專(zhuān)利名稱(chēng)：抗成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23(FGF-23)的抗體。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一些抗體，它們提供通過(guò)適當(dāng)?shù)貦z測(cè)和測(cè)定FGF-23而診斷FGF-23蛋白在體內(nèi)積累或降低所伴隨的疾病或病理狀態(tài)的方法，所述方法能夠通過(guò)阻遏FGF-23而改善或治療由FGF-23過(guò)量的作用導(dǎo)致的疾病的癥狀或病理狀態(tài)，本發(fā)明同時(shí)涉及制備抗體的方法和利用抗體的方法。
背景技術(shù)：
成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是首次作為刺激成纖維細(xì)胞系NIH3T3的物質(zhì)從小牛的垂體純化的。然后，在各種組織中鑒定了類(lèi)似的蛋白，一組這些物質(zhì)形成了多肽家族(FGF家族)。至今，屬于FGF家族的22個(gè)類(lèi)型的蛋白已經(jīng)在脊椎動(dòng)物中鑒定。關(guān)于這些類(lèi)型的蛋白的生物學(xué)活性，不僅成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)刺激活性而且大范圍的作用也是已知的，如發(fā)育期間中胚層和神經(jīng)外胚層的生長(zhǎng)，血管發(fā)生，肢芽的形成。FGF家族成員是關(guān)于基因的表達(dá)位點(diǎn)和表達(dá)時(shí)間而變更的。在發(fā)育時(shí)期或成人中經(jīng)常只在特定的位點(diǎn)表達(dá)其基因。作為編碼FGF受體的基因，至少有4個(gè)類(lèi)型是已知的FGFR1，F(xiàn)GFR2，F(xiàn)GFR3和FGFR4。另外，已知在FGFR1，F(xiàn)GFR2和FGFR3中，由于拼接的不同，在受體蛋白的細(xì)胞外的結(jié)構(gòu)域中的差異是獨(dú)立存在的。另外，已知肝素和類(lèi)肝素(heparan)硫酸糖蛋白與FGF和FGF受體反應(yīng)，以便調(diào)節(jié)其作用。另外，有許多蛋白由于其結(jié)構(gòu)上的相似性屬于FGF家族，但它們的生物活性，它們的受體結(jié)合能力等等仍然幾乎是未知的。FGF家族的表征已經(jīng)如綜述所述完成(Ornitz，D.M.和Itoh N.，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，基因組生物學(xué)23005.1-3005.12，2001)。
FGF-23首先是通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，利用它與FGF-15的同源性和PCR方法，從小鼠中克隆的，然后，利用它與小鼠FGF-23的序列同源性來(lái)克隆人FGF-23(Yamashita T.，Yoshioka M.，和Itoh N.，新成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-23的鑒定，其在腦的腹側(cè)丘腦核中優(yōu)先表達(dá)，Biochem.Biophy.Res.Commun.，277494-498，2000)。隨后，根據(jù)對(duì)常染色體顯性的低磷酸鹽血癥性(hypophosphatemic)佝僂病/骨軟化癥(下文中稱(chēng)為ADHR)的研究，在ADHR患者的FGF-23基因中特征性地發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變，同時(shí)使ADHR患者中突變基因的區(qū)域變窄并且鑒定了致病基因(ADHR協(xié)會(huì)，常染色體顯性低磷酸鹽血癥性佝僂病是與FGF-23的突變相關(guān)的，Nature Genet.26345-348，2000)。這一發(fā)現(xiàn)明顯地表明了體內(nèi)FGF-23的生理重要性。但是，F(xiàn)GF-23的生物學(xué)活性仍然是未知的。同時(shí)，通過(guò)對(duì)腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥的研究已經(jīng)確定了FGF-23的生物活性?？梢哉J(rèn)為，在這一疾病中，與疾病有關(guān)的腫瘤產(chǎn)生了并且分泌了誘導(dǎo)疾病的體液因子，并且通過(guò)這一因子的作用，發(fā)生了疾病，如低磷酸鹽血癥(hypophosphatemia)或軟骨病。
在尋找這樣的致病腫瘤產(chǎn)生的疾病誘導(dǎo)因子中，F(xiàn)GF-23已經(jīng)作為腫瘤中高水平表達(dá)的基因來(lái)克隆。另外，已經(jīng)顯示，通過(guò)施用這一因子，再現(xiàn)了(reproduced)低磷酸鹽血癥和骨軟化癥(Shimada T.，Mizutani S.，Muto T.，Yoneya T.，Hino R.，Takeda S，Takeuchi Y.，F(xiàn)ujitaT.，F(xiàn)ukumoto S和Yamashita T.，作為腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥的成因因子的FGF-23的克隆和表征，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊986500-6505，2001)。這一研究顯示了FGF-23參與了與磷和鈣有關(guān)的體內(nèi)代謝控制，并且表明，F(xiàn)GF-23作為系統(tǒng)性因子表現(xiàn)其作用，同時(shí)在體內(nèi)循環(huán)。但是，表現(xiàn)FGF-23作用所需要的體內(nèi)濃度和代謝并未被顯示，F(xiàn)GF-23的生理作用仍然大部分未知。另外，作為呈現(xiàn)臨床發(fā)現(xiàn)有類(lèi)似癥狀的疾病，與性連遺傳型(X-linked)低磷酸鹽血癥性佝僂病是已知的。但是，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)發(fā)病過(guò)程中FGF-23的參與。除了ADHR和腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥，還沒(méi)有已知的疾病被證明是與FGF-23相關(guān)的。
通過(guò)顯示異常低水平的血磷和1α，25-二羥基維生素D(下文中稱(chēng)為1，25D)以及腫瘤的發(fā)生可以表征上面的腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥。該病癥伴隨肌肉力量降低或骨軟化癥，可以導(dǎo)致步行障礙或起立困難。在大多數(shù)情況中，導(dǎo)致(responsible)這一疾病的腫瘤是從間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal cells)派生的良性腫瘤。大多數(shù)致病腫瘤生長(zhǎng)能力較弱，并且在隨訪中很少觀察到明顯的增大。另外，雖然觀察到了發(fā)病(morbidity)的進(jìn)展，通常需要詳細(xì)的檢測(cè)如全身MRI掃描檢測(cè)來(lái)發(fā)現(xiàn)致病(responsible)腫瘤。因此，對(duì)于沒(méi)有給出明確診斷，或者作出由未知原因?qū)е碌土姿猁}血癥的一些情況，懷疑它們是腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥。目前，對(duì)腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥的唯一經(jīng)證實(shí)的診斷方法是證明通過(guò)腫瘤切除術(shù)(tumorectomy)從疾病癥狀中恢復(fù)。這是因?yàn)檫€沒(méi)有通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤發(fā)生與疾病癥狀的成因和效果關(guān)系的方法。在一些情況中，進(jìn)行了完全與疾病癥狀無(wú)關(guān)的非致病性腫瘤的去除。為了改進(jìn)這些情況，人們期望開(kāi)發(fā)臨床實(shí)驗(yàn)的方法，從而可以進(jìn)行腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥的差異(differential)診斷。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了FGF-23在體內(nèi)具有控制磷代謝作用。已知具有控制磷代謝作用的甲狀旁腺激素和1，25D在鈣代謝而不是磷代謝的控制中起更重要的作用。主要控制磷代謝的分子還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，而FGF-23可以期望具有這樣的活性。同時(shí)，磷代謝和鈣代謝之間的密切關(guān)系在臨床上是已知的。特別是，關(guān)于骨組織的鈣化和病理異位鈣化，將兩者分開(kāi)考慮是困難的。基于FGF-23在過(guò)量狀態(tài)時(shí)可誘導(dǎo)骨軟化癥和其具有降低1，25D作用的事實(shí)，F(xiàn)GF-23不僅可能與磷的代謝有關(guān)，而且還可能廣泛地與控制鈣化和骨代謝有關(guān)。此外，在主要包括腸道、腎和骨組織的控制礦物質(zhì)代謝的器官中的異常性疾病可能與FGF-23的過(guò)量積累和缺乏有關(guān)。人們期望發(fā)展一種測(cè)定體內(nèi)FGF-23濃度的方法以利于了解上述疾病，以及對(duì)該疾病進(jìn)行精確的治療。
從由過(guò)量FGF-23誘導(dǎo)的發(fā)病體中抑制或除掉FGF-23可以成為治療該疾病的一種方法。一種可能的方法是利用FGF-23的受體的拮抗物或者可結(jié)合FGF-23的物質(zhì)來(lái)抑制配體-受體的相互作用，另外一種可能的方法是利用一種可結(jié)合FGF-23的物質(zhì)除去FGF-23。然而，利用上述方法有選擇性地抑制或除去FGF-23的物質(zhì)還未發(fā)現(xiàn)。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可識(shí)別FGF-23的抗體，診斷方法，有效的治療方法，和利用所述抗體抵抗由FGF-23引發(fā)的疾病的預(yù)防方法。
為了達(dá)到上述目標(biāo)，我們進(jìn)行了大量的研究，目前該發(fā)明已經(jīng)得到了一種抗體，該抗體可特異性識(shí)別并與FGF-23蛋白的部分結(jié)構(gòu)相結(jié)合，并且我們發(fā)現(xiàn)利用該抗體可檢測(cè)FGF-23。
本發(fā)明如下(1)通過(guò)利用多肽免疫動(dòng)物而得到的抗體，所述多肽包含如SEQID NO1所示的氨基酸序列，或包含從SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中通過(guò)缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而衍生得到的氨基酸序列，并且所述抗體具有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23的活性，具有控制磷酸鹽代謝或維生素D代謝的活性，并且如以下(a)、(b)或(c)所示(a)識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180位和第194位，或第237位和第251位氨基酸殘基之間的一段氨基酸序列的抗體；(b)由保藏號(hào)為FERM BP-7838，F(xiàn)ERM BP-7839，F(xiàn)ERM BP-7840，或FERM BP-8268的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體；或(c)通過(guò)結(jié)合由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列所組成的多肽，與保藏號(hào)為FERM BP-7838，F(xiàn)ERM BP-7839，F(xiàn)ERM BP-7840，或FERMBP-8268的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)的抗體。
(2)一種藥物組合物，其包含上述抗體作為活性成分。
本發(fā)明的藥物組合物包含一種可識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180位和第194位氨基酸殘基之間的氨基酸序列的抗體。本發(fā)明的藥物組合物可有效地抵抗至少一種下述的疾病腫瘤誘導(dǎo)骨軟化癥，ADHR，XLH，腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良，透析性骨病，骨質(zhì)疏松癥，低磷酸鹽血癥，佝僂病，骨軟化癥，腎小管機(jī)能障礙，骨量減少，低鈣血癥，骨延長(zhǎng)障礙，骨鈣化障礙，甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥，異位鈣化，搔癢，骨硬化，佩吉特氏病，高鈣血特發(fā)性綜合癥，甲狀旁腺功能減退癥，骨痛，肌力下降，骨骼畸形，發(fā)育不良，和低1，25D疾病(血液中1，25D低于某一水平的疾病)，并且能用于治療或預(yù)防這些疾病。
該藥物組合物包含一種藥劑，該藥劑利用上述抗體作為活性組分可促進(jìn)骨的生成。
(3)一種檢測(cè)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23的方法，包括使識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第25位和第179位氨基酸殘基之間的部分氨基酸序列的抗體，和一種可識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180位和第251位氨基酸殘基之間的部分氨基酸序列的抗體，與測(cè)試樣品發(fā)生反應(yīng)。
用于上述檢測(cè)方法中的識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180位和第251位氨基酸殘基之間的部分氨基酸序列的抗體是一種識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180和第196位氨基酸殘基之間的氨基酸序列的抗體。此外，本發(fā)明的檢測(cè)方法中也使用了一種凝血酶抑制劑。
(4)一種檢測(cè)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23的試劑盒，它包含識(shí)別如SEQ ID NO1所示介于第25位和第179位氨基酸殘基之間的部分氨基酸序列的抗體，和識(shí)別如SEQ ID NO1所示介于第180位和第251位氨基酸殘基之間的部分氨基酸序列的抗體。
本發(fā)明的試劑盒包含識(shí)別如SEQ ID NO1所示氨基酸殘基中的介于第180位和第196位之間的氨基酸序列的抗體，作為識(shí)別如SEQ IDNO1所示氨基酸殘基中的介于第180位和第251位之間的部分氨基酸序列的抗體。
(5)一種抗成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23抗體的結(jié)合物質(zhì)，該物質(zhì)至少結(jié)合一種選自上面的抗體。
(6)一種醫(yī)療器具，裝備有上述結(jié)合物質(zhì)。本發(fā)明提供的這種醫(yī)療器具能用于除去血液中的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23。
(7)一種藥物組合物，該藥物組合物包含至少2種如上所述的可識(shí)別不同位點(diǎn)的抗體作為活性成分。
本發(fā)明的詳細(xì)介紹如下已知FGF-23在致病腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥的腫瘤中可高水平地表達(dá)。當(dāng)分泌FGF-23的細(xì)胞被實(shí)驗(yàn)性地轉(zhuǎn)移進(jìn)裸鼠的體內(nèi)時(shí)，低磷酸鹽血癥或者是骨軟化癥就發(fā)生了，它們都是腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥的特征疾病。因此，F(xiàn)GF-23被認(rèn)為是腫瘤誘導(dǎo)骨軟化癥的一種誘導(dǎo)劑。對(duì)產(chǎn)生常染色體顯性低磷酸鹽血癥性佝僂病(ADHR)的基因的單獨(dú)探索和研究已經(jīng)展開(kāi)，ADHR是遺傳性低磷酸鹽血癥的一種模式。因此，F(xiàn)GF-23被認(rèn)為是其突變可在ADHR病人體內(nèi)特別觀察到的基因。這些結(jié)果表明FGF-23是造成低磷酸鹽血癥的一種致病因素。對(duì)FGF-23的生物學(xué)活性，在一種對(duì)小鼠施用重組體FGF-23的實(shí)驗(yàn)中，證明了FGF-23可誘導(dǎo)低磷酸鹽血癥。基于這些結(jié)果，可以假定FGF-23在體內(nèi)起到了控制磷代謝和骨代謝的體液因子的作用。因此，定量的和定性地評(píng)價(jià)體內(nèi)的FGF-23對(duì)理解和診斷疾病具有非常重要的意義。而且，期望控制FGF-23的生物學(xué)活性不僅能夠治愈低磷酸鹽血癥(上面的描述已經(jīng)說(shuō)明了FGF-23與低磷酸鹽血癥有關(guān))，而且能夠控制磷的代謝和骨的代謝，還能夠應(yīng)用到礦物質(zhì)代謝異常、代謝性骨病等的治療上。
通過(guò)對(duì)本發(fā)明中的一些術(shù)語(yǔ)的說(shuō)明來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和附圖中的單字母符號(hào)通常用于表示氨基酸，其表述如下(G)甘氨酸，(A)丙氨酸，(V)纈氨酸，(L)亮氨酸，(I)異亮氨酸，(S)絲氨酸，(T)蘇氨酸，(D)天門(mén)冬氨酸，(E)谷氨酸，(N)天門(mén)冬酰胺，(Q)谷氨酰胺，(K)賴(lài)氨酸，(R)精氨酸，(C)半胱氨酸，(M)甲硫氨酸，(F)苯基丙氨酸，(Y)酪氨酸，(W)色氨酸，(H)組氨酸，和(P)脯氨酸。另外，單字母符號(hào)的意義通常也用于表示DNA的構(gòu)成物，表述如下(A)腺嘌呤，(C)胞嘧啶，(G)鳥(niǎo)嘌呤，和(T)胸腺嘧啶。
活性控制磷酸鹽(activity controlling phosphate)指的是血液中活性控制磷酸鹽濃度。
活性控制維生素D代謝(activity controlling vitamin D metabolism)的是指存在于體內(nèi)的維生素D和在體內(nèi)利用維生素D合成的代謝物的絕對(duì)水平的變化，或者是指控制維生素D存在率變化的潛能。
1.抗體識(shí)別FGF-23在本發(fā)明中所用的人類(lèi)FGF-23是一種具有如下面描述的氨基酸序列(SEQ ID NO1)，并且具有上面所述的特性(活性)的多肽。此外，本發(fā)明中的FGF-23和它的一部分包含一種人類(lèi)FGF-23的衍生物(該衍生物在一級(jí)結(jié)構(gòu)方面與天然類(lèi)型的FGF-23具有基本上相同的氨基酸序列)，和人類(lèi)FGF-23的衍生物的一部分，只要是在本發(fā)明中后面所描述的抗體具有反應(yīng)活性。
這里，“具有基本上相同氨基酸序列的人類(lèi)FGF-23衍生物”這一術(shù)語(yǔ)指的是一種具有通過(guò)替代，缺失和/或修飾一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而衍生得到的氨基酸序列的蛋白，條件是該蛋白具有與天然類(lèi)型的人類(lèi)FGF-23基本上相同的特性(活性)。而且，多個(gè)替代、缺失、修飾和添加可結(jié)合使用。人類(lèi)FGF-23的活性指的是能夠誘導(dǎo)類(lèi)似于上述情況的低磷酸鹽血癥或骨軟化癥的活性。
本發(fā)明的人類(lèi)FGF-23可以用本領(lǐng)域已知的方法適當(dāng)?shù)刂苽?，比如，除基因重組技術(shù)外，有化學(xué)合成方法，細(xì)胞培養(yǎng)方法，或這些方法的改進(jìn)方法。而且，人類(lèi)FGF-23的一部分序列也能夠利用基因重組技術(shù)，或按照如下描述的技術(shù)領(lǐng)域中一種已知的方法，如化學(xué)合成的方法，或這些方法的改進(jìn)方法來(lái)制備，或者可利用蛋白水解酶適當(dāng)?shù)厍懈钔ㄟ^(guò)細(xì)胞培養(yǎng)方法分離的人類(lèi)FGF-23的方法來(lái)制備。
本發(fā)明中的抗體是一種對(duì)上面所定義的人類(lèi)FGF-23或其一部分具有反應(yīng)活性的抗體，或是這種抗體的一部分。本發(fā)明的抗體包括單克隆抗體，該單克隆抗體包含重鏈和/或輕鏈，其氨基酸序列通過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、替代或添加衍生于組成抗體的每一條重鏈和/或輕鏈的氨基酸序列，并且可與FGF-23相結(jié)合。上面描述的氨基酸的部分變化(缺失，替代，插入和添加)能通過(guò)部分改變編碼氨基酸序列的核苷酸序列被引入到人類(lèi)FGF-23的氨基酸序列或本發(fā)明的抗體中。用于這些變化的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知，并且可使用用于引入突變等的商業(yè)化試劑盒。
(1)能特異性識(shí)別并能與FGF-23蛋白部分結(jié)構(gòu)結(jié)合的抗體為了獲得一種用于測(cè)定FGF-23和控制FGF-23的生物學(xué)活性的抗體，獲得可識(shí)別FGF-23結(jié)構(gòu)特征的抗體，對(duì)FGF-23有高度的親和力的抗體，能中和生物活性的抗體等等是有效的。由于FGF-23的結(jié)構(gòu)和抗原性是未知的，所以合成了相應(yīng)于FGF-23部分序列的許多肽，并且得到了針對(duì)每一種肽的抗體。利用這些抗體通過(guò)Western印跡法測(cè)定了由表達(dá)細(xì)胞分泌的FGF-23，揭示了表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中除成熟的FGF-23蛋白外，包含大量低分子量的肽，這些肽是由FGF-23蛋白衍生得到的。而且，所獲得的抗體表現(xiàn)出了抵抗成熟的FGF-23和由成熟的FGF-23切割產(chǎn)生的肽的各種結(jié)合特異性。
此外，利用免疫沉淀方法發(fā)現(xiàn)了該抗體在液相中的結(jié)合活性。而且，聯(lián)合使用這些位點(diǎn)特異性抗體使得對(duì)從FGF-23中衍生得到的各種各樣的肽中檢測(cè)出具有特定序列區(qū)域的肽成為可能。關(guān)于FGF-23的修飾和代謝的細(xì)節(jié)仍然未知。我們通過(guò)利用本發(fā)明的各種抗體進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，證明了當(dāng)FGF-23在CHO細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，不僅存在沒(méi)有信號(hào)序列的全長(zhǎng)蛋白，而且存在由于第179位精氨酸殘基和第180位絲氨酸殘基之間切割產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。除此以外，通過(guò)采集血漿的血樣和含有FGF-23的血清的血樣，和檢測(cè)代謝物的實(shí)驗(yàn)，以及將純化后的重組體與血清混合的實(shí)驗(yàn)，我們還揭示了雖然FGF-23在血漿中以全長(zhǎng)形式存在，在血清中，F(xiàn)GF-23的第196位精氨酸殘基和第197位丙氨酸殘基之間會(huì)發(fā)生切割。這可能是由于凝血酶的原因，切割也在第198位精氨酸和第199位甲硫氨酸之間發(fā)生。
(2)抗體的產(chǎn)生作為例子，通過(guò)下面的生產(chǎn)方法可以產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。具體地說(shuō)，例如，對(duì)一種非人類(lèi)的哺乳動(dòng)物，例如產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠，利用結(jié)合上面定義的人FGF-23或其一部分的產(chǎn)物，或它們與適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)(例如，小牛血清白蛋白)的結(jié)合復(fù)合物進(jìn)行免疫，來(lái)增強(qiáng)抗原以及佐劑(如果需要的話(huà)，例如費(fèi)氏佐劑)的抗原性?；蛘撸ㄟ^(guò)施用其中摻入了FGF-23的表達(dá)載體進(jìn)行免疫。從免疫動(dòng)物得到的血清可以得到多克隆抗體。此外，單克隆抗體能夠通過(guò)下述過(guò)程產(chǎn)生從由被免疫的動(dòng)物獲得的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，和不能自身產(chǎn)生抗體的骨髓瘤細(xì)胞制備雜交瘤，克隆這些雜交瘤，并且篩選產(chǎn)生對(duì)免疫所用抗原有特異親和性的單克隆抗體的克隆。
更具體地說(shuō)，單克隆抗體可利用下面描述的方法來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)。分泌的單克隆抗體的雜交瘤可通過(guò)并按照Khler和Milstein等人的方法(Nature，1975，256卷，495-497)來(lái)制備。具體地說(shuō)，雜交瘤是通過(guò)融合如上所述被免疫的動(dòng)物的脾臟、淋巴結(jié)、骨髓、扁桃體，優(yōu)選淋巴結(jié)或脾臟中包含的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，和不能生產(chǎn)優(yōu)選來(lái)源于哺乳動(dòng)物，如小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、兔子或者人的抗體的骨髓瘤細(xì)胞來(lái)制備。篩選產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤克隆可通過(guò)例如在微量滴定平板里培養(yǎng)雜交瘤，在培養(yǎng)物的上清液里檢測(cè)其對(duì)免疫原的反應(yīng)活性，其中利用酶免疫測(cè)定方法，比如酶聯(lián)免疫特異性測(cè)定(ELISA)觀察到其生長(zhǎng)。
單克隆抗體能從雜交瘤中產(chǎn)生，方法是體外培養(yǎng)雜交瘤并且從培養(yǎng)上清中分離抗體，或體內(nèi)培養(yǎng)雜交瘤，例如在小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠或者兔子的腹水中進(jìn)行培養(yǎng)，然后從腹水中分離抗體。
另外，重組抗體可以通過(guò)以下方法制備從一種抗體生產(chǎn)細(xì)胞，比如雜交瘤中克隆編碼人類(lèi)單克隆抗體的基因，將該基因整合到合適的載體上，再將載體引入到宿主(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，大腸桿菌，酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞和植物細(xì)胞)中，然后利用基因重組技術(shù)生成抗體(P.J.Delves，抗體生產(chǎn)基本技術(shù)，1997 WILEY；P Shepherd和CDean，單克隆抗體，2000年，牛津大學(xué)出版社，J.W.Goding，單克隆抗體，原理和應(yīng)用，1993學(xué)術(shù)出版社)。而且，利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)技術(shù)將一靶抗體基因整合到內(nèi)源基因上，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因牛，山羊，綿羊或豬，然后可由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁中大量獲得抗體基因衍生出的單克隆抗體。當(dāng)在體外培養(yǎng)雜交瘤時(shí)，可以依照各種各樣的條件進(jìn)行培養(yǎng)，這些條件包括待培養(yǎng)細(xì)胞類(lèi)型的特性，實(shí)驗(yàn)和研究的目的，培養(yǎng)方法等等，可以利用已知類(lèi)型的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基生長(zhǎng)、維持和貯藏雜交瘤，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基可以用于在培養(yǎng)物上清液中產(chǎn)生單克隆抗體，或是從已知的基本培養(yǎng)基中誘導(dǎo)和制備的任何類(lèi)型的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。
關(guān)于本發(fā)明的多克隆抗體，如實(shí)施例5所示，將一種化學(xué)合成的FGF-23的部分肽與一種牛甲狀腺球蛋白(載體蛋白)相結(jié)合，再利用該產(chǎn)物對(duì)兔子免疫。然后利用親和層析柱對(duì)這種抗體(該抗體通過(guò)免疫接種已誘導(dǎo)其抵抗各種肽的作用)進(jìn)行純化，用于免疫接種的肽已經(jīng)被固定化在層析柱上。這樣得到的抗體的特性通過(guò)Western印跡法和ELISA方法進(jìn)行了檢測(cè)，可以清楚地得到其抵抗FGF-23蛋白的反應(yīng)活性。
關(guān)于制備本發(fā)明的單克隆抗體，可以通過(guò)兩種方法進(jìn)行免疫接種，如實(shí)施例3所示。對(duì)這樣獲得的雜交瘤產(chǎn)生出的單克隆抗體的特性，即，抵抗固定化的FGF-23部分肽的反應(yīng)活性(如實(shí)施例9所示)，在免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中抵抗FGF-23蛋白的反應(yīng)活性(如實(shí)施例10所示)，進(jìn)行了測(cè)定，以便揭示每一種抗體同F(xiàn)GF-23的結(jié)合特性和識(shí)別位點(diǎn)的專(zhuān)一性。
2.檢測(cè)FGF-23的方法(1)從生物學(xué)樣品中定量檢測(cè)和鑒別FGF-23與其代謝產(chǎn)物在臨床試驗(yàn)中，必須對(duì)生物學(xué)樣品中的FGF-23的活性進(jìn)行精確測(cè)定。然而，由FGF-23生成的FGF-23蛋白的切割或由血樣制備的FGF-23蛋白的切割產(chǎn)生的片段化產(chǎn)物(這些我們已經(jīng)觀察到)，可能是妨礙FGF-23的測(cè)定的因素。具體地說(shuō)，我們的試驗(yàn)已表明，如SEQ ID NO1所示的介于第179位和第180位氨基酸殘基之間的切割導(dǎo)致了活性的喪失。因此，為了檢測(cè)在生物學(xué)樣品中具有活性的FGF-23，利用一種可識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第25位和第179位氨基酸殘基之間的部分氨基酸序列的抗體和一種可識(shí)別如SEQ IDNO1所示的介于第180位和第251位氨基酸殘基之間的氨基酸序列的抗體的組合的夾心式(sandwich)ELISA方法是有效的。這種檢測(cè)方法能夠通過(guò)將2C3B抗體或2C5L抗體(我們已經(jīng)得到了這種N-末端識(shí)別抗體)與3C1E抗體或1D6A抗體(C-末端識(shí)別抗體)相結(jié)合來(lái)進(jìn)行(見(jiàn)圖5)。而且，當(dāng)利用血清樣品制備血樣時(shí)，存在于血中的全長(zhǎng)FGF-23在介于第196位和第197位氨基酸殘基之間或介于第198位和第199位氨基酸殘基之間的位置可能發(fā)生切割。在這一情況下，當(dāng)使用一種可識(shí)別位于C-末端上的第197位和該位置后的氨基酸殘基部分的抗體時(shí)，利用這種方法不能對(duì)反映存在于血液中的這種蛋白的原始量進(jìn)行測(cè)定。由于即使使用了血清樣品，在血漿中也不能觀察到這種切割(見(jiàn)實(shí)施例26)，而如利用我們所得到的可以識(shí)別處于第180位和第196位氨基酸殘基之間的一個(gè)位點(diǎn)的3C1E抗體，作為識(shí)別C-末端的抗體，可以使得測(cè)定反映存在于血液中的蛋白的原始量的方法成為可能。
另外，在制備一個(gè)血清樣品時(shí)，凝血酶被證明是一種可以切割FGF-23的酶(見(jiàn)實(shí)施例17)。因此，在制備血清樣品時(shí)，通過(guò)加入凝血酶抑制劑，可避免檢測(cè)中的FGF-23的切割產(chǎn)生的效果，使得抑制伴隨血清樣品的制備的FGF-23的大部分切割是可能的。凝血酶抑制劑可以是任何不妨礙FGF-23檢測(cè)的物質(zhì)，并且優(yōu)選是水蛭素。
而且，本申請(qǐng)涉及檢測(cè)FGF-23的試劑盒，該試劑盒含有一種可識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第25位和第179位氨基酸殘基之間的氨基酸序列的一部分的抗體和一種可識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180位和第251位氨基酸殘基之間的氨基酸序列的一部分的抗體。本申請(qǐng)中檢測(cè)FGF-23的試劑盒中除了包括抗FGF-23抗體之外，如有必要的話(huà)，還可包括穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑等。
