專利名稱：治療疾病和損傷用的氧化氮供體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病和損傷的治療，尤其涉及包括氧化氮供體和細(xì)胞療法治療疾病和損傷的方法和化合物。
背景技術(shù)：
在美國，中風(fēng)是第三大死因，也是造成殘疾的主要原因。大腦某個(gè)部位梗塞就會(huì)發(fā)生中風(fēng)，造成大腦供血受阻導(dǎo)致腦組織死亡。伴隨急性中風(fēng)的大腦梗塞會(huì)引發(fā)突發(fā)的并且明顯的神經(jīng)損傷。其它神經(jīng)疾病也會(huì)導(dǎo)致組織死亡和神經(jīng)損傷。
藥物干預(yù)嘗試增大大腦中風(fēng)區(qū)域的血流量使組織得以恢復(fù)，但無臨床效果。正如Harrison(第九版，1980，p.1926)內(nèi)科原理所述，除實(shí)驗(yàn)證據(jù)……[大腦血管舒張劑]由氧化氮法測得，增加了大腦血流量，它們并未在進(jìn)一步的人類中風(fēng)病例中被證明是有效的，無論是局部缺血發(fā)病階段，血栓形成階段或疾病確立階段。煙酸，Priscoline，酒精，罌粟堿和5％二氧化氮的吸入劑都是如此。相反，這個(gè)研究結(jié)果提示血管舒張劑甚至是有害的，它們通過降低全身血壓而減少顱內(nèi)吻合流，或者通過擴(kuò)張大腦正常部位的血管從梗塞部位盜血。
此外，心血管系統(tǒng)疾病在全球范圍是死亡率和發(fā)病率最高的疾病。比如，心臟衰竭的發(fā)病率在激增，表現(xiàn)為心臟無法將足夠的血液供給身體的各個(gè)器官。大約有500萬美國人患病，每年增加約500000的新病人，而每年造成250000的病人死亡。盡管在過去的20年里，治療不斷有新的突破，但心臟衰竭病人數(shù)持續(xù)增加，同時(shí)成為發(fā)達(dá)國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展的阻礙。
心臟衰竭的臨床癥候群變現(xiàn)為由于心臟的輸出量失調(diào)和靜脈壓升高引起的典型癥狀。而且，心臟衰竭是一種進(jìn)行性的紊亂，心臟功能會(huì)不斷惡化且無法逆轉(zhuǎn)。因此，心臟衰竭會(huì)造成心臟的輸出量不足。
心臟衰竭有兩種類型，一種是右側(cè)心臟不能將靜脈血泵入肺循環(huán)，造成體內(nèi)積水導(dǎo)致腫脹和水腫。另一種是左側(cè)心臟不能將血液泵入體循環(huán)，造成左心室后積水而引起肺內(nèi)水腫。
心臟衰竭主要的后果是體液積滯。如果心臟泵血效能降低，機(jī)體需通過激素和神經(jīng)信號(hào)來增加血容量等方式彌補(bǔ)。引起心臟衰竭的因素有很多，如，心臟組織的病變導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡，喪失功能。心肌細(xì)胞不斷死亡是引起左心室功能障礙的一個(gè)原因。
現(xiàn)在有多種治療和預(yù)防心臟衰竭的方法，例如，干細(xì)胞再生心臟細(xì)胞用于急性心臟局部缺血和/或梗塞或動(dòng)物模型的心臟損傷。在一個(gè)特殊的病例中，由供體腿骨分離的活的骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，標(biāo)記，注射到基因純化的成年大鼠受體的心肌層。移植4天至12周的時(shí)間里收集心臟，對(duì)移植位點(diǎn)檢測發(fā)現(xiàn)在心肌層環(huán)境中，移植的基質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出生長潛能(Wang，et，al)。
來自D3品系的多能胚胎干(ES)細(xì)胞的心肌細(xì)胞通過胚胎樣聚集體(胚狀體)可以在體內(nèi)分化。在整個(gè)分化階段，細(xì)胞可通過全細(xì)胞膜片夾技術(shù)，形態(tài)學(xué)，基因表達(dá)模擬鑒定(Maltsev，et，al.，1994)。此外，多能小鼠ES細(xì)胞可以分化成心肌細(xì)胞并可表達(dá)哺乳動(dòng)物心臟的主要特征(Maltsev，et，al.，1993)。
干細(xì)胞，不管它們的來源(胚胎，骨髓，骨骼肌等)，有分化成多種，如果不是全部，細(xì)胞類型的潛能。干細(xì)胞可以分化成功能性的心肌細(xì)胞。因此，基于干細(xì)胞的心臟衰竭治療方法優(yōu)于現(xiàn)有的傳統(tǒng)治療。
相應(yīng)的，需要一種治療疾病或損傷病人的方法，這種方法將細(xì)胞治療和使用氧化氮供體相結(jié)合。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供了一種促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的方法，通過給予需要促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的病人治療量的磷酸二酯酶抑制劑化合物。也提供了一種可以促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的化合物，含有足以促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的有效量的磷酸二酯酶抑制劑。還提供了一種促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的磷酸二酯酶抑制劑。進(jìn)一步，提供了一種增大腦細(xì)胞生成和促進(jìn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和受體改變的方法，通過在需要增大的位點(diǎn)給予有效量的磷酸二酯酶抑制劑化合物。提供了一種提高神經(jīng)和認(rèn)知功能的方法，通過給予病人有效量的磷酸二酯酶抑制劑化合物。
附圖的簡明描述以下的詳細(xì)描述和附圖相結(jié)合，進(jìn)一步闡明本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，其中

圖1A-D顯示大腦血管周長；圖2A-C顯示增值的大腦內(nèi)皮細(xì)胞；圖3A-C顯示DETANONOate誘導(dǎo)的血管發(fā)生，三維成像分析；圖4A-E顯示DETANONOate體外誘導(dǎo)的血管發(fā)生；圖5顯示Sildenafil誘導(dǎo)的毛細(xì)管形成的定量數(shù)據(jù)柱狀圖；圖6A-I顯示Slidenafil對(duì)細(xì)胞的處理效應(yīng)；圖7A和B分別顯示用Sildenafil處理后cGMP在小腦和皮層的水平和非缺血大鼠對(duì)照；圖8顯示經(jīng)Sildenafil處理的大鼠的局部CBF及對(duì)照；圖9A和B分別顯示粘性去除試驗(yàn)和mNSS試驗(yàn)結(jié)果；圖10A和B分別為用本發(fā)明的治療方法處理室下區(qū)的BrdU陽性細(xì)胞的結(jié)果的照片和圖表；圖11A和B分別為用本發(fā)明的治療方法處理血管的BrdU陽性細(xì)胞的結(jié)果的照片和圖表；圖12A-C照片顯示本發(fā)明的方法用大腦衍生內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮血管的形成及對(duì)照；圖13圖表顯示和對(duì)照比較本發(fā)明的治療方法增加VEGF分泌；圖14A-G照片顯示本發(fā)明治療的結(jié)果；圖15A-C柱狀圖顯示非局部缺血年輕成年大鼠在DETANONate或生理鹽水處理14及42天后，在齒狀回(圖15A)，室下區(qū)(圖15B)和嗅球(圖15C)中BrdU免疫活性細(xì)胞的數(shù)量；圖16A-C柱狀圖顯示非局部缺血老齡大鼠在DETANONate或生理鹽水處理14及42天后，在齒狀回(圖16A)，室下區(qū)(圖16B)和嗅球(圖16C)中BrdU免疫活性細(xì)胞的數(shù)量；圖17A-D顯示SNAP處理對(duì)梗塞體積(圖17A)，轉(zhuǎn)圈試驗(yàn)(圖17B)，粘性去除試驗(yàn)(圖17C)和動(dòng)物體重(圖17D)的影響；圖18A和B照片顯示在非缺血大鼠皮層(圖18A和B中的N)和局部缺血2小時(shí)到7天的大鼠的同側(cè)皮層中，PDE5A1(圖18A)和PNE5A2(圖18B)mRNA的RT-PCR結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
總體而言，本發(fā)明提供了一種方法和一種化合物，它將細(xì)胞治療和氧化氮供體和PDE抑制劑相結(jié)合，用于治療多器官系統(tǒng)的疾病或損傷。這種結(jié)合療法增加了兩種治療方法的療效，而治療風(fēng)險(xiǎn)沒有增加。治療的優(yōu)點(diǎn)在于通過誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生，血管發(fā)生及薄壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變增加了器官的可塑性，而且，由于協(xié)同效應(yīng)，藥物劑量可以減少，從而限制藥物毒副作用的發(fā)生。此外，PDE抑制劑可單獨(dú)給藥用于治療。
“PDE抑制劑”指一種抑制PDE的化合物，如Slidenafil(ViagraTM)。PDE抑制劑是一種試劑，它降低(如選擇性降低)或消除磷酸二酯酶的活性，如PDE1-10(如磷酸二酯酶5，磷酸二酯酶10)，及其它任何磷酸二酯酶。在本發(fā)明的方法和化合物的上下文中，磷酸二酯酶抑制劑包括鹽，酯，酰胺，前體藥物和其它活性試劑(如PDE)衍生物。磷酸二酯酶抑制劑放大了任何NO產(chǎn)生的效應(yīng)。磷酸二酯酶抑制劑可用于舒血管和改善血管功能。
這些抑制劑化合物包括但不限于洛利普南，茶堿，己酮可可豆堿，環(huán)鳥苷酸，Zaprinast，IBMX，米利酮，5-(2-乙氧基-5-嗎啉代乙?；交?-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氫-7H-比唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，5-(5-嗎啉代乙?；?2-n-丙氧基苯基)-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氫-7-H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，5-[2-乙氧基-5-(4-甲基-1-哌嗪基磺?；?-苯基-]1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氫-7-H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，5-[2-烯丙氧基-5-(4-甲基-1-哌嗪基磺酰基)-苯基]-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氫-7H-比唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，5-[2-乙氧基-5-[4-(2-丙基)-1-哌嗪基磺?；鵠-苯基]-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氫-7-H-比唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，5-[2-乙氧基-5-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基磺?；鵠苯基]-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氫-7-H-比唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，5-[5-[4-(2-羥乙基-)-1-哌嗪基磺?；鵠-2-n-丙氧基苯基]-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氫-7-H-比唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，5-[2-乙氧基-5-(4-甲基-1-哌嗪基羰基)苯基]-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氫-7-H-比唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，和5-[2-乙氧基-5-(1-甲基-2-咪唑基)苯基]-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氫-7-H-比唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮。
