顯示與極少肽集合反應(yīng)的供體。陽性列與行集合的交叉點(diǎn)鑒定肽490-492。這3種肽含有良好表征的免疫顯性CD8限制的9-mer最小表位NLVPMVATV,位點(diǎn)495-503。這些肽集合引發(fā)的應(yīng)答大部分等于9-mer最小表位引發(fā)的應(yīng)答(圖8a)。這表明,較短的表位在15-mer肽內(nèi)被適當(dāng)識(shí)別,高DMSO含量不損害T細(xì)胞應(yīng)答。
      大多數(shù)其它供體顯示針對(duì)幾種表位的更復(fù)雜的應(yīng)答。一個(gè)例子如圖8b所示。用所有10名供體進(jìn)行的第一次篩選的結(jié)果總結(jié)于表4中。
      表4.第一次篩選的總結(jié)
      在第二次篩選中,重新檢測(cè)對(duì)應(yīng)于陽性行和列集合的交叉點(diǎn)的所有肽。在此情況下,相同供體的PBMC與終濃度為20μg/ml的各種肽溫育20小時(shí)。再次用人IFN-γElispot測(cè)定讀取T細(xì)胞再激活。
      圖9顯示供體10736的結(jié)果,他在第一次篩選中鑒定為一名具有高度集中的T細(xì)胞應(yīng)答的個(gè)體(圖8a)。用肽489-495重新檢測(cè)證實(shí)了肽490-492的反應(yīng)性,另外也鑒定了肽493是IFN-γ分泌的誘導(dǎo)劑。對(duì)15mer肽的反應(yīng)程度與9-mer最小表位相當(dāng)。在第一次篩選中包括隨機(jī)選擇的對(duì)應(yīng)于陰性行和列混合物的交叉點(diǎn)的肽作為陰性對(duì)照;不誘導(dǎo)任何IFN-γ分泌(圖9)。
      這第二次篩選的全部結(jié)果和由它確定的所有表位都總結(jié)于表5(表位已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述)和表6(新型表位通過根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定)中。
      在已知的表位中,引人注目的是,良好表征的CD8限制的9-mer最小表位(NLVPMVATV,位點(diǎn)495-503)在10名供體中的9名中被識(shí)別,證明它是CMV pp65抗原中最常被識(shí)別的HLA-A*0201限制的表位之一。在10名HLA A2供體中,有2名也表達(dá)HLA-B7。根據(jù)文獻(xiàn)已知兩種HLA-B7限制的表位pp65 265-274和pp65 417-426。這兩種都在HLA B7陽性供體中發(fā)現(xiàn),特別是pp65 417-426表位似乎比HLA-A*0201限制的pp65 495-503表位誘導(dǎo)更多的IFN-γ分泌。該數(shù)據(jù)與下列發(fā)現(xiàn)相一致對(duì)CMV pp65抗原的T細(xì)胞應(yīng)答與HLA-A2和/或HLA-B7表位的表達(dá)強(qiáng)烈相關(guān)(Eur.J.Immunol.,2000,30,2531-2539)。除了這些所謂的“免疫顯性”表位之外,再次發(fā)現(xiàn)了pp65內(nèi)描述的大多數(shù)其它表位(表5)。這證明該方法既是非常靈敏的又是廣泛適用的,因此適于檢測(cè)免疫顯性和亞顯性的表位。
      表5a.發(fā)現(xiàn)的表位與文獻(xiàn)中所知的I類表位的比較
      1)重新發(fā)現(xiàn)的數(shù)量/表達(dá)各自HLA類型的供體的數(shù)量表5b.發(fā)現(xiàn)的表位與文獻(xiàn)已知的II類表位的比較
      1)沒有關(guān)于供體的MHC II類表型的信息可以獲得。
      表6列出了如實(shí)施例I和II所述通過根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定的所有新型T細(xì)胞表位。
      第一組表位(肽262、394、395、411、415、416、417)含有已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述為T細(xì)胞表位的序列,雖然它們具有與此處發(fā)現(xiàn)的不同的HLA限制。這些結(jié)果表明,這些表位在與以前所知不同的HLA內(nèi)容中也能夠被T細(xì)胞識(shí)別。該發(fā)現(xiàn)是新的發(fā)現(xiàn),擴(kuò)展了這些肽的有效性,例如作為適用于表達(dá)這些具體HLA的個(gè)體的疫苗的一部分。