(2)高靈敏度檢測(cè)FGF-23的方法闡明FGF-23的體內(nèi)作用和發(fā)病率之間的關(guān)系在臨床上是有意義的，并且對(duì)腫瘤誘導(dǎo)骨軟化癥的差異診斷和遺傳性低磷酸鹽血癥佝僂病(ADHR，XLH性連遺傳型低磷酸鹽血癥佝僂病)的診斷也是有意義的。低磷酸鹽血癥，佝僂病，和骨軟化癥，對(duì)已證實(shí)沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)不良和家族病史的病人來(lái)說(shuō)，是不能夠確定病因的疾病，因此對(duì)該疾病的診斷在目前很困難。只有檢測(cè)到上述患者血液中FGF-23的濃度升高時(shí)，才有可能基于基因突變的確認(rèn)，通過(guò)遺傳性疾病的差異診斷，或者利用一種檢測(cè)腫瘤的詳細(xì)方法來(lái)發(fā)現(xiàn)腫瘤，使擬定治療腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥的治療方案成為可能。而且，由于FGF-23作為一種控制磷代謝的因子和/或控制維生素D代謝的因子可能與生物功能緊密相關(guān)，因此認(rèn)為血液濃度在礦物質(zhì)代謝異常，腎功能障礙，骨代謝疾病等的病癥中是波動(dòng)的。因此，將健康的成年人血液中FGF-23濃度的平均值同患有上述疾病的患者體內(nèi)血液中FGF-23濃度的平均值相比，對(duì)于我們了解發(fā)病原因，選擇治療方法，和確定治療方案是有意義的。為了構(gòu)建這樣一種FGF-23的測(cè)定系統(tǒng)，需要能夠?qū)ρ褐蠪GF-23濃度進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)靈敏度。我們已經(jīng)利用夾心式ELISA方法檢測(cè)了我們所得到的各種各樣的抗體組合，使得我們能夠定量測(cè)定健康的人體血液中和患有上述疾病的患者的血液中的FGF-23的濃度。
利用抗體檢測(cè)能夠被抗體識(shí)別的物質(zhì)(指的是一種抗原分子)的方法的實(shí)例，包括利用抗體與抗原分子相結(jié)合來(lái)采集達(dá)到可檢測(cè)數(shù)量的底物的方法，通過(guò)檢測(cè)與待測(cè)抗原分子特異性結(jié)合的抗體來(lái)檢測(cè)抗原分子存在的方法，和通過(guò)檢測(cè)待測(cè)抗原分子與已知數(shù)量的底物和抗體特異性結(jié)合之間的競(jìng)爭(zhēng)來(lái)測(cè)定抗原分子的存在的方法。利用Western印跡方法，免疫沉淀方法，和免疫染色法可進(jìn)行定性測(cè)定。而且，已知的定量檢測(cè)方法的實(shí)例包括放射免疫法，ELISA法，熒光激活細(xì)胞分類(lèi)法(FACS)等。當(dāng)被修飾或切割時(shí)，被抗體識(shí)別的抗原可以為多種形式。作為一種包括使其中的一部分形式專(zhuān)一化的檢測(cè)方法，將可識(shí)別靶物質(zhì)不同位點(diǎn)的抗體進(jìn)行組合是有效的。這種方法的代表性例子是夾心式ELISA法。
基于本發(fā)明檢測(cè)FGF-23的方法的完成，在

圖1A中明確地表示了由于FGF-23蛋白的切割而導(dǎo)致產(chǎn)生許多分子物種(species)。尤其是，實(shí)施例16所示表明，F(xiàn)GF-23在血液中以全長(zhǎng)蛋白的形式存在，而在血清中被切割。正因?yàn)槿绱耍紤]到這種切割，為了在體內(nèi)定量和精確地檢測(cè)FGF-23，有必要發(fā)展一種檢測(cè)系統(tǒng)。為達(dá)到這一目的，組合使用可識(shí)別FGF-23蛋白部分序列的上述抗體被證明非常有用。關(guān)于利用多克隆抗體的ELISA技術(shù)，如實(shí)施例7所示，表明FGF-23蛋白和其已切割的片段是可以選擇性地測(cè)定的。另外，關(guān)于實(shí)施例3和實(shí)施例4中得到的抗FGF-23的單克隆抗體，其對(duì)FGF-23蛋白上的識(shí)別位點(diǎn)的專(zhuān)一性被分析了，證明了其與FGF-23結(jié)合的特性可應(yīng)用于夾心式ELISA技術(shù)。實(shí)驗(yàn)揭示了在獲得的抗體中，1D6A抗體，2C3B抗體，和3C1E抗體均可獨(dú)立作為固定化的抗體，并也能被當(dāng)作檢測(cè)用的抗體。另一方面，2A2B抗體不適于任何這樣的用途。而且，實(shí)驗(yàn)表明，在體內(nèi)和在制備血清時(shí)FGF-23蛋白均可被切割。通過(guò)組合使用可分別識(shí)別如SEQ ID NO1所示的FGF-23蛋白中的介于第25位和第179位氨基酸之間的一段序列的抗體，識(shí)別介于第180位和第196位氨基酸之間的一段序列的抗體，和識(shí)別介于第197位和第251位氨基酸之間的一段序列的抗體，可以實(shí)現(xiàn)FGF-23蛋白的代謝物的檢測(cè)和測(cè)定。在本發(fā)明的抗體中，2C3B抗體可識(shí)別如SEQ IDNO1所示的FGF-23蛋白中的介于第25位和第179位氨基酸之間的一段序列，3C1E抗體可識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180位和第196位氨基酸之間的一段序列。1D6A抗體可識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第237位和第251位氨基酸之間的一段序列。需要特別指出的是，為了臨床實(shí)驗(yàn)等目的而檢測(cè)具有活性的FGF-23蛋白，根據(jù)制備血清時(shí)出現(xiàn)的切割現(xiàn)象，最好使用可識(shí)別介于第25位和第179位氨基酸之間的一段序列的抗體和可識(shí)別介于第180位和第196位氨基酸之間的一段序列的抗體的組合。特別地，利用2C3B抗體或者2C5L抗體作為固定化抗體，用3C1E作為檢測(cè)抗體，可以實(shí)現(xiàn)高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)。而且，為了檢測(cè)全長(zhǎng)FGF-23蛋白，最好使用可識(shí)別介于第25位和第179位氨基酸之間的一段序列的抗體和可識(shí)別介于第237位和第251位氨基酸之間的一段序列的抗體的組合。尤其是，利用2C3B抗體作為固定化抗體，1D6A抗體作為檢測(cè)抗體，可實(shí)現(xiàn)高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)。
3.低磷酸鹽血癥，佝僂病和骨軟化癥的診斷方法已有人提出，在ADHR病人中，F(xiàn)GF-23基因的錯(cuò)義突變參與了低磷酸鹽血癥的誘導(dǎo)(ADHR協(xié)會(huì)，常染色體顯性的低磷酸鹽血癥佝僂病與FGF23突變有關(guān)，Nature Genet.26345-348，2000)。另外，我們已經(jīng)鑒定FGF-23是一種疾病誘導(dǎo)因子，從而在腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥中會(huì)產(chǎn)生腫瘤(Shimada T，Mizutani S，Muto T，Yoneya T，Hino R，Takeda S，Takeuchi Y，F(xiàn)ujita T，F(xiàn)ukumoto S，和Yamashita T.，對(duì)作為腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥的致病因子的FGF23的克隆與表征，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，986500-6505，2001)。這些研究表明FGF-23可能參與了低磷酸鹽血癥、佝僂病和骨軟化癥伴隨的疾病。但是，尚未有在活的生物體中定量分析FGF-23的方法。在本發(fā)明中，我們已經(jīng)建立了如上所述的特異性FGF-23檢測(cè)系統(tǒng)。如實(shí)施例19中所示利用這種系統(tǒng)，可以定量測(cè)定腫瘤切除之前和腫瘤切除后從患有腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥的患者中采集到的血樣中所含的FGF-23。如圖14B所顯示的，雖然手術(shù)前表現(xiàn)出明顯高的血液FGF-23水平，但是腫瘤切除之后，血液中FGF-23的濃度降低至近檢測(cè)極限值。在腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥中，腫瘤一般較小，雖然諸如低磷酸鹽血癥，肌力下降，骨痛，或者骨軟化癥的病癥顯現(xiàn)出來(lái)，但是沒(méi)有發(fā)現(xiàn)致病性腫瘤。除此之外，當(dāng)腫瘤被觀察到時(shí)，不可能確定腫瘤是否產(chǎn)生FGF-23，以至于區(qū)分腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥和表現(xiàn)出相似癥狀的其它血磷酸鹽過(guò)少疾病的診斷是非常困難的。本發(fā)明中的測(cè)定方法使得從腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥患者的血液中檢測(cè)出FGF-23的增長(zhǎng)值成為可能，因此就能夠?qū)σ恍┯脗鹘y(tǒng)方法檢測(cè)不出來(lái)的疾病進(jìn)行診斷。
XLH，一種在遺傳性低磷酸鹽血癥患者中發(fā)病率最高的疾病，據(jù)說(shuō)每?jī)扇f(wàn)人中就有大約1例。造成XLH疾病的基因被鑒定為PHEX基因。該基因包含22個(gè)外顯子，基因區(qū)跨越220個(gè)kb，使得目前分析導(dǎo)致這種遺傳性低磷酸鹽血癥的突變來(lái)用于診斷的目的還不可能。該疾病發(fā)生突然，并且以在成人中發(fā)病為特征的類(lèi)型已經(jīng)有過(guò)報(bào)道。迄今為止，PHEX基因和FGF-23的關(guān)系尚未澄清。一種Hyp小鼠是已知的，它是一種自發(fā)性突變的小鼠，可作為XLH的模型動(dòng)物。在這種小鼠中，已證實(shí)PHEX基因的3’區(qū)缺失，并且已知該小鼠會(huì)發(fā)展成低磷酸鹽血癥，佝僂病或骨軟化癥。利用本發(fā)明中的測(cè)定系統(tǒng)，如實(shí)施例23所示，我們測(cè)定了Hyp小鼠中FGF-23的血液濃度，發(fā)現(xiàn)其中FGF-23的濃度非常高。
相應(yīng)于此，本發(fā)明的抗體，和利用該抗體的檢測(cè)方法或測(cè)定方法使得能夠診斷腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥和XLH。另外，應(yīng)該考慮本發(fā)明中的測(cè)定方法也可用于ADHR，該疾病是低磷酸鹽血癥的另一種形式，可能是由于FGF-23中的變異引起。
FGF-23具有降低血液中的磷濃度和1，25D濃度的活性。但是，其生理作用尚未得到很好的解釋。通過(guò)后面所述的中和FGF-23活性的實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，即使是在正常的情況下，F(xiàn)GF-23在維持磷或1，25D的代謝平衡中發(fā)揮了重要的作用。因此，F(xiàn)GF-23可能參與了磷代謝，并參與了腎臟疾病、腸道疾病、礦物質(zhì)代謝紊亂和維生素D代謝異常的疾病的發(fā)生，這些疾病與磷代謝密切相關(guān)。而且，給病人施用1，25D或它的一種衍生物，F(xiàn)GF-23的波動(dòng)可能影響發(fā)病和治療效果。本發(fā)明中的測(cè)定系統(tǒng)被認(rèn)為可以加深人們對(duì)于這些疾病發(fā)病的理解并完成了更為精確的醫(yī)療實(shí)踐。
4.以抑制FGF-23活性為特征的疾病治療方法已知，在腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥和ADHR中，F(xiàn)GF-23的過(guò)度作用誘導(dǎo)了這些疾病。另外，在本發(fā)明中，我們也揭示了在XLH疾病中，血液中具有高水平的FGF-23。人們認(rèn)為抑制FGF-23可改善低磷酸鹽血癥，佝僂病和骨軟化癥。根據(jù)FGF-23作用于腎臟的近端小管的上皮細(xì)胞的事實(shí)，抑制FGF-23可能對(duì)治療腎小管功能紊亂有意義。另外，根據(jù)FGF-23在控制磷代謝和維生素D代謝中的作用，F(xiàn)GF-23在與磷代謝異常有關(guān)的疾病，與鈣代謝異常有關(guān)的疾病，與骨代謝異常有關(guān)的疾病，伴隨腎功能下降的代謝異常疾病，伴隨著給腎衰竭病人進(jìn)行血液透析時(shí)的代謝異常疾病，和伴隨腎移植過(guò)程的疾病中可能發(fā)揮了不利的作用。與此類(lèi)似，有報(bào)道說(shuō)低磷酸鹽血癥在腎移植后有高發(fā)病率，該疾病伴隨著骨量減少的癥狀，表明FGF-23也在其中發(fā)揮了作用。在這些病例中，不但要將FGF-23從異常提高的水平恢復(fù)至正常水平，還需要進(jìn)一步降低正常值的FGF-23作為藥理治療手段。我們認(rèn)為實(shí)施例27和實(shí)施例28中所顯示能夠中和或者是修飾FGF-23活性的抗體對(duì)治療各種疾病是具有重要意義的。如實(shí)施例25所示，我們發(fā)現(xiàn)由于腎功能的下降而出現(xiàn)高磷酸鹽血癥的動(dòng)物具有明顯高的FGF-23水平。據(jù)認(rèn)為伴隨著腎功能下降的維生素D代謝異常疾病至少一部分是由于FGF-23水平升高引起的。另外我們也認(rèn)為伴隨FGF-23水平異常升高的疾病能夠利用本發(fā)明的抗體通過(guò)中和或除去FGF-23的活性來(lái)治療。需要指出的是，由于磷的代謝，鈣的代謝，和維生素D的代謝通過(guò)利用本發(fā)明的抗體進(jìn)行了改善，這些抗體在抵抗伴隨著礦物質(zhì)代謝異常的疾病，例如低血鈣癥，甲狀旁腺功能亢進(jìn)，異位鈣化，和搔癢，或者是伴隨著腎功能下降的骨代謝異常疾病，例如腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良，和透析性骨病方面可能是有療效的。而且，利用本發(fā)明的抗體在治療伴隨著鈣化的心血管機(jī)能減退疾病(該疾病是困擾血液透析病人的疾病)方面也可能是有療效的。此外，如實(shí)施例27所示，揭示了即使在正常的代謝條件下，F(xiàn)GF-23在礦物質(zhì)代謝和維生素D代謝中也發(fā)揮了非常重要的作用。考慮到FGF-23不僅可誘導(dǎo)高磷酸鹽血癥的事實(shí)，而且考慮到FGF-23可以快速的降低1，25D和通過(guò)1，25D可快速誘導(dǎo)FGF-23的事實(shí)，本發(fā)明的能中和或修飾FGF-23活性的抗體在抵抗礦物質(zhì)代謝異常的疾病方面可能得到廣泛的應(yīng)用。這是因?yàn)樵摽贵w通過(guò)抑制FGF-23的作用不僅控制磷的代謝，維生素D的代謝和鈣的代謝，而且間接地控制用于鈣代謝的激素，例如甲狀旁腺激素和降血鈣素。尤其是，本發(fā)明的抗體有望在治療有與礦物質(zhì)代謝和代謝轉(zhuǎn)換平衡有關(guān)各種各樣的發(fā)病形式的骨質(zhì)疏松癥、骨量減少癥、骨硬化癥或佩吉特氏病中發(fā)揮作用。正如上面所描述的那樣，本發(fā)明的抗體可抵抗上面所述的一種或多種疾病。
5.中和FGF-23生物學(xué)活性的抗體如上面所描述的那樣，F(xiàn)GF-23被認(rèn)為具有控制活體代謝的重要作用。控制這樣的因子的生物學(xué)活性的方法對(duì)于治療和預(yù)防各種疾病是有意義的?？贵w的特征在于可與抗原分子特異性結(jié)合，并已知依賴(lài)于其識(shí)別位點(diǎn)，其對(duì)抗原分子結(jié)構(gòu)和功能有影響。因此，我們以分離和鑒定一種可控制FGF-23功能，特別是，能夠抑制FGF-23的生物學(xué)活性的抗體為目標(biāo)。如實(shí)施例27和實(shí)施例28所示，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將一種可識(shí)別FGF-23的抗體進(jìn)行給藥后導(dǎo)致了血清中磷的濃度和血清中1，25D濃度的升高。特別是，在這些實(shí)施例中使用的本發(fā)明的抗體導(dǎo)致人類(lèi)FGF-23的降低血清磷和1，25D的活性完全消失，所述人類(lèi)FGF-23是在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)性地產(chǎn)生的。另外，在還沒(méi)有產(chǎn)生人類(lèi)FGF-23的對(duì)照小鼠中，證實(shí)了血清中的磷和維生素D的水平升高。這一現(xiàn)象與施用FGF-23時(shí)觀察到的變化完全相反。因此，本發(fā)明的這種抗體也被認(rèn)為能抑制小鼠的內(nèi)源性FGF-23。另外，這一現(xiàn)象表明，F(xiàn)GF-23作為控制磷代謝和維生素D代謝的因子，不僅在致病狀態(tài)中，而且在正常狀態(tài)中可以起作用。本發(fā)明的具有能導(dǎo)致FGF-23的生物學(xué)活性消失或弱化的抗體能控制生理學(xué)狀況和病理學(xué)病癥，這些病癥是FGF-23生物學(xué)活性的反應(yīng)。本發(fā)明的抗體能夠控制的FGF-23生物學(xué)活性的范圍不僅僅局限于磷代謝和維生素D的代謝。該抗體能控制FGF-23的每一種生物學(xué)活性和生理學(xué)活性。
此外，如實(shí)施例31所示，可利用識(shí)別FGF-23不同位點(diǎn)的兩種或多種類(lèi)型的抗體，即不同的抗原決定部位。在這一情況下，抗體的中和活性被提高了，這樣抗體的作用時(shí)間也能夠維持一段較長(zhǎng)的時(shí)間。兩種或多種類(lèi)型抗體組合的實(shí)例，包括可識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180位和第194位或介于第237位和第251位氨基酸殘基之間的氨基酸序列的抗體，和通過(guò)雜交瘤產(chǎn)生的抗體，所述雜交瘤的保藏號(hào)是FERM BP-7838，F(xiàn)ERM BP-7839，F(xiàn)ERM BP-7840，或FERMBP-8268。
6.包含抗FGF-23抗體的藥物組合物本發(fā)明的抗體或者是藥物組合物能應(yīng)用于由FGF-23在體內(nèi)產(chǎn)生的或涉及細(xì)胞表達(dá)FGF-23的各種疾病或癥狀的治療或預(yù)防上。本發(fā)明的抗體能用于抵抗腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥、ADHR和XLH的藥物組合物，并且可望在改善一般在低磷酸鹽血癥，骨鈣化功能障礙，骨痛，肌力下降，骨骼畸形，發(fā)育不良，和低1，25D癥(血液中1，25D水平低)等疾病中觀察到的病癥方面起作用。正如上面所描述的，F(xiàn)GF-23在生理狀況方面發(fā)揮了重要的作用。本發(fā)明的抗體能作為一種用于治療和預(yù)防由礦物質(zhì)或維生素D代謝異常引起的疾病(例如骨質(zhì)疏松癥，佝僂病，高鈣血特發(fā)性綜合癥，低鈣血癥，異位鈣化，骨硬化，骨生長(zhǎng)障礙，骨鈣化機(jī)能障礙，佩吉特氏病，甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥，甲狀旁腺功能減退癥，和搔癢)的藥物組合物，所述治療和預(yù)防是通過(guò)控制FGF-23的磷代謝控制作用，或由FGF-23控制的由維生素D的代謝介導(dǎo)的鈣代謝控制作用而實(shí)現(xiàn)的。而且，對(duì)患有腎功能衰竭的患者來(lái)說(shuō)，其血液中FGF-23的濃度升高是明確的。因此，本發(fā)明的抗體能作為藥物組合物用于治療和預(yù)防腎功能衰竭或血液透析的并發(fā)癥，該并發(fā)癥表現(xiàn)為腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良、透析性骨病、腎小管機(jī)能障礙等。
另外，本發(fā)明的抗體結(jié)合一種治療劑后能用作藥物組合物。在腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥中，已知由于腫瘤過(guò)多地產(chǎn)生FGF-23，誘發(fā)病癥。目前，唯一的治療方法包括除掉致病腫瘤。然而，致病腫瘤通常很小。已經(jīng)有許多研究報(bào)道了致病腫瘤最終被高能磁共振成像(MRI)搜索發(fā)現(xiàn)的實(shí)例。除此以外，還可能有許多因?yàn)闆](méi)有發(fā)現(xiàn)腫瘤，而未知致病原因的低磷酸鹽血癥或骨軟化癥的診斷實(shí)例。本發(fā)明的抗體被認(rèn)為能在這樣的疾病中在產(chǎn)生FGF-23的腫瘤中積累，這是由于與FGF-23的親和性。作為一種利用上述特性來(lái)退變(degenerating)腫瘤的方法，將治療劑同本發(fā)明的抗體相結(jié)合是有效的。能與抗體結(jié)合的治療劑的示例有(1)放射性同位素，例如碘(131碘131I；125碘125I)，釔(90釔90Y)，銦(111銦111In)，和锝(99m锝99mTc)(J.W.Goding，單克隆抗體原理和應(yīng)用，1993學(xué)術(shù)出版社)，(2)細(xì)菌毒素，例如假單胞菌毒素(假單胞菌外毒素)、白喉毒素和蓖麻毒素，和(3)化學(xué)治療劑，例如氨甲蝶呤、絲裂霉素和加利車(chē)霉素(calicheamicin)(D.J.King，單克隆抗體應(yīng)用和工程化，1998 T.J.International Ltd，M.L.Grossbard.，基于單克隆抗體治療癌癥，1998 Marcel Dekker Inc)。更優(yōu)選地，藥物前體，例如美登木素生物堿是比較好的選擇(Chari et al.，Cancer Res.，1992 52卷，Liu等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，1996，193卷8681)。
此外，本發(fā)明的范圍也包括一種藥物制劑，其包含抗人類(lèi)FGF-23抗體的純化產(chǎn)物。這樣的藥物制劑除了包含抗體外，優(yōu)選包含生理學(xué)相容的稀釋劑或載體，并且可以是混合了其它抗體或者是其它藥物(例如抗菌素)的產(chǎn)品。合適載體的例子包括，但不局限于，生理鹽水，磷酸鹽緩沖鹽水，磷酸鹽緩沖鹽水葡萄糖溶液，和緩沖生理鹽水?？贵w可以冷凍并干燥(冷凍干燥)，如果需要，上述的緩沖含水溶液可以加到抗體中，這樣可以重建和利用該抗體。服藥的方法可以是口服或者是非腸道吸收給藥方法，包括靜脈、肌肉、皮下和腹膜注射或者是藥物遞送。
當(dāng)利用本發(fā)明的藥物組合物對(duì)病人進(jìn)行給藥時(shí)，每次給藥的有效劑量可以選自每千克體重施用介于20ng和200mg之間的劑量。或者，每位病人按體重施用劑量介于0.001到10000mg之間，優(yōu)選0.005到2000mg之間，更優(yōu)選0.01至1000mg之間。然而，本發(fā)明的藥物組合物的劑量并不局限于上述劑量。
7.包含抗FGF-23抗體的醫(yī)療器具(medical appliance)在血液透析、血漿交換和細(xì)胞采集這樣的醫(yī)療技術(shù)中，將活體中的物質(zhì)從一部分采集到的體液或參與體外循環(huán)的體液中除掉、交換、采集。在這樣的醫(yī)療技術(shù)中，可利用本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合FGF-23分子的特性，選擇性地除掉活體中的FGF-23分子并選擇性地采集表達(dá)FGF-23的細(xì)胞。在血液透析和血漿交換中，有潛力的治療方法包括將本發(fā)明的抗體固定到與體液接觸的部分物質(zhì)上。作為透析膜的材料，除了纖維素膜以外，合成的聚合物膜，例如聚丙烯腈膜，聚甲基丙烯酸甲酯膜，聚乙烯-乙烯醇膜，聚砜膜，聚酰胺膜，聚醚砜/聚多芳基化合物膜等都可作為血液透析膜使用。對(duì)于這樣的膜，將抗體通過(guò)共價(jià)鍵固定在膜上后，可用于血液透析。而且，可以用填充有結(jié)合了抗體的珠子(例如瓊脂糖凝膠珠)的柱子分離體液。此外，另一種可能的方法包括將抗體固定在磁性珠上，將該抗體和抗體結(jié)合分子混合以提高其結(jié)合力，然后利用磁鐵收集抗體和靶物質(zhì)的復(fù)合物。利用這樣的方法收集到了細(xì)胞并且可用于治療。如上面描述的那樣，結(jié)合在基物上的本發(fā)明的抗體(所述基物適于作為醫(yī)療裝置)可作為醫(yī)療器具。
8.控制FGF-23分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的方法在體內(nèi)保持蛋白的生物學(xué)活性的重要一點(diǎn)是允許該蛋白在體內(nèi)維持其三維結(jié)構(gòu)。在生物學(xué)因子當(dāng)中，正像實(shí)施例中針對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)或者是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)觀察到的那樣，有許多這樣的例子一種生物學(xué)因子在體內(nèi)與另一種蛋白相結(jié)合以控制生物學(xué)活性。對(duì)FGF-23來(lái)說(shuō)，沒(méi)有已知的結(jié)合蛋白。本發(fā)明抗體的實(shí)例包括2C3B抗體，如實(shí)施例9所示，該抗體被認(rèn)為不用與部分肽結(jié)合，就可強(qiáng)烈識(shí)別FGF-23的結(jié)構(gòu)。因此可以設(shè)想能夠通過(guò)創(chuàng)造一種這些抗體或抗體的一部分結(jié)合到FGF-23上的狀態(tài)，來(lái)控制體內(nèi)FGF-23的生物學(xué)活性。
9.有效除去FGF-23的方法腎功能顯著下降要求從體內(nèi)除去尿毒癥物質(zhì)。對(duì)于除掉低分子量的尿毒癥物質(zhì)，在臨床上是利用透析膜來(lái)進(jìn)行血液透析。然而，除掉高分子量的蛋白在臨床上仍是一個(gè)問(wèn)題。本發(fā)明的抗體能夠用于專(zhuān)一性的除去FGF-23。和做血液透析一樣，將體外循環(huán)的血液與一種材料接觸，所述材料已固定了本發(fā)明的抗體，這樣FGF-23就能被選擇性的除掉。將該抗體作為一種用于治療FGF-23過(guò)量存在的疾病的工具是可行的。如實(shí)施例25所示，基于當(dāng)腎功能衰竭時(shí)FGF-23呈現(xiàn)高水平的事實(shí)，F(xiàn)GF-23可能是一種誘導(dǎo)透析性并發(fā)癥的因素。需要特別指出的是，由于FGF-23具有降低1，25D的作用，這樣FGF-23就非常有可能是誘導(dǎo)1，25D隨腎功能下降而降低的因子。因此，利用本發(fā)明的抗體去除透析病人的FGF-23的方法可用于透析性并發(fā)癥的治療。
如上面描述的那樣，我們通過(guò)獲得不僅能識(shí)別FGF-23，而且能控制涉及FGF-23的生理學(xué)作用、藥理學(xué)作用和病理學(xué)作用的抗體而完成了本發(fā)明，并且所述抗體能用于治療，預(yù)防，和診斷疾病。
10.競(jìng)爭(zhēng)性抗體的說(shuō)明在結(jié)合FGF-23方面，可識(shí)別與本發(fā)明的抗體所識(shí)別的位點(diǎn)相同的位點(diǎn)，或者與該位點(diǎn)非常接近的位點(diǎn)的抗體被認(rèn)為顯示與本文所示特性等同的特性。這樣一種基本上等同的抗體能通過(guò)進(jìn)行與競(jìng)爭(zhēng)性相關(guān)的試驗(yàn)來(lái)和其它的抗體相區(qū)別。當(dāng)允許2種或多種抗體共存時(shí)，顯示與抗原的結(jié)合時(shí)相互專(zhuān)一結(jié)合的特性的抗體被定義為競(jìng)爭(zhēng)性抗體。為了明確本發(fā)明的競(jìng)爭(zhēng)性抗體，在被標(biāo)記的本發(fā)明的抗體與FGF-23蛋白結(jié)合的條件下，使未作標(biāo)記的抗體過(guò)量存在，這樣就能進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)加入的抗體顯著地降低了本發(fā)明的抗體與FGF-23蛋白的結(jié)合時(shí)，就能夠確定加入的抗體同本發(fā)明的抗體競(jìng)爭(zhēng)。
本說(shuō)明書(shū)包括了日本專(zhuān)利申請(qǐng)第2001-401689號(hào)和第2002-262020號(hào)的說(shuō)明書(shū)和/或附圖中公開(kāi)的部分或全部?jī)?nèi)容，上述兩項(xiàng)申請(qǐng)是本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)文本。
附圖簡(jiǎn)述圖1A表明了利用抗FGF-23的多克隆抗體通過(guò)Western印跡法對(duì)重組體FGF-23蛋白和其代謝產(chǎn)物的測(cè)定結(jié)果，該多克隆抗體利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)經(jīng)過(guò)分離CHO-FGF23H細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液得到。在培養(yǎng)物的上清液中，提供了由在SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中的介于第179位和第180位氨基酸殘基之間的切割產(chǎn)生的全長(zhǎng)FGF-23H蛋白，和N-末端片段和C-末端片段。利用hFGF23-48抗體和hFGF23-148抗體對(duì)全長(zhǎng)FGF-23H蛋白和N-末端片段肽進(jìn)行了識(shí)別。對(duì)于N-末端片段，觀察到了小片段肽的存在。對(duì)全長(zhǎng)蛋白和N-末端片段利用抗6組氨酸標(biāo)記的抗體(anti-His6-tag抗體)進(jìn)行了測(cè)定。(實(shí)施例2)圖1B表明了從CHO-FGF-23細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中純化出的全長(zhǎng)FGF-23蛋白，N-末端片段和C-末端片段，CHO-FGF-23的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后通過(guò)考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色后所得到的測(cè)定結(jié)果。
圖1C表明了利用一種抗FGF 23-148抗體通過(guò)Western印跡法對(duì)一種重組體FGF-23蛋白，一種重組體FGF-23RQ蛋白，和其代謝產(chǎn)物的測(cè)定結(jié)果，這種抗FGF 23-148抗體是先通過(guò)分離CHO-FGF-23H細(xì)胞和CHO-FGF-23RQ細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液，然后再利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞得到的。(實(shí)施例5)圖2表明了利用一種hFGF23-25抗體作為固定化抗體，和一種hFGF23-237作為檢測(cè)抗體(這種檢測(cè)抗體是抗FGF-23的多克隆抗體)通過(guò)夾心式ELISA法對(duì)FGF-23H蛋白進(jìn)行測(cè)定后所得的結(jié)果。
(實(shí)施例7)圖3表明了利用抗FGF-23的單克隆抗體免疫沉淀FGF-23H蛋白后，利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離該蛋白，然后利用2A2B抗體和1C3H抗體對(duì)該蛋白進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。(實(shí)施例10)圖4表明了利用抗FGF-23單克隆抗體作為固定化抗體和抗FGF-23多克隆抗體作為檢測(cè)抗體通過(guò)夾心式ELISA法對(duì)純化后的FGF-23H全長(zhǎng)蛋白，N-末端多肽片段和C-末端多肽片段的測(cè)定結(jié)果。(實(shí)施例11)圖5概略性的表明了全長(zhǎng)FGF-23蛋白和其切割點(diǎn)，和抗FGF-23的單克隆抗體的識(shí)別位點(diǎn)。(實(shí)施例12)圖6表明了利用2C3B抗體作為一種固定化的抗體和1C3H，1D6A，和3C1E抗體作為檢測(cè)抗體通過(guò)ELISA系統(tǒng)對(duì)純化后的FGF-23蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)得到的結(jié)果。(實(shí)施例13)圖7表示了用固定了1C3H，1D6A，和2C3B抗體的樹(shù)脂將CHO-FGF23H細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裸鼠體中，從該裸鼠中采集血清，通過(guò)免疫沉淀方法從血清中采集了FGF-23H蛋白，然后通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離該蛋白，最后利用2A2B和1C3H抗體對(duì)蛋白進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。(實(shí)施例15)圖8表明了向20ng純化后的FGF-23蛋白中加入大鼠的血清，獲得了最終濃度為50％的混合溶液，混合該溶液，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離經(jīng)過(guò)0，0.5，1，2，4，8，或24小時(shí)培育后的代謝產(chǎn)物，利用2A2B抗體對(duì)該代謝產(chǎn)物進(jìn)行Western印跡法測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例16)圖9表明了向20ng純化后的FGF-23蛋白中加入人類(lèi)的血清或人類(lèi)的血漿，獲得了最終濃度為50％的混合溶液，將該混合溶液在37℃的環(huán)境中培育3小時(shí)，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離培養(yǎng)物，利用2A2B抗體對(duì)該分離物進(jìn)行Western印跡法測(cè)定的結(jié)果。