磷酸二酯酶抑制劑也包括灰鏈菌酸衍生物，2-苯基嘌呤酮衍生物，苯基吡啶酮衍生物，融合的和縮聚的嘧啶，嘧啶并嘧啶衍生物，嘌呤化合物，喹唑啉化合物，苯基嘧啶酮衍生物，咪唑喹喔啉酮衍生物或其氮雜類似物，苯基吡啶酮衍生物及其它。磷酸二酯酶抑制劑特例包括1，3-二甲基-5-芐基吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，2-(2-丙氧基苯基)-6嘌呤酮，6-(2-丙氧基苯基)-1，2-二氫-2-氧吡啶-3-酰胺(3-carboxamide)，2-(2-丙苯基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶4(3H)-酮，7-甲硫基-4-氧-2-(2-丙氧基苯基)-3，4-二氫-嘧啶并[4，5-d]嘧啶，6-羥基-2-(2-丙氧基苯基)嘧啶-4-酰胺，1-乙基-3-甲基咪唑并[1，5a]喹喔啉-4(5H)-酮，4-苯基甲基胺-6-氯-2-(1-咪唑基)喹唑啉，5-乙基-8-[3-(N-環(huán)己基-N-甲基氨基甲?；?-丙氧基]-4，5-二氫-4-氧-吡啶并[3，2-e]-吡咯并[1，2-a]吡嗪，5’-甲基-3’-(苯基甲基)-螺[環(huán)戊烷-1，7’(8’H)-(3’H)-咪唑并[2，1b]嘌呤]4’(5’H)-酮，1-[6-氯-4-(3，4-亞甲基二氧芐基)-氨基喹唑啉基-2-]哌啶-4-羧酸，(6R，9S)-2-(4-三氟甲基-苯基)甲基-5-甲基-3，4，5，6a，7，8，9，9a-八氫環(huán)戊烷[4，5]-咪唑并[2，1-b]嘌呤-4-酮，1t-丁基-3-苯甲基-6-(4-吡啶基)吡唑并[3，4-d]-嘧啶-4-酮，1-環(huán)戊基-3-甲基-6-(4-比啶基)-4，5-二氫-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮，2-丁基-1-(2-芐氯)6-乙氧基-羰基苯并咪唑，和2-(4-羧哌啶)-4-(3，4-亞甲基二氧芐基)氨基-6-硝基喹唑啉，和2-苯基-8-乙氧基環(huán)庚咪唑。
本發(fā)明有關(guān)的其它有效磷酸二酯酶V抑制劑包括IC-351(ICOS)；4-溴-5-(吡啶基甲基氨基)-6-[3-(4-氯苯基)丙氧基]-3(2H)噠嗪酮；1-[4-[(1，3-苯并二氧-5-甲基)氨基]-6-氯-2-喹唑啉基]-4-哌啶-羧酸，單鈉鹽；(+)-順-5，6a，7，9，9a-六氫-2-[4-(三氟甲基)-苯基甲基-5-甲基-環(huán)戊-4，5]咪唑并[2，1-b]嘌呤-4(3H)-酮；furazlocillin；順-2-己基-5-甲基-3，4，5，6a，7，8，9，9a-八氫環(huán)戊[4，5]咪唑并[2，1-b]嘌呤-4-酮；3-乙酰-1-(2-芐氯)-2-丙基吲哚-6-羧酸鹽；4-溴-5-(3-吡啶基甲基氨基)-6-(3-(4-芐氯)丙氧基)-3-(2H)噠嗪酮；1-甲基-5-(5-嗎啉代乙?；?2-n-丙氧基苯基)--n-丙基-1，6-二氫-7H-吡唑并(4，3-d)嘧啶-7-酮；1-[4-[(1，3-苯并二氧-5-甲基)氨基]-6-氯-2-喹唑啉基]-4-哌啶羧酸，單鈉鹽；Pharmaprojects No.4516(Glaxo Wellcome)；Pharmaprojects No.5051(Bayer)；Pharmaprojects No.5064(Kyowa Hakko；參見WO 96/26940)；Pharmaprojects No.5069(Schering Plough)；GF-196960(Glaxo Wellcome)；和Sch-51866。
其它磷酸二酯酶V抑制劑包括但不限于DMPPO(Eddahibi(1988)Br.J.Pharmacol.，125(4)681-188)，和1-芳基萘木酚素系列物，包括1-(3-溴-4，5-二甲氧基苯基)-5-氯-3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基羰基]-2-(甲氧基羰基)萘氯化氫(27q)(Ukita(1999)J.MED.Chem.42(7)1293-1305)。
“多器官系統(tǒng)”指影響多個(gè)器官的系統(tǒng)。這些器官包括但不限于心臟，肝和腦。
“氧化氮供體”指一類能夠供給氧化氮或促進(jìn)氧化氮增加的化合物。提供氧化氮的化合物族包括DETANONOate(DETANONO，NONOate或1-取代二氮烯-1-鎓-1，2-二醇酯(1-substituted diazen-1-ium-1，2-diolates)，為包括[N(O)NO]-官能團(tuán)的化合物DEA/NO；SPER/NO；DETA/NO；OXI/NO；SULFI/NO；PAPA/NO；MAHMA/NO和DPTA/NO)，PAPANONOate，SNAP(S-亞硝基-N-乙?；嗝拱?，硝普酸鈉和硝化甘油鈉。能促進(jìn)氧化氮增加的化合物，如磷酸二酯酶抑制劑和L-精氨酸。
這里的“促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生”指神經(jīng)發(fā)生被促進(jìn)或增強(qiáng)，包括但不限于，新神經(jīng)元生長或已有神經(jīng)元生長增強(qiáng)，也指薄壁細(xì)胞及促進(jìn)組織可塑性的細(xì)胞的生長和增殖。神經(jīng)發(fā)生也包括但不限于軸突和樹突的延伸和突觸發(fā)生。
這里的“增大”指在特定環(huán)境要求下，生長被促進(jìn)或抑制。因此，如果要求額外的神經(jīng)元生長，氧化氮供體加入可起到促進(jìn)作用。氧化氮供體或氧化氮源使大腦組織通過提高受體活性，促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞增殖，補(bǔ)償由損傷，神經(jīng)退化或老化引起的傷害。
這里的“神經(jīng)”或“認(rèn)知”功能指大腦的神經(jīng)生長增強(qiáng)了病人思考，活動(dòng)或更多的能力。用氧化氮治療后，人腦細(xì)胞數(shù)增加，促進(jìn)了認(rèn)知，記憶和運(yùn)動(dòng)能力。而且，患有神經(jīng)疾病或損傷的病人接受氧化氮治療后認(rèn)知，記憶，運(yùn)動(dòng)功能也有改善。
這里的“細(xì)胞療法”包括但不限于干細(xì)胞給藥，干細(xì)胞是一種普通的母細(xì)胞，它的子代分化成不同的細(xì)胞類型。干細(xì)胞有不同的來源，包括但不限于胚胎，骨髓，肝，間質(zhì)，脂紡組織以及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它干細(xì)胞來源。這些干細(xì)胞可給藥或植入它們自然發(fā)生部位中需要的區(qū)域，或以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方式經(jīng)工程改造植入。因此，通過各種基因工程方法，包括但不限于轉(zhuǎn)化，剔除及類似的方法。干細(xì)胞可經(jīng)工程改造提高存活率或滿足其它需要。
這里的“富集”包括但不限于，通過適當(dāng)加入或增加物質(zhì)的數(shù)量或質(zhì)量來提高產(chǎn)量。在本發(fā)明中，在心肌膜內(nèi)或周圍加入或增加功能較強(qiáng)的心肌細(xì)胞產(chǎn)生富集。
這里的“細(xì)胞群恢復(fù)”包括但不限于，在心肌膜內(nèi)或周圍加入或補(bǔ)充心細(xì)胞。這些細(xì)胞加強(qiáng)了現(xiàn)有功能細(xì)胞的活性，由此，代替和/或增強(qiáng)了已有的心細(xì)胞。
本發(fā)明的目的是，通過增大治療效應(yīng)促進(jìn)神經(jīng)元損傷或其它損傷的結(jié)果的改善，如神經(jīng)發(fā)生和增大細(xì)胞的變化從而促進(jìn)功能的提高。比如，中風(fēng)后神經(jīng)或功能缺失的病人，CNS損傷和患有神經(jīng)退行性疾病的病人。這些發(fā)現(xiàn)提供了一種手段，在CNS損傷或退化后，可以提高腦的補(bǔ)償機(jī)制從而改善功能。氧化氮給藥誘導(dǎo)神經(jīng)元和細(xì)胞改變可以促進(jìn)中風(fēng)，損傷，老化和退行性疾病后功能的改善。這一途徑也可以使患有神經(jīng)疾病的病人受益。這些神經(jīng)疾病包括但不限于ALS，MS和Huntington’s病。此外，本發(fā)明的方法和化合物可以提高細(xì)胞治療的療效。
CNS損傷后在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間給予氧化氮可以促進(jìn)大腦的神經(jīng)發(fā)生。氧化氮也可以增大細(xì)胞治療的療效。在初始試驗(yàn)中，使用DETA/NO，一種長半衰期(約50小時(shí))的化合物，可產(chǎn)生NO。在中風(fēng)發(fā)生24小時(shí)和24小時(shí)后給藥，可鑒定新神經(jīng)元數(shù)目增加。較佳的是，本發(fā)明的化合物可直接給藥到損傷位點(diǎn)，比如，可通過口服，腹腔注射，靜脈注射或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方式給藥達(dá)到預(yù)期結(jié)果。如果治療需要，也可全身給藥。
這里包括的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示了一種藥物干預(yù)，目的在于誘導(dǎo)NO的生成從而促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。采用了三種化合物DETANONOate，Sildenafil(ViagraTM)和SNAP。這些化合物已經(jīng)成功的誘導(dǎo)了神經(jīng)發(fā)生，改善了中風(fēng)后功能上的不良后果。使用的化合物可以通過血腦屏障。神經(jīng)發(fā)生是神經(jīng)科學(xué)研究主要的最終目的。找到一種新的促進(jìn)神經(jīng)元產(chǎn)生的方法為治療各種神經(jīng)疾病，CNS損傷和神經(jīng)退化開創(chuàng)了新的機(jī)遇。它可能增大了未損傷大腦的神經(jīng)元生成從而增強(qiáng)了功能。
這類促進(jìn)神經(jīng)元生成的藥物市場很廣，氧化氮供體DETANONO只是其中一種可促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的化合物。增加神經(jīng)發(fā)生可以成為一種在老化，損傷和疾病中提高，改善神經(jīng)，行為，認(rèn)知功能的方法。
近年來，任何一種疾病引起的心臟衰竭導(dǎo)致功能退化的機(jī)制已經(jīng)被闡明，它一定程度上緣于心臟細(xì)胞持續(xù)死亡(Sabbah，2000)。這個(gè)問題的解決方法是使用新的心臟細(xì)胞補(bǔ)充或恢復(fù)心肌層。這些心臟細(xì)胞可以代替死亡的細(xì)胞或額外增加已有的功能心臟細(xì)胞的數(shù)量，因此改善了病變心臟的泵血功能。本發(fā)明是基于細(xì)胞治療來治療疾病的。盡管干細(xì)胞有不同來源(胚胎，骨髓，肝，脂肪組織等)，它們重要的共性是有分化成機(jī)體各種不同細(xì)胞類型的潛能。如前所述，顯示干細(xì)胞可以分化成心肌細(xì)胞(Maltsev et al.，1993和1994)。
本發(fā)明比現(xiàn)有的治療方法都要優(yōu)越，例如，現(xiàn)行的心臟衰竭的治療方法主要基于藥物的使用，打亂了神經(jīng)體液系統(tǒng)。此外，現(xiàn)有的外科治療包括心臟移植和使用心室或雙心室輔助裝置。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于通過直接針對(duì)根本的病因，即收縮單位的喪失，治療心臟衰竭。干細(xì)胞可分化為收縮單位，恢復(fù)心肌層，幫助病變心臟整體功能恢復(fù)。用干細(xì)胞恢復(fù)心肌層是一種新的方法，并且直接針對(duì)問題的中心。其它優(yōu)點(diǎn)包括沒有藥物治療常引起的副作用和沒有心臟移植和其它器官移植需面對(duì)的免疫排斥。
本發(fā)明有取代許多現(xiàn)行外科治療甚至藥物治療的潛力。已有的裝置可以通過導(dǎo)管將干細(xì)胞釋放到病變的心臟，無需開腔手術(shù)。此外，本發(fā)明在人體醫(yī)學(xué)環(huán)境和獸醫(yī)學(xué)環(huán)境同樣適用。
本發(fā)明治療損傷或疾病，改善和/或維持正常功能，更特殊的是，本發(fā)明用于增大細(xì)胞治療，療效更明顯。干細(xì)胞移植后分化為受損的細(xì)胞類型，受損細(xì)胞得以富集和/或恢復(fù)，功能也得到改善。因此，收縮單位的增加增強(qiáng)了心臟的功能。此外，干細(xì)胞也可以釋放多種物質(zhì)如營養(yǎng)因子。因此，例如，營養(yǎng)因子的釋放誘導(dǎo)血管發(fā)生(增加血管數(shù)量)以此增強(qiáng)心臟功能和/或治療心臟衰竭。所以，干細(xì)胞也可通過處理分化成功能性心肌細(xì)胞之外的多種機(jī)制增強(qiáng)心臟功能和/或治療心臟衰竭。