      第二組表位(肽213、214和216)已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述為與HLA-A*0201分子結(jié)合,然而在我們的工作之前,沒有數(shù)據(jù)證明這些肽能夠激活T細(xì)胞。一種肽的結(jié)合是被T細(xì)胞激活/識(shí)別的前提條件,但是不能確保這種激活/識(shí)別。首先,一種抗原內(nèi)不是所有可能的肽序列都同樣較好地產(chǎn)生,或者在體內(nèi)抗原加工和呈遞過程中根本不產(chǎn)生。因此,與HLA結(jié)合的合成肽不一定是一種天然存在的表位。即使通過主動(dòng)接種能夠引發(fā)針對(duì)這些肽的T細(xì)胞,它們也不能用于對(duì)抗病原體,因?yàn)楦腥镜募?xì)胞不在其表面展示這些肽。其次,即使結(jié)合的肽對(duì)應(yīng)于一種天然存在的表位,這也不能確保它能夠誘導(dǎo)功能性T細(xì)胞。相反,某些肽能夠作為拮抗劑,使T細(xì)胞無反應(yīng)性。這些數(shù)據(jù)第一次顯示,由于病毒感染,這些肽能夠在人體中誘導(dǎo)分泌IFN-γ的功能性T細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)是新的發(fā)現(xiàn),為針對(duì)CMV的疫苗中包含這些肽提供了理論基礎(chǔ)。
      第三組表位(肽211、476、477、479、421、422、423、424、469、470、503、506)迄今為止根本沒有描述。由于這些數(shù)據(jù)顯示,由于病毒感染,這些肽能夠誘導(dǎo)的分泌IFN-γ的功能性T細(xì)胞,它們本身就是或者在其序列內(nèi)含有新的T細(xì)胞表位。它們尤其可用于包含于針對(duì)CMV的疫苗中。
      由于該實(shí)施例描述的篩選使用全部PBMC,因此分析對(duì)所有15mers的全部T細(xì)胞應(yīng)答。該應(yīng)答可能限于各自供體表達(dá)的任何一種HLA-等位基因。在每種情況下包括HLA-A、-B、-C(I類)和HLA-DR、-DP、-DQ(II類)中的至少兩種可能的等位基因。為了進(jìn)一步表征此處提供的新型表位,人們可以定義這些表位的準(zhǔn)確HLA限制,和T細(xì)胞識(shí)別的序列內(nèi)的最小表位。它們都能用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種已經(jīng)建立的方法完成(《現(xiàn)代免疫學(xué)方法》(Current Protocols inImmunology),John Wiley &amp; Sons,Inc.)。
      首先,能夠利用可以公開獲得的程序根據(jù)結(jié)合基序預(yù)測(cè)T細(xì)胞表位。例如包括http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/(Parker等人1994),http://134.2.96.221/scripts/MHCServer.dll/home.htm(Rammensee等人1999),http://mypage.ihost.com/usinet.hamme76/(Sturniolo等人1999)。后一種預(yù)測(cè)算法使得可能鑒定混雜的T輔助表位,即可與幾種HLA II類分子結(jié)合的肽。用最高概率預(yù)測(cè)的各自的HLA分子在表4中列出。通過檢測(cè)肽與各自HLA的結(jié)合能夠證實(shí)這些預(yù)測(cè)。對(duì)于預(yù)測(cè)可能是II類表位的序列,檢測(cè)它們與DRB1*0101、*0401和*0404分子的結(jié)合(見實(shí)施例III)。發(fā)現(xiàn)肽421、469、470(覆蓋氨基酸421-438、469-484和470-485)與DRB1*0404結(jié)合(見表5)。
      快速辨別對(duì)一種肽的應(yīng)答是I類還是II類限制的一種方法是用純CD4+或CD8+T效應(yīng)細(xì)胞群體重復(fù)ELIspot測(cè)定。其實(shí)現(xiàn)方法例如是利用磁性細(xì)胞分選分離各自的亞組。純CD8+T細(xì)胞也能夠與只表達(dá)一種目的HLA分子的人工抗原呈遞細(xì)胞一起在ELIspot測(cè)定中檢測(cè)。一個(gè)例子是HLA-A*0201陽性T2細(xì)胞(174CEM.T2,Nijman等人,1993)。此外,也能夠在特異阻斷CD4+或CD8+T細(xì)胞亞群的單克隆抗體存在下,用全PBMC進(jìn)行ELIspot測(cè)定。準(zhǔn)確的HLA限制能夠用類似的方法測(cè)定,使用對(duì)某種等位基因特異的阻斷單克隆抗體。例如,加入HLA-A24特異的單克隆抗體能夠特異地阻斷對(duì)HLA-A24限制的表位的應(yīng)答。