(實(shí)施例16)圖10表明了向20ng純化后的FGF-23蛋白中加入凝血酶，獲得了最終濃度為1單位/毫升的混合溶液，將該混合溶液在37℃的環(huán)境中培育3小時(shí)，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)培育物進(jìn)行分離，利用2A2B抗體對(duì)該分離物進(jìn)行Western印跡法測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例17)圖11表明了向20ng純化后的FGF-23蛋白中在添加有或未添加水蛭素(一種凝血酶選擇性抑制劑)的條件下加入大鼠的血清，獲得了一種最終濃度為50％的混合溶液，將該混合溶液培育4小時(shí)，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)培育物進(jìn)行分離，利用2A2B抗體對(duì)該分離物進(jìn)行Western印跡法測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例17)圖12表明了將10μg純化后的FGF-23蛋白和大鼠血清混合24小時(shí)以產(chǎn)生22kDa(一種分子量單位，為千道爾頓)的多肽，利用抗2A2B抗體柱純化這種22kDa多肽，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)純化后的產(chǎn)物進(jìn)行分離，再通過(guò)CBB染色法進(jìn)行鑒別的結(jié)果。(實(shí)施例18)圖13表明了利用ELISA系統(tǒng)(該系統(tǒng)利用2C3B抗體作為固定化抗體，和3C1E抗體或者是1D6A抗體作為檢測(cè)抗體來(lái)進(jìn)行檢測(cè))測(cè)定的血液樣品中FGF-23蛋白的測(cè)定結(jié)果，該蛋白采集自患有腫瘤性骨軟化癥的病人體內(nèi)中的致病性腫瘤提取前和提取后的血樣。(實(shí)施例19)圖14表明了對(duì)血液樣品中FGF-23蛋白的定量測(cè)定結(jié)果，該蛋白采集自患有腫瘤性骨軟化癥的病人體內(nèi)中的致病性腫瘤提取前和提取后的血樣。(實(shí)施例19)圖15表明了利用免疫組織學(xué)染色法測(cè)定的腫瘤組織中在FGF-23蛋白存在時(shí)的結(jié)果，該腫瘤組織采集自患有腫瘤性骨軟化癥的患者。
(實(shí)施例20)圖16A表明了利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離純化后的小鼠FGF-23RQ蛋白，然后利用3C1E抗體(該抗體是一種抗人類(lèi)FGF-23的單克隆抗體)通過(guò)Western印跡法對(duì)小鼠的FGF-23RQ蛋白進(jìn)行了測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例22)圖16B表明了利用2C3B抗體作為一種固定化抗體和3C1E抗體作為一種檢測(cè)抗體來(lái)測(cè)定純化后的小鼠FGF-23蛋白經(jīng)連續(xù)稀釋后的溶液的結(jié)果。(實(shí)施例22)圖17表明了利用2C3B抗體作為一種固定化抗體，和3C1E抗體作為一種檢測(cè)抗體通過(guò)ELISA系統(tǒng)對(duì)血清中內(nèi)生性FGF-23蛋白進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，該血清采集自27周至30周大的Hyp小鼠和對(duì)照小鼠。
(實(shí)施例23)
圖18A表明了給6個(gè)6周大的BALB/c雄性小鼠進(jìn)行給藥，劑量為每只小鼠5μg經(jīng)純化后的FGF-23蛋白，然后分別采集給藥1，4，和9小時(shí)后的血清，圖18A表明了對(duì)血清中1，25D濃度的測(cè)定結(jié)果。
(實(shí)施例24)圖18B表明了給6個(gè)6周大的BALB/c雄性小鼠通過(guò)腹腔進(jìn)行給藥，劑量為每只小鼠0.025μg的1，25D，然后采集給藥8小時(shí)后的血樣，圖18B表明了對(duì)血清中FGF-23的定量測(cè)定結(jié)果。(實(shí)施例24)圖19A表明了給7周大的的威斯塔氏小鼠服用以0.75％的一種比例混合了腺嘌呤的CE-2(日本CLEA公司)，這樣可在威斯塔氏小鼠體中產(chǎn)生一種腎功能衰竭性高磷酸鹽血癥模式，給一對(duì)照組威斯塔氏小鼠只服用CE-2(未混合腺嘌呤)。在給小鼠服用混合了腺嘌呤的藥劑3周之后，采集小鼠血樣后的血清中磷酸鹽濃度的測(cè)定結(jié)果。(實(shí)施例25)圖19B表明了給7周大的威斯塔氏小鼠服用以0.75％的一種比例混合了腺嘌呤的CE-2(日本CLEA公司)，這樣可在威斯塔氏小鼠體中產(chǎn)生一種腎功能衰竭性高磷酸鹽血癥模式，給一對(duì)照組威斯塔氏小鼠只服用CE-2(未混合腺嘌呤)。在給小鼠服用混合了腺嘌呤的藥劑3周之后，采集血樣和尿樣(血樣采集完后，將小鼠飼養(yǎng)在代謝性的籠子中，采集尿樣進(jìn)行24小時(shí))，圖19B表明了對(duì)血清中和尿中脲肌酸酐濃度的測(cè)定結(jié)果。(實(shí)施例25)圖19C表明了給7周大的威斯塔氏小鼠服用以0.75％的一種比例混合了腺嘌呤的CE-2(日本CLEA公司)，這樣可在威斯塔氏小鼠體中產(chǎn)生一種腎功能衰竭性高磷酸鹽血癥模式，給一對(duì)照組威斯塔氏小鼠只服用CE-2。在給小鼠服用混合了腺嘌呤的藥劑3周之后，采集小鼠血樣，然后利用2C3B抗體作為一種固定化抗體，和3C1E抗體作為一種檢測(cè)抗體通過(guò)ELISA系統(tǒng)對(duì)血清中的FGF-23濃度進(jìn)行了測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例25)圖20表明了利用免疫沉淀方法對(duì)FGF-23蛋白的測(cè)定結(jié)果，該蛋白存在于患有腫瘤性骨軟化癥的病人體內(nèi)的血漿中。(實(shí)施例26)圖21A表明了在接種各種單克隆抗體和一種載體24小時(shí)后，對(duì)血清中磷酸鹽，鈣，和1α，25-二羥基維生素D的濃度進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例27)圖21B表明了在接種3C1E單克隆抗體和一種載體8小時(shí)后，對(duì)血清中1α，25-二羥基維生素D的濃度進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例28)圖22A表明了在一組服用混合腺嘌呤(腺嘌呤組)的藥劑和一組服用一般的藥劑(對(duì)照組)之后第7天對(duì)血清中1α，25-二羥基維生素D的濃度進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。測(cè)定結(jié)果利用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示?！?”和“**”分別表示p＜0.05和p＜0.01，上述內(nèi)容均為通過(guò)Student-t(一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法)進(jìn)行顯著性測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例29)圖22B表明了在一組服用混合腺嘌呤(腺嘌呤組)的藥劑和一組服用一般的藥劑(對(duì)照組)之后第7天對(duì)血清中FGF-23的濃度進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。測(cè)定結(jié)果利用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示?！?”和“**”分別表示p＜0.05和p＜0.01，上述內(nèi)容均為通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例29)圖22C是兩種濃度的關(guān)系圖，兩種濃度分別為服用混合了已給出的腺嘌呤(腺嘌呤組)藥劑之后第7天測(cè)定的血清中FGF-23的濃度和1α，25-二羥基維生素D的濃度，該圖是通過(guò)個(gè)體小鼠的測(cè)定數(shù)據(jù)得到的。(實(shí)施例29)圖22D表明在一組服用混合腺嘌呤(腺嘌呤組)的藥劑和一組服用一般的藥劑(對(duì)照組)之后第7天，在接種3C1E抗體或一種載體，12小時(shí)之后測(cè)得的血清中1α，25-二羥基維生素D的濃度變化情況。測(cè)定結(jié)果利用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示?！?”和“**”分別表示p＜0.05和p＜0.01，上述內(nèi)容均為通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例29)圖23顯示了患有性連遺傳型低磷酸鹽血癥的6位病人的性別，已鑒定的phex基因的突變位點(diǎn)，被采集患者的年齡，和血清的FGF-23的濃度。(實(shí)施例30)圖24顯示給正常小鼠接種2種抗體(2C3B抗體和3C1E抗體)的混合物或一種載體(PBS)之后第1天和第2天對(duì)血清中的磷酸鹽濃度。測(cè)定值用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示?！?”和“**”分別表示p＜0.05和p＜0.01，上述內(nèi)容均為通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定的結(jié)果，上述結(jié)果與只給服用載體的組的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較?！癮”和“b”分別表示p＜0.05和p＜0.01，上述內(nèi)容為通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例31)圖25A顯示的是給野生型小鼠(WT)和Hyp小鼠(Hyp)重復(fù)接種包含有2C3B抗體和3C1E抗體的抗體(Ab)的混合物，或一種載體(PBS)后的第1天和第7天對(duì)血液中磷酸鹽濃度，1α，25-二羥基維生素D的濃度，和堿性磷酸酶總活性。血液中磷的濃度和堿性磷酸酶的活性值測(cè)定結(jié)果用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。“*”和“**”分別表示p＜0.01和p＜0.001，上述內(nèi)容為通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定的結(jié)果。血液中1α，25-二羥基維生素D的濃度通過(guò)混合體積相同的從每一組小鼠中采集的血漿樣品而制得的血漿進(jìn)行測(cè)定。(實(shí)施例32)圖25B顯示的是給野生型小鼠(WT)和Hyp小鼠(Hyp)用包含有2C3B抗體和3C1E抗體的混合物的抗體(Ab)，或一種載體(PBS)進(jìn)行一次接種后的第4天對(duì)血液中磷酸鹽濃度和1α，25-二羥基維生素D的濃度進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。測(cè)定結(jié)果用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示?！?”和“**”分別表示p＜0.01和p＜0.001，上述內(nèi)容為通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例32)圖25C顯示的是用Wester印跡法分析從腎臟中制得的腎近位細(xì)管刷狀緣膜囊(BBMV)中的NaPi2a蛋白的表達(dá)量的結(jié)果(上面)，和給野生型小鼠(WT)和Hyp小鼠(Hyp)用包含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體(Ab)，或一種載體(PBS)進(jìn)行一次接種之后的第4天對(duì)磷酸鹽轉(zhuǎn)移活性測(cè)定的結(jié)果(下面)。利用測(cè)試來(lái)校正BBMV的蛋白水平，用于Western印跡法CBB染色，染色后β-肌動(dòng)蛋白的影像同時(shí)顯示出來(lái)。每個(gè)實(shí)例中磷酸鹽轉(zhuǎn)移活性的測(cè)定結(jié)果用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差和n＝3來(lái)表示。(實(shí)施例32)圖25D給野生型小鼠(WT)和Hyp小鼠(Hyp)用包含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體，或一種載體(PBS)進(jìn)行一次接種之后的第4天，從小鼠腎臟中制備RNA，利用Northern(RNA轉(zhuǎn)移)吸印技術(shù)分析一個(gè)1αOH基因的表達(dá)變化，圖25D顯示了該基因的表達(dá)變化情況。(實(shí)施例32)圖26顯示了給正常的大鼠接種3C1E抗體或一種載體時(shí)，血液中骨鈣素濃度隨時(shí)間的變化情況。測(cè)定結(jié)果用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示?！?”和“**”分別表示p＜0.01和p＜0.001，上述內(nèi)容為通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例33)圖27顯示了給野生型小鼠(WT)和Hyp小鼠(Hyp)接種包含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體(Ab)，或一種載體(PBS)之后，從小鼠中所提取的股骨，脛骨和肋骨的放大的X-射線影像。(實(shí)施例32)圖28顯示的是兩種影像的比較，一種影像是給Hyp小鼠(Hyp/抗體)重復(fù)接種含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體后，其脛骨近端和股骨遠(yuǎn)端的骨組織影像，另一種影像是給Hyp小鼠(Hyp/載體)和野生型小鼠(WT/載體)服用載體后，其相應(yīng)位置的組織影像。提取的脛骨和股骨用Villanueva Bone染色。將它們植入樹(shù)脂中，然后制備成一種大約5μm厚的非脫鈣切片。這些樣品被染成不同的顏色類(lèi)骨質(zhì)染成紫色，鈣化骨染成亮橙色，低鈣化骨染成亮棕色，包埋進(jìn)樹(shù)脂中的細(xì)胞在可見(jiàn)光下呈亮紫色。(實(shí)施例32)圖29A顯示下組進(jìn)行卵巢切除一組小鼠(假切除/PBS)是假切除，施用載體(PBS)，一組小鼠(卵巢切除/混合抗體)卵巢切除，施用含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體，或一組小鼠(卵巢切除/PBS)后給其接種載體(PBS)后2星期時(shí)的血液中骨鈣素濃度(IRMA試劑盒，Immutopics，Inc.)。血液中骨鈣素濃度利用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。“*”和“**”分別表示p＜0.01和p＜0.001，上述內(nèi)容為通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例34)圖29B顯示了下組進(jìn)行卵巢切除一組小鼠(假切除/PBS)是假切除，施用載體(PBS)，一組小鼠(卵巢切除/混合抗體)進(jìn)行卵巢切除，施用接種含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體，或一組小鼠(卵巢切除/PBS)進(jìn)行卵巢切除，施用載體(PBS)后4星期時(shí)血液中骨鈣素濃度(IRMA試劑盒，Immutopics，Inc.)。血液中骨鈣素濃度利用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示?！?”和“**”分別表示p＜0.01和p＜0.001，上述內(nèi)容為通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例34)圖30A顯示了對(duì)如下組進(jìn)行卵巢切除一組小鼠(假切除/PBS)是假切除，給其接種載體(PBS)，一組小鼠(卵巢切除/混合抗體)進(jìn)行卵巢切除，給其接種含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體，或一組小鼠(卵巢切除/PBS)進(jìn)行卵巢切除，給其接種載體(PBS)后4星期的股骨中的骨鹽數(shù)量。股骨中的骨鹽數(shù)量和骨密度利用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示?！?”和“**”分別表示p＜0.05和p＜0.01，上述內(nèi)容為通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例34)圖30B顯示了對(duì)下組進(jìn)行卵巢切除一組小鼠(假切除/PBS)是假切除，給其接種載體(PBS)，一組小鼠(卵巢切除/混合抗體)進(jìn)行卵巢切除，給其接種含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體，或一組小鼠(卵巢切除/PBS)進(jìn)行卵巢切除，給其接種載體(PBS)。后4星期時(shí)的骨密度(骨密度計(jì)，DCS-600型，日本阿洛卡公司)。股骨中的骨鹽數(shù)量和骨密度利用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示?！?”和“**”分別表示p＜0.05和p＜0.01，上述內(nèi)容為通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例34)圖31A顯示了在對(duì)Hyp小鼠(Hyp/載體)重復(fù)皮下給藥(一星期一次)載體，含有2C3B抗體和3C1E抗體，量為4mg/kg的Hyp小鼠(Hyp/抗體低劑量)，16mg/kg的相同的混合物對(duì)Hyp小鼠(Hyp/低劑量的抗體，16mg/kg的相同的混合物對(duì)Hyp小鼠(Hyp/高劑量的抗體)后定期測(cè)量尾椎骨的全長(zhǎng)的結(jié)果。這些結(jié)果利用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。“**”表示p＜0.01，其為當(dāng)測(cè)量結(jié)果與接種載體的Hyp組結(jié)果相比較時(shí)，通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定而得到的。
(實(shí)施例35)圖31B同樣顯示了共分四組的實(shí)驗(yàn)，一組Hyp小鼠(Hyp/載體)通過(guò)皮下注射重復(fù)接種載體；一組Hyp小鼠(Hyp/低劑量抗體)按4毫克/千克的劑量通過(guò)皮下注射重復(fù)接種含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體；相同的混合抗體按16mg/千克的劑量通過(guò)皮下注射重復(fù)接種另一組Hyp小鼠(Hyp/高劑量抗體)；或一組野生型小鼠(WT/載體)通過(guò)皮下注射重復(fù)接種載體，之后定期(每周一次)測(cè)量這些小鼠的脛骨全長(zhǎng)的結(jié)果。這些結(jié)果利用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。“**”表示p＜0.01，其為當(dāng)測(cè)量結(jié)果與接種載體的Hyp組結(jié)果相比較時(shí)，通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定而得到的。(實(shí)施例35)
圖31C顯示了共分四組的實(shí)驗(yàn)，一組Hyp小鼠(Hyp/載體)通過(guò)皮下注射重復(fù)接種載體；一組Hyp小鼠(Hyp/低劑量抗體)按4毫克/千克的劑量通過(guò)皮下注射重復(fù)接種含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體；相同的混合抗體按16mg/千克的劑量通過(guò)皮下注射重復(fù)接種另一組Hyp小鼠(Hyp/高劑量抗體)；或一組野生型小鼠(WT/載體)通過(guò)皮下注射重復(fù)接種載體，之后定期(每周一次)測(cè)量這些小鼠的體重變化的結(jié)果。這些結(jié)果用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。*”和“**”分別表示p＜0.05和p＜0.01，其為當(dāng)測(cè)量結(jié)果與接種載體的Hyp組結(jié)果相比較時(shí)，通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定而得到的。
(實(shí)施例35)圖32顯示了在對(duì)Hyp(載體)皮下重復(fù)給藥(一星期一次)，含有2C3B抗體和3C1E抗體的抗體混合物，量4mg/kg的Hyp小鼠(Hyp/低劑量抗體)；或?qū)yp小鼠16mg/kg的相同的混合物抗體(Hyp/高劑量抗體)，和對(duì)野生型小鼠(野生型/載體)的載體后提取股骨并且焚燒31天后的干骨重中骨灰重的比例。這些結(jié)果利用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。*”表示p＜0.001，其為當(dāng)測(cè)量結(jié)果與施用載體的Hyp組結(jié)果相比較時(shí)，通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定而得到的。
圖33顯示了利用以2C3B或2C5L抗體作為固定抗體，3C1E作為檢測(cè)抗體的ELISA系統(tǒng)對(duì)純化的FGF-23蛋白進(jìn)行了定量測(cè)定的結(jié)果。(實(shí)施例36)圖34顯示了在給藥之前和對(duì)未處理的正常小鼠的組(未處理/載體)施用一種載體，和載體(FGF-23/PBS)，2C5L抗體(FGF-23/2C5L)，或?qū)σ呀?jīng)用等滲泵連續(xù)施用人重組FGF-23的各組施用2C3B抗體(FGF-23/2C3B)后24小時(shí)時(shí)的血液磷酸的濃度。這些結(jié)果利用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。*”表示p＜0.001，該結(jié)果為每一組在抗體接種前，其測(cè)量結(jié)果與服用載體的組結(jié)果相比較時(shí)，通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定而得到的?！?”和“##”分別表示p＜0.01和p＜0.001，其為通過(guò)Student-t對(duì)每一組在接種抗體前和接種抗體后第24小時(shí)進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。“+”，“++“和“+++”分別表示p＜0.05，p＜0.01和p＜0.001，其為當(dāng)接種抗體的每一組與接種FGF-23/PBS 24小時(shí)后的組相比較時(shí)，通過(guò)Student-t進(jìn)行顯著性測(cè)定而得到的。(實(shí)施例38)。
序列表內(nèi)容SEQ ID NOs2-8合成DNASEQ ID NOs9-24合成肽SEQ ID NOs25-36合成DNA完成本發(fā)明的最佳模式參照以下實(shí)施例，本發(fā)明將可解釋的更加明確，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例所描述的實(shí)施方案及技術(shù)范疇。
實(shí)施例1重組體FGF-23表達(dá)型載體的構(gòu)建(1)FGF-23H蛋白表達(dá)型載體的制備編碼FGF-23的cDNA在96℃的條件下保持1分鐘后，進(jìn)行35個(gè)PCR循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)包括96℃，30秒；55℃，30秒；和72℃，30秒。PCR反應(yīng)的模板為腫瘤性骨軟化癥的腫瘤中的cDNA文庫(kù)，引物為F1EcoRI(見(jiàn)SEQ ID NO2)和LHisNot(見(jiàn)SEQ ID NO3)，酶為L(zhǎng)A-TaqDNA聚合酶。F1EcoRI引物對(duì)與編碼FGF-23的5’端遠(yuǎn)上游核苷酸序列進(jìn)行退火反應(yīng)，使得在編碼FGF-23 5’端的擴(kuò)增片段上增加一個(gè)EcoRI限制性酶切位點(diǎn)。LHisNot引物包含一段在編碼FGF-23的序列的5’端終止密碼子序列處退火的序列，和編碼一個(gè)6組氨酸標(biāo)記序列(His-His-His-His-His-His)的一段序列，還包括終止密碼子和一個(gè)Not I限制性酶切序列。因此，擴(kuò)增片段編碼FGF-23蛋白的一段序列，該序列在C-末端增加有6個(gè)組氨酸，在6個(gè)組氨酸序列的下游還有一個(gè)Not I限制性酶切位點(diǎn)。該擴(kuò)增片段用EcoR I和Not I消化，然后連接到pcDNA3.1 Zeo載體上(美國(guó)，Invitrogen公司)，該載體為一種動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體，具有與EcoR I和Not I消化方式相類(lèi)似的消化特征?？寺≈苽涞脑摫磉_(dá)載體，測(cè)定其核苷酸序列，以保證其編碼的靶FGF-23蛋白具有6個(gè)組氨酸序列。該載體指的是pcDNA FGF-23H。
F1EcoRICCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG(見(jiàn)SEQ ID NO2)
LHisNotATAAGAATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGATGAACTTGGCGAA(見(jiàn)SEQ ID NO3)(2)FGF-23蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建在94℃的條件下保持1分鐘，然后進(jìn)行25個(gè)PCR循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)的條件是利用pcDNA/FGF-23H作為模板，并且利用F1EcoRI和LNoT(見(jiàn)SEQ ID NO4)作為引物，和LA-Taq DNA聚合酶，94℃，30秒；55℃，30秒；和72℃，1分鐘。經(jīng)過(guò)反應(yīng)以后，利用T4 DNA聚合酶(瑞士羅氏公司)處理PCR產(chǎn)物使其具有粘性末端制備一種編碼FGF-23的cDNA片段，和利用多核苷酸激酶(瑞士羅氏公司)使DNA末端磷酸化。一種pCAGGS表達(dá)載體(Niwa H等，基因，1991，108193-199)利用EcoR I進(jìn)行消化，用Klenow片段(瑞士羅氏公司)使其末端粘性化，然后利用牛的小腸堿性磷酸酶(日本寶酒造公司)脫磷酸。這樣制備的編碼FGF-23的cDNA片段結(jié)合到一種pCAGGS載體上。對(duì)如此制備的表達(dá)載體進(jìn)行克隆并且對(duì)核苷酸序列進(jìn)行測(cè)定，這樣確保一種編碼FGF-23蛋白的靶序列能精確的插入到載體中。這里的載體指的是pCAGGS/FGF-23。
上述編碼FGF-23的片段利用F1EcoRI引物和LNot引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后用EcoR I和Not I消化，最后對(duì)其進(jìn)行純化。純化的產(chǎn)物通過(guò)插入到一種已經(jīng)通過(guò)將分子內(nèi)的核糖體進(jìn)入序列(IRES)和增強(qiáng)類(lèi)型的綠熒光蛋白(EGFP)連接到pEAK表達(dá)載體(Edge生物系統(tǒng)，美國(guó))而制備的pEAK8/IRES/EGFP載體的EcoR I和Not I的限制性酶切位點(diǎn)中得以克隆。對(duì)獲得的質(zhì)體核苷酸序列進(jìn)行測(cè)定，證明該序列編碼FGF-23蛋白。這個(gè)載體指的是pEAK8/IRES/EGFP/FCG-23。
LNotATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA(見(jiàn)SEQ ID NO4)pCAGGS/FGF-23用EcoR I消化后，變得線性化，然后用Klenow片段(瑞士羅氏公司)使其具有粘性末端。用BamH I進(jìn)一步消化。一段含有FGF-23的cDNA的DNA片段被分離得到并用瓊脂糖電泳進(jìn)行純化。而且，一個(gè)INPEP4表達(dá)載體用Bgl II消化，用Klenow片段(瑞士羅氏公司)使其具有粘性末端，用BamH I消化，然后進(jìn)行瓊脂糖電泳，純化載體。含有FGF-23 cDNA的片段與載體相連?？寺≈苽涑鰜?lái)的表達(dá)載體，測(cè)定其核苷酸序列，證實(shí)準(zhǔn)確插入了編碼FGF-23的蛋白的靶序列。該載體指的是INPEP4/FGF-23。
(3)FGF-23RQH表達(dá)載體的構(gòu)建已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FGF-23蛋白在第179位精氨酸和第180位絲氨酸之間易于切割。切割位點(diǎn)的N-末端氨基酸序列是精氨酸(第176位)-組氨酸(第177位)-蘇氨酸(第178位)-精氨酸(第179位) (見(jiàn)SEQID NO31)，與精氨酸-X-X-精氨酸序列相同，該序列為一種蛋白轉(zhuǎn)化酶的識(shí)別序列。而且，已知ADHR中的錯(cuò)義突變是第176位或第179位的精氨酸殘基的替代突變。因此，為了制備一個(gè)突變的FGF-23蛋白(這里指FGF-23RQH)作為突變的FGF-23在ADHR中可進(jìn)行識(shí)別的模型，我們構(gòu)建了一個(gè)載體，該載體通過(guò)蛋白轉(zhuǎn)化成的酶而表現(xiàn)出對(duì)切割具有抗性，其在C-末端具有6組氨酸標(biāo)記，和因替代第176位和第179位的精氨酸殘基而具有谷氨酰胺殘基。在該制備方法中，合成了兩條引物，一條是RQF正向引物(見(jiàn)SEQ ID NO5)，另一條是RQR反向引物(見(jiàn)SEQ ID NO6)，它們包含有核苷酸替代序列，并可用谷氨酰胺代替精氨酸。而且，為了擴(kuò)增5’端和3’端突變引入位點(diǎn)的FGF-23序列，與這些核苷酸替代引物一起，還制備了另外兩條引物ME1(見(jiàn)SEQ ID NO7)和HNt(見(jiàn)SEQ ID NO8)。ME1是一個(gè)正向引物，含有由FGF-23 cDNA編碼的起始密碼子，并具有EcoR I限制性酶識(shí)別序列。HNt是一個(gè)反向引物，能在由FGF-23 cDNA編碼的起始密碼子前插入一個(gè)編碼6組氨酸標(biāo)記序列的密碼子，并增加一個(gè)Not I限制性酶識(shí)別序列。
RQFATACCACGGCAGCACACCCAGAGCGCCGAG(見(jiàn)SEQID NO5)RQRCTCGGCGCTCTGGGTGTGCTGCCGTGGTAT(見(jiàn)SEQID NO6)ME1ATGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGG(見(jiàn)SEQ ID NO7)HNtATGCGGCCGCCTA ATGATGATGATGATGATGGATGAACTTGGCGAAGGG (見(jiàn)SEQ ID NO8)PCR反應(yīng)體系包括10ng pGAGGS/FGF-23作為模板，RQF和HNt的結(jié)合引物，ME1和RQR的結(jié)合引物(每個(gè)引物200nM)。反應(yīng)所用的酶為pfu DNA聚合酶(美國(guó)普洛麥格公司)。在94℃的條件下保持1分鐘，然后進(jìn)行25個(gè)PCR循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)包括94℃，30秒；55℃，30秒；和72℃，1分鐘。得到的兩種類(lèi)型的反應(yīng)溶液均稀釋10倍。將反應(yīng)溶液混合(每種1μl)，制成模板。ME1和HNt以終濃度為200nM加到模板中，制備成50μl的PCR反應(yīng)溶液。在94℃的條件下保持1分鐘，然后進(jìn)行25個(gè)PCR循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)包括94℃，30秒；55℃，30秒；和72℃，1分鐘。反應(yīng)中用的酶為L(zhǎng)A TaqDNA聚合酶(日本寶酒造公司)。得到的長(zhǎng)約800bp(堿基對(duì))的擴(kuò)增產(chǎn)物用EcoR I和Not I消化，然后純化，產(chǎn)物中包含有插入的DNA序列。它是通過(guò)插入到pEAK8/IRES/EGFP載體的EcoR I和Not I限制酶位點(diǎn)中得以克隆的，pEAK8/IRES/EGFP載體通過(guò)在pEAK8表達(dá)載體(Edge生物系統(tǒng)公司，美國(guó))上連接分子內(nèi)核糖體進(jìn)入序列(IRES)和加強(qiáng)型綠色熒光蛋白(RGFP)而得。測(cè)定得到的質(zhì)體的核苷酸序列，證實(shí)第176位和第179位的精氨酸殘基如期轉(zhuǎn)換成谷氨酰胺殘基，并且編碼加于C-末端含有6個(gè)組氨酸標(biāo)記的突變FGF-23蛋白。該載體指的是pEAK8/IRES/EGFP/FGF-23RQH。
實(shí)施例2重組體FGF-23蛋白和重組體突變FGF-23蛋白的表達(dá)(1)FGF-23H表達(dá)細(xì)胞的獲得通過(guò)在載體中的抗氨芐青霉素基因內(nèi)的Fsp I限制酶位點(diǎn)處切割使大約20μg的pcDNAFGF-23H線性化，然后被純化。純化的產(chǎn)物溶于10μl純水中，與1×107CHO Ras克隆-1細(xì)胞(Shirahata S.等，生物科學(xué)、技術(shù)與生物化學(xué)，59345-347，1995)混合，利用Gene PulserII(Bio Rad，美國(guó))通過(guò)電穿孔法將該基因引入到細(xì)胞中。這些培育細(xì)胞在含有10％胎牛血清(FCS)的MEMα培育溶液(Gibco BRL，美國(guó))中培育24小時(shí)后，Zeocin(美國(guó)英杰生命技術(shù)公司)以終濃度為0.5mg/ml加到溶液中，混合溶液，培育1周。粘著的和生長(zhǎng)的細(xì)胞用胰蛋白酶培育，然后在Zeocin最終濃度為0.3mg/ml時(shí)用限制稀釋法對(duì)其進(jìn)行克隆，由此得到了35種類(lèi)型的克隆細(xì)胞。所有細(xì)胞中表達(dá)FGF-23H蛋白的細(xì)胞通過(guò)下面的Western印跡法以最高水平得以鑒定。收集每一種克隆細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。然后得到的蛋白轉(zhuǎn)移至一種聚偏氟乙烯膜(美國(guó)Millipore公司)上，利用抗組氨酸標(biāo)記(C-末端)的抗體(美國(guó)英杰生命技術(shù)公司)和ECL發(fā)光系統(tǒng)(美國(guó)Amersham Pharmacia Biotech公司)對(duì)FGF-23H蛋白上的信號(hào)分子序列(約32KDa)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)的結(jié)果，表達(dá)量最高的#20克隆命名為CHO-OST311，然后利用與2000年8月11日(編號(hào)為FERM BP-7273)的申請(qǐng)相同的方法保存在日本現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)科學(xué)和技術(shù)國(guó)家研究所的國(guó)際專(zhuān)利生物體保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)。這里的CHO-OST311指的就是CHO-FGF23H。