將干細(xì)胞移植到心肌層的一般方法如下，干細(xì)胞和氧化氮供體或PDE抑制劑給藥到患者體內(nèi)，給藥可以是皮下的不經(jīng)腸的包括靜脈的，關(guān)節(jié)內(nèi)的，肌肉的，腹腔的和鼻內(nèi)的給藥以及鞘內(nèi)的和融合技術(shù)給藥。
“干細(xì)胞”指任何細(xì)胞治療形式，包括但不限于造血細(xì)胞，移植到人體后有再生能力可以變成細(xì)胞系限制的祖細(xì)胞，并進(jìn)一步分化增殖成特定的細(xì)胞系。這里的“干細(xì)胞”指造血細(xì)胞而不是其它類型的細(xì)胞。進(jìn)一步，若無說明，“干細(xì)胞”指人造血干細(xì)胞。
“干細(xì)胞”或“多能干細(xì)胞”相互交替使用，指一種干細(xì)胞，有1)生成所有確定細(xì)胞系的子代細(xì)胞的能力；2)干細(xì)胞包括多能造血干細(xì)胞的所有血細(xì)胞類型及其子代細(xì)胞，通過自我更新能夠完全重組一個(gè)無免疫應(yīng)答的宿主。
骨髓是一種軟組織，存在于長骨髓腔，某些哈氏導(dǎo)管，以及網(wǎng)狀軟骨或松質(zhì)骨的小梁間隙。骨髓有兩種類型紅質(zhì)，生命早期在所有骨中存在，成年后只存在于某些部位(如網(wǎng)狀軟骨)與血細(xì)胞和血紅蛋白的產(chǎn)生有關(guān)(因此呈紅色)；黃質(zhì)，主要有脂肪細(xì)胞(因此呈黃色)和連接組織構(gòu)成。
總而言之，骨髓是一種復(fù)雜的組織，包括造血干細(xì)胞，紅白血細(xì)胞及其前體細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞及其前體，以及一組細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞，網(wǎng)狀細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。它們形成“基質(zhì)”的連接組織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。基質(zhì)中的細(xì)胞通過細(xì)胞表面蛋白和分泌生長因子直接相互作用在形態(tài)上調(diào)控造血細(xì)胞的分化，同時(shí)參與骨結(jié)構(gòu)的建立和維持。用動(dòng)物模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，骨髓含“基質(zhì)前體”細(xì)胞，能夠分化為軟骨，骨，以及其它連接組織細(xì)胞(Beresford，J.N.成骨干細(xì)胞和骨及骨髓的基質(zhì)系統(tǒng)，Clin.Orthop.，240270，1989)。最新證據(jù)顯示這些多能基質(zhì)干細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞被活化后能夠形成多種不同的細(xì)胞系(即骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞等)。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞在組織中和許多其它細(xì)胞(即紅細(xì)胞，血小板，嗜中性細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，嗜酸性細(xì)胞，嗜堿性細(xì)胞，脂肪細(xì)胞等)共存，含量極小，且隨年齡增長而減少，它們在許多生物因子的影響下能夠分化為一類連接組織。
所以，發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種方法，從組織中分離和純化分化前的人間充質(zhì)干細(xì)胞，然后培養(yǎng)使其擴(kuò)增成為一種骨骼肌治療的有效工具。目的在于更大的增加間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量，然后利用這些細(xì)胞指導(dǎo)和/或增加機(jī)體正常的修復(fù)再生功能。大量收集間充質(zhì)干細(xì)胞，將其用于組織的受損區(qū)域，在體內(nèi)增強(qiáng)或刺激再生和/或修復(fù)，通過隨后的活化和分化改善不同假器官裝置的移植粘性，增強(qiáng)造血細(xì)胞的生成，等等。
多種實(shí)驗(yàn)流程被開發(fā)出來，在修復(fù)，移植的位點(diǎn)轉(zhuǎn)化，固定，激活被擴(kuò)增，純化的間充質(zhì)干細(xì)胞，包括在骨髓缺損位點(diǎn)注射細(xì)胞，與假器官一起培養(yǎng)細(xì)胞及假器官移植等。因此，通過在分化前分離純化和擴(kuò)增細(xì)胞，然后根據(jù)它們所在受損組織的定位特征或移植前體外預(yù)處理控制其分化過程，培養(yǎng)擴(kuò)增的未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞可用于不同的治療目的以闡明多種代謝性骨病變，骨髓發(fā)育異常，軟骨缺失的細(xì)胞分子，遺傳失調(diào)，韌帶和肌腱損傷及其它骨骼肌和連接組織紊亂的機(jī)制。
同樣，多種實(shí)驗(yàn)流程被開發(fā)出來，在修復(fù)，移植的位點(diǎn)轉(zhuǎn)化，固定，激活間充質(zhì)干細(xì)胞或祖細(xì)胞，通過采用多種穿孔陶制載體，包括將細(xì)胞注射到損傷部位。
人間充質(zhì)干細(xì)胞有多種來源，包括股骨頭部松質(zhì)骨填充物，可在退行性關(guān)節(jié)病人進(jìn)行髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)替換手術(shù)時(shí)獲得，以及從正常供體和需要接受骨髓移植的癌癥病人吸取收集的骨髓。盡管收集到的骨髓根據(jù)其來源(即骨頭片，外周血等)經(jīng)多種不同機(jī)械分離過程制備，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)分離，分離過程的關(guān)鍵步驟是采用了一種特別制備的培養(yǎng)基，它含有某些試劑，不僅可維持間充質(zhì)干細(xì)胞不分化，而且使其直接粘附于培養(yǎng)皿表面。通過生成一種介質(zhì)，使在骨髓樣品中含量極少的有用的間充質(zhì)干細(xì)胞有選擇性粘附力，可以將其從骨髓中的其它細(xì)胞(紅，白血細(xì)胞，其它分化的間充質(zhì)細(xì)胞等)中分離出來。
如上所述，這種完全培養(yǎng)基可以應(yīng)用于多種基于開始所采用的特定收集方法而選擇的分離過程，制備收集到的骨髓進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)分離。就這一問題，如果使用的是松質(zhì)骨髓，骨髓加到完全培養(yǎng)基中，混勻分散，離心使骨髓與骨碎片分離。將含有骨髓細(xì)胞的完全培養(yǎng)基依次通過16，18，20號(hào)針頭的注射器，骨髓細(xì)胞(主要含紅，白血細(xì)胞，極少量間充質(zhì)細(xì)胞)被分散成單個(gè)細(xì)胞。機(jī)械分離法比任何酶分離過程都要優(yōu)越，因?yàn)闄C(jī)械分離過程中細(xì)胞很少發(fā)生變化，而酶過程中細(xì)胞往往受到損傷，尤其是培養(yǎng)粘性和選擇性分離所需的蛋白結(jié)合位點(diǎn)和/或間充質(zhì)干細(xì)胞特異性抗體產(chǎn)生所需要的蛋白位點(diǎn)。單細(xì)胞懸液(約50-100×10sup.6個(gè)具核細(xì)胞)倒入100毫米平板，選擇性分離出間充質(zhì)干細(xì)胞。
若用吸出骨髓作為人間充質(zhì)干細(xì)胞源時(shí)，骨髓干細(xì)胞(含少量或不含骨碎片但含大量血)加到完全培養(yǎng)基中。用Percoll(Sigma，St.Louis，Mo.)梯度分級(jí)，在下面的實(shí)施例1中有詳述。Percoll梯度將占多數(shù)的紅細(xì)胞和單核造血細(xì)胞與含有骨髓衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞的低密度血小板組分相分離。就這一點(diǎn)，血小板組分，含有約30-50×10.sup.6個(gè)具核細(xì)胞，血小板數(shù)量不確定，其中只有50-500個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞，具體數(shù)量和供體年齡有關(guān)。低密度血小板組分倒入Petri平板，基于其細(xì)胞粘性進(jìn)一步分離。
就這一點(diǎn)，骨髓細(xì)胞無論來自松質(zhì)骨或是髂骨吸出(即初級(jí)培養(yǎng)物)都在完全培養(yǎng)基中生長，并根據(jù)實(shí)施例1中所設(shè)條件，可在Petri平板表面粘附1-7天。由于第三天后，細(xì)胞粘附?jīng)]有增加，選擇三天作為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間，用新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基將未粘附的細(xì)胞從培養(yǎng)物中清除。然后，每4天更換培養(yǎng)基，直到平板上細(xì)胞連片生長，約14-21天，這表示未分化的人間充質(zhì)干細(xì)胞約增加10.sup.3-10.sup.4倍。
然后，細(xì)胞經(jīng)一種釋放試劑如胰蛋白酶EDTA(乙二胺四乙酸)液(0.25％胰蛋白酶，1毫摩爾/升EDTA(1×)，Gibco，Grand Island，N.Y.)或一種螯合劑如EGTA(乙二醇雙[2-氨基乙醚]N，N′四乙酸，SigmaChemical Co.，St.Louis，Mo.)分離。用螯合劑比胰蛋白酶好，因?yàn)橐鹊鞍酌缚赡芰呀忾g充質(zhì)干細(xì)胞的結(jié)合蛋白。由于這些結(jié)合蛋白包括識(shí)別位點(diǎn)，如果要產(chǎn)生單抗，則應(yīng)使用螯合劑，如EGTA而不是胰蛋白酶作為釋放劑。然后，將釋放劑滅活，分離出的未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物，用完全培養(yǎng)基洗滌后待用。
這些結(jié)果表明在一定條件下，培養(yǎng)擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞移植到多孔磷酸鈣陶器中培養(yǎng)可以分化為骨細(xì)胞。盡管，我們并不很清楚什么內(nèi)在因子影響間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨而不是軟骨細(xì)胞，是多孔磷酸鈣陶器中的微觀結(jié)構(gòu)而不是擴(kuò)散小室提供生長和營養(yǎng)因子，間充質(zhì)干細(xì)胞可與這些因子直接接觸，影響其分化為骨細(xì)胞。
因此，分離并培養(yǎng)擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞可在特定環(huán)境和/或某些因子的影響下分化產(chǎn)生組織修復(fù)所需的細(xì)胞表型。
給藥單劑量間充質(zhì)干細(xì)胞可以有效降低或清除T細(xì)胞對(duì)異源組織或“非己”組織的反應(yīng)，尤其在這樣的病例中，T淋巴細(xì)胞對(duì)從間充質(zhì)干細(xì)胞分離后的異源細(xì)胞保持其無免疫反應(yīng)的特性(即耐受或無反應(yīng)性)。
間充質(zhì)干細(xì)胞劑量范圍很廣，適用于任何特殊病例的要求，一般而言，對(duì)于非腸胃道給藥，約0.01-5百萬細(xì)胞受體每千克體重。所用細(xì)胞數(shù)根據(jù)受體體重和身體狀況，給藥次數(shù)或頻率，及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的變數(shù)而定。間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過適合要被移植的組織，器官或細(xì)胞的途徑給藥。可以全身給藥，即非腸胃道的，靜脈注射，或特定組織器官如骨髓，靶向釋放。人間充質(zhì)干細(xì)胞可通過皮下移植或注射到連接組織如肌肉的方式給藥。
可將細(xì)胞懸浮于一種合適的稀釋劑，濃度約0.01-5×106細(xì)胞/毫升。注射液適當(dāng)?shù)馁x形劑應(yīng)和細(xì)胞及受體在生物學(xué)上是可配伍的，如生理鹽水緩沖液或其它合適的賦形劑。藥物成分必須根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行配方，生產(chǎn)，儲(chǔ)存，并有適當(dāng)?shù)臏缇幚砑胺€(wěn)定劑。