      為了確定T細(xì)胞識(shí)別的肽序列內(nèi)的最小表位,例如能夠合成一系列重疊的和截短的肽(例如8-、9-、10-mers)并分別重新檢測(cè)。實(shí)施例V通過T2-ELIspot對(duì)新型HLA-A*0201表位的證實(shí)為了證實(shí)預(yù)測(cè)的陽性15mer內(nèi)的HLA-A2表位,合成9-或10-mer肽,并分別檢測(cè)。用T2細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞以及從幾名供體中分離的CD8+T細(xì)胞進(jìn)行ELIspot測(cè)定。在該設(shè)置中,只有從外部與HLA-A*0201結(jié)合的最佳長度的表位能夠觸發(fā)IFN-γ分泌。有5種新HLA-A*0201表位能夠用這種方法證實(shí)(表6)。該測(cè)定如前所述進(jìn)行(Herr 1997)。簡言之,T2細(xì)胞(Nijman 1993)在ELIspot培養(yǎng)基中生長(參見M&amp;M部分),在使用前3天調(diào)節(jié)為4×105/ml。在洗滌2次后(PBS;1%人白蛋白,來自SIGMA),細(xì)胞以2.5×106/ml的濃度接種到ELIspot培養(yǎng)基中,加入10μg/ml肽培養(yǎng)過夜。次日,T2細(xì)胞用ELIspot培養(yǎng)基洗滌一次,100μl(1×106T2細(xì)胞/ml)接種包被并封閉的ELIspot板(見上),其中補(bǔ)充了20μg/ml肽。為了分離CD8+淋巴細(xì)胞,1×107PBMNC與20μl抗人CD8+微珠(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)混合,終體積為100μl,在冰上溫育15分鐘。之后,細(xì)胞用過量的MACS緩沖液洗滌10次,CD8+細(xì)胞在磁性微型柱(Miltenyi)上分離。每孔加入調(diào)節(jié)為1×106c/ml的100μl CD8+淋巴細(xì)胞。在培養(yǎng)20小時(shí)后,用PBS,0.05%Tween 20洗滌4次分離細(xì)胞,如M&amp;M部分所述進(jìn)行測(cè)定。
      表6針對(duì)HLA-A*0201限制的CMV pp65表位的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答,通過對(duì)IFN-γ的T2 ELIspot測(cè)定評(píng)價(jià)。
      1)除第一次矩陣篩選外新血液抽取3-6個(gè)月2)新表位以黑體字顯示3)每100,000個(gè)CD8+T細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)量;<低于背景(含HIV陰性對(duì)照肽的斑點(diǎn))加兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。
      實(shí)施例VI使用人PBMC通過表位捕獲方法鑒定的新型II類(HLA-DR4)表位的證實(shí)其中,15mer 55-61通過表位捕獲法確定為可溶性HLA-DRB1*0401的強(qiáng)結(jié)合劑(圖7a,7b)。各種重疊15mer 55-61的結(jié)合確定氨基酸序列YTPDSTPCH為LILVSQYTPDSTPCHRGDNQL的核心結(jié)合區(qū),它可含有幾種形式的II類表位。眾所周知,II類表位含有可變長度的末端,伸出于MHC結(jié)合溝槽。有趣的是,供體10788顯示對(duì)15mer 57和59的強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答(圖10),通過如實(shí)施例IV所述的IFN-γELIspot測(cè)定。這證實(shí)LILVSQYTPDSTPCHRGDNQL是或者含有至少一種HTL表位,該表位至少可與最初通過本發(fā)明的表位捕獲法發(fā)現(xiàn)的HLA-DRB1*0401結(jié)合。
      圖10使用CMV pp65 15mers 57、59和對(duì)照(med不含肽,HIV無關(guān)HIV衍生肽,ConA多克隆刺激)的IFN-γELIspot使用來自受試者10788的PBMC。
      作為另一個(gè)實(shí)施例,對(duì)于通過本發(fā)明的表位捕獲法確定為與DRB1*0404弱結(jié)合的15mer 469和470(表3),檢測(cè)它與人PBMC的反應(yīng)性。為了辨別CD8陽性CTL介導(dǎo)的或CD4-陽性HTL介導(dǎo)的反應(yīng)性,進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色聯(lián)合表面標(biāo)志物染色融解后,PBMNC在含有10%人AB型血清(BioWhittaker)的RPMI1640中保存過夜(37℃,5%CO2)。次日,2百萬個(gè)PBMNC的等份與肽(80μg/ml)或伴刀豆球蛋白A(SIGMA)一起溫育。1小時(shí)后,加入10μg/ml布雷菲德菌素A(SIGMA),繼續(xù)溫育5小時(shí)。對(duì)CD4(藻紅蛋白)、CD8(細(xì)胞色素)、CD69(別藻藍(lán)蛋白)的表面染色用如述標(biāo)記的抗體(Pharmingen,San Diego,CA,USA)進(jìn)行。在用1%低聚甲醛PBS溶液固定后,通過在0.5%BSA/0.1%疊氮鈉/0.1%皂苷PBS溶液中溫育15分鐘使細(xì)胞透化。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子用抗-IFN-γ(FITC)抗體4S.B3(Pharmingen)染色。樣品(淋巴細(xì)胞門中的100,000個(gè)事件)用FACScalibur(Becton Dickinson)讀數(shù)。