(2)表達(dá)FGF-23和表達(dá)FGF-23RQH的細(xì)胞的獲得利用膜融合脂，通過(guò)基因轉(zhuǎn)移方法將pEAK8/IRES/EGFP/FGF-23和pEAK8/IRES/EGFP/FGF-23RQH載體轉(zhuǎn)入到CHO Ras克隆-1細(xì)胞中。CHO Ras克隆-1細(xì)胞培育至細(xì)胞覆蓋6孔板的底面約60％的程度。然后，將培育溶液轉(zhuǎn)移，加入1ml不含血清的MEMα培育液。2.5μg的載體和10μl的Transfectam(商標(biāo))(美國(guó)普洛麥格公司)各自與50μl的不合血清的MEMα培育液相混合。然后這兩種混合溶液再混合，培育10分鐘，混合，然后再加到原來(lái)的6孔板中。培育2小時(shí)之后，含有DNA的培育溶液被轉(zhuǎn)移，由含有10％FCS的培養(yǎng)液代替，然后培養(yǎng)液培育過(guò)夜。次日，加入最終濃度為5μg/ml的嘌羅霉素(美國(guó)Sigma公司)，以選擇抗藥性細(xì)胞。以這種方式獲得的抗藥性細(xì)胞通過(guò)類(lèi)似于上述獲得FGF-23H表達(dá)細(xì)胞的限制稀釋法進(jìn)行克隆。而且，通過(guò)Western印跡法選擇最高水平表達(dá)靶蛋白的細(xì)胞線。這些細(xì)胞分別指CHO-FGF23和CHO-FGF23RQ。
(3)重組蛋白的純化當(dāng)利用抗6組氨酸標(biāo)記序列的抗體通過(guò)Western印跡法從CHO-FGF23H的培養(yǎng)物上清液中檢測(cè)出重組體時(shí)，一條約32kDa的帶和一條約10kDa的帶被識(shí)別，見(jiàn)圖1A。當(dāng)把兩條帶從凝膠中切下來(lái)，測(cè)定N-末端的氨基酸序列時(shí)，從大分子量的帶中檢測(cè)出一個(gè)起始于SEQID NO1中的第25位氨基酸殘基的一段氨基酸序列，表明信號(hào)分子序列在從FGF-23蛋白分泌的過(guò)程中被除去。另一方面，已確定小分子量的帶含有的一段氨基酸序列始于SEQ ID NO1中的第180位氨基酸殘基，表明該片段是從第179位和第180位切割處產(chǎn)生的。通過(guò)利用識(shí)別FGF-23的N-末端的多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，證明存在一段至第179位的序列。
1000ml CHO-FGF23H細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液在4℃，16,200g離心15分鐘，以除去懸浮的細(xì)胞。然后上清液通過(guò)一個(gè)充滿(mǎn)SP-瓊脂糖凝膠FF(商標(biāo))(美國(guó)Amersham Pharmacia生物技術(shù)有限公司)的柱子(內(nèi)徑為30mm×200mm長(zhǎng))，以使相應(yīng)于SEQ ID NO1中的第180位至第251位氨基酸殘基的肽和具有6組氨酸標(biāo)記序列的肽通過(guò)柱子而不被吸收，而相應(yīng)于SEQ ID NO1(從這里開(kāi)始，該段可能也指全長(zhǎng)FGF-23蛋白)中的具有6組氨酸標(biāo)記序列的第25位至第251位氨基酸殘基的肽被吸附在柱子上。當(dāng)柱子上吸附的物質(zhì)用氯化鈉濃度梯度溶液(用50mM的磷酸鈉緩沖液配制成從0至0.7M的氯化鈉溶液，pH 6.7)洗脫時(shí)，發(fā)現(xiàn)用約0.3M的氯化鈉溶液可將一部分含有6組氨酸標(biāo)記的全長(zhǎng)FGF-23蛋白洗脫掉，從SEQ ID NO1的第179位氨基酸殘基至N-末端的序列可用約0.4M的氯化鈉溶液洗脫掉。用SP-瓊脂糖凝膠柱以這種方式分離得到的片段可進(jìn)一步將它們通過(guò)Talon Superflow(商標(biāo))(Clontech公司，美國(guó))金屬親和柱進(jìn)行分離。由于從第179位氨基酸殘基至N-末端范圍的序列也與金屬柱有親和性，這對(duì)于提高純化效果是有效的。為了全長(zhǎng)FGF-23蛋白通過(guò)CBB染色可得到單一條帶，利用SP-瓊脂糖凝膠柱進(jìn)一步純化。結(jié)果見(jiàn)圖1B。
FGF-23蛋白也可用一種相似的方法進(jìn)行純化。CHO-FGF23的培養(yǎng)物上清液通過(guò)一個(gè)孔徑為0.2μm的SuperCap(商標(biāo))(Pall Gelman實(shí)驗(yàn)室，美國(guó))膜過(guò)濾，然后過(guò)濾后的溶液加到SP-瓊脂糖凝膠FF(美國(guó)Amersham Pharmacia生物技術(shù)有限公司)。和柱子親和力弱的物質(zhì)用50mM的磷酸鈉緩沖液(pH 6.7)洗滌下來(lái)。當(dāng)滯留在柱子中的蛋白用0至0.7M的氯化鈉濃度梯度溶液洗脫時(shí)，發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)FGF-23蛋白被洗脫進(jìn)了0.3MnaCl的組分中。蛋白被吸附于Talon Superflow(商標(biāo))(克隆技術(shù)公司(Clontech)，美國(guó))金屬親和柱上，用50mM的磷酸鈉緩沖液(pH 6.7)洗脫，然后向柱內(nèi)加入各種濃度的咪唑，洗脫和純化蛋白。而且，進(jìn)一步將含有靶蛋白的級(jí)分吸附于一種SP-瓊脂糖凝膠FF柱上進(jìn)行洗脫，然后純化。利用類(lèi)似方法，全長(zhǎng)FGF-23RQ蛋白從CHO-FGF23RQ的上清液中純化出來(lái)。
實(shí)施例3產(chǎn)生抗人類(lèi)FGF-23的小鼠單克隆抗體的雜交瘤的獲得根據(jù)“單克隆抗體實(shí)驗(yàn)方案的介紹”等中敘述的一般方法，在本實(shí)施例中制備了單克隆抗體(Tamie Ando，等，Tan-kurokh KoutaiJikken Sosa Nyumon，KODANSHA，1991)。用于免疫的動(dòng)物是Balb/c小鼠。人類(lèi)FGF-23免疫是根據(jù)免疫原的差異，在2個(gè)類(lèi)型的方法后進(jìn)行的。
(1)利用載體的給藥和重組蛋白的給藥的結(jié)合來(lái)免疫初始時(shí)對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行免疫是通過(guò)引入實(shí)施例1中制備的INPEP4/FGF-23載體(10或50μg/小鼠)利用Trans IT(商標(biāo))體內(nèi)基因多樣性系統(tǒng)試劑(日本寶酒造公司) 進(jìn)行靜脈注射。助促進(jìn)免疫反應(yīng)是通過(guò)初始免疫后每周一次引進(jìn)相同載體來(lái)進(jìn)行的。將實(shí)施例2中制備的FGF-23RQH蛋白(20-30μg/小鼠)懸浮于含有三十碳六烯，吐溫80(聚山梨醇酯80)，單磷酰脂A和海藻糖霉菌酸酯的RIBI佐劑(Corixa，美國(guó))中。加強(qiáng)免疫是通過(guò)腹膜注射乳液4或5次來(lái)進(jìn)行的。隨后，在得到下面描述的脾細(xì)胞之前第4天時(shí)，小鼠用尾靜脈注射實(shí)施例2中制備的FGF-23H蛋白(18μg/小鼠)的方法進(jìn)行免疫。
(2)用人類(lèi)FGF-23進(jìn)行免疫初始免疫利用Balb/c小鼠通過(guò)腹膜注射一種懸浮液，該懸浮液是通過(guò)在上述RIBI佐劑中懸浮實(shí)施例2中制備的FGF-23(22μg/小鼠)而制得的。加強(qiáng)免疫是通過(guò)腹膜注射同一種蛋白，每周一次，持續(xù)4周以上。在得到下面描述的脾細(xì)胞之前第3天時(shí)，通過(guò)尾靜脈給小鼠注射實(shí)施例2中制備的FGF-23H蛋白(10μg/鼠)的方法進(jìn)行免疫。
(3)雜交瘤的制備和選擇切除小鼠的脾臟，按照上述方法進(jìn)行免疫。從脾臟中采集到的脾細(xì)胞與小鼠的骨髓瘤SP2/0(ATCC∶CRL 1581)以5∶1的比例混合，然后細(xì)胞用聚氧乙烯1500(日本羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)作為一種融合劑進(jìn)行融合，制備雜交瘤。雜交瘤通過(guò)在含有HAT，含有10％胎牛血清(FCS)，次黃嘌呤(H)，氨基喋呤(A)和胞嘧啶(T)的DMEM培氧基(Gibco BRL，美國(guó))上培育細(xì)胞而進(jìn)行選擇?？寺∈抢煤蠬T的DMEM(達(dá)爾伯克氏必需基本培養(yǎng)基)培養(yǎng)基通過(guò)限制稀釋法而進(jìn)行。因此，最終獲得從單個(gè)細(xì)胞衍生而來(lái)的克隆雜交瘤。
(4)產(chǎn)生抗FGF-23抗體的克隆雜交瘤的選擇產(chǎn)生專(zhuān)一性識(shí)別FGF-23蛋白抗體的雜交瘤通過(guò)檢測(cè)由雜交瘤產(chǎn)生的抗體和FGF-23蛋白的結(jié)合來(lái)選擇。根據(jù)第一種免疫方法獲得的雜交瘤以下面的方法來(lái)進(jìn)行選擇。向用于ELISA(Maxisorp(商標(biāo))，Nunc，美國(guó))實(shí)驗(yàn)的一個(gè)96孔微量培養(yǎng)板中加入50μl在50mM碳酸氫納溶液中稀釋至1μg/ml的FGF-23H蛋白溶液。在37℃培育30分鐘或4℃培育10小時(shí)，使得FGF-23H蛋白吸附在微量培養(yǎng)板上。接下來(lái)，除去該溶液，一種阻滯劑(SuperBlock(商標(biāo))Blocking Buffer，PIERCE，美國(guó))加到每個(gè)孔中，然后在室溫培育30分鐘。每個(gè)孔用含有0.1％吐溫20(包含500mM氯化鈉的TRIZMA預(yù)置晶體(商標(biāo))，美國(guó)Sigma公司)(T-TBS，為三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水)的Tris(三羥甲基氨基甲烷緩沖液)緩沖鹽溶液洗滌兩次。取每種類(lèi)型的雜交瘤培養(yǎng)物上清液50μl加入到已被上述的FGF-23H蛋白包被的微量培養(yǎng)板的每個(gè)孔中。反應(yīng)30分鐘后，每個(gè)孔用T-TBS(Tris緩沖鹽溶液)洗滌兩次。接下來(lái)，向每個(gè)孔中加入50μl稀釋3000倍的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(Zymed實(shí)驗(yàn)室，美國(guó))，在室溫培育30分鐘。利用T-TBS(三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水，下同)洗滌每個(gè)孔3次后，向孔中加入50μl含有N-四甲聯(lián)苯胺(丹麥，DAKO)的底物緩沖液，在室溫培育15分鐘。隨后，向每個(gè)孔中加入50μl 0.5M的硫酸，以停止反應(yīng)。450nm波長(zhǎng)下的吸收值通過(guò)一個(gè)微量培養(yǎng)板閱讀器(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)參照570nm波長(zhǎng)的吸收值進(jìn)行測(cè)定。選擇吸收值明顯增加的雜交瘤，利用FGF-23蛋白做相同實(shí)驗(yàn)，再次確保選擇的是與FGF-23結(jié)合的克隆。因此，得到了9種類(lèi)型的作為產(chǎn)生識(shí)別FGF-23蛋白的抗體的雜交瘤克隆。
在這些克隆中，包括下述的1C3H，1D6A，2A2B，2C3B和2C5L。
通過(guò)二次免疫方法獲得的雜交瘤按照下列步驟進(jìn)行選擇。向用于ELISA(Maxisorp(商標(biāo))，Nunc，美國(guó))實(shí)驗(yàn)的96孔微量培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入50μl在50mM的碳酸氫鈉溶液中稀釋至1μg/ml的FGF-23蛋白溶液。在4℃培育10小時(shí)，以使FGF-23蛋白吸附在微量培養(yǎng)板上。隨后，除去溶液，一種阻滯劑(SuperBlock(商標(biāo))BlockingBuffer，PIERCE，美國(guó))加到每個(gè)孔中，然后在室溫培育30分鐘。每個(gè)孔用含有0.1％吐溫20的Tris緩沖溶液(T-TBS)洗滌兩次。取每種類(lèi)型的雜交瘤的培養(yǎng)物上清液50μl加入到已被上述的FGF-23H蛋白包被的微量培養(yǎng)板的每個(gè)孔中。反應(yīng)30分鐘后，每個(gè)孔用含有0.1％吐溫20的T-TBS(Tris緩沖鹽溶液)洗滌兩次。接下來(lái)，向每個(gè)孔中加入50μl稀釋3000倍的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(Zymed實(shí)驗(yàn)室，美國(guó))，在室溫培育30分鐘。每個(gè)孔用T-TBS溶液洗滌3次，向每個(gè)孔中加入50μl含有四基甲聯(lián)苯胺(丹麥，DAKO)的底物緩沖液，在室溫培育15分鐘。隨后，向每個(gè)孔中加入50μl的0.5M的硫酸，以停止反應(yīng)。450nm波長(zhǎng)下的吸收值通過(guò)一個(gè)微量培養(yǎng)板閱讀器(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)參照570nm波長(zhǎng)的吸收值進(jìn)行測(cè)定。選擇吸收值明顯增加的雜交瘤。因此，得到了9種類(lèi)型的作為產(chǎn)生識(shí)別FGF-23蛋白的抗體的雜交瘤克隆。在這些克隆中，包括3C1E。
這樣得到的專(zhuān)一性識(shí)別FGF-23蛋白的抗體的亞類(lèi)利用一種IsoStrip小鼠單克隆抗體isotyping試劑盒(Roche公司，美國(guó))進(jìn)行鑒定。結(jié)果如表1所示。
表1抗人類(lèi)FGF-23的抗體

在上述的雜交瘤克隆中，有3個(gè)雜交瘤克隆(2C3B，3C1E，和1D6A)利用與2001年12月26日的申請(qǐng)相同的方法被國(guó)際性的保存在布達(dá)佩斯協(xié)議認(rèn)可的日本現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)科學(xué)技術(shù)國(guó)家研究院的國(guó)際生物體儲(chǔ)藏處(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)。而且，2C5L雜交瘤克隆利用與2003年1月6日的申請(qǐng)相同的方法被國(guó)際性地保存在布達(dá)佩斯條約認(rèn)可的日本現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)研究所的國(guó)際專(zhuān)利生物體保藏處(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)。這些克隆的保藏號(hào)如下所示2C3BFERM BP-78383C1EFERM BP-78391D6AFERM BP-78402C5LFERM BP-8268實(shí)施例4單克隆抗體的制備(1)包含有抗FGF-23抗體的培養(yǎng)物上清液的制備產(chǎn)生抗FGF-23抗體的雜交瘤在eRDF培養(yǎng)基(KYOKUTOPHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO.，LTD.日本)中進(jìn)行馴化，培養(yǎng)基包含有10μg/ml的牛胰島素(美國(guó)Sigma公司)，5.5μg/ml的人轉(zhuǎn)鐵蛋白(美國(guó)Sigma公司)，0.01mM的乙醇胺溶液(美國(guó)Sigma公司)，和5ng/ml的亞硒酸鈉溶液(美國(guó)Sigma公司)。用于制備抗體的雜交瘤在旋轉(zhuǎn)式燒瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)后的溶液利用孔徑為0.2μm的濾紙(Pall Gelman實(shí)驗(yàn)室，美國(guó))進(jìn)行過(guò)濾以除去如雜交瘤這樣的廢物，然后收集包含抗體的培養(yǎng)物上清液。
(2)利用G蛋白純化單克隆抗體包含有抗FGF-23抗體的培養(yǎng)物上清液通過(guò)一種G蛋白瓊脂糖親和柱(美國(guó)Amersham Pharmacia生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行分離，這樣抗體被吸附在了親和柱上。然后利用一種0.1M的甘氨酸緩沖液(pH值為2.8)進(jìn)行淋洗。1M的Tris-HCL溶液加入進(jìn)洗脫部分的溶液中以調(diào)節(jié)pH值為7.2。對(duì)這樣制備的抗體溶液利用一種透析膜(Spectrum實(shí)驗(yàn)室，美國(guó))用PBS(-)進(jìn)行透析和取代，該透析膜的最大分子量為10000，并且利用一種孔徑為0.22μm的濾紙膜(美國(guó)Millipore公司)進(jìn)行過(guò)濾滅菌，這樣得到純化后的抗FGF-23抗體。通過(guò)在280nm波長(zhǎng)處的吸收值來(lái)計(jì)算純化抗體的濃度，然后通過(guò)利用1mg/ml作為1.35OD的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算。
(3)利用A蛋白純化單克隆抗體抗體利用一種A蛋白載體親和柱(IBL Co.，Ltd.，日本)，一種甘氨酸緩沖溶液(pH值為8.9)作為吸附緩沖溶液，一種檸檬酸緩沖液(pH值為4.0)作為洗脫緩沖溶液來(lái)親和性純化包含有抗FGF-23抗體的培養(yǎng)物上清液。1M的Tris-HCL溶液加入進(jìn)包含有該抗體的洗脫部分溶液中以調(diào)節(jié)pH值為7.2。然后，對(duì)包含有抗體的溶液利用PBS(-)溶液通過(guò)一種透析膜和一種孔徑為0.22μm，已滅菌的濾紙膜進(jìn)行透析和取代。通過(guò)在280nm波長(zhǎng)處的吸收值來(lái)計(jì)算純化抗體的濃度，然后通過(guò)利用1mg/ml作為1.35OD的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算。
這樣獲得的每一種純化后的單克隆抗體利用產(chǎn)生這種抗體的雜交瘤的名稱(chēng)來(lái)命名。例如，由1D6A雜交瘤產(chǎn)生的抗體命名為1D6A抗體。
實(shí)施例5抗FGF-23部分肽的多克隆抗體的制備(1)對(duì)應(yīng)FGF-23部分序列的肽的合成SEQ ID NO1多肽的疏水性程度通過(guò)利用版本為6.5.1的MacVector計(jì)算函數(shù)來(lái)預(yù)測(cè)，然后對(duì)制備的肽抗體的合適的位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。在去除了具有高度親水性，并經(jīng)過(guò)糖鏈改性或磷酸化位點(diǎn)之后，適于制備抗體的部分序列被提取出來(lái)。因此，一種從SEQ ID NO1的第25位酪氨酸(殘基號(hào)為25)開(kāi)始的包含有15個(gè)氨基酸殘基和C-末端上加有一個(gè)半胱氨酸殘基的hFGF23-25的肽(SEQ ID NO9)；一種從第48位精氨酸開(kāi)始的包含有20個(gè)氨基酸殘基和C-末端上加有一個(gè)半胱氨酸殘基的hFGF23-48的肽(SEQ ID NO10)；一種從第114位精氨酸開(kāi)始的包含有15個(gè)氨基酸殘基和C-末端上加有一個(gè)半胱氨酸殘基的hFGF23-114的肽(SEQ ID NO11)；一種從第148位甘氨酸開(kāi)始的包含有16個(gè)氨基酸殘基和C-末端上加有一個(gè)半胱氨酸殘基的hFGF23-148的肽(SEQ ID NO12)；一種從第170位天門(mén)冬酰胺開(kāi)始的包含有20個(gè)氨基酸殘基和N-末端上加有一個(gè)半胱氨酸殘基的hFGF23-170肽(SEQ ID NO13)；一種從第174位脯氨酸開(kāi)始的包含有14個(gè)氨基酸殘基和C-末端上加有一個(gè)半胱氨酸殘基的hFGF23-174肽(SEQ ID NO14)；一種從第180位絲氨酸開(kāi)始的包含有15個(gè)氨基酸殘基和C-末端上加有一個(gè)半胱氨酸殘基的hFGF23-180肽(SEQ IDNO15)；一種從第210位亮氨酸開(kāi)始的包含有13個(gè)氨基酸殘基和C-末端上加有一個(gè)半胱氨酸殘基的hFGF23-210肽(SEQ ID NO16)；一種從第237位甘氨酸開(kāi)始的包含有15個(gè)氨基酸殘基的hFGF23-237肽(SEQ ID NO17)被選擇作為抗原，并且通過(guò)化學(xué)方法進(jìn)行了合成。
hFGF23-25YPNASPLLGSSWGGLC (SEQ ID NO9)hFGF23-48RNSYHLQIHKNGHVDGAPHQC (SEQ ID NO10)hFGF23-114RFQHQTLENGYDVYHSPQYHC (SEQ ID NO11)hFGF23-148GMNPPPYSQFLSRRNEC (SEQ ID NO12)hFGF23-170CNTPIPRRHTR (SEQ ID NO13)hFGF23-174PRRHTRSAEDDSERC(SEQ ID NO14)hFGF23-180SAEDDSERDPLNVLKC (SEQ ID NO15)hFGF23-210LPSAEDNSPMASDC (SEQ ID NO16)hFGF23-237GGTGPEGCRPFAKFI (SEQ ID NO17)(2)抗FGF-23部分肽的多克隆抗體的制備所有上述制備的肽通過(guò)它們自己的半胱氨酸殘基結(jié)合到牛的甲狀腺球蛋白上(載體蛋白)，然后用于免疫接種。對(duì)于免疫接種，每一種抗原肽用3只兔子。第一次接種利用結(jié)合到載體蛋白(利用弗羅德氏完全佐劑作為載體蛋白)上的肽作為乳液(100μg/兔子)，然后將該乳液通過(guò)真皮或皮下接種的方式給兔子進(jìn)行接種。第一次接種1周以后，利用結(jié)合到載體蛋白(利用弗羅德氏不完全佐劑作為載體蛋白)上的肽作為乳液，以100μg/兔子的劑量進(jìn)行類(lèi)似的給藥。以2周的間隔進(jìn)行同樣的給藥6次，最后一次給藥完成后1周，對(duì)兔子進(jìn)行放血，采集抗血清。
為了制備用于從兔子的血清中純化抗部分肽抗體的一種親和性層析柱，用于免疫的每一種肽利用SulfoLink試劑盒(PIERCE，美國(guó))固定在了凝膠上?？寡寮尤脒M(jìn)利用PBS(-)溶液作為吸附緩沖溶液的親和柱中，這樣可在親和柱中滯留結(jié)合到用于免疫接種的肽上的抗體。接下來(lái)，利用0.1M的甘氨酸緩沖溶液(pH值為2.5至3.3)作為洗脫緩沖溶液對(duì)結(jié)合到親和柱上的抗體進(jìn)行洗脫，然后收集洗脫部分溶液。1M的Tris-HCL溶液加入進(jìn)洗脫溶液中以調(diào)節(jié)pH值為7.2左右。將這樣制備的抗體溶液加入到一種NAP25凝膠過(guò)濾親和柱(美國(guó)Amersham Pharmacia生物技術(shù)有限公司)中，這樣緩沖溶液就被PBS(-)取代了。利用一種孔徑為0.22μm，型號(hào)為MILLEX-GV的濾紙膜(美國(guó)Millipore公司)進(jìn)行消毒過(guò)濾，這樣可得到抗每一種肽的抗體。通過(guò)在280nm波長(zhǎng)處的吸收峰來(lái)計(jì)算純化抗體的濃度，然后通過(guò)用1mg/ml作為1.35OD的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算。這樣獲得的每一種純化后的抗體用一種用于免疫接種的肽的名稱(chēng)來(lái)命名。例如，一種通過(guò)SEQ ID NO9的hFGF23-25肽進(jìn)行免疫接種所得到的抗體命名為一種hFGF23-25抗體。
(3)利用抗FGF-23部分肽抗體識(shí)別FGF-23蛋白和其代謝產(chǎn)物利用Western印跡法(該印跡法利用由上述方法得到的h FGF23-48和hFGF23-148抗體)對(duì)CHO-FGF23H-表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的FGF-23H蛋白和其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析。如圖1所示，利用這兩種抗體對(duì)大約為32kDa的全長(zhǎng)FGF-23H蛋白進(jìn)行了測(cè)定。而且，觀察到了一種大小約為18或小于18kDa的代謝產(chǎn)物，并且它們被認(rèn)為是由FGF-23蛋白(該蛋白介于如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中的第179位和第180位之間的氨基酸殘基)的切割所導(dǎo)致的N-末端片段衍生出來(lái)的。hFGF23-48抗體可識(shí)別小片段的代謝產(chǎn)物。CHO-FGF23RQ培養(yǎng)物上清液中的FGF-23RQ蛋白和其代謝物，由于產(chǎn)生了變異蛋白從而避免了介于第179位和第180位之間的氨基酸殘基的切割，利用hFGF23-148對(duì)FGF-23RQ蛋白和其代謝物進(jìn)行了檢測(cè)。如圖1C所示，在FGF-23H例子中已被識(shí)別的片段的肽未被檢測(cè)出來(lái)?；谏鲜鼋Y(jié)果，通常認(rèn)為在FGF-23蛋白切割的代謝中，介于第179位和第180位氨基酸殘基之間的切割產(chǎn)生的N-末端片段進(jìn)一步斷裂成小片段，但是這樣的小片段是經(jīng)過(guò)介于第179位和第180位氨基酸殘基之間的切割之后產(chǎn)生的。因此，當(dāng)考慮FGF-23蛋白的代謝作用時(shí)，檢測(cè)介于第179位和第180位氨基酸殘基之間的切割與否非常重要。
實(shí)施例6生物素化抗體的制備利用上述9種類(lèi)型經(jīng)純化后的抗FGF-23部分肽的多克隆抗體和13種類(lèi)型的抗FGF-23的單克隆抗體進(jìn)行生物素化(biotinylated)。將Biotin-AC5-Osu(DOJINDO實(shí)驗(yàn)室，日本)溶解到N，N-二甲基甲酰胺中，得到濃度為1.82mg/ml的溶液，取10μl加入到一種抗體溶液(該抗體溶液已經(jīng)利用一種濃度為50mM的碳酸氫納溶液稀釋到了1mg/ml)中，然后將生成物在4℃通過(guò)上下?lián)u蕩的方式混合2小時(shí)。接下來(lái)，將反應(yīng)溶液加入到一種NAP10親和柱(美國(guó)AmershamPharmcia生物技術(shù)有限公司)中，除去未反應(yīng)的Biotin-AC5-Osu，并且溶劑被PBS(-)取代了。這樣，獲得了9種類(lèi)型的生物素標(biāo)記的抗FGF-23部分肽的多克隆抗體和5種類(lèi)型的生物素標(biāo)記的抗FGF-23的單克隆抗體(1C3H抗體，1D6A抗體，2A2B抗體，2C3B抗體，和3C1E抗體)。
實(shí)施例7利用識(shí)別FGF-23專(zhuān)一性位點(diǎn)的多克隆抗體的夾心式ELISA法(1)夾心式ELISA系統(tǒng)的構(gòu)建從上述9種類(lèi)型的抗FGF-23部分肽序列的多克隆抗體中通過(guò)結(jié)合其中8種類(lèi)型的抗體(hFGF23-25抗體，hFGF23-48抗體，hFGF23-114抗體，hFGF23-148抗體，hFGF23-170抗體，hFGF23-180抗體，hFGF23-210抗體，和hFGF23-237抗體)作為固定化抗體和檢測(cè)抗體對(duì)一種夾心式ELISA系統(tǒng)的構(gòu)建進(jìn)行了檢測(cè)。
為了固定抗體，用50mM的碳酸氫納溶液稀釋8種類(lèi)型的抗FGF-23部分肽的多克隆抗體(hFGF23-25抗體，hFGF23-48抗體，hFGF23-114抗體，hFGF23-148抗體，hFGF23-170抗體，hFGF23-180抗體，hFGF23-210抗體，和hFGF23-237抗體)至30μg/ml。向進(jìn)行ELISA系統(tǒng)(Maxisorp(商標(biāo))，Nunc，美國(guó))實(shí)驗(yàn)的96孔板的每一個(gè)孔中加入50μl的這種溶液，然后將該溶液在37℃培育1.5小時(shí)。接下來(lái)，除去反應(yīng)溶液，向每孔中加入50μl的Superblock(商標(biāo))(PIERCE，美國(guó))，室溫培育60分鐘，以阻滯反應(yīng)的進(jìn)行。在溶液除掉以后，向每一個(gè)孔中加入50μl濃度為1μg/ml的FGF-23H蛋白溶液，并且在室溫培育1小時(shí)，以將該蛋白結(jié)合到固定化的抗體上。經(jīng)過(guò)抗體反應(yīng)，利用T-TBS溶液洗滌孔3次。利用含量為10％Blockace(日本制藥公司)的T-TBS溶液稀釋上述8種類(lèi)型的生物素標(biāo)記的抗FGF-23部分肽的抗體(hFGF23-25抗體，hFGF23-48抗體，hFGF23-114抗體，hFGF23-148抗體，hFGF23-170抗體，hFGF23-180抗體，hFGF23-210抗體，和hFGF23-237抗體)到10μg/ml。這些抗體和作為對(duì)照的一種含量為10％Blockace的T-TBS溶液以50μl/孔的量加入到每一個(gè)孔中。每一種溶液在室溫培育30min，以進(jìn)行次級(jí)反應(yīng)。利用T-TBS溶液將每一孔洗滌3次后，利用含Blockace量為10％的T-TBS溶液稀釋標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)溶液到5000倍，取50μl稀釋后的溶液加入到每一個(gè)孔中。用T-TBS溶液洗滌每一孔4次，將50μl的N-四甲聯(lián)苯胺(是一種過(guò)氧化物生色底物)加入到每孔中，室溫作用15分鐘，以使其發(fā)生顏色反應(yīng)。50μl濃度為0.5M的硫酸溶液加入到每孔中以停止反應(yīng)。利用MTP-300(用于吸收峰測(cè)定的系統(tǒng))對(duì)該96孔板(CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)量值為450nm處的光吸收值減去570nm處的光吸收值(見(jiàn)表2)。對(duì)于未加生物素標(biāo)記的抗體的對(duì)照組，從450nm-570nm范圍內(nèi)獲得的所有測(cè)定值都是0.06或低于0.06。然而，如表2所示，由于固定化抗體和檢測(cè)用抗體的多重結(jié)合，致使450nm-570nm的光吸收值明顯升高。如圖1所示，由于通過(guò)FGF-23蛋白的切割產(chǎn)生多肽的事實(shí)在目前來(lái)說(shuō)是已知的，那么在同一樣品中就可能產(chǎn)生由FGF-23衍生得到的不同分子類(lèi)型的多肽?；谶@里的抗體可識(shí)別FGF-23的特異性位點(diǎn)這一事實(shí)，根據(jù)抗體的重組體可縮減所要測(cè)定的分子類(lèi)型。比如，當(dāng)使用一種重組體時(shí)，hFGF23-170抗體被固定化，hFGF23-25抗體作為檢測(cè)抗體，因?yàn)閮煞N抗體的抗原位點(diǎn)均包含在如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中的介于第25位和第179位殘基之間的N-末端部分多肽片斷，那么就不僅能預(yù)測(cè)SEQ ID NO1所示的介于第25位和第251位殘基之間的多肽的全長(zhǎng)，而且能利用這種重組體通過(guò)夾心式ELISA對(duì)N-末端部分多肽片段進(jìn)行測(cè)定。另一方面，當(dāng)hFGF23-180抗體被固定化，并且利用hFGF23-237抗體進(jìn)行測(cè)定時(shí)，不僅能預(yù)測(cè)N-末端部分多肽片斷，而且能測(cè)定一種相當(dāng)于如SEQ ID NO1所示的FGF-23蛋白中的第180位至第251位殘基之間的C-末端部分多肽片段。而且，舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)hFGF23-237抗體被固定化，hFGF23-25抗體作為檢測(cè)抗體時(shí)，據(jù)估計(jì)只有全長(zhǎng)FGF-23蛋白可被檢測(cè)出(未能檢測(cè)出切割后產(chǎn)生的N-末端和C-末端部分多肽)。因此，利用這些重組體的復(fù)合物能夠?qū)Ψ治鑫?如生物樣品)中的FGF-23全長(zhǎng)多肽和部分多肽進(jìn)行絕對(duì)量的測(cè)定，也使得我們能夠區(qū)分這些多肽的存在比例。
表2利用抗FGF-23的多克隆抗體結(jié)合夾心式ELISA系統(tǒng)測(cè)定FGF-23蛋白(450nm-570nm的光吸收值)

固定化抗體的種類(lèi)列在了表2中頂部的水平線之上，檢測(cè)抗體的種類(lèi)如表2中的最左一列所示。表中的數(shù)字是利用每一種重組體測(cè)定得到的。
(2)利用夾心式ELISA法定量測(cè)定FGF-23蛋白根據(jù)以上描述的制備夾心式ELISA系統(tǒng)的方法，利用hFGF23-25抗體做固定化抗體，hFGF23-237抗體做檢測(cè)抗體對(duì)測(cè)定物質(zhì)，濃度分別為1，0.33，0.1，0.033，0.01，0.0033，和0.001μg/ml的FGF-23H蛋白溶液進(jìn)行了測(cè)定。測(cè)定結(jié)果如Figure2所示。在0.1-1μg/ml的濃度范圍之內(nèi)，觀察到了由450nm-570nm處測(cè)定所得值的濃度依賴(lài)性增加，表明了至少在該濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)GF-23H蛋白能以一種濃度依賴(lài)型的方式進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例8FGF-23部分肽的制備除了如實(shí)施例5中所制備的對(duì)應(yīng)FGF-23部分序列的肽以外，還通過(guò)化學(xué)方法合成了具有下述FGF23的部分序列的肽一種從SEQ ID NO1的殘基號(hào)38(甘氨酸)開(kāi)始的13個(gè)氨基酸殘基和具有在肽的C末端加入半胱氨酸殘基的hFGF23-38肽(SEQID NO18)；一種從SEQ ID NO1中的殘基號(hào)為68(蘇氨酸)開(kāi)始的包含有28個(gè)氨基酸殘基的hFGF23-68肽(SEQ ID NO19)；一種從SEQID NO1中的殘基號(hào)為96(甲硫氨酸)開(kāi)始的包含有18個(gè)氨基酸殘基的hFGF23-96肽(SEQ ID NO20)；一種從SEQ ID NO1中的殘基號(hào)為129(絲氨酸)開(kāi)始的包含有22個(gè)氨基酸殘基和肽的C-末端上加有一個(gè)半胱氨酸殘基的hFGF23-129肽(SEQ ID NO21)；一種從SEQID NO1中的殘基號(hào)為161(精氨酸)開(kāi)始的包含有13個(gè)氨基酸殘基和肽的C-末端上加有一個(gè)半胱氨酸殘基的hFGF23-161肽(SEQ IDNO22)；一種從SEQ ID NO1中的殘基號(hào)為197(丙氨酸)開(kāi)始的包含有16個(gè)氨基酸殘基的hFGF23-197肽(SEQ ID NO23)；和一種從SEQID NO1中的殘基號(hào)為220(絲氨酸)開(kāi)始的包含有24個(gè)氨基酸殘基的hFGF23-220肽(SEQ ID NO24)。