盡管本發(fā)明并無限制，較佳的是，間充質(zhì)干細(xì)胞從骨髓中分離，經(jīng)培養(yǎng)，即在體外，純化，擴(kuò)增以獲得這里所述方法所需的足夠數(shù)量的細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞，在骨中發(fā)現(xiàn)的成多能胚細(xì)胞，在骨髓(1∶100000)及其它間充質(zhì)組織中存在的幾率很低。見，Caplan和Haynesworth，U.S.Pat.No.5486359。間充質(zhì)干細(xì)胞的基因傳導(dǎo)見Gersonet al U.S.Pat.No.5591625。
除另外說明，遺傳操作方法見Sambrook和Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)室操作指南，第二版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989)。
本發(fā)明的方法和藥物組成的詳述見附錄A，并全面結(jié)合參考文獻(xiàn)。這里所給出的具體實(shí)施例并非詳盡無遺，可能包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的在設(shè)計(jì)和方法學(xué)上的變化的其它設(shè)計(jì)?；旧夏鼙焕玫谋绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何不同的設(shè)計(jì)，方法，結(jié)構(gòu)，原料都不會(huì)背離本發(fā)明的精神。
方法分子生物學(xué)一般方法本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)不再具體描述，參見Sambrook et al，分子克隆實(shí)驗(yàn)室操作指南，Cold SpringHarbor Laboratory Press，N.Y.(1989)；Ausubel et al.，分子生物學(xué)通用操作流程，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，分子克隆操作指南，John&Sons，N.Y.(1988)；Watson et al.，重組DNA，Scientific American Books；N.Y.和Birren et al(eds)基因組分析實(shí)驗(yàn)室操作指南叢書，1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.(1998)。方法學(xué)在美國專利4666828，4683202，4801531，5192659和5272057中詳述，并結(jié)合參考文獻(xiàn)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)參見PCR操作流程方法及應(yīng)用指南，Academic Press，San Diego，CA(1990)。原位(細(xì)胞內(nèi))PCR和流式細(xì)胞儀可用于檢測含有特定DNA和mRNA序列的細(xì)胞(Testoni et al，1996，Blood 873822)。
免疫學(xué)一般方法本領(lǐng)域熟知的免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)不再具體描述，參見Stites et al.(eds)，基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)和Mishell，Shiigi(eds)，細(xì)胞免疫學(xué)方法精選，W.H.Freeman&Co.，N.Y.(1980)。
給藥本發(fā)明藥物的給藥和劑量應(yīng)符合醫(yī)學(xué)用藥規(guī)范，并考慮病人的臨床狀況，給藥位點(diǎn)及方法，給藥時(shí)間表，病人年齡，性別，體重及其它因素。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的這些考慮因素決定藥物“有效量”。這個(gè)量必須有效地改善包括但不局限于提高存活率或更快恢復(fù)，或改善或消除癥狀，以及其它通過本領(lǐng)域技術(shù)人員選用來作為適當(dāng)?shù)暮饬恐笜?biāo)。
在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的化合物可以有多種給藥方式。應(yīng)當(dāng)注意可以化合物或藥學(xué)上可接受的鹽的形式給藥，可以單獨(dú)或作為活性成分和藥學(xué)載體，稀釋劑，佐劑結(jié)合給藥。化合物可以口服，皮下給藥或非腸胃道給藥包括靜脈，動(dòng)脈，肌肉，腹腔和鼻內(nèi)給藥以及鞘內(nèi)和融合技術(shù)給藥?；衔镆浦惨灿行АＶ委煂?duì)象是暖血?jiǎng)游?，特別是哺乳動(dòng)物包括人。藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑，佐劑及移植載體一般指惰性，無毒固體或液體填充劑，稀釋劑或膠囊內(nèi)的原料，與本發(fā)明的活性成分不反應(yīng)。
應(yīng)當(dāng)注意人的治療時(shí)間比這里所列的實(shí)施例中的小鼠或其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的治療時(shí)間要長，治療時(shí)間的長短與疾病過程的長短及藥效是相關(guān)的。劑量可以是單一劑量或幾天的一段時(shí)間中給予多樣的劑量，但單一劑量較佳。
劑量可以是單一劑量或幾天的一段時(shí)間中給予多樣的劑量。治療時(shí)間的長短一般與疾病過程的長短，藥效及治療對(duì)象的種系是相關(guān)的。
如果本發(fā)明的化合物通過非腸胃道給藥，一般配方成一個(gè)單位劑量的注射劑形式(溶液，懸浮液，乳劑)。適合注射的藥學(xué)配方包括無菌水溶液或分散體，和重新組成無菌注射溶液或分散劑的無菌粉末。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括，例如水，酒精，多元醇(如，甘油，丙二醇，液體聚乙二醇，等等)，及其適當(dāng)?shù)幕旌衔锖椭参镉汀?br> 合適的流動(dòng)性可以通過以下方法維持，例如，用卵磷脂包被，分散劑時(shí)將藥物制成適當(dāng)?shù)念w粒大小及使用表面活性劑。非水載體如棉籽油，芝麻油，橄欖油，大豆油，玉米油，葵花油，或花生油和酯類，如肉豆蔻酸異丙酯，也可作為溶劑系統(tǒng)。此外，可加入各種提高制劑穩(wěn)定性，無菌性和等滲性的添加劑，包括抗菌防腐劑，抗氧化劑，螯合劑和緩沖液。通過不同的抗細(xì)菌和抗真菌試劑可預(yù)防微生物引起的變質(zhì)，如對(duì)羥基苯甲酸酯類，氯丁醇，酚，山梨酸，等等。在許多情況下，需加入等滲劑，如糖類，氯化鈉等等。延長注射劑型的吸收時(shí)間可加入阻滯吸收試劑，如單硬脂酸鋁，明膠。根據(jù)本發(fā)明，任何載體，稀釋劑，或佐劑與化合物都應(yīng)當(dāng)是可配伍的。
無菌注射溶液的制備應(yīng)當(dāng)結(jié)合本發(fā)明實(shí)際操作中所用的化合物，加入適當(dāng)?shù)娜軇┝考捌渌璩煞帧?br> 本發(fā)明的藥學(xué)配方可以注射配方給病人給藥，可以含有任何可配伍的載體，如不同的載體，佐劑，添加劑和稀釋劑；本發(fā)明的化合物也可以以下形式非腸胃道給藥，如緩釋皮下植入或靶向釋放系統(tǒng)如單抗，載體釋放，離子滲透，大分子基質(zhì)，酯質(zhì)體和微球體。本發(fā)明有用的釋放系統(tǒng)實(shí)施例包括5225182，5169383，5167616，4959217，4925678，4487603，4486194，4447233，4447224，4439196，4475196。許多其它如植入劑釋放系統(tǒng)和模型是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
本發(fā)明的化合物的藥學(xué)配方可以口服給藥。傳統(tǒng)的方法，如片劑，懸浮劑，溶液，乳劑，膠囊，粉末，糖漿等都適用。較佳的是成熟的技術(shù)，通過口服或靜脈給藥，且能維持其生物活性。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的化合物可以首先通過靜脈注射給藥，以達(dá)到合適的血液濃度。然后，通過口服給藥維持血藥濃度。其它上述的給藥形式，也可以根據(jù)具體病情采用。給藥量根據(jù)接受治療的病人，范圍在約100微克每千克體重至100毫克每千克體重每天，較佳范圍在10毫克每千克體重至10毫克每千克體重每天。
實(shí)施例1NO對(duì)血管發(fā)生和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的影響在病灶內(nèi)陷大腦局部缺血大鼠模型上研究。與對(duì)照相比，在中風(fēng)24小時(shí)后給大鼠全身注射一種NO供體，DETANONOate，在三維激光掃描共焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)明顯擴(kuò)大了血管的周長，增加了大腦內(nèi)皮細(xì)胞增值的數(shù)量和缺血區(qū)新生血管的數(shù)量。通過ELISA法檢測到用DETANONOate治療顯著提高了缺血區(qū)VEGF的水平，用毛細(xì)血管形成檢測法研究DETANONOate是否通過活化可溶性鳥苷酸環(huán)化酶加快缺血腦區(qū)的血管發(fā)生。DETANONOate誘導(dǎo)毛細(xì)管形成被可溶性鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑，1H-[1，2，4]氧雜重氮鹽并[4，3-a]喹喔啉-1-酮(ODQ)完全抑制。用抗VEGF受體2的中和型抗體阻斷VEGF的活性明顯減弱了DETANONOate誘導(dǎo)的毛細(xì)管的形成。此外，給中風(fēng)24小時(shí)的大鼠全身給藥磷酸二酯酶5抑制劑(Sildenafil)明顯增加了缺血部位的血管發(fā)生。Sildenafil和環(huán)鳥苷酸(cGMP)類似物也誘導(dǎo)毛細(xì)管生成。這些發(fā)現(xiàn)提示外源NO加快缺血大腦血管發(fā)生，是通過NO/cGMP途徑調(diào)節(jié)的。而且，數(shù)據(jù)顯示NO在一定程度上通過VEGF可以提高缺血大腦中血管發(fā)生。
用氧化氮(NO)供體治療中風(fēng)降低了功能的神經(jīng)缺失。NO是一種多效分子，會(huì)影響許多生理病理功能。用NO供體治療動(dòng)物會(huì)引起大腦神經(jīng)發(fā)生區(qū)的細(xì)胞增殖，例如室下區(qū)，齒狀回。然而，神經(jīng)功能改善的機(jī)理尚不明確。
NO治療中風(fēng)的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)是血管發(fā)生。對(duì)中風(fēng)的動(dòng)物以生血管前體試劑給藥，例如堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)明顯降低了神經(jīng)功能失調(diào)。用NO供體培養(yǎng)人血管平滑肌細(xì)胞增加了VEGF合成，而NO合成酶(NOS)拮抗劑NW-硝基-1-精氨酸甲酯(L-NAME)降低了VEGF生成。內(nèi)皮NO合成酶(eNOS)缺失的小鼠在缺血肢表現(xiàn)出明顯的血管發(fā)生損傷，表明NO調(diào)節(jié)缺血組織的血管發(fā)生。因而，在NO，VEGF和血管發(fā)生之間看來好象是有關(guān)的。但是，NO供體對(duì)中風(fēng)后VEGF和血管發(fā)生的作用尚未研究。相應(yīng)地，NO通過環(huán)鳥苷酸(cGMP)途徑增加VEGF加快血管發(fā)生的作用在病灶內(nèi)陷大腦缺血大鼠模型上被檢測。
材料和方法動(dòng)物模型雄性Wistar大鼠重320-380克。在大腦中動(dòng)脈(MCA)的起始段用一插入器將其封閉。
實(shí)驗(yàn)流程1)檢測外源性NO是否影響缺血?jiǎng)游锏男卵苄纬?，將一NO供體(Z)-1-[N-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)aminio]diazen-1-ium-1，2-diolate(DETANONOate)，半衰期57小時(shí)，在生理?xiàng)l件下給藥于缺血大鼠。中風(fēng)24小時(shí)后大鼠(n＝8)靜脈注射DETANONOate(0.4毫克每千克體重)然后連續(xù)六天，每天腹腔注射。給缺血大鼠(n＝8)注射等量的衰變的DETANONOate作為對(duì)照。所有大鼠在中風(fēng)14天后處死。
2)檢測外源性NO對(duì)腦部VEGF水平的作用，給缺血大鼠分別DETANONOate(0.4毫克每千克體重)或生理鹽水(n＝3每實(shí)驗(yàn)組)，具體方法同1。中風(fēng)7天后處死大鼠。