      覆蓋DEDSDNEIHNPAVFTW469-484的15mer 469和470含有A*0201和II類結(jié)合基序,并可與可溶性DRB1*0404結(jié)合(表3)。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色證實(shí),對(duì)于供體10788,在CD8和CD4陽性T細(xì)胞區(qū)室中有顯著的IFN-γ分泌(圖11,下面兩張圖)。相反,供體10687只顯示針對(duì)15mer 489 AGILARNLVPMVATV489-503的CD8介導(dǎo)的IFN-γ分泌,表明在這種情況下只有HLA-A2表位NLVPMVATV495-503被靶向。這些結(jié)果證實(shí),肽DEDSDNEIHNPAVFTW469-484含有I類和II類限制的表位。
      圖11通過細(xì)胞內(nèi)IFN-γ染色證實(shí)針對(duì)CMV pp65 15mer 469、470的同時(shí)的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。來自兩名供體(10687、10788)的PBMC用ConA作為陽性對(duì)照(第一列)、含有推斷的I類和II類表位的15mer(第2列和第3列)或培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照(右列)刺激。對(duì)胞內(nèi)IFN-γ(x軸)或表面T細(xì)胞分化標(biāo)記CD4或CD8(y軸)染色細(xì)胞。標(biāo)出了右上四分之一的百分?jǐn)?shù),顯著高于背景的數(shù)字用黑體顯示。
      實(shí)施例VII利用HLA-DR4轉(zhuǎn)基因小鼠,通過表位捕獲法鑒定的新型II類(HLA-DRB1*0401)表位的證實(shí)為此,在表達(dá)DRB1*0401分子的HLA-DR4轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行DRB1*0401結(jié)合實(shí)驗(yàn),其中檢測(cè)CMV血清陽性個(gè)體不能證明T細(xì)胞的反應(yīng)性。合成覆蓋可與DRB1*0401分子結(jié)合的所有候選表位的較長肽(1500-1505)(見表7),并注射到小鼠中。最后一次注射一周后,總鼠脾細(xì)胞用下列成分來自體內(nèi)地再刺激用于接種的相同肽,以及代表相應(yīng)較長肽的重疊15-mer,和一種無關(guān)的流感血凝素衍生肽(1171)作為陰性對(duì)照。T細(xì)胞反應(yīng)性通過INF-γELISpot試驗(yàn)檢測(cè)(圖12),結(jié)果6種較長肽中有5種顯示免疫原性。而且,代表較長的肽并顯示與DRB1*0401分子的親和力的大多數(shù)15-mer也已經(jīng)證實(shí)再激活DRBI*0401轉(zhuǎn)基因小鼠的來自體內(nèi)的T細(xì)胞。有一種肽(1503)至少在這些研究使用的免疫條件下不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
      為了免疫原性肽的精確表位作圖和CD4+特異性的體內(nèi)檢測(cè),小鼠接種較長的肽,如上所述將脾細(xì)胞分成CD4+和CD8+T細(xì)胞群體(CD4+級(jí)分的純度為92-94%),待測(cè)IFN-γ的產(chǎn)生。圖12顯示該ELISpot測(cè)定的結(jié)果。在所有情況下,用脾細(xì)胞測(cè)定的T細(xì)胞應(yīng)答能夠用CD4+細(xì)胞證實(shí)。CD8+應(yīng)答通??梢院雎?。肽1502同時(shí)所見的CD4+和CD8+應(yīng)答可能是由于肽序列內(nèi)所含的另一種I類小鼠表位。
      表7a總結(jié)了用可溶性DR分子進(jìn)行的肽結(jié)合研究和小鼠實(shí)驗(yàn)的所有數(shù)據(jù)。觀察到肽對(duì)DRB1*0401分子的親和力與HLA-DR4轉(zhuǎn)基因小鼠中CD4+細(xì)胞的特異性刺激之間的良好相關(guān)性。例如,肽1500-1502和1504在兩種方法中顯示相似的結(jié)果。肽1505在結(jié)合測(cè)定中不是很好,在肽注射后引起小鼠產(chǎn)生最高頻率的T細(xì)胞。在體外與DRB1*0401分子有弱親和力的肽1503在注射CpG1668或CFA/IFA的小鼠中沒有免疫原性。在此也應(yīng)當(dāng)提到,根據(jù)用于注射的佐劑不同,有些肽顯示可變的免疫原性和特定的CD4+頻率。根據(jù)使用CD4+細(xì)胞富集級(jí)分的小鼠ELISpot測(cè)定和使用可溶性DRB1*0401分子的肽結(jié)合測(cè)定的結(jié)果,能夠確定可被攜帶DRB1*0401的T細(xì)胞識(shí)別的表位核心序列(參見表7和表7a)。其中4種與通過TEPITOPE算法序列預(yù)測(cè)的恰好一致,除了沒有預(yù)測(cè)到肽1501可與DRB1*0401分子結(jié)合之外。