hFGF23-38GLIHLYTATARNSC (SEQ ID NO18)hFGF23-96TIYSALMIRSEDAGFVVITGVMSRRYLC (SEQ IDNO19)
hFGF23-96MDFRGNIFGSHYFDPENC (SEQ ID NO20)hFGF23-96SPQYHFLVSLGRAKRAFLPGMNC (SEQ ID NO21)hFGF23-96RNEIPLIHFNTPIC (SEQ ID NO22)hFGF23-96ARMTPAPASCSQELPS (SEQ ID NO23)hFGF23-96SDPLGVVRGGRVNTHAGGTGPEGC (SEQ ID NO24)實(shí)施例9對(duì)單克隆抗體中FGF-23識(shí)別區(qū)域的檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)含有人類(lèi)FGF-23的部分序列的肽的反應(yīng)活性對(duì)包含能夠被抗FGF-23單克隆抗體所識(shí)別的氨基酸序列的區(qū)域進(jìn)行測(cè)定。
(1)實(shí)驗(yàn)1與固定的肽相結(jié)合利用50mM的碳酸氫納溶液將實(shí)施例5中合成的肽(SEQ ID NOS7-17)稀釋到濃度為1μg/ml的溶液。50μl的這種溶液加入到ELISA系統(tǒng)(Maxisorp(商標(biāo))，Nunc，美國(guó))中的96孔板中，然后將該溶液在37℃培育1小時(shí)，以固定FGF-23部分肽。接下來(lái)，除去反應(yīng)溶液，向每孔中加入50μl的一種阻滯溶液(Superblock(商標(biāo))，PIERCE，美國(guó))，然后室溫培育60分鐘，以阻滯反應(yīng)的進(jìn)行。在溶液除掉以后，向每一個(gè)孔中加入50μl實(shí)施例3制備的雜交瘤的培養(yǎng)物上清液或一種作為對(duì)照的包含有DMEM介質(zhì)的HT溶液，然后將該溶液在室溫培育1小時(shí)以結(jié)合FGF-23部分肽。在抗體結(jié)合反應(yīng)的后期，利用T-TBS溶液洗滌孔3次。利用一種含10％封閉溶液(Blockace(商標(biāo))，(日本制藥公司)的T-TBS溶液稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L)-F(ab’)2片段至3000倍，取50μl稀釋后的溶液加入進(jìn)每一孔中，然后將該溶液在室溫培育30分鐘以結(jié)合次級(jí)抗體。利用T-TBS溶液洗滌每個(gè)孔3次，將50μl的N-四甲聯(lián)苯胺(是一種過(guò)氧化物生色底物，丹麥，DAKO)加入到每孔中，室溫作用3分鐘，以使其發(fā)生顏色反應(yīng)。下一步，50μl濃度為0.5M的硫酸溶液加入到每孔中以停止反應(yīng)。利用一種吸收峰測(cè)定系統(tǒng)(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)對(duì)該96孔板進(jìn)行測(cè)定，獲得的測(cè)定值為450nm處的光吸收值減去570nm處的光吸收值。對(duì)于對(duì)照組(僅加有包含DMEM基質(zhì)的HT溶液)，從450nm-570nm范圍內(nèi)獲得的所有測(cè)定值都是0.06或低于0.06。然而，在該實(shí)例中(已經(jīng)加入了雜交瘤培養(yǎng)物的上清液和固定了專(zhuān)一性的肽)，觀察到了光吸收值的明顯增加。這些結(jié)果如表3所示。2A2B抗體結(jié)合在了SEQ ID NO12的一種hFGF23-96肽上。1D6A表明可與SEQ ID NO17的hFGF23-148肽相結(jié)合。因此，可得出如下結(jié)論2A2B雜交瘤產(chǎn)生的抗體與SEQ ID NO1所示的FGF-23中的介于第148位和第163位氨基酸殘基之間的區(qū)域或部分區(qū)域相結(jié)合。而且，1C3H結(jié)合在了SEQ ID NO1所示的FGF-23中的介于第180位和第194位氨基酸殘基之間的區(qū)域或部分區(qū)域，1D6A結(jié)合在了SEQ ID NO1所示的FGF-23中的介于第237位和第251位氨基酸殘基之間的區(qū)域或部分區(qū)域。
表3具有FGF-23部分序列的固定化肽與由產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤培養(yǎng)物上清液中的抗體的反應(yīng)活性

(2)實(shí)驗(yàn)2與固定化的肽相結(jié)合對(duì)于FGF-23，觀察到切割發(fā)生在SEQ ID NO1所示的第179位和第180位氨基酸殘基之間。為了詳細(xì)檢測(cè)識(shí)別切割位點(diǎn)至C-末端的區(qū)域的抗體，利用含有相應(yīng)部分區(qū)域的序列的合成肽進(jìn)行了結(jié)合實(shí)驗(yàn)。利用50mM的碳酸氫納溶液將實(shí)施例5中合成的肽(SEQ ID NOS14，15，16和17)和實(shí)施例8中合成的肽(SEQ ID NOS23和24)稀釋到1μg/ml。50μl的這種溶液加入到ELISA系統(tǒng)(Maxisorp(商標(biāo))，Nunc，美國(guó))中的96孔板中，然后將該溶液在4℃培育12小時(shí)以使其固定在平板上。接下來(lái)，除去反應(yīng)溶液，向每孔中加入50μl的封閉溶液(Superblock(商標(biāo))，PIERCE，美國(guó))，然后室溫培育60分鐘，以停止反應(yīng)的進(jìn)行。在溶液除掉以后，向每一個(gè)孔中加入50μl用含有10％封閉溶液(SuperBlock(商標(biāo))，PIERCE，美國(guó))的T-TBS溶液稀釋實(shí)施例3和實(shí)施例4中純化得到的1D6A和3C1E抗體至其濃度為10μl/ml。作為對(duì)照，向一孔中加入50μl含有10％封閉溶液(Blockace(商標(biāo))，日本制藥公司)的T-TBS溶液。將該溶液在室溫培育1小時(shí)，這樣固定化的肽可與抗體進(jìn)行反應(yīng)。在抗體反應(yīng)的后期，利用T-TBS溶液洗滌孔4次，取50μl稀釋后(稀釋方法為利用一種含10％阻滯溶液(Blockace(商標(biāo))，日本制藥公司)的T-TBS溶液稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L)-F(ab’)2片段至3000倍)的溶液加入進(jìn)每一孔中。將該溶液在室溫培育60分鐘以同次級(jí)抗體發(fā)生反應(yīng)。經(jīng)過(guò)T-TBS溶液洗滌每孔4次以后，向每個(gè)孔中加入50μl的N-四甲聯(lián)苯胺(DAKO，丹麥)，是一種過(guò)氧化物生色底物，室溫作用20分鐘，以使其發(fā)生顏色反應(yīng)。然后，向每一孔中加入50μl濃度為0.5M的硫酸溶液以停止反應(yīng)。利用一種用于96孔板的吸收峰測(cè)定系統(tǒng)(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)對(duì)溶液進(jìn)行測(cè)定，獲得的測(cè)定值為450nm處的光吸收值減去570nm處的光吸收值。結(jié)果表示在Table4。對(duì)于對(duì)照組孔板(僅加有稀釋溶液)，從450nm-570nm范圍內(nèi)獲得的所有測(cè)定值均小于或等于0.05。與其相反，3C1E抗體與hFGF23-180肽(SEQ ID NO15)相結(jié)合，1D6A抗體與hFGF23-237肽(SEQ ID NO17)相結(jié)合。
表4具有FGF-23的部分序列的固定化肽與純化后單克隆抗體的反應(yīng)活性

實(shí)施例10利用免疫沉淀法檢測(cè)FGF-23蛋白和從FGF-23蛋白衍生出的多肽應(yīng)用免疫沉淀法的目的在于為了揭示獲得的單克隆抗體與FGF-23和從FGF-23衍生出的多肽在液相中(與固定化的肽相比，更接近生理?xiàng)l件)進(jìn)行反應(yīng)的活性，沉淀的蛋白可以利用Western印跡法進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)施例2中制備的表達(dá)FGF-23H的CHO-FGF23細(xì)胞在CHO-S-SFM II介質(zhì)(Gibco BRL，美國(guó))中培育4天，這樣可得到包含有FGF-23蛋白，N-末端多肽片段，和C-末端多肽片段的培養(yǎng)物上清液。每400μl的上清液中分別加入0.5μg實(shí)施例3和實(shí)施例4中制備的抗FGF-23單克隆抗體5種類(lèi)型中的1種，以制備溶液。一組僅添加緩沖溶液的樣作為對(duì)照溶液。利用上下?lián)u蕩的方式將這些溶液在4℃混合1.5小時(shí)以確?？贵w同培養(yǎng)物上清液中的蛋白發(fā)生反應(yīng)。接下來(lái)，30μl的G蛋白4FF瓊脂糖(凝膠)(美國(guó)Amersham Pharmacia生物技術(shù)有限公司)加入到反應(yīng)液中，利用上下?lián)u蕩的方式將該溶液在4℃混合3小時(shí)，然后利用PBS溶液洗滌樹(shù)脂3次，這樣未結(jié)合到樹(shù)脂上的物質(zhì)就被洗滌掉了。取一半洗滌后的樹(shù)脂，向其中加入30μl的20mM的含有DDT的緩沖溶液和20mM的不含DDT樣品的緩沖溶液(50mM的Tris-Cl溶液，pH為6.8，1％的SDS溶液，10％的甘油溶液，0.001％的溴酚藍(lán)溶液，2mM的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液)。將該溶液在95℃加熱5分鐘后進(jìn)行離心分離，收集分離后的上清液。對(duì)這樣采集到的免疫沉淀物利用濃度為10％-20％的濃度梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。利用一種半干印跡轉(zhuǎn)移槽(Owl Separation Systems，美國(guó))將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到一種固定化的聚偏氟乙稀膜(美國(guó)Millipore公司)上。利用一種阻滯溶液(Blockace(商標(biāo))，日本制藥公司)阻滯PVDF膜以后，在一種生物素標(biāo)記的2A2B抗體或1C3E抗體(這兩種抗體均溶解在T-TBS溶液中，將抗體稀釋到1μg/ml)溶液中在4℃培育12小時(shí)。而且，HRP標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)同生成物進(jìn)行反應(yīng)。經(jīng)過(guò)洗滌之后，將生成物利用一種ECL Plus發(fā)光系統(tǒng)(一種電化學(xué)發(fā)光脈沖系統(tǒng)，美國(guó)AmershamPhamacia生物技術(shù)有限公司)曝光到一張膠片上1小時(shí)，然后膠片用自動(dòng)處理器進(jìn)行處理(日本富士膠片公司)。其結(jié)果如圖3所示。用于Western印跡實(shí)驗(yàn)的2A2B抗體識(shí)別的位點(diǎn)相當(dāng)于SEQ ID NO1中的長(zhǎng)為148至163位的氨基酸序列。而且，該實(shí)驗(yàn)所用的1C3H抗體表明可識(shí)別一個(gè)相當(dāng)于SEQ ID NO1中的長(zhǎng)為180至194的氨基酸序列的位點(diǎn)。利用這兩種抗體，可區(qū)分并識(shí)別由介于第179位和第180位氨基酸殘基之間的切割所產(chǎn)生的多肽片段與其它的多肽。本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)結(jié)果，單克隆抗體被分為下面的3種類(lèi)型。具體地說(shuō)，即為(1)兩種類(lèi)型的抗體(2C3B抗體和2C5L抗體)在相應(yīng)于SEQ ID NO1中的第25位和第179位之間的氨基酸序列的N-末端多肽內(nèi)有一個(gè)識(shí)別序列，或者與N-末端多肽片段和FGF-23全長(zhǎng)蛋白形成免疫復(fù)合體；(2)兩種類(lèi)型的抗體(1D6A抗體和3C1E抗體)在相應(yīng)于SEQ IDNO1中的第180位和第251位之間的氨基酸序列的C-末端多肽內(nèi)有一個(gè)識(shí)別序列，并與C-末端多肽片段和FGF-23全長(zhǎng)蛋白形成免疫復(fù)合體；(3)一種抗體(2A2B抗體)未檢測(cè)到免疫沉淀物。
實(shí)施例11利用抗FGF-23的單克隆抗體和抗FGF-23的多克隆抗體通過(guò)ELISA測(cè)定FGF-23蛋白2種類(lèi)型的單克隆抗體(1D6A抗體和2C3B抗體)分別固定化，然后利用5種類(lèi)型的多克隆抗體(hFGF23-25抗體，hFGF23-170抗體，hFGF23-180抗體，hFGF23-210抗體，和hFGF23-237抗體。這5種類(lèi)型的多克隆抗體在實(shí)施例7中表明其作為檢測(cè)抗體是有效的)中的一種通過(guò)夾心式ELISA系統(tǒng)對(duì)純化后FGF-23蛋白進(jìn)行了測(cè)定。
利用50mM的碳酸氫納溶液稀釋上述經(jīng)由一種G蛋白親和層析柱純化過(guò)的兩種類(lèi)型的單克隆抗體，使稀釋后單克隆抗體的濃度為10μl/ml。50μl的這種溶液加入到ELISA系統(tǒng)(Maxisorp(商標(biāo))，Nunc，美國(guó))的96孔板中，然后將該溶液在37℃培育1小時(shí)以進(jìn)行固定化。接下來(lái)，除去反應(yīng)溶液，向每孔中加入50μl的阻滯溶液(Superblock(商標(biāo))，PIERCE，美國(guó))，然后在室溫培育30分鐘，以阻滯反應(yīng)的進(jìn)行。在溶液除掉以后，利用含吐溫20為0.05％的PBS(T-PBS)溶液洗滌每個(gè)孔3次。每個(gè)孔中加入50μl濃度均為0.1μg/ml的下列溶液之一純化后的FGF-23H蛋白，純化后的N-末端多肽片段，和純化后的具有6組氨基酸標(biāo)記的C-末端多肽片段。將該溶液在室溫培育2小時(shí)以使其和固定化抗體進(jìn)行反應(yīng)?？贵w經(jīng)過(guò)反應(yīng)后，利用T-TBS溶液洗滌孔3次。5種類(lèi)型的生物素標(biāo)記的抗FGF-23部分肽的多克隆抗體(hFGF23-25抗體，hFGF23-170抗體，hFGF23-180抗體，hFGF23-210抗體，和hFGF23-237抗體) 利用含阻滯溶液為0.05％的T-TBS溶液稀釋到2.5μg/ml，將該溶液在室溫培育30分鐘以進(jìn)行次級(jí)抗體反應(yīng)。利用T-TBS溶液洗滌每個(gè)孔3次之后，利用含阻滯溶液為10％的(Blockace(商標(biāo))，日本制藥公司)T-TBS溶液稀釋HRP標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)溶液至5000倍，取50μl稀釋后的溶液加入進(jìn)每個(gè)孔中，將該溶液在室溫培育30分鐘以使抗生物素蛋白鏈菌素與生物素標(biāo)記的抗體相結(jié)合。利用T-TBS溶液洗滌每一個(gè)孔4次之后，將50μl的N-四甲聯(lián)苯胺(是一種過(guò)氧化物生色底物，DAKO，丹麥)加入到每一個(gè)孔中，接下來(lái)在室溫進(jìn)行培育。7分鐘之后，50μl濃度為0.5M的硫酸溶液加入到每一孔中以停止反應(yīng)。利用一種測(cè)定96孔板的光吸收值的系統(tǒng)(MTP-300，CORONAELECTRIC CO.，LTD.，日本)進(jìn)行測(cè)定，獲得的測(cè)定值為450nm處的光吸收減去570nm處的光吸收。結(jié)果如圖4所示。對(duì)于沒(méi)有加抗體的對(duì)照組，從450nm-570nm范圍內(nèi)獲得的所有測(cè)定值均小于0.015或低于0.015。然而，倚賴(lài)于固定化抗體和檢測(cè)用抗體的結(jié)合，反應(yīng)對(duì)于FGF-23全長(zhǎng)蛋白(圖4A)，N-末端多肽片段(圖4B)，和C-末端多肽片段(圖4C)而言是特異性的?；谠诜磻?yīng)活性上的差別，能夠證實(shí)抗FGF-23單克隆抗體的識(shí)別位點(diǎn)。尤其是，利用2C3B抗體的重組體作為一種固定化抗體，3種類(lèi)型的生物素化了的多克隆抗體(hFGF23-180抗體，hFGF23-210抗體，和hFGF23-237抗體)之一作為檢測(cè)抗體，對(duì)全長(zhǎng)FGF-23蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。但是，既沒(méi)有檢測(cè)到N-末端多肽片段，也沒(méi)有檢測(cè)到C-末端多肽片段。另一方面，利用生物素標(biāo)記的可識(shí)別N-末端多肽片段的多克隆抗體(hFGF23-25抗體和hFGF23-170抗體)檢測(cè)到了全長(zhǎng)FGF-23蛋白和N-末端多肽片段，但沒(méi)有檢測(cè)到C-末端多肽片段。
因此，這就證實(shí)了2C3B抗體能夠識(shí)別N-末端多肽片段。當(dāng)1D6A抗體被固定時(shí)，利用多克隆抗體作為識(shí)別N-末端多肽片段的檢測(cè)抗體，檢測(cè)全長(zhǎng)蛋白。但是，未檢測(cè)到N-末端多肽片段和C-末端多肽片段。另一方面，當(dāng)利用多克隆抗體作為識(shí)別C-末端多肽片段的檢測(cè)抗體，檢測(cè)全長(zhǎng)蛋白和C-末端多肽片段時(shí)，利用1D6A抗體與hFGF23-180結(jié)合的檢測(cè)方法是可行的。這些結(jié)果表明1D6A抗體可與hFGF23-237多克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)，這樣就證實(shí)了可識(shí)別SEQ ID NO1中的介于第237位和第251位氨基酸殘基之間的一段區(qū)域。
實(shí)施例12利用組合的抗FGF-23的單克隆抗體通過(guò)夾心式ELISA法檢測(cè)FGF-23蛋白純化后的FGF-23蛋白利用實(shí)施例3和實(shí)施例4中獲得的4種固定類(lèi)型的抗FGF-23的單克隆抗體通過(guò)夾心式ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，這4種類(lèi)型的生物素標(biāo)記的抗FGF-23的單克隆抗體為實(shí)施例6中作為檢測(cè)抗體而制得的。
利用50mM的碳酸氫納溶液稀釋4種類(lèi)型的FGF-23單克隆抗體(1D6A抗體，2A2B抗體，2C3B抗體，和3C1E抗體)至濃度為10μg/ml。50μl的這種溶液加入到ELISA系統(tǒng)(Maxisorp(商標(biāo))，Nunc，美國(guó))的96孔板中，然后在4℃培育12小時(shí)以進(jìn)行固定化。接下來(lái)，除去反應(yīng)溶液，向每孔中加入50μl的阻滯溶液(Superblock(商標(biāo))，PIERCE，美國(guó))。生成物在室溫培育20分鐘，以阻滯反應(yīng)的進(jìn)行。在溶液除掉以后，利用含吐溫20為0.1％的TBS(T-TBS)溶液洗滌每個(gè)孔3次。每個(gè)孔中加入50μl濃度均為0.1μg/ml的純化后的FGF-23蛋白溶液。將該溶液在室溫培育1小時(shí)以使其和固定化抗體進(jìn)行反應(yīng)?？贵w經(jīng)過(guò)反應(yīng)后，利用T-TBS溶液洗滌孔4次。3種類(lèi)型的生物素標(biāo)記的抗FGF-23單克隆抗體(1D6A抗體，2C3B抗體，和3C1E抗體)利用含阻滯溶液為10％的T-TBS溶液稀釋到10μg/ml，取這樣的溶液加入每一孔板中。將該溶液在室溫培育1小時(shí)以進(jìn)行次級(jí)抗體反應(yīng)。利用T-TBS溶液洗滌每一個(gè)孔4次之后，利用含阻滯溶液為10％的(Blockace(商標(biāo))，(日本制藥公司)T-TBS溶液稀釋HRP標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)溶液至5000倍，取50μl稀釋后的溶液加入進(jìn)每一孔中，將該溶液在室溫培育20分鐘以使抗生物素蛋白鏈菌素與生物素標(biāo)記的抗體相結(jié)合。利用T-TBS溶液洗滌每個(gè)孔4次并且將50μl的N-四甲聯(lián)苯胺(是一種過(guò)氧化物生色底物，DAKO，丹麥)加入到每一個(gè)孔中，接下來(lái)在室溫進(jìn)行培育。30分鐘之后，50μl濃度為0.5M的硫酸溶液加入到每一孔中以停止反應(yīng)。測(cè)定通過(guò)利用一種測(cè)量96孔板的光吸收值的系統(tǒng)(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)而進(jìn)行，測(cè)量值為450nm下的光吸收值減去570nm下的光吸收值。結(jié)果如表6所示。對(duì)于沒(méi)有加固定化抗體或檢測(cè)抗體的對(duì)照組，從450nm-570nm范圍內(nèi)獲得的所有測(cè)定值均小于0.033或等于0.033。然而，倚賴(lài)于固定化抗體和檢測(cè)用抗體的結(jié)合，觀察到光吸收值有增加的現(xiàn)象。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)進(jìn)行夾心式ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)，利用2C3B抗體作為固定化抗體(在SEQ IDNO1所示的FGF-23蛋白的氨基酸序列中的介于第25位和第179位氨基酸殘基之間的區(qū)域內(nèi)具有一個(gè)識(shí)別位點(diǎn))，生物素標(biāo)記的1D6A和3C1E抗體作為檢測(cè)用抗體(在SEQ ID NO1所示的FGF-23蛋白的氨基酸序列中的介于第180位和第251位氨基酸殘基之間的區(qū)域內(nèi)具有識(shí)別位點(diǎn))，得到的所有450nm-570nm的光吸收值均高達(dá)2.9或更高。由SEQ ID NO1所示的FGF-23蛋白的氨基酸序列中的介于第179位精氨酸和第180位絲氨酸之間的切割所得到的多肽片段以該種方式通過(guò)夾心式ELISA實(shí)驗(yàn)從被測(cè)定的序列中去除掉了。因此，利用這樣一種抗體的重組體，不用識(shí)別N-末端多肽片段或C-末端多肽片段就能夠?qū)⑽辞懈畹腇GF-23蛋白高靈敏度地檢測(cè)出來(lái)。當(dāng)將實(shí)施例2中制備的全長(zhǎng)FGF-23H蛋白，N-末端多肽片段，和C-末端多肽片段以與以前報(bào)道相似的方式接種小鼠時(shí)，僅在全長(zhǎng)FGF-23H蛋白的病例中出現(xiàn)了血清中磷的量誘導(dǎo)降低的現(xiàn)象。因此，如SEQ IDNO1所示的FGF-23蛋白的氨基酸序列中的介于第179位精氨酸和第180位絲氨酸之間的切割極大的改變了FGF-23蛋白的活性。利用這里所示的方法(包括去除切割的多肽的同時(shí)，選擇性檢測(cè)未切割的FGF-23H蛋白)，可以更加精確地檢測(cè)和測(cè)定樣品中具有活性的FGF-23。另一方面，當(dāng)如SEQ ID NO1所示的FGF-23蛋白的氨基酸序列中的介于第180位和第251位氨基酸殘基之間的區(qū)域內(nèi)具有識(shí)別位點(diǎn)的1D6A抗體和3C1E抗體被作為固定化抗體，并且生物素標(biāo)記的1D6A抗體和3C1E抗體也被用于檢測(cè)用抗體時(shí)，通過(guò)抗體間的競(jìng)爭(zhēng)相似地表明了具有可識(shí)別如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中的介于第180位和第194位氨基酸殘基之間的區(qū)域的3C1E抗體組其識(shí)別位點(diǎn)與具有可識(shí)別如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中的介于第237位和第251位氨基酸殘基之間的區(qū)域的1D6A抗體的識(shí)別位點(diǎn)不同。而且，實(shí)驗(yàn)還表明結(jié)合使用這些抗體可以建立一種測(cè)定方法，利用該測(cè)定方法可除去位于SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中的介于第25位和第179位氨基酸殘基之間的多肽片段，并且可以高靈敏度檢測(cè)出第180位至第251位殘基之間的C-末端多肽片段。
表5結(jié)合利用抗FGF-23的單克隆抗體(作為固定化抗體)和生物素化的抗體(作為檢測(cè)抗體)通過(guò)夾心式ELISA法檢測(cè)FGF-23蛋白獲得的光吸收值。

實(shí)施例13利用抗FGF-23的單克隆抗體通過(guò)夾心式ELISA法定量測(cè)定FGF-23蛋白利用50mM的碳酸氫納溶液稀釋2C3B抗體至濃度為10μg/ml。50μl的這種溶液加入到ELISA系統(tǒng)(Maxisorp(商標(biāo))，Nunc，美國(guó))的96孔板中，然后在4℃培育12小時(shí)以進(jìn)行固定化。接下來(lái)，除去反應(yīng)溶液，向每孔中加入250μl的阻滯溶液(Superblock(商標(biāo))，PIERCE，美國(guó))，然后生成物在室溫培育20分鐘，以阻滯反應(yīng)的進(jìn)行。在溶液除掉以后，利用含吐溫20為0.1％的TBS(T-TBS)溶液洗滌每一個(gè)孔2次。利用含阻滯溶液(SuperBlock(商標(biāo))，PIERCE，美國(guó))為10％的T-TBS溶液稀釋實(shí)施例2中純化后得到的FGF-23蛋白，得到一組濃度分別為10，3，1，0.3，0.1，0.03，0.01，或0.003ng/ml的FGF-23蛋白溶液。每種溶液取50μl加入到每個(gè)孔中。將該溶液在室溫培育1小時(shí)以使其和固定化抗體進(jìn)行反應(yīng)?？贵w經(jīng)過(guò)反應(yīng)后，利用T-TBS溶液洗滌孔4次，2種類(lèi)型的生物素標(biāo)記的抗FGF-23單克隆抗體(1D6A抗體和3C1E抗體)利用含封閉溶液(Blockace(商標(biāo))，(日本制藥公司)為10％的T-TBS溶液稀釋到10μg/ml，取這樣的溶液加入每一孔板中。將該溶液在室溫培育30分鐘以進(jìn)行次級(jí)抗體反應(yīng)。利用T-TBS溶液洗滌每一個(gè)孔4次之后，利用含阻滯溶液為10％的(Blockace(商標(biāo))，(日本制藥公司)T-TBS溶液稀釋HRP標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)的溶液至5000倍，取50μl稀釋后的溶液加入進(jìn)每一孔中。將該溶液在室溫培育30分鐘以使抗生物素蛋白鏈菌素與生物素標(biāo)記的抗體相結(jié)合。利用T-TBS溶液洗滌每個(gè)孔4次后，將50μl的N-四甲聯(lián)苯胺(是一種過(guò)氧化物生色底物，DAKO，丹麥)加入到每個(gè)孔中，接下來(lái)在室溫進(jìn)行培育。25分鐘之后，50μl濃度為0.5M的硫酸溶液加入到每一孔中以停止反應(yīng)。測(cè)定通過(guò)利用一種測(cè)量96孔板的光吸收值的系統(tǒng)(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)而進(jìn)行，測(cè)量值為450nm下的光吸收值減去570nm下的光吸收值。結(jié)果如圖6所示。由于FGF-23蛋白(濃度至少為0.03ng/ml)的存在，觀察到了測(cè)定值的顯著增大，并且在0.03-大約3ng/ml的濃度范圍之內(nèi)，獲得了在450nm-570nm范圍內(nèi)所有測(cè)定值具有濃度倚賴(lài)性增加的結(jié)果，表明在該濃度范圍之內(nèi)可測(cè)定FGF-23蛋白。
實(shí)施例14抗FGF-23單克隆抗體固定層析柱的制備利用一種商業(yè)化的固定試劑(SulfoLink(商標(biāo))，PIERCE，美國(guó))制備了一種固定化的抗FGF-23抗體的層析柱，該層析柱通過(guò)免疫沉淀方法在收集FGF-23蛋白或純化FGF-23蛋白方面是有效的。將1C3H抗體，1D6A抗體，和2C3B抗體在pH值為6.0，濃度為0.1M的磷酸鹽緩沖液(含5mM的乙二胺四乙酸)中進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e制得濃度為1mg/ml，1mg/ml，和0.4mg/ml的溶液。向1ml的這種抗體溶液中加入6mg的2-巰基乙醇胺，所得溶液在37℃以上下?lián)u蕩的方式混合1小時(shí)，然后，抗體內(nèi)的二硫鍵通過(guò)約簡(jiǎn)反應(yīng)被切割。當(dāng)緩沖液利用1.5ml的一種結(jié)合緩沖溶液(50mM的Tris/HCl溶液，pH值為8.5，5mM的EDTA)在NAP 10層析柱(美國(guó)Amersham Pharmacia生物技術(shù)有限公司)中進(jìn)行交換時(shí)，除掉2-巰基乙醇胺以停止約簡(jiǎn)反應(yīng)。這些抗體溶液加入到已利用結(jié)合緩沖溶液洗滌過(guò)的1ml的SulfoLink(商標(biāo))結(jié)合凝膠(PIERCE，美國(guó))中。該溶液在室溫以上下?lián)u蕩的方式混合30分鐘以進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。經(jīng)過(guò)離心過(guò)濾后，利用一種結(jié)合緩沖液對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行洗滌。為了阻滯未反應(yīng)的硫醇基，加入1ml濃度為0.05mM的左旋半胱氨酸-鹽酸溶液，然后將該溶液在室溫以上下?lián)u蕩的方式混合30分鐘。接下來(lái)，利用1M的氯化鈉溶液洗滌樹(shù)脂以除去未反應(yīng)的抗體和左旋半胱氨酸。
實(shí)施例15利用免疫沉淀法對(duì)存在于CHO-FGF23H細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠中的FGF-23蛋白進(jìn)行檢測(cè)為了檢測(cè)FGF-23蛋白在血液中的存在狀態(tài)，表達(dá)FGF-23H的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至裸鼠中，然后，由這些細(xì)胞分泌到血液中的FGF-23H蛋白利用免疫沉淀法檢測(cè)到了。2×107的CHO-FGF23H細(xì)胞，或CHO ras克隆1細(xì)胞作為對(duì)照以皮下轉(zhuǎn)導(dǎo)方式轉(zhuǎn)導(dǎo)至每一只Balb/c裸鼠中。轉(zhuǎn)導(dǎo)后的第32天，從細(xì)胞已成功粘附形成腫瘤的小鼠中采集血清。將從5只CHO ras克隆1轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠中采集到的血清和從6只CHO-FGF23H轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠中采集到的相同量的血清以相同的體積各自獨(dú)立地混合。向150μl各自混勻的血清中分別加入下列物質(zhì)10μl實(shí)施例14中制備的已固定上1D6A抗體的樹(shù)脂，10μl實(shí)施例14中制備的已固定上2C3B抗體的樹(shù)脂，和10μl未固定抗體的樹(shù)脂。將生成物在4℃以上下?lián)u蕩的方式混合1小時(shí)。以利于抗體和FGF-23進(jìn)行反應(yīng)。利用PBS溶液洗滌該樹(shù)脂3次以除去未反應(yīng)的產(chǎn)物。向每一種樹(shù)脂中加入一種50μl的緩沖液(50mM的Tris-Cl溶液，pH值為6.8，1％的SDS溶液，10％的甘油溶液，0.001％溴酚藍(lán)溶液，2mM的EDTA溶液，和20mM的DDT溶液)。生成物在95℃加熱5min，然后進(jìn)行離心分離。收集這樣得到的上清液。利用濃度為10％-20％的梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)上清液進(jìn)行分離，通過(guò)一種半干印跡轉(zhuǎn)移槽(Owl Separation Systems，美國(guó))將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到一種聚偏氟乙烯膜(美國(guó)Millipore公司)上。聚偏氟乙烯膜在經(jīng)由(Blockace(商標(biāo))，日本制藥公司)稀釋至0.5μg/ml的一種生物素標(biāo)記的2A2B或1C3H抗體溶液中在4℃條件下培育12小時(shí)。而且，HRP標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)同生成物進(jìn)行反應(yīng)。利用一種ECL Plus發(fā)光系統(tǒng)(美國(guó)Amersham Pharmacia Biotech公司)將混合溶液暴露于膠片上1小時(shí)，然后用自動(dòng)處理器(日本富士膠片公司)進(jìn)行處理。結(jié)果如圖7所示。對(duì)于沒(méi)有固定化抗體的樹(shù)脂，根本就沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)分子。然而，當(dāng)利用1C3H抗體進(jìn)行免疫沉淀，利用2A2B抗體作檢測(cè)之用時(shí)，檢測(cè)到了一種22kDa的信號(hào)分子。當(dāng)利用1C3H抗體進(jìn)行檢測(cè)之用時(shí)，檢測(cè)到了22kDa和10kDa的信號(hào)分子。此外，當(dāng)利用1D6A抗體進(jìn)行免疫沉淀，利用2A2B抗體作檢測(cè)之用時(shí)，未檢測(cè)到22kDa的信號(hào)分子，當(dāng)1C3H抗體作為檢測(cè)之用時(shí)，僅檢測(cè)到了一種10kDa的信號(hào)分子。而且，當(dāng)利用2C3B抗體進(jìn)行免疫沉淀和利用2A2B抗體作檢測(cè)之用時(shí)，檢測(cè)到了22kDa和16kDa的信號(hào)分子，當(dāng)利用1C3H抗體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，僅檢測(cè)到了一種22kDa的信號(hào)分子。表明2A2B抗體可識(shí)別SEQ ID NO1中的介于第148位和第163位氨基酸殘基之間的區(qū)域，1C3H抗體可識(shí)別SEQ ID NO1中的介于第180位和第194位氨基酸殘基之間的區(qū)域。而且，通過(guò)Western印跡法實(shí)驗(yàn)表明2A2B抗體可識(shí)別N-末端多肽片段(該片段相當(dāng)于SEQ ID NO1所示的介于第25位和第179位氨基酸殘基之間一段序列)，通過(guò)電泳檢測(cè)信號(hào)分子的分子量為16kDa。已經(jīng)表明1C3H抗體可識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180位和第251位氨基酸殘基之間的C-末端多肽片段，檢測(cè)到的信號(hào)分子的分子量為16kDa。因此，這就清楚的表明了該實(shí)驗(yàn)中測(cè)定到的16kDa的信號(hào)分子是N-末端多肽片段，10kDa的信號(hào)分子表明是C-末端多肽片段。此外，從小鼠血清中采集到的分子量為22kDa的多肽能夠被下列抗體所識(shí)別能識(shí)別第25位至第179位氨基酸殘基之間的N-末端區(qū)域的2C3B抗體；能識(shí)別第148位至第163位氨基酸殘基之間區(qū)域的2A2B抗體，和由1C3H產(chǎn)生的能識(shí)別介于第180位和第194位氨基酸殘基之間的抗體，但該多肽不能被1D6A抗體所識(shí)別(該抗體能識(shí)別如SEQ IDNO1所示的介于第237位和第251位氨基酸殘基之間的區(qū)域)。本實(shí)驗(yàn)中觀察到的分子量大約為22kDa的信號(hào)分子可能由FGF-23蛋白的切割產(chǎn)生，切割位點(diǎn)位于1C3H抗體識(shí)別區(qū)域的C-末端。在對(duì)血清進(jìn)行測(cè)定的實(shí)驗(yàn)中觀察到了與發(fā)生于SEQ ID NO1所示的第179位精氨酸和第180位絲氨酸之間的切割不同的切割和由切割產(chǎn)生的片段，對(duì)此我們予以了注意。