3)檢測增加cGMP水平是否促進(jìn)缺血腦部血管發(fā)生。Sildenafil溶于3毫升水(2毫克每千克體重)，喂給中風(fēng)24小時(shí)的缺血大鼠(n＝8)，連續(xù)7天。中風(fēng)14天后處死。
溴脫氧鳥苷標(biāo)記溴脫氧鳥苷(BrdU，Sigma Chemical)，胸腺嘧啶類似物，可在細(xì)胞分裂S期結(jié)合到DNA中，用于有絲分裂標(biāo)記。缺血大鼠MCA阻塞1天后，連續(xù)13天腹腔注射BrdU(50毫克每千克)。
三維成像及分析為檢測缺血大腦新血管形成，給MCAo 14天的大腦缺血大鼠靜脈注射異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的右旋糖苷(2×106分子量，Sigma，St.Louis.MO；50毫克/毫升的0.1毫升)。迅速將大腦取出放入4％的多聚甲醛4℃48小時(shí)。用振動(dòng)切片機(jī)切冠狀切面(100微米)。如前所述，切片用Bio-Rad MRC 1024(氬和氪)激光掃描共焦成像系統(tǒng)Zeiss顯微鏡(Bio-Red，Cambridge，MA)分析。從每個(gè)大鼠腦部的前囟門5.2毫米到-8.8毫米處以2毫米間距切片，選取七個(gè)100μm厚的冠狀切面。從切片中選擇有同側(cè)和對(duì)側(cè)大腦半球中的八個(gè)腦區(qū)(耳間8.8毫米，囟門0.8毫米)。這些腦區(qū)在x-y方向上以512×512象素(276×276平方微米)用4×掃描框，在z軸上以1微米的步長用25個(gè)光切面在40×物鏡下觀察。分別測量血管分支點(diǎn)，節(jié)段長度和直徑。成像和分析盲法進(jìn)行。
免疫組織化學(xué)及定量分析對(duì)于BrdU免疫染色，腦切片(6微米)在50％甲酰胺2×SSC于65℃溫育2小時(shí)，2N HCl于37℃溫育30分鐘，在此過程中DNA變性。切片用tris緩沖液沖洗，經(jīng)1％H2O2處理封閉內(nèi)源過氧化物酶。然后，切片用鼠源的抗BrdU單抗(1∶1000，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)溫育過夜再用生物素標(biāo)記的二抗(1∶200，Vector，Burlingame，CA)溫育1小時(shí)。
為定量BrdU免疫活性的內(nèi)皮細(xì)胞，給每個(gè)大鼠的缺血病灶區(qū)十個(gè)擴(kuò)張的血管進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞和BrdU免疫活性內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)側(cè)的同源區(qū)進(jìn)行相同的計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)用每只大鼠免疫活性內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)占總內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)的百分比表示。
如前所述，在用抗-von Willebrand因子抗體免疫染色的冠狀切片上測量血管周長。
ELISA檢測VEGF解剖缺血區(qū)及對(duì)側(cè)腦半球同源組織。組織勻漿，在4℃于10000g離心20分鐘，收集上清夜，用市售試劑盒進(jìn)行大鼠VEGF(R&D，systems)ELISA檢測。
毛細(xì)管形成檢測進(jìn)行體外血管生成檢測。0.8毫升生長因子減量的Matrigel(BectonDickinson)加入預(yù)冷的35毫米培養(yǎng)皿在37℃下聚合2-5小時(shí)。小鼠大腦衍生內(nèi)皮細(xì)胞(2×104個(gè)細(xì)胞)在含有DETANONOate，Sildenafil，1H-[1，2，4]氧雜重氮鹽并[4，3-a]喹喔啉-1-酮(ODQ)，8-Br-cGMP，或大鼠抗小鼠VEGF受體2(VEGFR2，DC101，Imclone System)中和型抗體的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)3小時(shí)。隨機(jī)抽取培養(yǎng)皿的三個(gè)區(qū)域成像，測量三個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞的連續(xù)帶的長度，作為毛細(xì)管形成的定量測量。
統(tǒng)計(jì)分析采用Student-Newman-Keuls法進(jìn)行方差分析(ANOVA)，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.5作為顯著。
結(jié)果體內(nèi)DETANONOate和Sildenafil對(duì)血管發(fā)生的作用為檢測外源性的NO是否增加缺血大腦的血管發(fā)生，中風(fēng)24小時(shí)的大鼠用DETANONOate連續(xù)7天給藥，結(jié)果顯著(p＜0.01)擴(kuò)大了缺血病灶周圍的血管周長(圖1A和1D)，但未擴(kuò)大對(duì)側(cè)腦半球的血管(圖1B和1D)，和對(duì)照的同側(cè)血管比較(圖1C和1D)。擴(kuò)大的薄壁管的內(nèi)皮細(xì)胞有BrdU免疫活性(圖2A和2B)定量分析顯示在用DETANONOate處理的大鼠腦內(nèi)增殖的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)顯著增加(圖2C)。為進(jìn)一步檢測血管發(fā)生，用軟件進(jìn)行三維分析，測量節(jié)段數(shù)，長度和血管直徑。用DETANONOate處理顯著(p＜0.05)增加了缺血邊界的毛細(xì)管節(jié)段數(shù)(圖3A和表1)，和用相同體積衰變了的DETANONOate處理的缺血大鼠比較(圖3B和表1)。在DETANONOate處理組中，毛細(xì)節(jié)段的直徑較小長度較短(圖3A和表1)，提示這些是新生血管。在用Sildenafil處理的大鼠體內(nèi)也可觀察到顯著增加的血管發(fā)生(表1)。
DETANONOate和Sildenafil對(duì)腦內(nèi)VEGF水平的作用為檢測給藥DETANONOate是否增加VEGF在大腦內(nèi)的水平，用ELISA檢測大鼠內(nèi)源VEGF。結(jié)果顯示用DETANONOate處理顯著(p＜0.05)增加缺血邊界的VEGF水平，從對(duì)照組(n＝3)的13.4±1.5皮克/毫升增加到實(shí)驗(yàn)組(n＝3)的28.9±1.0皮克/毫升。由于NO增加cGMP，DETANONOate可經(jīng)cGMP途徑誘導(dǎo)VEGF。測量了用PDE5抑制劑(Sildenafil)處理的大鼠的VEGF大腦水平，結(jié)果顯示Sildenafil顯著(p＜0.05)增加了缺血邊界的VEGF水平(34.4±2.9皮克/毫升對(duì)對(duì)照組13.4±1.5皮克/毫升，每組n＝3)。
可溶性鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑和中和VEGFR2對(duì)DETANONOate誘導(dǎo)毛細(xì)管形成的作用為支持DETANONOate通過活化可溶性鳥苷酸環(huán)化酶增加缺血大腦的血管發(fā)生這一假設(shè)，通過毛細(xì)管形成檢測試驗(yàn)進(jìn)一步分析DETANONOate對(duì)血管發(fā)生的作用。當(dāng)小鼠大腦衍生內(nèi)皮細(xì)胞用DETANONOate培養(yǎng)(0.2微摩爾，圖4B和4E)和僅用DMEM培養(yǎng)(圖4A和4E)比較，看到毛細(xì)管發(fā)生顯著增加。但是，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞用DETANONate培養(yǎng)時(shí)有ODQ，一種可溶性鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑存在時(shí)，DETANONOate誘導(dǎo)的毛細(xì)管發(fā)生被完全抑制了(圖4C和4E)，表明NO/cGMP信號(hào)途徑參與調(diào)節(jié)DETANONOate對(duì)血管發(fā)生的作用。為檢測DETANONOate是否也通過增加VEGF促進(jìn)血管發(fā)生，將內(nèi)皮細(xì)胞在DETANONOate(0.2微摩爾)和一種抗小鼠VEGFR2(DC101，10微克/毫升)中和型抗體中培養(yǎng)3小時(shí)?？贵w是有活性的。內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)VEGFR2抗體處理顯著(p＜0.05)降低了DETANONOate誘導(dǎo)毛細(xì)管發(fā)生(圖4D和4E)，提示VEGF參與DETANONOate誘導(dǎo)血管發(fā)生。
Sildenafil對(duì)毛細(xì)管形成的作用內(nèi)皮細(xì)胞在Sildenafil(100-500納摩爾)中培養(yǎng)產(chǎn)生濃度依賴的毛細(xì)管形成(圖5)。8-Br-cGMP(1毫摩爾)，cGMP的類似物，也顯著(p＜0.05)增加毛細(xì)管形成(圖5)。ODQ(10微摩爾)顯著抑制Sildenafil誘導(dǎo)的毛細(xì)管形成(圖5)，表明Sildenafil的血管發(fā)生依賴于內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的sGC的活性。ODQ沒有顯著抑制8-Br-cGMP誘導(dǎo)毛細(xì)管形成(圖5)，證實(shí)此作用不依賴于可溶性鳥苷酸環(huán)化酶活性。
討論本實(shí)驗(yàn)的主要發(fā)現(xiàn)是1)中風(fēng)24小時(shí)后給予DETANONOate或Sildenafil增加缺血大腦VEGF的合成促進(jìn)血管發(fā)生；2)ODQ，一種可溶性鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑，完全抑制DETANONOate誘導(dǎo)毛細(xì)管發(fā)生；3)Sildenafil，一種PDE5抑制劑，誘導(dǎo)毛細(xì)管發(fā)生；4)用VEGFR2中和型抗體阻斷VEGF活性減弱DETANONOate誘導(dǎo)毛細(xì)管形成；綜上，這些數(shù)據(jù)表明外源性NO通過NO/cGMP途徑促進(jìn)缺血區(qū)血管發(fā)生，PDE5抑制劑(Sildenafil)增強(qiáng)血管發(fā)生。這些數(shù)據(jù)也提示NO，VEGF和血管發(fā)生有關(guān)。
NO在血管發(fā)生中有重要作用。然而，NO對(duì)缺血大腦血管發(fā)生的作用尚未研究。缺乏eNOS的小鼠對(duì)肢體缺血的反應(yīng)中表現(xiàn)自發(fā)血管發(fā)生的嚴(yán)重?fù)p傷，給藥L-精氨酸促進(jìn)血管發(fā)生。在本實(shí)驗(yàn)中，DETANONOate給藥顯著增加缺血邊界擴(kuò)張血管的數(shù)量和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，這和NO誘導(dǎo)血管擴(kuò)張和內(nèi)皮細(xì)胞增值的數(shù)據(jù)是一致的。
NO激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，由此增加靶細(xì)胞內(nèi)的cGMP。PDE5酶高度特異性水解cGMP，檸檬酸Sildenafil是一個(gè)有效的PDE5抑制劑，可以引起細(xì)胞內(nèi)cGMP22積累。DETANONOate誘導(dǎo)的毛細(xì)管形成可被ODQ，一種可溶性鳥苷酸環(huán)化酶選擇性抑制劑完全抑制，提示DETANONOate可以通過鳥苷酸環(huán)化酶的活化提高大腦血管發(fā)生。這些結(jié)果和以前報(bào)道的NO在血管發(fā)生中激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶一致。為進(jìn)一步證明在缺血大腦，cGMP的增加對(duì)NO增進(jìn)的血管發(fā)生有作用，給中風(fēng)24小時(shí)的大鼠給予PDE5抑制劑(Sildenafil)。數(shù)據(jù)顯示Sildenafil處理提高了缺血邊界的血管發(fā)生。而且，Sildenafil和8-BrcGMP(cGMP類似物)在大腦衍生內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)毛細(xì)管形成。ODQ顯著抑制Sildenafil，但不抑制8-BrcGMP誘導(dǎo)的毛細(xì)管形成，表明這一反應(yīng)依賴于sGC的基礎(chǔ)活性。因此，這一數(shù)據(jù)支持在缺血大腦NO/cGMP途徑調(diào)節(jié)DETANONOate誘導(dǎo)的血管發(fā)生這一結(jié)論。