      表7.DRB1*0401配體在轉(zhuǎn)基因小鼠中作為候選表位的證實(shí)突出了提出的DRB1*0401核心結(jié)合基序。
      “-”不結(jié)合/T細(xì)胞應(yīng)答;“+/-弱結(jié)合/T細(xì)胞應(yīng)答;“+”中度結(jié)合/T細(xì)胞應(yīng)答;“++”強(qiáng)結(jié)合/T細(xì)胞應(yīng)答。
      總之,對(duì)于用“反向免疫學(xué)”方法發(fā)現(xiàn)是可溶性DRB1*0401分子的配體的大多數(shù)肽,證實(shí)它在DRB1*0401轉(zhuǎn)基因小鼠中引發(fā)特異的CD4+應(yīng)答。因此,6個(gè)候選表位中有5個(gè)是真正的DRB1*0401表位。另外,它們是混雜的(見表7和表7a)。其中3個(gè)(1501、1502、1503)已經(jīng)在以前的文獻(xiàn)中描述,但不是作為DRB1*0401特異的表位。也發(fā)現(xiàn)2種DRB1*0401結(jié)合劑(57和59)和與DRB1*0404結(jié)合的3種肽(421、469、470)在來自CMV血清陽性供體的PBMC中可誘導(dǎo)INF-γ的產(chǎn)生(見實(shí)施例IV和VI)。總之,表明該表位捕獲方法能夠鑒定真正的T細(xì)胞表位。
      表7a.使用可溶性DRB1*0401分子和HLA DR4轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定人II類表位的總結(jié)
      “-”不結(jié)合/T細(xì)胞應(yīng)答;“+/-”弱結(jié)合/T細(xì)胞應(yīng)答;“+”中度結(jié)合/T細(xì)胞應(yīng)答;“++”強(qiáng)結(jié)合/T細(xì)胞應(yīng)答參考文獻(xiàn)1.Aichinger G等人,1997.J.Biol.Chem.27229127-29136.
      2.Ausubel FM等人(編著),2001.Current Protocols in Mo-lecularBiology,Volumes 1-4,John Wiley and Sons(出版商).
      3.Bitmansour AD等人,2001.J.Immunol.1671151-1163.
      4.Bonifacino JS等人(編著),2001.《現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)方法》(Current Protocols in Cell Biology),1-2卷,John Wiley and Sons(出版商).
      5.Britt WJ等人,1996.第77章″巨細(xì)胞病毒″,《病毒學(xué)》,F(xiàn)ields等人(編著),Livincott-Raven Publishers6.Cox AL等人,1994.Science 264716-719.
      7.Coligan JE等人(編著),2001.《現(xiàn)代免疫學(xué)方法》(CurrentProtocols in Immunology),1-4卷,John Wiley and sons(出版商).
      8.Drew WL等人,1999.Curr Clin Top Infect Dis 1916-29.
      9.Field AK等人,1999.Antivir Chem Chemother 10(5)219-232.
      10.Fowler KB等人,1992.N EnglJ Med 326663-673.
      11.Gallot G.等人,2001.J.Immunol.1674196-4206.
      12.Gavin MA等人,1993.J Immunol.1513971-8013.Gorga,JC等人,1987.J.Biol.Chem.26216087-16094.
      14.Greenberg,P.D.等人,1999.Science 285546.
      15.Heemels,MT等人,1995.Annu.Rev.Biochem.64463-491.
      16.Kern F等人,2000.Eur J Immun 301676-1682.
      17.Kern F等人,1999.J Virol 73(10)8179-8184.
      18.Khattab BA等人,1997.J Med Virol 5268-76.