實(shí)施例16血清中FGF-23蛋白的切割(1)大鼠血清和純化后的FGF-23蛋白的混合實(shí)驗(yàn)通過(guò)混合純化后的FGF-23蛋白和大鼠血清對(duì)血清中FGF-23蛋白的切割進(jìn)行了檢測(cè)。大鼠血清加入到20ng純化后的FGF-23蛋白中，得到最終濃度為50％。將兩種溶液混合并進(jìn)行培養(yǎng)0，0.5，1，2，4，8，和24小時(shí)。通過(guò)聚丙烯酰胺電泳分離溶液，然后通過(guò)一種半干印跡轉(zhuǎn)移槽(Owl Separation Systems，美國(guó))將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到一種聚偏氟乙烯(美國(guó)Millipore公司)膜上。利用2A2B抗體通過(guò)Western印跡法進(jìn)行測(cè)定，可測(cè)定由純化后的FGF-23蛋白衍生得到的代謝物。其結(jié)果如圖8所示。和血清混合以后，存在于溶液中的全長(zhǎng)FGF-23蛋白的數(shù)量隨培育時(shí)間的增加而降低，并且觀察到了分子量為22kDa的新片段的出現(xiàn)及增加。
(2)人的血清或血漿與純化后的FGF-23蛋白的混合實(shí)驗(yàn)將人的血清或人血漿以最后50％的濃度加入到20ng的純化的FGF-23蛋白，接著在37℃溫育3小時(shí)。將溶液通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠分離，然后將凝膠上的蛋白利用半干印跡系統(tǒng)(Owl分離系統(tǒng)，美國(guó))轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore美國(guó))。利用2A2B抗體通過(guò)Western印跡法進(jìn)行測(cè)定，可測(cè)定由純化后的FGF-23蛋白衍生得到的代謝物。其結(jié)果如圖9所示。當(dāng)人的血清與FGF-23蛋白混合時(shí)，出現(xiàn)了一條分子量為22kDa的條帶。但是，當(dāng)人的血漿與FGF-23蛋白混合時(shí)，未出現(xiàn)一條分子量為22kDa的條帶。因此，推斷該22kDa的條帶來(lái)源于存在于血清中的蛋白切割酶。
實(shí)施例17切割FGF-23蛋白的酶的鑒定(1)凝血酶作用下的FGF-23的切割凝血酶(美國(guó)Sigma公司)加入到20ng純化后的FGF-23蛋白中，得到最終濃度為1單位/ml的溶液，接下來(lái)培育3小時(shí)。將培育后的溶液利用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，然后通過(guò)一種半干印跡轉(zhuǎn)移槽(Owl Separation Systems，美國(guó))將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到一種PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)上。利用2A2B抗體通過(guò)Western印跡法進(jìn)行測(cè)定，可測(cè)定由純化后的FGF-23蛋白衍生得到的代謝物。其結(jié)果如圖10所示。全長(zhǎng)FGF-23蛋白消失，并且其帶轉(zhuǎn)換成22kDa的帶。
(2)水蛭素對(duì)血清中FGF-23蛋白切割的抑制作用為了檢測(cè)血清中凝血酶對(duì)FGF-23切割的作用，對(duì)水蛭素(已知其為一種凝血酶選擇性抑制劑)的效果進(jìn)行了檢測(cè)。以最后濃度為50％，在20ng的純化的FGF-23蛋白中加入大鼠血清，接著溫育4小時(shí)。而且，加入大鼠血清的同時(shí)，加入了濃度為1.0單位/ml的水蛭素，接下來(lái)進(jìn)行類(lèi)似的溫育。將該溶液利用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，然后將凝膠中的蛋白利用一種半干印跡轉(zhuǎn)移槽(Owl SeparationSystems，美國(guó))轉(zhuǎn)移到一種PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)上。利用2A2B抗體通過(guò)Western印跡法進(jìn)行測(cè)定，可測(cè)定由純化后的FGF-23蛋白衍生得到的代謝物。其結(jié)果如圖11所示。對(duì)于加入大鼠血清的溶液，一些FGF-23蛋白轉(zhuǎn)化成了22kDa的多肽，并且由于水蛭素的存在，抑制了22kDa條帶的出現(xiàn)。所以，實(shí)驗(yàn)表明血清中產(chǎn)生的FGF蛋白的切割是由于凝血酶或與其類(lèi)似的酶。
實(shí)施例18血清中FGF-23蛋白切割位點(diǎn)的鑒定為了鑒定血清中FGF-23的切割位點(diǎn)，10μg純化后的FGF-23蛋白和大鼠血清混合24小時(shí)，由此產(chǎn)生22kDa的多肽。該溶液中22kDa的多肽被吸附于實(shí)施例14中制備的抗1C3H的抗體柱上，洗脫，并純化。用于此處的抗體柱通過(guò)在500μl固定鏈霉抗生素的樹(shù)脂(美國(guó)Amersham Pharmacia生物技術(shù)有限公司)上吸附200μg生物素化的1C3H抗體而制得。衍生得到的FGF-23蛋白利用0.1M的甘氨酸溶液(pH值為2.7)從抗體柱上洗脫。這樣純化的多肽通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，用CBB進(jìn)行染色，以致可以如圖12中所示鑒定純化的22kDa多肽。切出這條帶，進(jìn)行MALDI-TOF MS分析?；趶脑摲治鲋械玫降姆肿恿浚砻鬟@種22kDa的多肽具有如SEQ IDNO1所示的氨基酸序列中的從第25位酪氨酸至第196位精氨酸之間的一段序列。
這些結(jié)果顯示在血清中，F(xiàn)GF-23蛋白被血清中的凝血酶在SEQID NO1所示的氨基酸序列中的從第196位精氨酸之后的位置進(jìn)行切割，然后，轉(zhuǎn)換成SEQ ID NO1中的介于第25位和第196位氨基酸殘基之間的一段序列所示的多肽。如上所述，測(cè)定血液中具有活性的FGF-23蛋白需要檢測(cè)SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中的介于第179位和第180位氨基酸殘基之間未進(jìn)行切割的多肽。實(shí)驗(yàn)表明具有活性的全長(zhǎng)FGF-23蛋白在制備血清樣品過(guò)程中在第196位和第197位氨基酸殘基之間發(fā)生了部分切割，識(shí)別C-末端的抗FGF-23單克隆抗體不能識(shí)別由其本身產(chǎn)生的代謝物。尤其是，當(dāng)利用可識(shí)別SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的介于第25位和第179位氨基酸殘基之間的區(qū)域的一種抗體，和可識(shí)別SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的介于第180位和第196位氨基酸殘基之間的區(qū)域的一種抗體結(jié)合進(jìn)行夾心式ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)，血清制備過(guò)程中所導(dǎo)致的切割效應(yīng)可以忽略不計(jì)。然而，當(dāng)利用一種可識(shí)別SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的介于第25位和第179位氨基酸殘基之間的區(qū)域的抗體，和一種可識(shí)別SEQ IDNO1所示氨基酸序列中的介于第197位和第251位氨基酸殘基之間的區(qū)域的抗體時(shí)，與血漿相比，血清中的測(cè)定值可能下降。在得到的抗FGF-23的單克隆抗體中，1C3H抗體和3C1E抗體可識(shí)別SEQ IDNO1所示氨基酸序列中的介于第180位和第194位氨基酸殘基之間的區(qū)域。因此，血清中FGF-23的切割得到的22kDa的蛋白(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的第25位和第196位氨基酸殘基之間的一段序列)可被識(shí)別，其與在SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的介于第179位和第180位氨基酸殘基之間的切割產(chǎn)生的多肽片段具有明顯差異。因此，表明這些抗體在建立測(cè)定血清樣品的方法中是非常有用。
實(shí)施例19對(duì)患有腫瘤誘導(dǎo)骨軟化癥病人中血清和血漿中FGF-23蛋白濃度的定量分析已有報(bào)道表明在腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥中，F(xiàn)GF-23在腫瘤中過(guò)量的生成，已知該疾病可通過(guò)除去病原性腫瘤而治愈。但是，腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥中的病原性腫瘤由于生長(zhǎng)力弱，一般較小，經(jīng)常很難辨別。因此，腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥和低磷酸鹽血癥很難辨別診斷。因此，如果證明血液中FGF-23的濃度能夠作為診斷腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥的指示劑，就可發(fā)展一種定量測(cè)定血液中FGF-23濃度的方法，這樣的方法在臨床上非常有用的。
從腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥病人中獲得血清和血漿樣品，利用抗FGF-23的單克隆抗體通過(guò)夾心式ELISA系統(tǒng)對(duì)分析物中的FGF-23進(jìn)行定量分析。上述方法利用了抗FGF-23單克隆抗體和ELISA系統(tǒng)。2C3B抗體用作固定化抗體，生物素標(biāo)記的3C1E或1D6A抗體用于檢測(cè)用抗體。純化的2C3B抗體用50mM的碳酸氫鈉溶液稀釋至10μg/ml。向ELISA(Maxisorp(商標(biāo))，Nunc，美國(guó))實(shí)驗(yàn)用的96孔板中的每個(gè)孔加入50μl得到的溶液，然后在4℃溫育12小時(shí)固定。隨后，除去反應(yīng)溶液，每孔中加入250μl的阻滯溶液(SuperBlock(商標(biāo))，PIERCE，美國(guó))，得到的溶液在室溫培育30分鐘，由此進(jìn)行封閉。溶液被除去之后，每一個(gè)孔用含有0.1％吐溫20的TBS(T-TBS)溶液洗滌2次。為了避免與小鼠抗體發(fā)生非特異性反應(yīng)，腫瘤誘導(dǎo)骨軟化癥病人的血清和血漿樣品利用含有小鼠IgG1的T-TBS溶液稀釋2倍，濃度為80μg/ml的小鼠IgG1作為同型對(duì)照。而且，為了確保與FGF-23蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，樣品均用含有過(guò)量體積(80μg/ml)的用于固定化的2C3B抗體的T-TBS溶液稀釋2倍。產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液為通過(guò)向正常受試者的血清或血漿中添加純化的FGF-23蛋白，用類(lèi)似含有同型對(duì)照抗體的溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)罱K形成濃度分別為0.5，0.25，0.125，0.061，0.031，和0.015ng/ml的溶液。加50μl各樣品至微量滴定盤(pán)的每孔中，然后溶液在室溫培育1小時(shí)，以使分析物中的FGF-23蛋白與固定化的抗體發(fā)生反應(yīng)?？贵w反應(yīng)完成之后，每一個(gè)孔用T-TBS溶液洗滌4次，然后向孔中加入兩種類(lèi)型用生物素標(biāo)記的含有10％阻滯劑(Blockace(商標(biāo))，日本制藥公司)的T-TBS溶液稀釋至10μg/ml的抗FGF-23的單克隆抗體的溶液(含有1D6A抗體和3C1E抗體)。該溶液在室溫培育30分鐘，以進(jìn)行次級(jí)抗體反應(yīng)。用T-TBS溶液將孔洗滌4次后，每孔加入50μl用含有10％封閉液(Blockace(商標(biāo))，日本制藥公司)的T-TBS溶液稀釋5000倍的HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)。該溶液在室溫培育30分鐘，以使抗生物素蛋白鏈菌素與生物素標(biāo)記的抗體相結(jié)合。每個(gè)孔用T-TBS溶液將孔洗滌4次，然后向每孔加入50μl的N-四甲聯(lián)苯胺溶液(是一種過(guò)氧化物酶生色底物，DAKO，丹麥)，室溫培育。30分鐘后，每孔加入50μl 0.5M的硫酸溶液，以停止反應(yīng)。利用一個(gè)測(cè)定96孔板(MTP-300，CORONAELECTRIC CO.，LTD.，日本)的光吸收的系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定，其值為450nm的吸收值減去570nm的吸收值。一個(gè)代表FGF-23特異性反應(yīng)的吸收值為存在過(guò)量同型對(duì)照抗體時(shí)所測(cè)得的450nm的吸收值減去570nm的吸收值。結(jié)果見(jiàn)圖13。當(dāng)1D6A抗體用作檢測(cè)抗體時(shí)，血漿和血清樣品的測(cè)量值分別為0.033和0.008。測(cè)得的血清樣品的吸收值明顯低于血漿。另一方面，當(dāng)3C1E用作檢測(cè)抗體時(shí)，血清和血漿中樣品的吸收值幾乎完全相同。這些結(jié)果表明，如實(shí)施例18描述的在血清中切割那樣，F(xiàn)GF-23蛋白可能在樣品中部分切割。因此，結(jié)果表明臨床樣品的測(cè)量值隨上述檢測(cè)用的抗體的不同而存在差異。因此，利用3C1E抗體作為一種檢測(cè)抗體的夾心式ELISA系統(tǒng)也能夠?qū)ρ逯挟a(chǎn)生的切割產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，然后對(duì)腫瘤切除前后采集的血漿中FGF-23的濃度進(jìn)行了測(cè)定。利用通過(guò)向正常受試者的血漿樣品中加入不同濃度的純化后的FGF-23蛋白而制得的標(biāo)準(zhǔn)溶液，基于純化的蛋白量的增加光吸收值也增加的事實(shí)制得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖14A。由此得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線也能被用于在稀釋了2倍的人的血清或血漿樣品中利用檢測(cè)變化范圍介于30pg/ml和至少約500pg/ml(該值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中是一個(gè)明顯增加的濃度值)之間定量分析FGF-23蛋白。在這樣的條件下，從腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥病人腫瘤切除之前的一天和腫瘤切除之后的一個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間對(duì)血漿樣品中的FGF-23濃度進(jìn)行了定量測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖14B。腫瘤切除之前血漿樣品中的FGF-23蛋白濃度約為270pg/ml。但是，在腫瘤切除之后的樣品中，F(xiàn)GF-23蛋白濃度降至檢測(cè)閾值(30pg/ml)或更少。因此，清楚表明在腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥中，由于病原腫瘤的存在，血液中FGF-23以可檢測(cè)到的濃度存在，腫瘤切除之后FGF-23蛋白的濃度顯著降低。利用抗FGF-23單克隆抗體的ELISA法在診斷腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥中非常有用，利用具有特異識(shí)別位點(diǎn)的抗體(將血清中FGF-23的切割效應(yīng)也考慮進(jìn)來(lái))，使定量測(cè)定成為可能。
實(shí)施例20用抗FGF-23單克隆抗體進(jìn)行免疫組織學(xué)染色腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥中的病原腫瘤用一個(gè)抗FGF-23的單克隆抗體進(jìn)行染色。將切除的一個(gè)腫瘤浸泡在一種包埋性溶液中，為冷凍做好準(zhǔn)備，冷凍劑使用液氮冷卻的丙酮，由此制得冷凍的腫瘤結(jié)塊。除此以外，將從腫瘤組織周緣確定為正常組織的部分切取一塊作為對(duì)照，冷凍成結(jié)塊。用低溫保持器(CMI1900，LEICA，德國(guó))將冷凍的結(jié)塊切成厚度為4μm的薄片。該切片被粘附到MAS包被的載玻片上(MATSUNAMI GLAS IND.，LTD.，日本)，進(jìn)行冷凍和干燥。由此制得的切片在零下20℃下保藏。粘附上冷凍切片的載玻片在丙酮中于室溫培育5分鐘，以使組織固定在載玻片上。用磷酸鹽緩沖液洗滌之后，在含有1％過(guò)氧化氫和0.1％疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液中，室溫培養(yǎng)30分鐘，以使內(nèi)生性過(guò)氧化物酶失活。隨后，混合溶液用含有0.1％吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌，然后在含有4％脫脂乳的磷酸鹽緩沖液中室溫培養(yǎng)30分鐘，進(jìn)行封閉反應(yīng)。隨后，在含有10μg/ml的生物素標(biāo)記的1C3H和2C3B抗體的磷酸鹽緩沖液中室溫培養(yǎng)1小時(shí)，使組織中的FGF-23與加入的單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)。用含有0.1％吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌之后，用一個(gè)過(guò)氧化物酶試劑盒(Vectastain Elite ABC(商標(biāo))，VECTOR實(shí)驗(yàn)室，美國(guó))將山葵過(guò)氧化物酶與和組織特異性結(jié)合的生物素標(biāo)記的單克隆抗體相結(jié)合。用含有0.1％吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌之后，進(jìn)行過(guò)氧化物酶與底物(DAKO液相DAB底物顯色系統(tǒng)(商標(biāo))，DAKO，丹麥)的反應(yīng)，然后用磷酸鹽緩沖液中止反應(yīng)。用離子交換水洗滌之后，在用離子交換水稀釋5倍的蘇木精染色液(Merck & Co.，美國(guó))中室溫培養(yǎng)30秒，然后用活水洗滌。接下來(lái)，用乙醇進(jìn)行脫水，用二甲苯進(jìn)行滲透，然后混合溶液用封裝液封面。結(jié)果見(jiàn)圖15。認(rèn)為與腫瘤組織中的FGF-23發(fā)生反應(yīng)的位點(diǎn)被染成褐色?？墒?，沒(méi)有在腫瘤周緣組織中觀察到染色的影像。因此，確定在腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥的病原性腫瘤中存在高濃度的FGF-23。
實(shí)施例21小鼠FGF-23蛋白的表達(dá)與純化小鼠FGF-23的序列已經(jīng)有過(guò)報(bào)道(Yamashita，T.等，生物化學(xué)與生物物理研究通訊，277494-498，2000)。小鼠FGF-23的序列信息能通過(guò)搜索NCBI基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)而獲得。基于由此得到的序列信息，利用嵌套PCR以獲得編碼小鼠FGF-23蛋白的cDNA。擴(kuò)增反應(yīng)第一階段使用的引物為一個(gè)mF5引物(見(jiàn)SEQ ID NO25)和一個(gè)mF3引物(見(jiàn)SEQ ID NO26)(5’端和3’端不翻譯的區(qū)域分別互補(bǔ))，小鼠FGF-23蛋白的cDNA序列被合成。94℃保持1分鐘后，以從小鼠肺部取得的cDNA(克隆技術(shù)公司，美國(guó))為模板，進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)。使用的酶為L(zhǎng)A-Taq DNA聚合酶(日本寶酒造公司)，每個(gè)循環(huán)包括94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，45秒。接下來(lái)，反應(yīng)的第二階段利用如下兩個(gè)引物一個(gè)含有SEQ ID NO27所示的從初始密碼子至翻譯區(qū)域的mF23F引物，和一個(gè)含有SEQ ID NO28所示的從翻譯區(qū)域至終止密碼子的mF23R引物。在mF23F引物中，引入了一個(gè)克隆用的EcoR I限制酶識(shí)別序列和一個(gè)Kozak序列。同時(shí)，在mF23R引物中，在終止密碼子后面引入了一個(gè)Not I限制酶識(shí)別序列。98℃保持1分鐘后，以第一階段反應(yīng)的反應(yīng)溶液作為模板，進(jìn)行35個(gè)PCR循環(huán)。使用的酶為PyroBest DNA聚合酶(日本寶酒造公司)，每個(gè)循環(huán)包括98℃，10秒；58℃，10秒；72℃，60秒。因此，編碼小鼠FGF-23蛋白的cDNA序列得以擴(kuò)增。該cDNA被克隆至一個(gè)pEAK8載體(EdgeBiosystem，美國(guó))的EcoR I位點(diǎn)和Not I位點(diǎn)。該載體即pEAK8mFGF-23。而且，根據(jù)實(shí)施例1中制備FGF-23RQH的方法，構(gòu)建小鼠的FGF-23RQ，其中引入一個(gè)突變，即在小鼠的FGF-23切割酶識(shí)別位點(diǎn)以一個(gè)谷氨酸殘基代替一個(gè)精氨酸殘基。該突變的引入方法參見(jiàn)實(shí)施例1(3)中所描述的方法。為了引入該突變，合成了兩個(gè)引物一個(gè)是正向引物mRQF(見(jiàn)SEQ ID NO29)，另一個(gè)是反向引物mRQR(見(jiàn)SEQ ID NO30)。首先，利用pEAK8mFGF-23為模板，一個(gè)mF23F引物和mRQR引物的重組體，和一個(gè)mF23R引物和mRQF引物的重組體，進(jìn)行PCR反應(yīng)，由此獲得每種樣品的PCR片段。接下來(lái)，利用兩種產(chǎn)物的混合物作為模板，位于小鼠FGF-23cDNA兩個(gè)末端的一個(gè)mF23F和一個(gè)mF23R引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，由此擴(kuò)增了引入突變的FGF-23 cDNA的片段。產(chǎn)物被克隆至一個(gè)pEAK8/IRES/EGFP質(zhì)粒的EcoR I限制酶位點(diǎn)和Not I限制酶位點(diǎn)。混合溶液被純化，然后測(cè)定其核苷酸序列，確保引入了靶突變的小鼠FGF-23 cDNA被成功克隆。命名其為pEAK8/IRES/EGFP/mFGF-23RQ。該質(zhì)粒還被引入到CHO ras克隆1細(xì)胞中，加入5μg/ml的嘌呤霉素(美國(guó)Sigma公司)，然后選擇具有抗藥性的細(xì)胞?？寺⊥旰?，獲得了小鼠表達(dá)FGF-23的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞命名為CHO-mFGF23RQ。這樣的CHO-mFGF23RQ細(xì)胞在輥式瓶中培養(yǎng)，由此獲得了約12升的培養(yǎng)物上清液。根據(jù)實(shí)施例2(3)中描述的純化FGF-23蛋白的方法對(duì)該溶液進(jìn)行純化，由此獲得了純化的FGF-23RQ。
本實(shí)驗(yàn)所用引物的序列如下mF5ATTAGCCACTCGTGCTGTGCAATG (SEQ ID NO25)mF3GCAGCCTGGCCTGGGGACCTA (SEQ ID NO26)mF23FGGAATTCCACCATGCTAGGGACCTGCCTTAGACTC(SEQ ID NO27)mF23RATAGTTTAGCGGCCGCCTAGACGAACCTGGGAAAGGGGCGACA(SEQ ID NO28)mRQFTTCGCCCACGGCAACACACGCAAAGCGCCGAGGAC(SEQ ID NO29)mRQRGTCCTCGGCGCTTTGCGTGTGTTGCCGTGGGCGAA(SEQ ID NO30)實(shí)施例22抗人FGF-23的單克隆抗體和FGF-23的交叉反應(yīng)活性利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)純化后的小鼠FGF-23RQ蛋白進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到一種聚偏氟乙稀膜(美國(guó)Millipore公司)上，然后利用3C1E抗體進(jìn)行Western印跡法測(cè)定。因此，得到了一條分子量大約為32.5kDa的條帶，如圖16A所示。純化后的小鼠FGF-23RQ蛋白溶液被系列稀釋?zhuān)缓笸ㄟ^(guò)利用抗人FGF-23的單克隆抗體的夾心式ELISA方法對(duì)其進(jìn)行嘗試性測(cè)定。這里所用的純化后小鼠FGF-23RQ蛋白溶液的濃度未能精確的獲得。通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離條帶，并進(jìn)行測(cè)定，與純化的已知濃度的人FGF-23蛋白進(jìn)行比對(duì)，并用CBB染色。實(shí)驗(yàn)人員認(rèn)為當(dāng)以圖16B所示的相對(duì)值為10進(jìn)行表達(dá)時(shí)，小鼠FGF-23RQ蛋白溶液的濃度范圍在1至5μg/ml之間。利用2C3B抗體作為固定化抗體，3C1E抗體作為檢測(cè)抗體對(duì)稀釋后的小鼠FGF-23RQ蛋白溶液進(jìn)行了測(cè)定。測(cè)定結(jié)果如圖16B所示。由于所得到的450nm-570nm范圍內(nèi)的測(cè)定值隨純化后的小鼠FGF-23RQ蛋白溶液的濃度增加而增大，那么小鼠的FGF-23蛋白就能夠以一種濃度依賴(lài)方式利用抗人FGF-23單克隆抗體通過(guò)ELISA法進(jìn)行檢測(cè)了。而且，可證明抗人FGF-23的單克隆抗體能夠識(shí)別小鼠的FGF-23蛋白，表明實(shí)施例27和28中所觀察到的抗人FGF-23單克隆抗體通過(guò)結(jié)合小鼠的內(nèi)生性FGF-23能中和或修飾其活性。
實(shí)施例23對(duì)患有遺傳性血磷酸鹽過(guò)少疾病的小鼠血液中的FGF-23蛋白進(jìn)行檢測(cè)FGF-23已知是一種誘導(dǎo)腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥的因子，因?yàn)樵贏DHR的FGF-23基因中發(fā)現(xiàn)了錯(cuò)義突變，所以已知其也參與誘導(dǎo)ADHR。然而，遺傳性血磷酸鹽過(guò)少疾病的另一種形式，XLH，盡管已闡明其對(duì)應(yīng)的基因，但目前對(duì)引發(fā)該疾病的機(jī)理還沒(méi)有完全弄清。此外，該疾病和FGF-23的關(guān)系也是未知的。為了檢測(cè)該疾病中FGF-23的參與情況，所以對(duì)Hyp小鼠(患有XLH疾病)血液中的FGF-23的濃度進(jìn)行了嘗試性測(cè)定。
ELISA方法中利用2C3B抗體作為固定化抗體，生物素標(biāo)記的3C1E抗體作為檢測(cè)抗體進(jìn)行測(cè)定。利用一種50mM的碳酸氫納溶液稀釋純化后的2C3B抗體至濃度為10μl/ml。50μl的生成物溶液加入到ELISA系統(tǒng)(Maxisorp(商標(biāo))，Nunc，美國(guó))中的96孔板中，然后將該溶液在4℃培育12小時(shí)以進(jìn)行固定化。接下來(lái)，除去反應(yīng)溶液，向每孔中加入250μl的阻滯溶液(Superblock(商標(biāo))，PIERCE，美國(guó))，然后在室溫培育30分鐘，以阻滯反應(yīng)的進(jìn)行。除掉溶液以后，每個(gè)孔用含有0.1％吐溫20的TBS(T-PBS)溶液洗滌兩次。從27-30周大小的同一窩出生的Hyp小鼠和正常的對(duì)照組小鼠眼眶中采集血樣，然后制得血清樣品。血清樣品用含有2C3B抗體或一個(gè)小鼠IgG1抗體(作為同型對(duì)照)的T-TBS溶液稀釋2倍，濃度為40μg/ml。每一種血清樣取50μl加入進(jìn)微量滴定盤(pán)的每個(gè)孔中，然后在室溫培育1小時(shí)，這樣可使分析物中的FGF-23蛋白與固定化抗體進(jìn)行反應(yīng)。經(jīng)過(guò)抗體反應(yīng)后，利用T-TBS溶液洗滌孔4次，然后向每個(gè)孔中加入稀釋后的濃度為2μl/ml的2C3B抗體溶液(稀釋方法為利用一種含10％阻滯溶液(Blockace(商標(biāo))，日本制藥公司)的T-TBS溶液稀釋2C3B抗體至2μl/ml)。將該溶液在室溫培育30分鐘以同次級(jí)抗體進(jìn)行反應(yīng)。經(jīng)過(guò)T-TBS溶液洗滌每一個(gè)孔4次以后，取50μl稀釋后(稀釋方法為利用一種含10％阻滯溶液(Blockace(商標(biāo))，日本制藥公司)的T-TBS溶液稀釋HRP標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)至5000倍)的溶液加入進(jìn)每一孔中。該溶液在室溫培育30分鐘以使抗生物素蛋白鏈菌素和生物素標(biāo)記的抗體相結(jié)合。利用T-TBS溶液洗滌每個(gè)孔4次，然后向每個(gè)孔中加入50μl的N-四甲聯(lián)苯胺(DAKO，丹麥)，是一種過(guò)氧化物生色底物，在室溫進(jìn)行培育。30分鐘后，向每一孔中加入50μl濃度為0.5M的硫酸溶液以停止反應(yīng)。利用測(cè)量96孔板(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)的光吸收值的系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定，得到的值(A450-A570)為450nm下的光吸收值減去570nm下的光吸收值。一個(gè)表明FGF-23特異性反應(yīng)的光吸收值是通過(guò)如下方法獲得的在反應(yīng)中加入同型對(duì)照獲得的A450-A570值減去在反應(yīng)中加入2C3B抗體作為吸收抗體獲得的A450-A570值。結(jié)果如圖17所示。圖17清楚的表明了Hyp小鼠血液中FGF-23濃度的顯著升高。由于Hyp小鼠患低磷酸鹽血癥是由于PHEX的基因缺陷，并且XLH，人類(lèi)的低磷酸鹽血癥，是由于PHEX基因的變異或缺陷所引起的，因此Hyp小鼠被認(rèn)為是XLH模型小鼠。該結(jié)果有力的表明了血液中FGF-23濃度的升高可作為XLH中誘導(dǎo)低磷酸鹽血癥的一個(gè)因素。
實(shí)施例24 FGF-23和1，25D的相互控制作用(1)接種FGF-23H引起1，25D下降純化后的FGF-23H蛋白通過(guò)臀靜脈給6只6周大的BALN/c雄性小鼠以每只小鼠5μg的劑量進(jìn)行接種。接種1，4，和9小時(shí)后，采集血樣，并且對(duì)血液中1，25D的濃度進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果如圖18A所示。接種FGF-23H后3小時(shí)，觀察到了血液中1，25D的濃度有了顯著的下降，并且接種9小時(shí)后，其濃度進(jìn)一步的降低。