VEGF調(diào)節(jié)血管發(fā)生，NO和VEGF相互作用促進(jìn)血管發(fā)生。高濃度的NO供體下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)。相反，最近的研究表明內(nèi)源性NO提高VEGF的合成。eNOS缺陷型小鼠對(duì)后肢缺血表現(xiàn)明顯的血管發(fā)生損傷，給藥VEGF不能改善損傷的血管發(fā)生，表明NO是VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生的下游調(diào)節(jié)物。VEGF引起的血管發(fā)生和組織的微環(huán)境有關(guān)。數(shù)據(jù)顯示外源NO提高缺血大腦的VEGF水平，阻斷VEGF活性，減弱了DETANONOate誘導(dǎo)的毛細(xì)管形成，提示NO誘導(dǎo)腦內(nèi)VEGF合成，而VEGF至少在一定程度上調(diào)節(jié)DETANONOate誘導(dǎo)的血管發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)和以前研究的NO供體衍生的NO增加VEGF合成這一結(jié)論是一致的。此外，PDE5抑制劑，Sildenafil，增加缺血大腦VEGF的腦內(nèi)水平，提示cGMP極有可能對(duì)NO誘導(dǎo)的VEGF合成有作用。這一發(fā)現(xiàn)和以前對(duì)培養(yǎng)的人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞cGMP并不參與NO誘導(dǎo)的VEGF的上調(diào)的研究結(jié)果也是一致的。其原因可能是細(xì)胞類型不同，但尚未闡明。
血管發(fā)生是由兩個(gè)生長因子家族嚴(yán)格調(diào)控的，VEGF和血管生成素家族，及內(nèi)皮細(xì)胞和胞外基質(zhì)的相互作用。VEGF和血管生成素基因的上調(diào)和中風(fēng)后大腦血管發(fā)生是一致的。而且，中風(fēng)誘導(dǎo)大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF受體1和2的表達(dá)。給藥NO供體可以在星形細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)增加內(nèi)源VEGF，增加的VEGF通過和內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)的VEGF受體的相互作用增強(qiáng)缺血大腦的血管發(fā)生，這和以前證明的用VEGF治療實(shí)驗(yàn)性中風(fēng)增加神經(jīng)發(fā)生的結(jié)論是一致的。新生血管在缺血腦中發(fā)揮作用，它們通過長期灌流功能得以修復(fù)。因此，NO和VEGF的相互作用提示用NO供體和VEGF聯(lián)合治療對(duì)血管發(fā)生有協(xié)同作用。
圖1顯示大腦血管周長。DETANONOate處理可擴(kuò)張缺血邊界的大腦血管(圖1A)，但不擴(kuò)張對(duì)側(cè)腦半球同源區(qū)的血管(圖1B)。圖1C顯示缺血邊界的一根擴(kuò)張血管，來自一只具有代表性的用降解的DETANONOate處理的大鼠。定量數(shù)據(jù)(圖1D)顯示用DETANONOate治療中風(fēng)顯著增加血管周長，和對(duì)照鼠同側(cè)血管周長相比。*p＜0.01vs同側(cè)的。C中標(biāo)線＝50微米。
圖2顯示增殖的大腦內(nèi)皮細(xì)胞。圖2A顯示經(jīng)DETANONOate處理的大鼠的一根擴(kuò)張的薄壁血管的BrdU免疫活性內(nèi)皮細(xì)胞(箭頭)。圖2B顯示對(duì)照組大鼠的一根擴(kuò)張血管的BrdU免疫活性內(nèi)皮細(xì)胞(箭頭)。盡管缺血誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖(圖2C，對(duì)照)，DETANONOate處理顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖數(shù)量(圖2C，DETANONO)。*p＜0.01vs對(duì)側(cè)腦半球，#p＜0.05vs對(duì)照組同側(cè)腦半球。B中標(biāo)線＝10微米。
圖3顯示DETANONOate誘導(dǎo)血管發(fā)生，三維成像分析。電腦成像來源于三維激光掃描共焦顯微鏡成像。DETANONOate處理增加新生血管數(shù)量(圖3A)，和對(duì)照組大鼠的新生血管數(shù)比較(圖3B)。然而，DETANONOate并不改變對(duì)側(cè)腦半球的血管形態(tài)(圖3C)。圖像中的綠色和紅色分別代表血管半徑大于或小于7.5微米。像的大小是276×276×25立方微米，單位為微米。
圖4顯示DETANONOate誘導(dǎo)體外血管發(fā)生。小鼠腦衍生內(nèi)皮細(xì)胞在不含DETANONOate(圖4A)，含DETANONOate(0.2微摩爾，圖4B)，含DETANONOate和ODQ(圖4C)或VEGFR2抗體(圖4D)的DMEM中培養(yǎng)3小時(shí)。DETANONate誘導(dǎo)毛細(xì)管形成(圖4B)，這一作用被ODQ(圖4C)或VEGFR2抗體(圖4D)抑制。類似的結(jié)果至少在四次實(shí)驗(yàn)中獲得。柱狀圖(圖4E)顯示毛細(xì)管形成的定量數(shù)據(jù)。*p＜0.05vs對(duì)照，#p＜0.05vsDETANONOate(0.2微摩爾)。NO 0.1和0.2代表DETANONOate0.1和0.2微摩爾。DC101代表VEGFR2抗體。
圖5柱狀圖顯示Sildenafil誘導(dǎo)毛細(xì)管形成的定量數(shù)據(jù)。Sildenafil(100-500納摩爾)和8-BrcGMP誘導(dǎo)的毛細(xì)管形成，ODQ顯著抑制Sildenafil(300納摩爾)誘導(dǎo)的毛細(xì)管形成但不減弱8-BrcGMP誘導(dǎo)的毛細(xì)管形成。*p＜0.05vs對(duì)照，#p＜0.05vsSildenafil 300納摩爾。Sil.＝Sildenafil。
實(shí)施例2方法用雄性Wistar大鼠進(jìn)行內(nèi)陷大腦中動(dòng)脈阻塞，中風(fēng)發(fā)生2或24小時(shí)后連續(xù)7天口服Sildenafi(Viagra)，2或5毫克/千克每天。缺血大鼠口服相同量的自來水作為對(duì)照。進(jìn)行功能結(jié)果試驗(yàn)(錯(cuò)步，粘性去除)。中風(fēng)28天后處死大鼠分析室下區(qū)和齒狀回的梗塞體積和新生細(xì)胞。測量另外大鼠的腦cGMP水平，PDE5，局部大腦血流量。
結(jié)果在所有實(shí)驗(yàn)中，Sildenafil處理后顯著(p＝0.05)增強(qiáng)神經(jīng)修復(fù)。實(shí)驗(yàn)組間無明顯的梗塞體積差異。Sildenafil處理顯著(p＝0.05)增加室下區(qū)和齒狀回的BrdU免疫活性細(xì)胞數(shù)量和未成熟神經(jīng)元，正如在同側(cè)室下區(qū)和紋狀體中III-微管蛋白(TuJ1)免疫反應(yīng)性所示。Sildenafil給藥后皮層cGMP水平顯著提高，非缺血和缺血大腦中均有PDE5mRNA存在。
結(jié)論大鼠中風(fēng)2或24小時(shí)后Sildenafil給藥提高大腦cGMP水平，引發(fā)神經(jīng)發(fā)生，減少神經(jīng)缺失。這些數(shù)據(jù)顯示此藥在臨床治療性功能失調(diào)時(shí)可促進(jìn)中風(fēng)后的恢復(fù)。
氧化氮(NO)是可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的強(qiáng)激活劑，在靶細(xì)胞引起cGMP形成。磷酸二酯酶5(PDE5)高度特異性水解cGMP，參與cGMP信號(hào)調(diào)控。Sildenafil是一種新的PDE5抑制劑，引起胞內(nèi)cGMP積累。中風(fēng)大鼠NO供體給藥顯著提高大腦cGMP水平，誘導(dǎo)細(xì)胞生成，改善功能修復(fù)。功能恢復(fù)一定程度上由于NO給藥引起的cGMP水平提高。因此，中風(fēng)大鼠給藥Sildenafil，一種PDE5抑制劑，在中風(fēng)恢復(fù)過程中促進(jìn)神經(jīng)功能改善。
材料和方法Sildenafil是一種弱堿性化合物，在生理pH下只能部分電離，在大鼠體內(nèi)半衰期為0.4小時(shí)。Viagra片劑(含100毫克Sildenafil，市售)稱重并粉碎。
動(dòng)物模型本試驗(yàn)中使用的雄性Wistar大鼠重320-380克。在大腦中動(dòng)脈(MCA)的起始段用一插入器將其封閉。
實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)為檢測Sildenafil給藥是否影響細(xì)胞增殖和神經(jīng)學(xué)行為，Sildenafil溶解在3毫升的自來水中，大鼠MCA梗塞2小時(shí)后以2毫克/千克(n＝10)或5毫克/千克(n＝9)劑量連續(xù)口服7天。另一組缺血大鼠(n＝10)在MCA梗塞24小時(shí)后口服Sildenafil(2毫克/千克)連續(xù)7天。缺血大鼠(n＝9)口服相同體積自來水作為對(duì)照。功能試驗(yàn)和體重測量在缺血前和MCA梗塞后4，7，14，21和28天時(shí)進(jìn)行。所有的大鼠在MCA梗塞28天后處死。實(shí)驗(yàn)也為檢測Sildenafil給藥是否影響大腦cGMP水平，非缺血大鼠喂服Sildenafil 2毫克/千克(n＝6)或自來水(n＝10)7天。這些大鼠在最后喂藥1小時(shí)后處死測大腦cGMP水平。實(shí)驗(yàn)也為檢測Sildenafil對(duì)大腦血流量(CBF)和血壓的作用，非缺血大鼠(n＝6)喂服Sildenafil，30分鐘后持續(xù)180分鐘測量局部CBF和平均動(dòng)脈血壓。實(shí)驗(yàn)也為了檢測大腦PDE5，非缺血大鼠和缺血大鼠在缺血發(fā)生2，4，24，48和168小時(shí)后處死(n＝3每時(shí)間點(diǎn))。逆轉(zhuǎn)錄(RT)一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測腦組織PDE5。
腦組織測量cGMPcGMP水平用市售低pH免疫試驗(yàn)試劑盒(R&D Systems Inc)測定。非乙酰化步驟的靈敏度約為0.6皮摩爾/毫升?？焖偃∧X，分離皮層和小腦。腦組織稱重在10倍體積含1毫摩爾/升3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的0.1N HCl中勻漿。
RT-PCR分析為檢測PDE5在大鼠腦組織中是否存在，根據(jù)公開的PDE5A1和PDE5A2的序列合成引物。5’引物5’-AAAACTCGAGCAGAAACCCGCGGCA-AACACC-3’，3’引物5’-GCATGAGGACTTTGAG-GCAGAGAGC-3’擴(kuò)增編碼大鼠PDE5A1 N-末端的cDNA片段。5’引物5’-ACCTCTGCTATGTTGCCCTTTGC-3’，3’引物5’-GCATGAGGACTTTGAGGCAGA GAGC-3’擴(kuò)增編碼大鼠PDE5A2的cDNA片段。從腦組織中抽提總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。樣品在95℃變性2分鐘，然后擴(kuò)增40循環(huán)。每一循環(huán)95℃變性30秒，62℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘。樣品(30微升每孔)用含溴化乙錠的1.5％瓊脂糖電泳。
體重減少動(dòng)物在內(nèi)陷缺血前和之后4，7，14，21和28天稱重。減少的體重用缺血前體重的百分?jǐn)?shù)表示。
錯(cuò)步試驗(yàn)在缺血前和之后4，7，14，21，28天進(jìn)行錯(cuò)步試驗(yàn)測試大鼠前肢定位功能失調(diào)。將大鼠放在升高的有不同大小的六邊形的格柵上，爪子放在格子的邊線上。它們移動(dòng)的時(shí)候爪子可能在線間打滑或從格子間滑落。計(jì)數(shù)大鼠跨過格子的步數(shù)(每個(gè)前肢的移動(dòng))，記錄每個(gè)前肢的總錯(cuò)步數(shù)。
粘性去除試驗(yàn)粘性去除試驗(yàn)用于測試體感缺失，在MCA梗塞前和之后4，7，14，21和28天時(shí)進(jìn)行。
溴脫氧鳥苷標(biāo)記溴脫氧鳥苷(BrdU)用于測定細(xì)胞增殖。從中風(fēng)那天起連續(xù)15天腹腔注射BrdU(50毫克/千克，Sigma)。缺血28天后處死大鼠，測定室下區(qū)和齒狀回的細(xì)胞增殖(見實(shí)驗(yàn)流程1，共4組)。