      19.Klein,J,1986.《MHC的自然史》(Natural History of theMHC),John Wiley and Sons(出版商)20.Komanduri,KV等人,1998.Nat.Med.4953.
      21.Kronenberg M等人,1999.Immunol Today 20515-21.
      22.Kuzushima K等人,2001.Blood 98(6)1872-1880.
      23.Kwok WW等人,2001.Trends Immunol 22(11)583-588.
      24.Lalvani A等人,1997.J.Exp.Med.186(6)859-865.
      25.McLaughlin-Taylor E等人,1994.J Med Virol 43103-110.
      26.Maecker HT等人,2001.J Immunol Methods 25527-40.
      27.Masuoka M等人,2001.Viral Immunology 14(4)369-377.
      28.Morgan CL等人,1998,Immunogenetics 48(2)98-107.
      29.Nichols WG等人,2000,J Clin Virol 16(1)25-40.
      30.Nijman HW等人,1993.Eur.J.Immunol.,6,1215-9.
      31.Novak N等人,2001.J.Immunol.1666665-6670.
      32.Parker,KC等人,1994.J.Immunol.152163.
      33.Plotkin SA,1999.Pediatr Infect Dis J 18 (4)313-25.
      34.Rammensee,HG等人,1999.Immunogenetics 50213-219.
      35.Reddehase MJ,2000.Curr Opin Immunol.12390-396.
      36.Retriere C等人,2000.J Virol 74(9)3948-3952.
      37.Saulquin X等人,2000.Eur J Immunol 302531-2539.
      38.Sia IG等人,2000.Clin Microbiol Rev 13(1)83-121.
      39.Solache A等人,1999.J.Immunol.1635512-5518.
      40.Stern LJ等人,1994.Structure 2245-251.
      41.Sturniolo T等人,1999.Nature Biotechnology 17555-562.
      42.Tana等人,1998,J.Human Genet.43(1)14-21.
      43.Tobery WT等人,2001.J Immunol Methods 25459-66.
      44.Valli A等人,1993.J.CIin.Invest.91616-628.
      45.Van den Eynde BJ等人,1997.Curr Opin Immunol.5684-93.
      46.van Son WJ,1999.Intervirology 42(5-6)285-290.
      47.Villadangos JA等人,2000.Immunity 12233-239.
      48.Waldrop SL等人,1998.J.Immunol.1615284.
      49.Wilson DB等人,1999.J.Immunol.1636424-6434.
      50.Weekes MP等人,1999a.J Immunol 1627569-7577.
      51.Weekes MP等人,1999b,J Virol 73(3)8140-8150.
      52.Zaia JA等人,2000.《2000年巨細(xì)胞病毒預(yù)防和治療》(Cytomegalovirus Prevention and Treatment in 2000).Hematology(Am Soc Hematol Educ Program)2000339-35權(quán)利要求
      1.分離具有結(jié)合MHC/HLA分子的能力的配體或含有該配體和該MHC/HLA分子的復(fù)合物的方法,其特征在于下列步驟—提供配體集合,該集合含有可與該MHC/HLA分子結(jié)合的配體和不與該MHC/HLA分子結(jié)合的配體,—使該MHC/HLA分子接觸該配體集合,從而使具有結(jié)合該MHC/HLA分子的能力的配體與該MHC/HLA分子結(jié)合,形成含有該配體和該MHC/HLA分子的復(fù)合物,—檢測(cè)該復(fù)合物,任選地使該復(fù)合物與不與該MHC/HLA分子結(jié)合的配體分離,和—任選地從該復(fù)合物中分離并表征配體。