(2)接種1，25D誘導(dǎo)產(chǎn)生FGF-23給小鼠接種1，25D，并且檢測(cè)了血中FGF-23的濃度變化。6只7周大的雄性小鼠構(gòu)成一組。一組接種0.025μg溶于含有0.05％吐溫的磷酸鹽緩沖液中的1，25D，對(duì)照組接種含有0.05％吐溫的磷酸鹽緩沖液。通過(guò)腹腔進(jìn)行接種。接種后8小時(shí)，在麻醉狀態(tài)下從小鼠的心臟中采集血樣，然后制得了血清樣品。利用如實(shí)施例23相同的方法通過(guò)ELISA對(duì)這些血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，然后血液中的FGF-23的數(shù)量利用由人FGF-23蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定。這些結(jié)果如圖18B所示。接種1，25D后8小時(shí)，觀測(cè)到了血中FGF-23濃度的顯著升高。
所以，結(jié)果表明FGF-23與1，25D具有密切的相互作用關(guān)系。
實(shí)施例25患有腎功能衰竭性高磷酸鹽血癥的病人血液中的FGF-23濃度給七周大小的威斯塔氏小鼠服用CE-2(日本CLEA公司，該CE-2已經(jīng)以0.75％的一種比例混合了腺嘌呤)，這樣可在威斯塔氏小鼠體中產(chǎn)生一種腎功能衰竭性高磷酸鹽血癥模式。作為一對(duì)照組，同樣給威斯塔氏小鼠服用CE-2(未混合腺嘌呤)。服用混合藥劑3周后，從臀動(dòng)脈中采集血樣，收集血清。采集血樣后，兔子飼養(yǎng)在代謝性籠舍中并采集尿樣24小時(shí)。對(duì)血清中的磷酸鹽濃度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖19A所示。血清和尿中的肌酸酐利用一種商業(yè)化的試劑盒(CRE-Ag Kainos(商標(biāo))，KAINOS實(shí)驗(yàn)室，INC.，日本)通過(guò)一種酶法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖19B所示。而且，利用2C3B抗體作為一種固定化抗體和3C1E抗體作為一種檢測(cè)抗體通過(guò)ELISA系統(tǒng)對(duì)血清中FGF-23的濃度進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果如圖19C所示。
在這種腎功能障礙的疾病中病情發(fā)展情況通過(guò)尿中肌氨酸酐濃度下降和血清中肌氨酸酐濃度升高而得以清楚體現(xiàn)。隨著病情發(fā)展，演變成了血磷酸鹽過(guò)高疾病。在該病例中，血液中FGF-23蛋白的濃度在一個(gè)顯著的高水平值。這種病例被認(rèn)為反映了腎功能衰竭的一種模式，表明了FGF-23可能是一種誘導(dǎo)腎功能下降和血液透析病人的某些并發(fā)癥的因素。
實(shí)施例26利用免疫沉淀法檢測(cè)存在于腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥病人血漿中的FGF-23蛋白為了檢測(cè)FGF-23蛋白在血液中的存在狀態(tài)，對(duì)正常受試者的血漿或腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥病人的血漿通過(guò)免疫沉淀方法進(jìn)行了檢測(cè)。向400μl混合血漿樣品中加入20μl已固定2C3B抗體的樹(shù)脂(實(shí)施例14中制備)，或加入20μl未固定抗體的樹(shù)脂。利用上下?lián)u蕩的方式將該溶液在4℃混合1小時(shí)以確保抗體同F(xiàn)GF-23進(jìn)行反應(yīng)。接下來(lái)，利用PBS溶液洗滌樹(shù)脂4次，這樣可除掉未反應(yīng)的產(chǎn)物。50μl樣品緩沖液(50mM的Tris-Cl溶液，pH為6.8，1％的SDS溶液，10％的甘油溶液，0.001％的溴酚藍(lán)溶液，2mM的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，和20mM的DTT溶液)加入進(jìn)每一種類(lèi)型的樹(shù)脂中。將該溶液在95℃加熱5分鐘后進(jìn)行離心分離，收集分離后的上清液。上清液利用濃度為10％-20％的濃度梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，然后利用一種半干印跡轉(zhuǎn)移槽(Owl Separation Systems，美國(guó))將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到一種聚偏氟乙稀膜(美國(guó)Millipore公司)上。然后，PVDF膜在室溫下用T-TBS(美國(guó)Sigma公司)溶液稀釋后的生物素標(biāo)記的3C1E抗體溶液(稀釋后的濃度為0.5μg/ml)中培育2小時(shí)。而且，將HRP標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)同生成物進(jìn)行反應(yīng)。利用一種ECL Plus發(fā)光系統(tǒng)(美國(guó)AmershamPharmacia Biotech公司)將混合溶液暴露于膠片上1小時(shí)，然后膠片用一個(gè)自動(dòng)處理器(日本富士膠片公司)進(jìn)行處理。結(jié)果見(jiàn)圖20。在未固定抗體的樹(shù)脂中，僅觀察到了血漿產(chǎn)生的非特異性信號(hào)分子。然而，利用2C3B抗體進(jìn)行免疫沉淀得到的產(chǎn)物中，檢測(cè)到了一條分子量為32kDa的帶，懷疑其代表了腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥病人血漿中的全長(zhǎng)FGF-23。而且，在用凝血酶切割的產(chǎn)物中未檢測(cè)到22kDa的條帶。同時(shí)，在正常受試者中，22kDa的帶和32kDa的帶均未檢測(cè)到。從這些結(jié)果中可以表明腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥中高水平表達(dá)的FGF-23以未經(jīng)切割的全長(zhǎng)形式存在于血液中。
實(shí)施例27正常小鼠接種抗人FGF-23的單克隆抗體實(shí)驗(yàn)為了檢測(cè)抗人FGF-23的單克隆抗體對(duì)正常小鼠的影響，進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)。正常小鼠(BALB/c，雄性，12周大)被隨機(jī)分成5組，每組由4只小鼠組成。如圖21A所示，0.15ml磷酸鹽緩沖液作為載體通過(guò)臀靜脈單一接種組1中的每只小鼠，0.67mg/ml抗人FGF-23的單克隆抗體(1D6A抗體，2C3B抗體，和3C1E抗體)通過(guò)臀靜脈分別單一接種組2，3和4中的每只小鼠，0.67mg/ml抗TPO的單克隆抗體作為對(duì)照通過(guò)臀靜脈單一接種組5中的每只小鼠。接種24小時(shí)后，在乙醚麻醉的狀態(tài)下從小鼠的心臟中采集血樣，然后利用一種微量采血管(美國(guó)Becton Dickinson公司)分離出血清。按照附件中的方法利用一種磷-測(cè)試Wako(日本和光純藥工業(yè)公司)，鈣-測(cè)試Wako(日本和光純藥工業(yè)公司)，和1，25(OH)2D RIA試劑盒TFB(TFB，美國(guó))對(duì)這樣采集到的血清中的磷酸鹽濃度，鈣濃度和1，25D的濃度分別進(jìn)行了測(cè)定。在接種至血樣采集期間，每組小鼠均被關(guān)在一只塑料籠中，包含有1％的磷和1％的鈣的CE-2固體飼料(日本CLEA公司)和自來(lái)水采取任意采食的方式進(jìn)行飼喂。
測(cè)定結(jié)果如圖21A所示。每組的測(cè)定值利用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。標(biāo)記有一個(gè)“*”號(hào)的組表明當(dāng)通過(guò)Student-t法進(jìn)行顯著性測(cè)試時(shí)，接種載體(磷酸鹽緩沖液)的組和接種抗TPO抗體的組其p值均小于0.01。
實(shí)施例28實(shí)施例27中，在接種3C1E抗體的實(shí)驗(yàn)中盡管觀察到了血清中磷濃度的升高，但是同時(shí)也觀察到了血清中1，25D濃度的降低。然而，已知血液中1，25D的濃度是快速變化的，1，25D的這樣一種特性，使得當(dāng)觀察到其濃度暫時(shí)增大的時(shí)候，稍后也能觀察到其濃度的降低。因此，重做一次接種3C1E抗體的實(shí)驗(yàn)。3C1E抗體以400μg/只的劑量通過(guò)靜脈接種的方式給6只正常小鼠接種。接種8小時(shí)以后，對(duì)血清中1，25D的濃度進(jìn)行檢測(cè)。作為一對(duì)照組，對(duì)通過(guò)相似的接種方式接種PBS的小鼠血清中的1，25D濃度也進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果如圖21B所示。在該實(shí)驗(yàn)中，觀察到了由于接種3C1E抗體而引起了小鼠血清中1，25D濃度明顯升高的現(xiàn)象。
實(shí)施例29抗FGF-23的抗體(3C1E抗體)在患有腺嘌呤誘導(dǎo)的腎功能障礙的大鼠中恢復(fù)1，25(OH)2D水平的作用如實(shí)施例25所描述的那樣，產(chǎn)生這種疾病(腺嘌呤誘導(dǎo)的腎功能障礙)的第3周，在大鼠的血清中觀察到了磷濃度和血液中FGF-23濃度的顯著升高。而且，在這種疾病中，在接種腺嘌呤之后第七天，觀察到了血液中1，25D濃度的下降(腎功能也是下降的)(見(jiàn)圖22A)。因此，為了比較和檢測(cè)腎功能紊亂早期時(shí)血液中FGF-23的濃度，按如下的方式對(duì)其進(jìn)行了定量檢測(cè)。
在ELISA化驗(yàn)中，2C3B抗體作為一種固定化抗體，生物素標(biāo)記的3C1E抗體作為檢測(cè)抗體。首先，利用50mM的碳酸氫納溶液稀釋純化后的2C3B抗體至50μg/ml。50μl的生成物溶液加入到ELISA系統(tǒng)(Maxisorp(商標(biāo))，Nunc，美國(guó))中的96孔板中，然后將該溶液在4℃培育12小時(shí)以使其固定在平板上。接下來(lái)，除去反應(yīng)溶液，向每孔中加入250μl的阻滯溶液(Superblock(商標(biāo))，PIERCE，美國(guó))，然后在室溫培育30分鐘，以阻滯反應(yīng)的進(jìn)行。除掉溶液以后，每個(gè)孔用含有0.1％吐溫20的TBS(T-PBS)溶液洗滌兩次。血清樣被制得，并利用T-TBS溶液稀釋2倍。除此之外，標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物用實(shí)施例14中制備的已經(jīng)應(yīng)用于固定抗2C3B抗體的樹(shù)脂實(shí)驗(yàn)中的大鼠血清進(jìn)行稀釋?zhuān)康氖浅?nèi)生性FGF-23，然后再用T-TBS溶液稀釋2倍。每一種樣品取50μl加入進(jìn)微量滴定盤(pán)的每個(gè)孔中，然后在室溫培育1小時(shí)，這樣可使分析物中的FGF-23蛋白與固定化抗體進(jìn)行反應(yīng)。經(jīng)過(guò)抗體反應(yīng)后，利用T-TBS溶液洗滌孔4次，然后向每個(gè)孔中加入稀釋后的濃度為1.5μg/ml的3C1E抗體溶液(稀釋方法為利用一種含10％阻滯溶液(Blockace(商標(biāo))，日本制藥公司)的T-TBS溶液稀釋3C1E抗體至1.5μg/ml)。將該溶液在室溫培育30分鐘，以使同生物素標(biāo)記的抗體相結(jié)合。利用T-TBS溶液洗滌每個(gè)孔4次，然后向每個(gè)孔中加入50μl的N-四甲聯(lián)苯胺(DAKO，丹麥)，是一種過(guò)氧化物生色底物，在室溫進(jìn)行培育。30分鐘后，向每一孔中加入5μl濃度為0.5M的硫酸溶液以停止反應(yīng)。利用測(cè)量96孔板的光吸收值的一種系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定，得到的值(A450-A570)為450nm下的光吸收值減去570nm下的光吸收值?；跇?biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)將獲得的測(cè)定值轉(zhuǎn)換為純化后的人抗FGF-23蛋白的重組體的產(chǎn)物的指示濃度值對(duì)濃度進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果如圖22B所示，在喂養(yǎng)混合了腺嘌呤的組中觀察到了血液中FGF-23濃度的明顯升高。如實(shí)施例25所示，給正常小鼠接種FGF-23后能導(dǎo)致血液中1，25D濃度的快速下降，表明當(dāng)腎功能下降時(shí)，血液中1，25D濃度的下降和血液中FGF-23濃度的增加之間存在某些聯(lián)系。為了證實(shí)這種可能性，將喂養(yǎng)混合了腺嘌呤的大鼠血液中的1，25D濃度和FGF-23濃度對(duì)單個(gè)大鼠作圖。因此，從圖中可見(jiàn)二者之間有一明顯的負(fù)的線性相關(guān)性(圖22C)。這些結(jié)果表明通過(guò)控制血液中FGF-23的濃度來(lái)校正1，25D濃度下降的方法具有可行性。因此，按下述的方式進(jìn)行了一個(gè)給這種模式的受試者接種中和抗FGF-23抗體的實(shí)驗(yàn)。
12只7周大的雄性威斯塔氏鼠用適于嚙齒動(dòng)物的并混合了腺嘌呤[(6-氨基嘌呤，美國(guó)Sigma公司)，腺嘌呤的最終濃度為0.75％]的CE-2商業(yè)粉狀飼料(日本CLEA公司)飼喂7天，飼喂方式為任意采食的方式，產(chǎn)生了腎功能下降疾病。給一對(duì)照組的12只小鼠只飼喂CE-2(未混合腺嘌呤)。為了使在病發(fā)第七天腎功能紊亂的程度與使用一種血液肌氨酸水平相當(dāng)，每組用混合有腺嘌呤的飼料喂養(yǎng)的鼠與對(duì)照組中的鼠均應(yīng)分別被分成2組(6只/組)，然后通過(guò)臀靜脈用3C1E抗體或磷酸鹽緩沖液以1mg/kg的劑量單一接種。接種12小時(shí)后，從臀動(dòng)脈采集部分血樣，然后將血樣進(jìn)行離心分離，這樣獲得血清。利用一種1，25(OH)2D RIA Kit TFB(TFB，美國(guó))對(duì)這樣獲得的血清中的1，25D濃度進(jìn)行檢測(cè)，并且利用CRE-EN Kainos((商標(biāo))，KAINOS實(shí)驗(yàn)室，Inc.，日本)對(duì)這樣獲得的血清中的肌酸酐濃度也進(jìn)行了檢測(cè)。
檢測(cè)結(jié)果如圖22D所示，與只喂養(yǎng)載體(PBS)的每一組相比，在所有的對(duì)照組和喂養(yǎng)混合了腺嘌呤的組中觀察到了1，25D濃度的明顯升高。上述結(jié)果表明FGF-23參與產(chǎn)生維生素D低下(一種血液中低水平的1，25D疾病)疾病，并伴隨腎功能下降，此時(shí)抑制FGF-23的作用能夠改善維生素D低下的狀況。
實(shí)施例30對(duì)患有性連遺傳型低磷酸鹽血癥佝僂病(XLH)的病人血液中FGF-23蛋白的測(cè)定XLH是一種低磷酸鹽血癥佝僂病的形式，顯示一種性連遺傳型的遺傳特性，而且其發(fā)病率與腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥具有許多相同點(diǎn)。近年來(lái)，屬于金屬內(nèi)肽酶家族的phex基因被認(rèn)為是產(chǎn)生這種疾病的致病性基因，并且一種假定的底物表明是誘導(dǎo)成病的一種因子。同時(shí)，如實(shí)施例23所示，在Hyp小鼠的血液中FGF-23的濃度極高，這種小鼠是在phex基因中有一個(gè)基因發(fā)生變異(同XLH中的基因變異相同)的遺傳性低磷酸鹽血癥的模式小鼠。這些現(xiàn)象表明對(duì)于患有XLH的病人的低磷酸鹽血癥，同腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥相似，是由于血液中FGF-23濃度升高所導(dǎo)致的。因此，首先，為了檢測(cè)FGF-23在該疾病中所起的作用，對(duì)正常受試者和患有XLH的病人的血清中的FGF-23濃度進(jìn)行了測(cè)定。除此之外，在獲得充足的phex基因突變之前的正常受試者和被證實(shí)在phex基因中有變異基因的XLH病人之后，用于測(cè)定的血清才能大量提供。病人的年齡，性別，和phex基因中的變異點(diǎn)如圖23所示。
在ELISA化驗(yàn)中，2C3B抗體被作為一種固定化抗體，生物素標(biāo)記的3C1E抗體被作為一種檢測(cè)抗體。首先，利用50mM的碳酸氫納溶液稀釋純化后的2C3B抗體至10μg/ml。50μl的生成物溶液加入到ELISA系統(tǒng)(Maxisorp(商標(biāo))，Nunc，美國(guó))中的96孔板中，然后將該溶液在4℃培育12小時(shí)以使其固定在平板上。接下來(lái)，除去反應(yīng)溶液，向每孔中加入250μl的阻滯溶液(Superblock(商標(biāo))，PIERCE，美國(guó))，然后在室溫培育30分鐘，以阻滯反應(yīng)的進(jìn)行。除掉溶液以后，每個(gè)孔用含有0.1％吐溫20的TBS(T-PBS)溶液洗滌兩次。從XLH病人中采集的血清被制備成測(cè)試樣，用含有一種在100μg/ml的濃度時(shí)不與FGF-23結(jié)合的包含有小鼠IgG1抗體的T-TBS溶液稀釋2倍。此外，利用正常受試者的血清(該血清利用一種在100μg/ml的濃度時(shí)不與FGF-23結(jié)合的包含有小鼠IgG1抗體的T-TBS溶液稀釋了2倍)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物進(jìn)行稀釋(利用向?qū)嵤├?4中制備的固定了抗2C3B抗體的樹(shù)脂中加入血清除去內(nèi)生性FGF-23)。每一種樣品取50μl加入進(jìn)微量滴定盤(pán)的每個(gè)孔中，然后在室溫培育1小時(shí)，這樣可使分析物中的FGF-23蛋白與固定化抗體進(jìn)行反應(yīng)。經(jīng)過(guò)抗體反應(yīng)后，利用T-TBS溶液洗滌孔4次，然后向每個(gè)孔中加入稀釋后的濃度為1.5μg/ml的3C1E抗體溶液(稀釋方法為利用一種含10％阻滯溶液(Blockace(商標(biāo))，日本制藥公司)的T-TBS溶液稀釋3C1E抗體至1.5μg/ml)。將該溶液在室溫培育30分鐘，以進(jìn)行次級(jí)抗體反應(yīng)。利用T-TBS溶液洗滌每個(gè)孔4次后，利用一種含10％阻滯溶液(Blockace(商標(biāo))，日本制藥公司)的T-TBS溶液稀釋HRP標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)至5000倍，取50μl稀釋后的溶液加入進(jìn)每一孔中。該溶液在室溫培育30分鐘，以使抗生物素蛋白鏈菌素同生物素標(biāo)記的抗體相結(jié)合。利用T-TBS溶液洗滌每個(gè)孔4次，然后向每個(gè)孔中加入50μl的N-四甲聯(lián)苯胺(DAKO，丹麥)，是一種過(guò)氧化物生色底物，在室溫進(jìn)行培育。30分鐘后，向每一孔中加入50μl濃度為0.5M的硫酸溶液以停止反應(yīng)。利用測(cè)量96孔板的光吸收值的一種系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定，得到的值(A450-A595)為450nm下的光吸收值減去595nm下的光吸收值。
結(jié)果，在104位正常成人中(30男性和74位女性)中，血液中的FGF-23濃度聚集在8.2-54.3ng/l的范圍內(nèi)，并且平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差是28.9+/-1.1ng/l。同時(shí)，如圖23所示，所有患有XLH疾病的病人血清中的FGF-23濃度值均高于正常受試者的平均值。而且，即使是患有XLH疾病的病人血清中FGF-23的平均濃度值也明顯高于正常受試者的平均濃度值(p＜0.0001，利用Student-t計(jì)算得到的)。這些結(jié)果強(qiáng)烈地暗示XLH患者血清中高濃度的FGF-23作為誘發(fā)疾病的因子的可能性。
實(shí)施例31兩種不同的中和抗體混合時(shí)增強(qiáng)中和活性的作用當(dāng)識(shí)別不同位點(diǎn)的中和抗體混合時(shí)，利用正常小鼠對(duì)其生理活性的變化進(jìn)行了檢測(cè)。
8周大的C57BL/6雄性小鼠被隨機(jī)分成4組，每組由6只小鼠組成。PBS溶液作為載體通過(guò)臀靜脈單一接種組1中的每只小鼠，100μg的2C3B抗體通過(guò)臀靜脈分別單一接種組2中的每只小鼠，100μg的3C1E抗體通過(guò)臀靜脈分別單一接種組3中的每只小鼠，100μg的抗體混合物(50μg的2C3B抗體和50μg的3C1E抗體)通過(guò)臀靜脈分別單一接種組4中的每只小鼠。接種后的第1天和第二天，在乙醚麻醉的狀態(tài)下從眼眶中采集血樣，利用一種微量采血管(美國(guó)BectonDickinson公司)分離出血清。然后按照附件中的方法利用一種磷測(cè)試Wako(日本和光純藥工業(yè)公司)對(duì)這樣采集到的血清中的磷酸鹽濃度進(jìn)行了測(cè)定。在接種至血樣采集期間，每組小鼠均被關(guān)在一只塑料籠中，CE-2(日本CLEA公司)和自來(lái)水采取任意采食的方式進(jìn)行飼喂。
所得結(jié)果如圖24所示。單獨(dú)的100μg 2C3B抗體或100μg 3C1E抗體在接種后第一天就導(dǎo)致血清中磷濃度的顯著增加。另一方面，在接種抗體混合物的組中，雖然每種抗體的劑量均減半，但還是顯示了血清中磷濃度的顯著增加，而且與任何只接種一種抗體的組相比其血清中的磷濃度都非常高。而且，在接種后的第二天，接種2C3B抗體或3C1E抗體的組中，提高血清中磷濃度的作用消失了，而接種抗體混合物的組中血清中磷濃度仍然急劇增加。上述結(jié)果表明與只接種一種類(lèi)型的抗體病例相比，識(shí)別不同位點(diǎn)的2種類(lèi)型的抗體混合物能夠進(jìn)一步增強(qiáng)中和活性，并更長(zhǎng)時(shí)間地維持這種作用。
實(shí)施例32給患有遺傳性低血磷酸鹽病的小鼠接種FGF-23中和抗體實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例23和實(shí)施例30所示，在XLH和Hyp小鼠中觀察到了血液中FGF-23濃度的升高，表明FGF-23是一種對(duì)應(yīng)低血磷酸鹽病(維生素D代謝異常，或骨鈣化障礙都是這種疾病的發(fā)病原因)的因子。因此，給Hyp小鼠接種抗FGF-23中和單克隆抗體，然后對(duì)該抗體是否能改善上述病癥進(jìn)行了檢測(cè)。
(1)重復(fù)接種抗FGF-23中和抗體實(shí)驗(yàn)利用4-7周大的C57BL/6-Hyp雄性小鼠和同一窩出生的野生型C57BL/6雄性小鼠，給Hyp小鼠重復(fù)接種中和抗體后對(duì)血液中磷濃度和1，25D濃度的影響進(jìn)行了檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中的四組包括一組接種載體的野生型小鼠，一組接種抗體的野生型小鼠，一組接種載體的Hyp小鼠，和一組接種抗體的Hyp小鼠。每組包括4只小鼠。在接種抗體的小鼠組實(shí)例中，具體的說(shuō)，3C1E抗體和2C3B抗體混合，它們的終濃度均為1.7mg/ml，然后生成物(混合溶液)以17mg/kg的劑量通過(guò)皮下至脊背區(qū)間接種每只小鼠。在接種抗體的小鼠組中，具體的說(shuō)，PBS以10mg/kg，同接種抗體的組相同體積的劑量接種該組中的每只小鼠。經(jīng)過(guò)最初接種后的第2，第4和第6天，截取小鼠的尾部末端，然后在乙醚麻醉的狀態(tài)下采集部分血樣。然后利用一種磷測(cè)試Wako(商標(biāo)，日本和光純藥工業(yè)公司)，鈣-測(cè)試Wako(商標(biāo)，日本和光純藥工業(yè)公司)，1，25(OH)2D RIA Kit TFB(TFB，美國(guó))和堿磷B-測(cè)試Wako(商標(biāo)，日本和光純藥工業(yè)公司)對(duì)這樣采集到的血液中的磷酸鹽濃度，鈣濃度，1，25D濃度和總堿性磷酸酶活性分別進(jìn)行了測(cè)定。
結(jié)果如圖25A所示。在接種抗體的野生型小鼠組中，在接種后的1至7天觀察到了血清中的磷酸鹽濃度明顯的升高了。同接種載體的Hyp小鼠組，在接種后的1至7天觀察到的血清中的磷酸鹽濃度相比，觀察到了接種抗體的Hyp小鼠組血清中的磷酸鹽濃度明顯的升高了。這些增高值在接種后的第7天變得更加明顯，表明濃度可達(dá)到與接種野生型小鼠抗體相同程度的濃度值。而且，通過(guò)接種中和抗體，在接種后的第1天，在野生型小鼠和Hyp小鼠組中都觀察到了血液中1，25D濃度的顯著升高。同時(shí)，在Hyp小鼠或患有低磷酸鹽血癥佝僂病(例如XLH)的病人中，其血液中總堿磷酸酶活性異常增高的現(xiàn)象已經(jīng)有過(guò)報(bào)道。表明從接種后24小時(shí)開(kāi)始，給Hyp小鼠接種的中和抗體逐漸減弱，血液中總的堿性磷酸酶活性水平比正常小鼠的活性水平異常的高，并且進(jìn)一步導(dǎo)致了活性顯著降低至與野生型小鼠初始接種后第七天時(shí)的程度相當(dāng)?shù)乃健?br> 利用4-7周大的雄性C57BL/6J-Hyp小鼠組和同一窩出生的雄性野生型C57BL/6J小鼠組和正常小鼠作為對(duì)照組，給Hyp小鼠重復(fù)接種抗FGF-23中和抗體后對(duì)骨組織的影響進(jìn)行了檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中的四組包括一組接種載體的野生型小鼠，一組接種抗體的野生型小鼠，一組接種載體的Hyp小鼠，和一組接種抗體的Hyp小鼠。每組包括4只小鼠。在接種抗體的小鼠組實(shí)例中，具體的說(shuō)，3C1E抗體和2C3B抗體混合，它們的終濃度均為1.7mg/ml，然后生成物(混合溶液)以17mg/kg的劑量通過(guò)皮下至脊背區(qū)間接種每只小鼠。在接種載體的組中，具體的說(shuō)，PBS以10mg/kg的劑量通過(guò)皮下至脊背區(qū)間接種該組中的每只小鼠。最初接種的時(shí)間被定為是第0天，那么在第2天，第4天，第6天，第8天，第21天和第40天時(shí)，進(jìn)行相同的接種。在最初接種后的第49天，在乙醚麻醉的狀態(tài)下從心臟中采集部分血樣，和右股骨樣，右脛骨樣，和肋樣。利用一種μF FX-1000微焦X-射線放大影像系統(tǒng)(日本富士膠片公司)在電流為100μA，電壓為25kV的輸出條件下輻射5秒，然后利用一種BAS影像分析儀(日本富士膠片公司)數(shù)字化后，得到所截取的股骨，脛骨和肋骨的放大的X-射線影像。
這樣所獲得的提取后的股骨，脛骨，和肋骨的放大X-射線影像如圖27所示。在Hyp小鼠或像低磷酸鹽血癥佝僂病(例如XLH疾病)這樣的病例中，對(duì)于鈣化紊亂，長(zhǎng)骨的干骨后端或助肋的軟骨關(guān)節(jié)處的增大現(xiàn)象相關(guān)聯(lián)的軟骨細(xì)胞增加的現(xiàn)象已有過(guò)報(bào)道。作為X射線影像分析的結(jié)果，在存在干骨后端增長(zhǎng)現(xiàn)象的Hyp小鼠組中，發(fā)現(xiàn)接種抗體后病情得到緩解，而在接種載體的組中發(fā)現(xiàn)骨密度下降，腿節(jié)和脛骨的皮質(zhì)骨變薄。而且，在接種抗體的Hyp小鼠組中發(fā)現(xiàn)病情得到緩和，而在接種載體的Hyp小鼠組中發(fā)現(xiàn)腿節(jié)和脛骨不能縱向增長(zhǎng)。接種載體的的Hyp小鼠組中肋脈關(guān)節(jié)和肋的軟骨增大，而這些現(xiàn)象在接種抗體的Hyp小鼠組中消失。表明給Hyp小鼠重復(fù)接種抗FGF-23的中和抗體可改善骨延伸紊亂和骨鈣化紊亂。
而且，為了詳細(xì)檢測(cè)抗FGF-23抗體對(duì)骨組織的作用，從進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物中制得了骨組織樣品。實(shí)驗(yàn)后的動(dòng)物經(jīng)宰殺后，左脛骨和右股骨被提取出來(lái)，將其加入進(jìn)70％的乙醇中，進(jìn)行VillanuevaBone(Villanueva Bone Stain Powder，MARUTO INSTRUMENT CO.，LTD.，日本)染色，利用濃度連續(xù)升高的乙醇溶液對(duì)骨進(jìn)行脫水，然后包埋進(jìn)Technovit 7100(德國(guó)Kulzer公司)中。生成物切成大約5μm厚的薄片，然后將脛骨的近端部分和股骨的遠(yuǎn)端部分在顯微鏡下進(jìn)行觀察。骨組織樣品的影像如圖28所示。在野生型小鼠中觀察到了軟骨細(xì)胞中的生長(zhǎng)片以有序的方式進(jìn)行排列(圖28A和D)，在Hpy小鼠的骨組織中，觀察到了有一被干擾的柱結(jié)構(gòu)區(qū)域，其特征為具有生長(zhǎng)片的擴(kuò)大區(qū)域和軟骨細(xì)胞的不規(guī)則序列(圖28B和E)。相反，對(duì)于進(jìn)行重復(fù)接種抗FGF-23中和抗體的Hyp小鼠中，觀察到了生長(zhǎng)片寬度的增加得到了抑制和軟骨細(xì)胞的不規(guī)則序列消失的現(xiàn)象(圖28C和F)。
(2)單一接種抗FGF-23中和抗體的實(shí)驗(yàn)利用12-20周大的雄性C57BL/6-Hyp小鼠和同一窩出生的野生型雄性C57BL/6J小鼠，給Hyp小鼠單一接種抗FGF-23中和抗體后對(duì)血液中磷酸鹽濃度和1,25D濃度的影響進(jìn)行了檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中的四組包括一組接種載體的野生型小鼠(n＝4)，一組接種抗體的野生型小鼠(n＝5)，一組接種載體的Hyp小鼠(n＝3)，和一組接種抗體的Hyp小鼠(n＝3)。在接種抗體的小鼠組實(shí)例中，具體的說(shuō)，3C1E抗體和2C3B抗體混合，它們的終濃度均為1.7mg/ml，然后生成物(混合溶液)以17mg/kg的劑量通過(guò)皮下至脊背區(qū)間接種每只小鼠。在接種載體的小鼠組中，具體的說(shuō)，PBS以10mg/kg的劑量接種該組中的每只小鼠。接種后的第4天，在乙醚麻醉的狀態(tài)下從小鼠中提取出來(lái)的心臟和腎臟中采集血樣。
對(duì)這樣獲得的血清中的磷酸鹽和1，25D的濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖25B所示。通過(guò)給野生型小鼠單一接種這種抗體，血清中磷酸鹽濃度和1，25D的濃度在接種后的第4天均表現(xiàn)了明顯的升高。在Hyp小鼠中也觀察到了濃度升高的這種效應(yīng)。通過(guò)接種抗體，血清中磷酸鹽的濃度被從低水平值校正到了高水平值，并且1,25D的濃度顯著增大。
(3)抗FGF-23中和抗體控制NaPi2a和1αOHase的表述的作用利用倚賴(lài)鈉的磷酸鹽協(xié)同運(yùn)輸效應(yīng)(NaPi2a該效應(yīng)主要出現(xiàn)在腎小管中)通過(guò)重吸收率對(duì)血清中磷酸鹽濃度進(jìn)行了測(cè)定。而且，已經(jīng)有過(guò)對(duì)重吸收率被倚賴(lài)NaPi2a自身的表達(dá)水平或NaPi2a蛋白的定位率所控制的報(bào)道。因此，對(duì)抗FGF-23中和抗體是否有通過(guò)NaPi2a的調(diào)控來(lái)提高血清中磷酸鹽濃度的效應(yīng)進(jìn)行了檢測(cè)。
利用一種凍融的腎臟，按照Katai等人在生物化學(xué)雜志(1999年，274卷，28845-28848頁(yè))上報(bào)道的一種鈣沉淀方法制備了固定有NaPi2a的腎近位尿細(xì)管刷狀緣膜囊(BBMV)。按照實(shí)施例16中描述的Western印跡法對(duì)每一種的得到的BBMV膜20μg進(jìn)行測(cè)定。利用從抗血清[利用和實(shí)例5相似的方法通過(guò)免疫兔子而得到抗血清，該抗血清具有小鼠的NaPi2a蛋白中的C-末端肽片段(SEQ ID NO32)]中純化得到的抗鼠NaPi2a的兔多克隆抗體對(duì)NaPi2a蛋白進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果如圖25C所示。已經(jīng)有過(guò)報(bào)道表明NaPi2a蛋白水平在Hyp小鼠的BBMV中被顯著降低了。然而，通過(guò)接種抗FGF-23中和抗體，NaPi2a的表達(dá)被顯著提高了。
在野生型小鼠中，也進(jìn)一步觀察到了NaPi2a蛋白濃度的升高。而且，利用上述的BBMV對(duì)NaPi2a蛋白調(diào)控的磷酸鹽轉(zhuǎn)移活性進(jìn)行了檢測(cè)。利用從每一個(gè)體制備的每一種BBMV 0.1mg，通過(guò)一種快速過(guò)濾方法對(duì)60秒內(nèi)的倚賴(lài)鈉的磷酸鹽攝取活性進(jìn)行了檢測(cè)。反應(yīng)物和反應(yīng)條件按照Katai等人在生物化學(xué)雜志(1999年，274卷，28845-28848頁(yè))上的報(bào)道進(jìn)行結(jié)果如圖25C所示，對(duì)野生型小鼠和Hyp小鼠，由于接種了抗FGF-23中和抗體，導(dǎo)致了磷酸鹽轉(zhuǎn)移活性的升高。這些結(jié)果表明通過(guò)給野生型小鼠和Hyp小鼠接種抗FGF-23中和抗體后血清中磷酸鹽濃度升高的效應(yīng)是由于存在于腎小管中的NaPi2a蛋白的水平值生高所導(dǎo)致的。
mNpt2CLALPAHHNATRLC(SEQ ID NO32)下一步，為了闡明提高血清中1，25D濃度的作用機(jī)理，對(duì)腎25-羥維生素D-羥化酶(1αOHase)的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。利用一種ISOGEN試劑(NIPPON GENE CO.，LTD.，日本)從一冷凍的腎中將總RNA提取出來(lái)。取20μg所得到的每一種RNA按照標(biāo)準(zhǔn)方法利用北方印跡法對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)。一種PerfectHyb試劑(日本Toyobo公司)用于進(jìn)行雜交，雜交點(diǎn)的反應(yīng)和洗滌按照附件中所述的方法進(jìn)行。通過(guò)PCR方法擴(kuò)增小鼠的1αOHase部分cDNA而制得這里所用的探針，該P(yáng)CR反應(yīng)利用從小鼠腎臟中制備的cDNA文庫(kù)作為模板，SEQID NOS33和34所示的寡核苷酸作為引物，或者通過(guò)PCR擴(kuò)增一個(gè)3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的部分cDNA作為一種內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，利用SEQ ID NOS35和36所示的寡核苷酸作為引物，通過(guò)一種MeagaprimeDNA標(biāo)記系統(tǒng)(美國(guó)Amersham Pharmacia Biotech公司)利用32P標(biāo)記cDNA。利用一種BAS影像分析儀(日本富士膠片公司)對(duì)信號(hào)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果如圖25D所示。證實(shí)了在野生型小鼠和Hyp小鼠中通過(guò)接種中和抗體，1αOHase的表達(dá)顯著提高了。這些結(jié)果表明抗FGF-23中和抗體在提高野生型小鼠和Hyp小鼠血清中1,25D濃度的作用是由于存在于腎中的1αOHase的基因表達(dá)水平值的提高。