免疫組化對(duì)于BrdU免疫染色，腦切片(6微米)在50％甲酰胺2×SSC于65℃溫育2小時(shí)，2N HCl于37℃溫育30分鐘，在此過程中DNA變性。切片用tris緩沖液沖洗，經(jīng)1％H2O2處理封閉內(nèi)源過氧化物酶。然后，切片用BrdU一抗(1∶100)室溫溫育1小時(shí)再用生物素標(biāo)記的二抗(1∶200，Vector)溫育1小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物用3’3’-二氨基聯(lián)苯胺-四氫氯化物(DAB；Sigma)。對(duì)于鑒定未成熟神經(jīng)元的III-微管蛋白(TuJ1)免疫染色，12片冠狀切片在抗TuJ1(1∶1000)抗體中4℃溫育過夜，然后和生物素標(biāo)記的馬源的抗小鼠免疫球蛋白抗體室溫溫育30分鐘。BrdU和TuJ1雙免疫熒光染色測定在切片上BrdU免疫活性細(xì)胞是否表達(dá)神經(jīng)元表型。
成像分析和定量檢測用石蠟包埋的6微米厚切片進(jìn)行BrdU免疫活性細(xì)胞測定。11個(gè)BrdU免疫染色的切片在40倍物鏡下(Olympus B×40)通過MCID計(jì)算機(jī)成像分析系統(tǒng)(Imaging Research)數(shù)字化分析。BrdU免疫活性細(xì)胞核在電腦顯示屏上計(jì)數(shù)并在1倍焦平面上避免取樣過量。室下區(qū)的側(cè)腦室的同側(cè)和對(duì)側(cè)壁以及齒狀回中的所有的BrdU免疫活性陽性細(xì)胞和都要計(jì)數(shù)。對(duì)于室下區(qū)，胼胝體膝節(jié)中間10.6毫米和前連合中間8.74毫米間每40片選取一片切片，共選7片。對(duì)于齒狀回，顆粒體細(xì)胞層中間5.86毫米和2.96毫米間每50片選取一片切片，共8片。室下區(qū)和齒狀回的BrdU免疫活性細(xì)胞核用每平方毫米的細(xì)胞數(shù)表示(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。取每個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7個(gè)切片(室下區(qū))和8個(gè)切片(齒狀回)的密度均值。在室下區(qū)和紋狀體中的TuJ1免疫活性細(xì)胞計(jì)數(shù)，用每個(gè)切片的TuJ1免疫活性細(xì)胞數(shù)表示(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。
相對(duì)紅細(xì)胞流速度監(jiān)控組織中的相對(duì)紅細(xì)胞流速度用激光Doppler流速計(jì)(PefiFlux PF4流速計(jì)；Perimed AB)探針測定。在頭骨前囟點(diǎn)后2毫米中線側(cè)6毫米處鉆一直徑為1.5毫米的小洞，硬腦膜保持完整。洞上加一點(diǎn)礦物油，探針放在膜表面上0.5毫米處。Sildenafil給藥30分鐘后測相對(duì)流速。測量反映相對(duì)局部的CBF。其值用對(duì)側(cè)腦半球值百分比表示。
梗塞體積測定在7個(gè)蘇木精和伊紅染色的切片上用Global Laboratory Image分析程序(Data Translation)測定梗塞體積。兩個(gè)腦半球面積和梗塞面積(平方毫米)在計(jì)算機(jī)上追蹤后計(jì)算。梗塞體積(立方毫米)用面積和切片間隔厚度乘積計(jì)算得到。梗塞體積用對(duì)側(cè)腦半球梗塞體積百分比表示(間接體積計(jì)算)。
統(tǒng)計(jì)分析對(duì)于神經(jīng)功能恢復(fù)和體重的分析，由于數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性和方差相同，用GEE分析法代替ANOVA。用配對(duì)t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)檢驗(yàn)室下區(qū)，齒狀回，紋狀體的兩側(cè)細(xì)胞增殖的差異。GEE法用來研究治療對(duì)室下區(qū)，齒狀回，紋狀體的兩側(cè)細(xì)胞增殖的作用。所有值均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。設(shè)定p＝0.05。
結(jié)果Sildenafil對(duì)細(xì)胞增殖的作用缺血的大鼠中風(fēng)發(fā)生2或24小時(shí)后用Sildenafil(2或5毫克/千克)處理，和對(duì)照大鼠比較，兩個(gè)腦半球的齒狀回中的BrdU免疫活性細(xì)胞數(shù)有顯著(p＜0.05)增加(表1)。和對(duì)照比較，所用劑量為2毫克/千克(2或24小時(shí))時(shí)，同側(cè)室下區(qū)BrdU免疫活性細(xì)胞數(shù)有顯著(p＜0.05)增加，所用劑量為5毫克/千克(2小時(shí))時(shí)，兩側(cè)室下區(qū)BrdU免疫活性細(xì)胞數(shù)均有顯著(p＜0.05)增加(表1)。
圖6顯示Sildenafil處理作用，在缺血28天后增加了TuJ1免疫活性細(xì)胞。圖6A是一只大鼠的樣本，和對(duì)側(cè)室下區(qū)比較(圖6B)同側(cè)室下區(qū)中的TuJ1免疫活性細(xì)胞數(shù)有大幅度增加。室管膜細(xì)胞(圖6A和B箭頭)不是TuJ1免疫活性的。TuJ1免疫活性細(xì)胞在同側(cè)紋狀體中成簇存在(圖6C)，和對(duì)側(cè)腦半球同源組織比較(圖6D)?？筎uJl和BrdU抗體雙重免疫染色顯示BrdU免疫活性細(xì)胞(圖6E和G，綠色，箭頭)是TuJ1免疫活性的(圖6E和F，紅色，箭頭)。圖6E是圖6F和G的重合圖。圖6H和1分別顯示室下區(qū)(n＝6每組)和紋狀體(n＝6每組)的TuJ1免疫活性細(xì)胞定量數(shù)據(jù)。(*p＝0.05，**p＝0.01，#p＝0.05vs對(duì)照組。LV表示側(cè)室。圖1B和G中標(biāo)線10微米，C中標(biāo)線20微米)。
表1新生細(xì)胞的腦內(nèi)密度

新生細(xì)胞的密度以每mm2的BrdU免疫活性細(xì)胞數(shù)表示(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。
★P＜0.05，P＜0.01vs對(duì)照組。
Sildenafil對(duì)未成熟神經(jīng)元的作用Sildenafil給藥大幅度增加同側(cè)室下區(qū)(圖6A)和紋狀體(圖6C)中TuJ1免疫活性細(xì)胞。TuJ1免疫活性細(xì)胞在同側(cè)紋狀體中成簇存在(圖6C)。一些TuJ1免疫活性細(xì)胞表現(xiàn)BrdU免疫活性(圖6E-6G)。定量測定顯示和對(duì)照比較Sildenafil以2或5毫克/千克給藥顯著(p＝0.05)增加同側(cè)和對(duì)側(cè)室下區(qū)的TuJ1免疫活性細(xì)胞數(shù)(圖6H)。和對(duì)側(cè)腦半球同源組織及對(duì)照的同側(cè)紋狀體比較Sildenafil也顯著增加同側(cè)紋狀體的TuJ1細(xì)胞數(shù)(圖6I)。
Sildenafil對(duì)神經(jīng)學(xué)結(jié)果的作用缺血大鼠在缺血發(fā)生2小時(shí)后，Sildenafil以2或5毫克/千克給藥，和對(duì)照大鼠比較，在4-21天的錯(cuò)步試驗(yàn)(表2)和粘性去除試驗(yàn)(表3)結(jié)果有顯著改善。而且，Sildenafil以2或5毫克/千克給藥顯著降低了動(dòng)物體重的減少(表4)。相反，缺血28天后測量梗塞體積無明顯的組間差異(表5)，提示梗塞體積對(duì)功能的改善無作用。Sildenafil也以2毫克/千克的劑量在缺血大鼠缺血24小時(shí)后給藥，在7-28天的錯(cuò)步試驗(yàn)(表2)和粘性去除試驗(yàn)(表3)中結(jié)果有顯著改善(p＝0.05)。缺血4，7，14，21和28天，經(jīng)Sildenafil處理的大鼠體重減少顯著(p＝0.05)降低(表4)。然而梗塞體積在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間無顯著差異(表5)。
Sildenafil對(duì)cGMP的作用在非缺血對(duì)照組中，小腦cGMP水平(圖7A，對(duì)照)高于皮層水平(圖7B，對(duì)照)，這和以前的研究結(jié)果是一致的。和對(duì)照組比較，Sildenafil以2或5毫克/千克的劑量給藥7天顯著(p＝0.05)增加了cGMP皮層水平(圖7B)。
Sildenafil對(duì)局部CBF的作用和對(duì)照大鼠比較，Sildenafil以2毫克/千克的劑量對(duì)非缺血大鼠給藥顯著增加了局部CBF水平(圖8)。Sildenafil給藥后，局部CBF持續(xù)顯著增加了70分鐘(圖8)。
大鼠腦中的PDE5RT-PCR分析表明PDE5A1(257bp)和PDE5A2(149bp)在非缺血大腦組織中均有轉(zhuǎn)錄，表明有PDE5存在(數(shù)據(jù)未顯示)。和非缺血對(duì)照大鼠比較，MCA梗塞后由帶密度(n＝3每時(shí)間點(diǎn))測定的PDE5A1和PDE5A2 mRNA水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
討論本研究表明用Sildenafil治療病灶大腦缺血大鼠顯著改善神經(jīng)功能，顯著增加缺血腦中的BrdU和TuJ1免疫活性細(xì)胞數(shù)。此外，Sildenafil給藥顯著提高皮層cGMP水平。因此，數(shù)據(jù)顯示cGMP水平增加是Sildenafil給藥調(diào)節(jié)神經(jīng)功能改善的結(jié)果。
表2錯(cuò)步試驗(yàn)

數(shù)值是缺血后特定天數(shù)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示★P＜0.05，P＜0.01vs對(duì)照組。
表3粘性去除試驗(yàn)

數(shù)值表示均值±標(biāo)準(zhǔn)差★P＜0.05，P＜0.01vs對(duì)照組。
PDE5是一種重要的cGMP水解酶。在非缺血大鼠皮層觀察到PDE5mRNA和以前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠中有PDE5 mRNA及其蛋白這一結(jié)果是一致的。Sildenafil檸檬酸鹽是PDE5強(qiáng)抑制劑，引起細(xì)胞內(nèi)cGMP積累。這一數(shù)據(jù)表明Sildenafil給藥表明顯著增加大腦cGMP水平。平行發(fā)現(xiàn)，給大鼠大腦切片局部給予zaprinast，它是一種PDE5選擇性抑制劑，會(huì)導(dǎo)致cGMP釋放的增加。由此，數(shù)據(jù)顯示Sildenafil影響大腦PDE5。cGMP調(diào)節(jié)血管肌肉的舒血管效應(yīng)。Sildenafil給藥逐漸增加非缺血大鼠的CBF，和以前的體內(nèi)體外試驗(yàn)結(jié)果一致。Zaprinast給藥引起大鼠基底動(dòng)脈擴(kuò)張，也引起狗的大腦動(dòng)脈擴(kuò)張。Sildenafil以5毫克/千克的劑量給藥會(huì)降低收縮期動(dòng)脈血壓，效應(yīng)至少持續(xù)6小時(shí)。然而，Sildenafil對(duì)CBF的影響無神經(jīng)保護(hù)作用，因?yàn)楣Ｈw積未減少，而且即使在缺血24小時(shí)后第一次Sildenafil給藥是有效的，這也超過了神經(jīng)保護(hù)的治療窗。
本研究的另一發(fā)現(xiàn)是Sildenafil治療顯著增加了室下區(qū)和齒狀回的祖細(xì)胞增殖和未成熟神經(jīng)元數(shù)，由TuJ1免疫染色測定。DETANONOate給藥，它是一種NO供體給藥，顯著提高神經(jīng)發(fā)生。NO活化可溶性鳥苷酸環(huán)化酶導(dǎo)致cGMP形成，而Sildenafil抑制PDE5活性從而抑制cGMP降解。綜上，這些數(shù)據(jù)顯示cGMP調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)和以前的研究結(jié)果cGMP依賴的蛋白激酶1提高感覺神經(jīng)元祖細(xì)胞增殖是一致的。值得注意的是室下區(qū)的神經(jīng)元祖細(xì)胞遷移到嗅球，之后分化為成熟的神經(jīng)元。這些數(shù)據(jù)和觀察到的嗅覺的記憶通過cGMP濃度調(diào)節(jié)這一現(xiàn)象是一致的。神經(jīng)元cGMP水平參與軸突和樹突導(dǎo)向的調(diào)節(jié)。通過信號(hào)增加胞內(nèi)cGMP可將軸突和樹突導(dǎo)向從相斥轉(zhuǎn)為相吸。此外，cGMP可增加海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物和PC12細(xì)胞的神經(jīng)突起。而且，老齡大鼠cGMP基線水平降低，這是由于和成年大腦比較老齡大腦中的磷酸二酯酶更加活躍地降解cGMP。老齡大腦中NO和cGMP合成降低對(duì)學(xué)習(xí)和記憶有重要影響。神經(jīng)發(fā)生可以改善功能。例如，齒狀回神經(jīng)發(fā)生更頻繁的小鼠在海馬依賴性試驗(yàn)中表現(xiàn)更出色，而在這些試驗(yàn)中神經(jīng)發(fā)生降低伴隨相應(yīng)的損傷。因此，Sildenafil治療后的神經(jīng)發(fā)生的增加對(duì)功能的改善有作用。總之，本研究結(jié)果表明中風(fēng)后Sildenafil給藥促進(jìn)大鼠的功能恢復(fù)，增強(qiáng)神經(jīng)發(fā)生。