      2.分離具有結(jié)合MHC/HLA分子的能力的T細(xì)胞表位或含有該表位和該MHC/HLA分子的復(fù)合物的方法,其特征在于下列步驟—提供配體集合,該集合含有可與一種MHC/HLA分子結(jié)合的配體和不與該MHC/HLA分子結(jié)合的配體,—使該MHC/HLA分子接觸該配體集合,從而使具有結(jié)合該MHC/HLA分子的能力的配體與該MHC/HLA分子結(jié)合,形成含有該配體和該MHC/HLA分子的復(fù)合物,—檢測(cè)該復(fù)合物,任選地使該復(fù)合物與不與該MHC/HLA分子結(jié)合的配體分離,—任選地從該復(fù)合物中分離并表征配體,—用T細(xì)胞測(cè)定法測(cè)定任選地分離的該配體或該復(fù)合物之T細(xì)胞激活能力,和—提供具有T細(xì)胞激活能力的任選地分離的配體作為T細(xì)胞表位或復(fù)合物。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法,其特征在于該配體集合選自肽集合,特別是重疊肽的集合,蛋白質(zhì)片段集合,糖脂的集合,鞘糖脂的集合,脂肽的集合,脂類的集合,聚糖的集合,修飾肽的集合,由抗原呈遞細(xì)胞獲得的集合,優(yōu)選地是其總裂解物或級(jí)分的形式,特別是從這些細(xì)胞的表面或MHC/HLA分子上洗脫的級(jí)分,包含細(xì)胞特別是病原體細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或組織之片段的集合,包含肽庫的集合,由重組DNA文庫產(chǎn)生的,特別是來源于病原體或腫瘤細(xì)胞的(多)肽的集合,來自具體病原體的蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)片段的集合,或其混合物。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法,其特征在于該MHC/HLA分子選自HLA I類分子、HLA II類分子、非傳統(tǒng)MHC/HLA和MHC/HLA-樣分子或其混合物,或它們的混合物。
      5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法,其特征在于利用一種方法表征該復(fù)合物的配體,該方法選自質(zhì)譜法,多肽測(cè)序,結(jié)合測(cè)定,特別是SDS-穩(wěn)定性測(cè)定,通過用層析,特別是HPLC測(cè)定其保留因子鑒定配體,或其它光譜技術(shù),特別是紫外線(UV)、紅外線(IR)、核磁共振(NMR)、圓二色性(CD)或電子自旋共振(ESR),或其組合。
      6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法,其特征在于它與細(xì)胞因子分泌測(cè)定組合,優(yōu)選地與Elispot測(cè)定、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色、FACS或ELISA組合。
      7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法,其特征在于該T細(xì)胞測(cè)定包括該復(fù)合物與分離的T細(xì)胞混合并溫育,隨后測(cè)定分離的T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌或增殖。
      8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法,其特征在于該T細(xì)胞測(cè)定包括測(cè)定激活標(biāo)記特別是CD69、CD38的上調(diào),或表面標(biāo)記特別是CD3、CD8或TCR的下調(diào)。
      9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法,其特征在于該T細(xì)胞測(cè)定包括特別是通過實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定與T細(xì)胞激活有關(guān)的mRNAs的上調(diào)/下調(diào)。
      10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法,其特征在于該T細(xì)胞測(cè)定選自測(cè)定T細(xì)胞受體下游成分,特別是p56 lck、TCR的ITAMS和zeta鏈、ZAP70、LAT、SLP-76、fyn和lyn的磷酸化/去磷酸化的T細(xì)胞測(cè)定,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca++濃度或Ca++-依賴蛋白質(zhì)激活的T細(xì)胞測(cè)定,測(cè)定免疫突觸形成的T細(xì)胞測(cè)定,測(cè)定效應(yīng)分子特別是穿孔素、粒酶或granulolysin釋放的T細(xì)胞測(cè)定,或這些T細(xì)胞測(cè)定的組合。
      11.可通過根據(jù)權(quán)利要求2-10中任一項(xiàng)的方法鑒定的T細(xì)胞表位,該T細(xì)胞表位選自含有序列KMQVIGDQYV、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV、KYQEFFWDA或其組合的多肽。
      12.具有T細(xì)胞激活能力的HLA A0201結(jié)合表位,其可以利用HLA A0201分子作為MHC/HLA分子,通過根據(jù)權(quán)利要求2-10中任一項(xiàng)的方法鑒定,該HLA A0201結(jié)合表位選自含有序列RLLQTGIHV、VIGDQYVKV、YLES FCEDV或其組合的多肽。
      13.含有序列RPHERNGFTV的肽在制備用于在B7陰性個(gè)體中激活T細(xì)胞的組合物中的用途。
      14.含有序列DDVWTSGSDSDE的肽在制備用于在B35陰性個(gè)體中激活T細(xì)胞的組合物中的用途。
      15.含有序列TPRVTGGGAM的肽在制備用于在B7陰性個(gè)體中激活T細(xì)胞的組合物中的用途。
      16.可與II類HLA分子結(jié)合的肽,其選自根據(jù)表3的肽55-64、109、383、384、421、449-454、469和470。