m1alphaFWcagacagagacatccgtgtag (SEQ ID NO33)m1alphaRVccacatggtccaggttcagtc (SEQ ID NO34)gapdhFWaccacagtccatgccatcac (SEQ ID NO35)gapdhRVtccaccaccctgttgctgta (SEQ ID NO36)上述結(jié)果表明FGF-23在降低Hyp小鼠血液中的磷酸鹽濃度和1，25D濃度中發(fā)揮了非常重要的作用，換句話(huà)說(shuō)，對(duì)于患有XLH的病人，通過(guò)接種抗FGF-23中和抗體可以抑制FGF-23作用的發(fā)揮，因此就能改善發(fā)病癥狀。而且，伴隨著骨增長(zhǎng)障礙和骨鈣化障礙的Hyp小鼠血液中總堿磷活性異常高的水平值這一現(xiàn)象，通過(guò)接種FGF-23中和抗體也能使其值正?；Ｒ虼?，該方法對(duì)治愈骨軟化癥并使骨重塑過(guò)程正常化是有療效的。
實(shí)施例33抗FGF-23抗體(3C1E)對(duì)骨重塑的作用如實(shí)施例32(1)所描述的那樣，表明了抗FGF-23抗體在骨重塑過(guò)程中的作用。為了進(jìn)一步檢測(cè)該結(jié)果，對(duì)經(jīng)過(guò)接種抗FGF-23抗體后血清中骨鈣素濃度隨時(shí)間的變化進(jìn)行了分析。該實(shí)驗(yàn)按如下程序進(jìn)行3C1E抗體以3mg/kg的劑量，或者是載體(PBS溶液)以1.1mg/kg的劑量通過(guò)臀靜脈給7周大的雄性S.D.大鼠進(jìn)行單一接種。在接種后的4，12，24，48，和72小時(shí)，從臀動(dòng)脈中采集部分血樣，然后制得血清樣。利用一種骨鈣素ELISA試劑盒(日本Amersham生物科學(xué)公司)對(duì)血清中骨鈣素的濃度進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果如圖26所示。在接種抗體后的12，24，48小時(shí)后，觀察到了血清中骨鈣素濃度的顯著升高。這些結(jié)果表明該種可能性，即接種的抗FGF-23抗體在骨重塑過(guò)程中有一種直接的或間接的影響。
實(shí)施例34抗FGF-23中和抗體(2C3B抗體和3C1E抗體的混合物)對(duì)骨質(zhì)疏松癥小鼠的作用為了進(jìn)一步檢測(cè)如實(shí)施例33中所描述的抗FGF-23中和抗體在骨代謝過(guò)程中的作用，在絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥受試者中對(duì)抗FGF-23抗體在卵巢切除后骨量降低模型小鼠(被認(rèn)為其可反映骨量減少)中的作用進(jìn)行了檢測(cè)。將8周大的ddy小鼠中的卵巢提取出來(lái)后，將小鼠分成2組一組接種載體，另一組接種抗FGF-23抗體。此外，作為一手術(shù)對(duì)照組，對(duì)一組小鼠進(jìn)行了假切除手術(shù)。對(duì)于接種抗體的組(n＝10)，接種在手術(shù)后3天開(kāi)始，抗體通過(guò)混合兩種體積相同的2C3B抗體和3C1E抗體(2C3B抗體和3C1E抗體的接種劑量同為1.5mg/kg，接種總劑量為3mg/kg)而制得，將該混合抗體通過(guò)皮下至脊背區(qū)域給小鼠進(jìn)行接種，一周3次，連續(xù)接種4周。而且，對(duì)于接種載體的組(n＝9)和進(jìn)行了假切除的對(duì)照組(n＝10)，將載體溶液以和抗體溶液相同的劑量(10ml/kg)給小鼠進(jìn)行接種。卵巢切除的第2周，在乙醚麻醉的狀態(tài)下從小鼠眼眶中采集血樣，卵巢切除的第4周，在乙醚麻醉的狀態(tài)下從小鼠心臟中采集血樣。通過(guò)離心分離(在8000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心分離10分鐘)從采集的血樣中制得血清，然后對(duì)血清中骨鈣素的濃度(IRMA試劑盒，Immutopics，日本)進(jìn)行測(cè)定。卵巢切除后的第四周，從由于采集血樣而宰殺掉的小鼠中提取股骨，然后對(duì)骨中礦物質(zhì)含量和骨密度(骨密度計(jì)，DCS-600型，ALOKA CO.，LTD.)進(jìn)行了測(cè)定。
如圖29A和B所示，同接種載體的組相比，卵巢切除后的第2周和第4周在接種抗FGF-23抗體(2C3B抗體和3C1E抗體的混合物)的組中都觀察到了血清中骨鈣素水平的明顯升高。骨鈣素是由造骨細(xì)胞特定產(chǎn)生的一種蛋白。由于體內(nèi)血清中骨鈣素的水平升高被認(rèn)為是骨生成的一種指示劑，因此表明了該種可能性，即通過(guò)接種抗FGF-23抗體可促進(jìn)骨的生成。
而且，如圖30A和B所示，同進(jìn)行了卵巢假切除并接種了載體的組相比，進(jìn)行了卵巢切除并接種了載體的組表現(xiàn)出了骨量的顯著減少。通過(guò)與卵巢切除后骨礦物質(zhì)含量和骨礦物質(zhì)密度明顯下降相對(duì)比，實(shí)行了卵巢切除并接種了抗FGF-23抗體的組表現(xiàn)出了異常高的骨礦物質(zhì)含量和骨礦物質(zhì)密度的水平值?；谶@些結(jié)果，我們認(rèn)為接種抗FGF-23抗體可抑制由于卵巢切除后所導(dǎo)致的骨量減少。
實(shí)施例35給患有遺傳性低磷酸鹽血癥佝僂病的小鼠接種抗FGF-23中和抗體(2C3B抗體和3C1E抗體的混合物)實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例32所示，表明了抗FGF-23的中和抗體可改善Hyp小鼠的骨增增長(zhǎng)紊亂和骨鈣化紊亂。因此，利用4周大的雄性C57BL/6-Hyp小鼠和同一窩出生的野生型C57BL/6小鼠(該野生型小鼠比例32中所用的小鼠在周年齡上小，這樣生長(zhǎng)更明顯)對(duì)抗FGF-23中和抗體在改善Hyp小鼠的骨增長(zhǎng)紊亂和骨鈣化紊亂疾病中所起的作用進(jìn)行了詳細(xì)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中的四組包括一組接種載體(PBS)的野生型小鼠，一組接種載體(PBS)的Hyp小鼠，一組接種低劑量抗體的Hyp小鼠，和一組接種高劑量抗體的Hyp小鼠。每組包括6-7只小鼠。中和抗體是由相同濃度的2C3B抗體和3C1E抗體相互混合而制得的。對(duì)低劑量組，這樣制得的中和抗體溶液中兩種類(lèi)型抗體的總量為4mg/kg，對(duì)高劑量組，這樣制得的中和抗體溶液中兩種類(lèi)型抗體的總量為16mg/kg。中和抗體或載體以10ml/kg的劑量通過(guò)皮下至脊背區(qū)域接種每只小鼠，將最初接種的時(shí)間定為第0天，那么在第7天，第14天，第21天，和第28天時(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行重復(fù)接種。第7天，第14天，第21天，和第28天進(jìn)行重復(fù)接種時(shí)對(duì)小鼠的體重，尾巴的長(zhǎng)度，和脛骨的thel長(zhǎng)度進(jìn)行了測(cè)量。而且，最初接種后的第31天，在乙醚麻醉的狀態(tài)下從小鼠心臟中采集血樣，小鼠也被宰殺，然后提取左右的股骨和脛骨。
(1)抗FGF-23中和抗體對(duì)增長(zhǎng)尾巴長(zhǎng)度，脛骨長(zhǎng)度和增大體重的作用Hyp小鼠的骨頭提供了佝僂病骨的表型(伴隨著骨發(fā)育不全的特征，例如長(zhǎng)骨在徑向方向的增長(zhǎng)障礙)。對(duì)于單個(gè)的小鼠，同野生型的小鼠相比，Hyp小鼠在體長(zhǎng)方面明顯小，體重方面明顯輕。為了檢測(cè)抗FGF-23中和抗體對(duì)Hyp小鼠中像骨發(fā)育不全這樣的疾病的作用，進(jìn)行了對(duì)本實(shí)驗(yàn)中所用Hyp小鼠的尾部長(zhǎng)度，脛骨長(zhǎng)度和體重變化的測(cè)定。結(jié)果如圖31A，B和C所示。也在本實(shí)驗(yàn)中，同正常小鼠相比，Hyp小鼠尾巴和脛骨的增長(zhǎng)程度明顯低，體重明顯輕。而且，同接種載體的Hyp小鼠組相比，接種了中和抗體的Hyp小鼠，中和抗體盡其最大作用使Hyp小鼠的尾部長(zhǎng)度和脛骨長(zhǎng)度得到了最大程度的增長(zhǎng)，并且在增加體重方面是一種倚賴(lài)接種劑量的方式。
(2)抗FGF-23中和抗體對(duì)骨鈣化的作用同正常的小鼠相比，已知Hyp小鼠的骨組織中未鈣化和低鈣化骨的比例是高的，但是在礦物質(zhì)含量方面是低的。因此，對(duì)抗FGF-23中和抗體能否提高Hyp小鼠股骨中礦物質(zhì)的含量進(jìn)行了測(cè)定。在該實(shí)驗(yàn)中，提取后的左股骨在100℃的干燥器中干燥12小時(shí)，然后稱(chēng)重，得到干燥后骨的重量。接下來(lái)，將干燥后的骨在600℃的馬弗爐中焚燒12小時(shí)。對(duì)生成物稱(chēng)重以得到骨灰的重量。結(jié)果如圖32所示。同野生型小鼠相比，在Hyp小鼠中，骨灰重量在干骨重量中所占的比例非常低。在接種了抗體的Hyp小鼠組中，骨灰重量在干骨重量中所占的比例表現(xiàn)出了明顯增加(以一種隨重復(fù)接種的中和抗體的劑量增加而增加的方式)。尤其是，在接種了高劑量抗體的組中，其骨灰重量在干骨重量中所占的比例表現(xiàn)出了同野生型小鼠組所示的同一水平值。
這些結(jié)果表明通過(guò)接種抗FGF-23中和抗體可抑制FGF-23的作用，因此能夠改善如Hyp小鼠所示的骨增長(zhǎng)障礙和骨鈣化疾病。
實(shí)施例36利用2C5L抗體通過(guò)夾心式ELISA方法定量測(cè)定人的FGF-23蛋白按照實(shí)施例3中的方法得到2C5L克隆雜交瘤，按照實(shí)施例4中的純化方法對(duì)其進(jìn)行純化后得到2C5L抗體。通過(guò)實(shí)施例10中所述的方法對(duì)其識(shí)別位點(diǎn)的分析表明同2C3B抗體的形式一樣，2C5L抗體在N-末端多肽片段(該多肽片段相當(dāng)于SEQ ID NO1的介于第25位和第179位氨基酸殘基之間的一段區(qū)域)內(nèi)有一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，并且和N-末端多肽片段和一種全長(zhǎng)FGF-23蛋白形成了一種免疫復(fù)合體。而且，如實(shí)施例12所描述的一種方法，對(duì)一種利用2C5L抗體和2C3B抗體的一種重組體的夾心式ELISA方法的建立做了嘗試。利用每一種抗體都可和FGF-23蛋白相結(jié)合的事實(shí)，表明這兩種抗體之間并不存在彼此競(jìng)爭(zhēng)性抑制的現(xiàn)象。根據(jù)這一結(jié)論，2C5L抗體在N-末端多肽片段(該多肽片段相當(dāng)于SEQ ID NO1的介于第25位和第179位氨基酸之間的一段區(qū)域)內(nèi)有一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，但該識(shí)別位點(diǎn)不同于2C3B抗體的也位于N-末端多肽片段內(nèi)的識(shí)別位點(diǎn)。這表明利用一種兩種類(lèi)型抗體作為重組體的ELISA方法是可行的。接下來(lái)，當(dāng)生物素標(biāo)記的3C1E抗體作為檢測(cè)抗體，并且2C3B抗體或2C5L抗體作為固定化抗體時(shí)，對(duì)利用實(shí)施例13中所描述的方法測(cè)定FGF-23蛋白的能力進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果如圖33所示。證實(shí)了2C5L抗體，在10pg/ml至10ng/ml的濃度范圍內(nèi)，以一種濃度倚賴(lài)型的方式可識(shí)別純化后的人類(lèi)FGF-23蛋白的重組體。
實(shí)施例37 2C5L抗體和小鼠FGF-23的交叉反應(yīng)活性如實(shí)施例22和23所示的利用2C3B抗體和3C1E抗體的一種重組體的夾心式ELISA系統(tǒng)中，同人的FGF-23相似，小鼠的FGF-23也能被識(shí)別出來(lái)。因此，對(duì)2C5L抗體是否能夠識(shí)別小鼠的FGF-23做了檢測(cè)。同實(shí)施例24類(lèi)似，在血液中具有高水平值的FGF-23的小鼠血清制得后，利用2C3B抗體和生物素標(biāo)記的3C1E抗體的一種重組體對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)，因此得到了一種濃度值顯示為大約600pg/ml的一種樣品。對(duì)于該樣品，利用2C3B抗體和生物素標(biāo)記的3C1E抗體的一種重組體通過(guò)夾心式ELISA系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)。然而，沒(méi)有觀察到反應(yīng)活性。該結(jié)果表明2C5L抗體與人的FGF-23有強(qiáng)的結(jié)合能力，但是與小鼠的FGF-23有非常弱的結(jié)合能力或根本就沒(méi)有結(jié)合能力。
實(shí)施例38 2C5L抗體對(duì)人的FGF-23中和活性的能力測(cè)定實(shí)施例37的結(jié)果表明由于同2C3B抗體或3C1E抗體與小鼠的FGF-23的結(jié)合能力相比，2C5L抗體的結(jié)合能力顯得非常低，因此2C5L抗體對(duì)小鼠內(nèi)生性FGF-23的中和活性的能力也將不明顯。然而，根據(jù)實(shí)施例36所示的結(jié)果，由于2C5L抗體與人的FGF-23有強(qiáng)的結(jié)合能力，2C5L抗體對(duì)于人的內(nèi)生性FGF-23可能有中和活性的能力。為了證實(shí)該能力，按照如下程序利用動(dòng)物通過(guò)一種檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)2C5L抗體中和人的FGF-23的活性做了測(cè)定，然后利用該系統(tǒng)對(duì)2C5L抗體對(duì)人的內(nèi)生性FGF-23的中和活性做了檢測(cè)。
一種被調(diào)節(jié)后的以1.2μg/天的劑量逐漸釋放人的FGF-23重組體的微型滲透泵(alzet微型滲透泵型號(hào)1007D，加拿大)通過(guò)皮下至脊背區(qū)域移植進(jìn)7周大的雄性C57BL/6小鼠體內(nèi)，這樣就構(gòu)建了一種人的FGF-23重組體能連續(xù)接種的模式。在移植泵后的第3天，給小鼠通過(guò)腹腔接種一種包含2C5L抗體的抗FGF-23中和抗體或一種載體，然后對(duì)連續(xù)存在的人的FGF-23重組體降低血清中磷酸鹽濃度的作用是否被接種后的抗體抑制而進(jìn)行了檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中的四組包括一組(未處理/載體)接種載體的未處理過(guò)的小鼠，一組(FGF-23/載體)接種載體的人類(lèi)FGF-23重組體連續(xù)接種模式的小鼠，一組(FGF-23/2C5L)接種2C5L抗體的人類(lèi)FGF-23重組體連續(xù)接種模式的小鼠，和一組(FGF-23/2C3B)接種2C5L抗體的人類(lèi)FGF-23重組體連續(xù)接種模式的小鼠。PBS作為載體并用于稀釋抗體。抗FGF-23中和抗體以一種20mg/kg的劑量進(jìn)行接種。載體和中和抗體以每10g體重接種0.1mL的劑量進(jìn)行接種。在抗體接種前和抗體接種后，在乙醚麻醉的狀態(tài)下從小鼠眼眶中采集血樣以獲得血清樣。利用一種磷測(cè)試Wako(商標(biāo))，日本和光純藥工業(yè)公司)對(duì)血清中磷酸鹽濃度進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果如下。利用該微型滲透泵通過(guò)連續(xù)接種人的FGF-23重組體，在移植進(jìn)泵后的第3天，同接種載體的未處理過(guò)的小鼠組相比，血液中磷酸鹽的濃度出現(xiàn)了明顯升高(圖34，左)。同F(xiàn)GF-23/載體接種組或抗體接種前相比，當(dāng)給一組人類(lèi)FGF-23重組體連續(xù)接種模式的小鼠組(FGF-23/2C5L)接種2C5L抗體時(shí)，24小時(shí)后，重組體降低血清中磷酸鹽濃度的作用被抗體明顯抑制了。血清中磷酸鹽的濃度被提高到了同未處理過(guò)的/載體接種組相同的程度(圖34，右)。根據(jù)上述結(jié)果和實(shí)施例37中的結(jié)論，清楚的表明2C5L抗體具有抵抗倚賴(lài)連續(xù)的接種人類(lèi)FGF-23重組體而導(dǎo)致血液中磷酸鹽濃度下降的作用的中和活性。另一方面，對(duì)于接種2C3B抗體的組，24小時(shí)后，血清中磷的濃度比未處理過(guò)的/載體接種組的磷濃度值明顯高。該結(jié)果可能由于以下事實(shí)具有與小鼠的FGF-23有強(qiáng)的結(jié)合能力的2C3B抗體不但對(duì)接種人的FGF-23重組體有中和活性，而且對(duì)內(nèi)生性的小鼠FGF-23也有中和活性。
工業(yè)應(yīng)用依照本發(fā)明，提供了抗FGF-23的抗體。本發(fā)明中的抗體在通過(guò)適當(dāng)?shù)卦隗w內(nèi)進(jìn)行測(cè)定和檢測(cè)FGF-23而診斷伴隨FGF-23蛋白的累積或下降的疾病或病理狀況中非常有效。而且，本發(fā)明的抗體具有中和FGF-23作用的活性，因此能夠通過(guò)抑制FGF-23的作用治療或改善由FGF-23的過(guò)量作用所導(dǎo)致的疾病或病理狀況。
將這里引用的出版物，專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)引入本申請(qǐng)作為參考。未背離本發(fā)明技術(shù)精神或范疇的一些改變和變化對(duì)本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)。本發(fā)明包含這樣的變化和修正。
序列表<110>KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA<120>抗FGF-23抗體<130>PH-1707-PCT<140>
<141>
<150>JP2001/401689<151>2001-12-28<150>JP2002/262020<151>2002-09-06<160>36<170>Patentln Ver.2.0<210>1<211>251<212>PRT<213>人<400>1Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val1 5 10 15
Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu20 25 30Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg35 40 45Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala50 55 60Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala65 70 75 80Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met85 90 95Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn100 105 110Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His115 120 125Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala130 135 140Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg145 150 155 160Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg165 170 175
His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val180 185 190Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln195 200 205Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu210 215 220Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly225 230 235 240Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile245 250<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>2ccggaattca gccactcaga gcagggcacg 30<210>3<211>52<212>DNA
<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述合成DNA<400>4ataagaatgc ggccgctcag atgaacttgg cgaa34<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述合成DNA
<400>8atgcggccgc ctaatgatga tgatgatgat ggatgaactt ggcgaaggg49<210>9<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
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20<210>11<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
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<210>13<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述合成肽<400>19
Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala Gly Phe Val1 5 10 15Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys20 25<210>20<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述合成肽<400>24Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala1 5 10 15Gly Gly Thr Gly Pro Glu Gly Cys20<210>25<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述合成DNA<400>28atagtttagc ggccgcctag acgaacctgg gaaaggggcg aca 43<210>29<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>29ttcgcccacg gcaacacacg caaagcgccg aggac 35<210>30<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>30gtcctcggcg ctttgcgtgt gttgccgtgg gcgaa 35
<210>31<211>4<212>PRT<213>人<400>31Arg His Thr Arg1<210>32<211>13<212>PRT<213>小家鼠<400>32Leu Ala Leu Pro Ala His His Asn Ala Thr Arg Leu Cys1 5 10<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>33cagacagaga catccgtgta g 21
<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>34ccacatggtc caggttcagt c 21<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>35accacagtcc atgccatcac20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>36tccaccaccc tgttgctgta 20
權(quán)利要求
1.通過(guò)利用多肽免疫動(dòng)物而得到的抗體，所述多肽包含如SEQ IDNO1所示的氨基酸序列，或包含從SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中通過(guò)缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而衍生得到的氨基酸序列，并且所述抗體具有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23的活性，具有控制磷酸鹽代謝或維生素D代謝的活性，并且如以下(a)、(b)或(c)所示(a)識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180位和第194位，或第237位和第251位氨基酸殘基之間的一段氨基酸序列的抗體；(b)由保藏號(hào)為FERM BP-7838，F(xiàn)ERM BP-7839，F(xiàn)ERM BP-7840，或FERM BP-8268的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體；或(c)通過(guò)結(jié)合由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列所組成的多肽，與保藏號(hào)為FERM BP-7838，F(xiàn)ERM BP-7839，F(xiàn)ERM BP-7840，或FERMBP-8268的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)的抗體。
2.權(quán)利要求1所述的抗體，該抗體是單克隆抗體。
3.權(quán)利要求1或2所述的抗體，該抗體是由保藏號(hào)為FERM BP-7838，F(xiàn)ERM BP-7839，F(xiàn)ERM BP-7840，或FERM BP-8268的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體。
4.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的抗體作為活性成分。
5.權(quán)利要求4所述的藥物組合物，它可有效抵抗至少一種下述疾病腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥，ADHR，XLH，腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良，透析骨病，骨質(zhì)疏松癥，低磷酸鹽血癥，佝僂病，骨軟化癥，腎小管機(jī)能障礙，骨量減少，低鈣血癥，骨生長(zhǎng)障礙，骨鈣化機(jī)能障礙，甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥，異位鈣化，搔癢，骨硬化，佩吉特氏病，高鈣血特發(fā)性綜合癥，甲狀旁腺功能減退癥，骨痛，肌力下降，骨骼畸形，發(fā)育不良和維生素D缺乏癥。
6.權(quán)利要求5所述的藥物組合物，它可有效抵抗至少一種下述的疾病腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化癥，XLH，低磷酸鹽血癥，骨質(zhì)疏松癥，骨生長(zhǎng)障礙，骨鈣化機(jī)能障礙和骨軟化癥。
7.一種促進(jìn)骨生成的藥劑，其包含權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的抗體作為活性成分。
8.權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)的藥物組合物，其包含至少2種可識(shí)別不同位點(diǎn)的如權(quán)利要求1所述的抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中的抗體可識(shí)別如SEQID NO1所示的介于第180位和第194位氨基酸殘基之間的一段氨基酸序列。
10.一種檢測(cè)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23的方法，該方法包括使識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第25位和第179位氨基酸殘基之間的部分氨基酸序列的抗體，和一種識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180位和第251位氨基酸殘基之間的部分氨基酸序列的抗體，與測(cè)試樣品發(fā)生反應(yīng)。
11.權(quán)利要求10所述的檢測(cè)方法，其中識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180位和第251位氨基酸殘基之間的部分氨基酸序列的抗體是一種識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180位和第196位氨基酸殘基之間的氨基酸序列的抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的檢測(cè)方法，該方法利用了凝血酶抑制劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的檢測(cè)方法，其中的抗體是由保藏號(hào)為FERM BP-7838，F(xiàn)ERM BP-7839，F(xiàn)ERM BP-7840，或FERMBP-8268的雜交瘤所產(chǎn)生的。
14.一種檢測(cè)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23的試劑盒，該試劑盒包含識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第25位和第179位氨基酸殘基之間的部分氨基酸序列的抗體，和識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180位和第251位氨基酸殘基之間的部分氨基酸序列的抗體。
15.權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180位和第251位氨基酸殘基之間的部分氨基酸序列的抗體是識(shí)別如SEQ ID NO1所示的介于第180位和第196位氨基酸殘基之間的氨基酸序列的抗體。
16.權(quán)利要求14或15所述的試劑盒，其中的抗體是由保藏號(hào)為FERM BP-7838，F(xiàn)ERM BP-7839，F(xiàn)ERM BP-7840，或FERM BP-8268的雜交瘤所產(chǎn)生的。
17.一種抗成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23的抗體結(jié)合物質(zhì)，該物質(zhì)可結(jié)合至少一種選自權(quán)利要求1至3的抗體。
18.一種醫(yī)療器具，其裝備有權(quán)利要求17中所述的結(jié)合物質(zhì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的醫(yī)療器具，該器具被用于除去血液中的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供抗成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子－23的抗體。即，具有控制磷酸鹽代謝或維生素D代謝的活性的抗體，和相應(yīng)于(a)，(b)，(c)中的抗體，該抗體是通過(guò)利用包含一種如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的多肽或包含一種從SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中通過(guò)缺失、替代或添加一個(gè)至多個(gè)氨基酸而衍生得到的一段氨基酸序列，并且具有成纖維生長(zhǎng)因子23活性的多肽免疫動(dòng)物得到的。(a)一種識(shí)別如SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的介于第180至第194位或第237至第251位之間的氨基酸序列的抗體。(b)一種由保藏號(hào)為FERM BP－7838，F(xiàn)ERM BP－7839，F(xiàn)ERM BP－7840，或FERM BP－8268的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體。(c)一種可與保藏號(hào)為FERM BP－7838，F(xiàn)ERM BP－7839，F(xiàn)ERM BP－7840，或FERM BP－8268的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)的抗體。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1639193SQ0380485
公開(kāi)日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月28日
發(fā)明者山崎雄司, 島田考志, 山下武美 申請(qǐng)人:麒麟麥酒株式會(huì)社