      17.根據(jù)權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)的表位或肽,其特征在于它進(jìn)一步含有1-30個(gè)、優(yōu)選地2-10個(gè)、特別是2-6個(gè)天然存在的氨基酸殘基,特別是在N端、C端或在N端和C端。
      18.根據(jù)權(quán)利要求11-17中任一項(xiàng)的表位或肽,其特征在于它進(jìn)一步在N端、C端或在N端和C端含有非天然存在的氨基酸,優(yōu)選地1-1000個(gè),更優(yōu)選地2-100個(gè),特別是2-20個(gè)非天然存在的氨基酸殘基。
      19.根據(jù)權(quán)利要求11-18中任一項(xiàng)的表位或肽在制備用于治療或預(yù)防巨細(xì)胞病毒(CMV)感染的HLA限制疫苗中的用途。
      20.根據(jù)權(quán)利要求11、17或18中任一項(xiàng)的表位在制備用于治療或預(yù)防巨細(xì)胞病毒(CMV)感染的疫苗中的用途。
      21,用于治療或預(yù)防巨細(xì)胞病毒(CMV)感染的疫苗,其含有根據(jù)權(quán)利要求11、17或18中任一項(xiàng)的表位。
      22.用于治療或預(yù)防巨細(xì)胞病毒(CMV)感染的HLA特異的疫苗,其含有根據(jù)權(quán)利要求11-18中任一項(xiàng)的表位或肽。
      23.如權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)所述的疫苗,其特征在于它進(jìn)一步含有免疫調(diào)節(jié)物,優(yōu)選地選自聚陽離子物質(zhì),特別是聚陽離子多肽,免疫調(diào)節(jié)核酸,特別是含有寡脫氧核苷酸的脫氧尿苷和/或脫氧肌苷,或其混合物。
      24.如權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)所述的疫苗,其特征在于它進(jìn)一步含有一種藥學(xué)可接受的載體。
      25.如權(quán)利要求19-24中任一項(xiàng)所述的疫苗,其特征在于該表位以一種選自下列的形式提供肽、肽類似物、蛋白質(zhì)、裸DNA、RNA、病毒載體、病毒樣顆粒、重組/嵌合病毒、重組細(xì)菌或用蛋白質(zhì)/肽/RNA脈沖或用含有該表位的DNA轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞。
      26.T細(xì)胞、T細(xì)胞克隆或T細(xì)胞群體或制品,其特異識(shí)別根據(jù)權(quán)利要求11-18中任一項(xiàng)的表位或肽。
      27.根據(jù)權(quán)利要求26的T細(xì)胞、T細(xì)胞克隆或T細(xì)胞群體或制品在鑒定不規(guī)則表位中的用途。
      28.根據(jù)權(quán)利要求26的T細(xì)胞、T細(xì)胞克隆或T細(xì)胞群體或制品在制備用于治療CMV患者的組合物中的用途。
      29.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法,其特征在于抗原的配體或片段,特別是來自下列生物的抗原人類免疫缺陷病毒(HIV),甲型肝炎和乙型肝炎病毒,丙型肝炎病毒(HCV),勞斯肉瘤病毒(RSV),EB病毒(EBV),流感病毒,輪狀病毒,金黃色葡萄球菌,肺炎衣原體,沙眼衣原體,結(jié)核分枝桿菌,肺炎鏈球菌,炭疽芽孢桿菌,霍亂弧菌,瘧原蟲屬的種(惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲等),曲霉屬的種或白色念珠菌,腫瘤抗原或自身免疫抗原。
      30.根據(jù)權(quán)利要求1-10和29中任一項(xiàng)的方法,其特征在于該配體是具有結(jié)合MHC/HLA分子的能力的HCV-肽、HIV-肽、HAV-肽、HBV-肽、RSV-肽、EBV-肽、流感病毒肽或輪狀病毒肽。
      全文摘要
      描述了一種分離具有結(jié)合MHC/HLA分子的能力的配體和含有該配體和該MHC/HLA分子的復(fù)合物的方法,該方法包括下列步驟—提供配體集合,該集合含有可與該MHC/HLA分子結(jié)合的配體和不與該MHC/HLA分子結(jié)合的配體,—使該MHC/HLA分子接觸該配體集合,從而使具有結(jié)合該MHC/HLA分子的能力的配體與該MHC/HLA分子結(jié)合,形成含有該配體和該MHC/HLA分子的復(fù)合物,—檢測(cè)該復(fù)合物,任選地使該復(fù)合物與不與該MHC/HLA分子結(jié)合的配體分離,—任選地從該復(fù)合物中分離并表征該配體,以及一種分離具有結(jié)合MHC/HLA分子的能力的T細(xì)胞表位的方法。
      文檔編號(hào)A61K38/00GK1659436SQ03804846
      公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2003年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月28日
      發(fā)明者C·克拉德, J·沙里尚, O·維圖斯卡, W·扎內(nèi)爾, M·伯恩斯特爾, G·艾奇格爾, A·奧塔維, F·瑪特尼爾 申請(qǐng)人:英特塞爾股份公司
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