圖7顯示用Sildenafil治處理非缺血大鼠(n＝6)后小腦(圖7A)和皮層(圖7B)的cGMP水平，對(duì)照組n＝10。
表4動(dòng)物體重減輕

數(shù)值表示均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
★P＜0.05，P＜0.01vs對(duì)照組。
表5 梗塞體積組梗塞體積％Sildenafil 2mg/kg，2h 35.2±3.3Sildenafil 5mg/kg，2h 37.7±4.3Sildenafil 2mg/kg，24h35.5±0.9對(duì)照 38.3±1.7梗塞體積是以相對(duì)于對(duì)側(cè)腦半球的受損百分?jǐn)?shù)表示(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。
實(shí)施例3雄性Wistar大鼠(n＝32)進(jìn)行大腦中動(dòng)脈阻塞手術(shù)(MCAo)，然后隨機(jī)分成4個(gè)處理組，每組8只，處理在中風(fēng)1天后進(jìn)行。處理組包括1)生理鹽水磷酸緩沖液(PBS)；2)亞治療的DETANONOate(NN)，劑量0.4毫克/千克(ip)；3)亞治療的hMSCs(1×106細(xì)胞，iv)；4)亞治療的NN和hMSCs聯(lián)合用藥。功能結(jié)果測定包括神經(jīng)學(xué)嚴(yán)格尺度(Neurologic Severity Scale，18點(diǎn)尺度)(NSS)和中風(fēng)前，治療前，治療后7和14天的的粘性去除試驗(yàn)。治療前組間數(shù)據(jù)很平衡(p＞0.30)。hMSC和NONO的相互作用可在14天觀察到(p＞0.86)。然而在14天hMSC對(duì)NSS有一綜合效應(yīng)。用hMSC，NONO聯(lián)合治療的大鼠和對(duì)照組比較在14天NSS有顯著(p＝0.01)改善，而和對(duì)照組大鼠比較，在14天hMSC低劑量組中的大鼠NSS的改善并不明顯(p＝0.05)。在14天，對(duì)照組和NONO組間(p＝0.64)，hMSC和hMSC+NONO組間(p＝0.48)均無顯著差異。相同的處理效應(yīng)在14天的粘性去除試驗(yàn)也可觀察到，hMSC+NONO組大鼠和對(duì)照組比較有顯著(p＝0.01)改善。和對(duì)照比較，在14天hMSC低劑量組(如亞治療量)和NONO亞治療量組均無明顯改善，p值分別為0.06和0.64。在7天，和對(duì)照組比較，神經(jīng)功能NSS的改善僅在hMSC和NONO聯(lián)合用藥組觀察到(p＝0.03)。這些數(shù)據(jù)表明和PBS對(duì)照組比較亞治療量的hMSC和NO供體(DETA-NONOate)聯(lián)合用藥顯著改善了功能結(jié)果。
缺血大腦的梗塞體積和MSCs和MCAo大鼠PBS(34.9±7.4％)對(duì)照組比較，hMSC(30.7±6.2％)組或NONOate(32.2±6.2％)組和hMSCs和NONOate(28.7±6.7％)聯(lián)合用藥組大鼠的缺血損傷體積都沒有顯著降低。HMSCs用人染色體特異性抗體(MAB1281)經(jīng)免疫組化鑒定。腦組織中的hMSCs衍生細(xì)胞用MAB1281染色鑒定。在非hMSCs處理大鼠中未發(fā)現(xiàn)MAB1281陽性細(xì)胞。經(jīng)MAB1281鑒定的MSCs存貨并在受體大鼠的整個(gè)受損腦部都有分布。在多個(gè)區(qū)域都可觀察到MAB1281陽性細(xì)胞，包括同側(cè)腦半球的皮層和紋狀體，大部分MAB1281陽性hMSCs位于缺血邊界區(qū)。對(duì)側(cè)腦半球則極少分布。HMSC和聯(lián)合用藥組在MAB1281細(xì)胞數(shù)增加上無顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明大腦梗塞體積并不受聯(lián)合治療的影響，進(jìn)入大腦的MSCs細(xì)胞數(shù)也沒有因?yàn)镹O的聯(lián)合給藥而發(fā)生變化。
神經(jīng)發(fā)生各組接收處理后連續(xù)14天注射BrdU(50毫克/千克，ip)。BrdU是胸腺嘧啶類似物標(biāo)記新合成的DNA從而鑒定新生細(xì)胞。圖9顯示和PBS對(duì)照組(圖9a，29.8±8.8/切片)比較，hMSC(2b，40.6±10.7)或/和NONOate(圖9c，43.6±10.0/切片；圖9d，67.4±22.8/切片)處理組與PBS對(duì)照組相比(圖9a，29.8±8.8/切片)(p＜0.05)。巨噬樣細(xì)胞胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的BrdU不計(jì)數(shù)。復(fù)染顯示BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記NeuN，神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)和星形細(xì)胞標(biāo)記GFAP。BrdU活性細(xì)胞表達(dá)NeuN，NSE和GFAP百分率分別約為3％，3％，6％。這些數(shù)據(jù)表明單獨(dú)的亞治療量NO供體和MSC治療和PSC對(duì)照組處理動(dòng)物比較并沒有顯著增加神經(jīng)發(fā)生，而聯(lián)合治療顯著促進(jìn)了缺血大腦的神經(jīng)發(fā)生。
血管發(fā)生擴(kuò)張的薄壁血管稱為母血管，在大腦缺血時(shí)的血管發(fā)生中發(fā)現(xiàn)。圖10顯示和MCAo對(duì)照組比較hMSCs處理組和NONOate處理組的同側(cè)腦半球的擴(kuò)張血管在BrdU免疫活性內(nèi)皮細(xì)胞(圖10a)數(shù)量上有顯著增加(p＜0.05)。和hMSCs或NONOate單獨(dú)處理組比較，亞治療量的hMSCs/NONOate聯(lián)合治療組的同側(cè)腦半球的BrdU活性內(nèi)皮細(xì)胞顯著增加(圖10b，p＜0.05)。這些數(shù)據(jù)表明NO供體和MSC聯(lián)合治療比單治療顯著增加了血管發(fā)生。
聯(lián)合治療后增強(qiáng)的血管發(fā)生在圖11中也有顯示，圖11是用1)PBS；2)NONOate；3)hMSCs；4)hMSCs+NONOate治療MCAo后，缺血邊緣血管的三維圖像。圖11A顯示FITC-右旋糖苷灌流的大腦微血管的原始復(fù)合圖像。圖11B和C是由計(jì)算機(jī)得到的從原始圖像衍生而來的三維圖像。圖11B中不同顏色代表不同血管，之間無連接。圖11C中的綠色和紅色分別標(biāo)志血管直徑小于7.5微米(紅色)和大于7.5微米(綠色)。三維定量數(shù)據(jù)顯示和對(duì)照MCAo大鼠比較，hMSCs和或不和NONOate聯(lián)合治療都顯著(p＜0.05)增加同側(cè)腦半球邊緣區(qū)的血管分支點(diǎn)數(shù)。和對(duì)側(cè)腦半球同源組織比較，hMSCs或/和NONOate處理組及PBS對(duì)照組同側(cè)腦半球的毛細(xì)管節(jié)段顯著短(p＜0.05)，表明中風(fēng)后在同側(cè)腦半球有新生血管。和對(duì)側(cè)腦半球同源區(qū)和對(duì)照MCAo動(dòng)物比較，hMSCs治療后的同側(cè)邊緣區(qū)血管直徑顯著增加(p＜0.05)。擴(kuò)張的血管在缺血后可發(fā)展成毛細(xì)管。和對(duì)照MCAo動(dòng)物比較，單用hMSC或hMSC與NONOate聯(lián)合治療的動(dòng)物的同側(cè)腦半球的血管表面積顯著增加(p＜0.05)。綜上，這些數(shù)據(jù)表明單用hMSC或hMSC與NONOate聯(lián)合治療增強(qiáng)了缺血大腦的血管發(fā)生。這些數(shù)據(jù)補(bǔ)充了BrdU血管發(fā)生的數(shù)據(jù)，表明聯(lián)合用藥促進(jìn)血管發(fā)生。
誘導(dǎo)血管發(fā)生的增強(qiáng)也可在體外大腦衍生內(nèi)皮細(xì)胞小管形成試驗(yàn)得到證實(shí)。圖12顯示和對(duì)照培養(yǎng)基比較(DMEM，圖12a)hMSC上清液(圖12b)和NONOate(圖12c)強(qiáng)烈誘導(dǎo)大腦衍生內(nèi)皮細(xì)胞形成內(nèi)皮小管。內(nèi)皮細(xì)胞有大量胞間接觸形成毛細(xì)管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。和對(duì)照培養(yǎng)基(DMEM，1.4±0.1毫米/平方毫米)比較，hMSCs(6.9±0.72毫米/平方毫米)培養(yǎng)物上清液和NONOate處理組(4.6±0.6毫米/平方毫米)中的小管總長度顯著增加(p＜0.01)。和NONOate比較，hMSCs培養(yǎng)物上清液的中的小管總長度顯著增加。這些數(shù)據(jù)顯示hMSCs和NONOate都促進(jìn)毛細(xì)管形成。
VEGF為進(jìn)一步研究誘導(dǎo)血管發(fā)生和神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制，聯(lián)合治療誘導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)和生長因子的表達(dá)這一現(xiàn)象被檢測。數(shù)據(jù)以MCAo動(dòng)物接受MSCs，DETANONOate，聯(lián)合(MSC+NONO)治療，對(duì)照PBS處理后大腦內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平表示。圖13顯示用三明治ELISA方法，和MCAo對(duì)照組比較，hMSCs和NONOate聯(lián)合處理組中的內(nèi)源性細(xì)胞分泌的VEGF(大鼠VEGF)顯著增加。在單hMSCs處理組中大鼠VEGF分泌僅有很少量增加。和MCAo對(duì)照組比較，單一劑量NONOate單處理組的VEGF無顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明亞治療量的MSC+NONO聯(lián)合治療比單治療顯著增強(qiáng)VEGF的分泌。
實(shí)施例4對(duì)正常非缺血?jiǎng)游镎T導(dǎo)細(xì)胞增殖給正常年輕成年大鼠NO供體給藥，在三個(gè)腦區(qū)齒狀回，嗅球(OB)和室下區(qū)(SVZ)檢測其對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的作用。選擇一種NO供體，DETANONOate，因?yàn)檫@種化合物是一種高效NO供體，在生理?xiàng)l件下半衰期57小時(shí)(Beckman，1995Estevez et al.，1998)。年輕雄性Wister大鼠(3-4月)在實(shí)驗(yàn)第一天接受連續(xù)4次靜脈注射DETANONOate(0.1毫克/千克，每15分鐘，總劑量0.4毫克/千克)然后連續(xù)六天腹腔注射DETANONOate(0.4毫克/千克)。對(duì)照組大鼠注射生理鹽水。BrdU作為有絲分裂標(biāo)記檢測細(xì)胞增殖。動(dòng)物從第一天實(shí)驗(yàn)起連續(xù)15天腹腔注射BrdU(50毫克/千克，Sigma)。在14天和42天將動(dòng)物處死。BrdU免疫活性細(xì)胞核在電腦顯示屏上計(jì)數(shù)并在1倍焦點(diǎn)平面上避免取樣過量。結(jié)構(gòu)通過對(duì)每個(gè)切片(OB)選擇設(shè)定區(qū)域或?qū)γ總€(gè)切片(SVZ和齒狀回)分析整個(gè)結(jié)構(gòu)取樣(Zhang et al.，2001)。這些區(qū)域內(nèi)所有BrdU免疫活性陽性細(xì)胞核數(shù)用BrdU免疫活性陽性細(xì)胞數(shù)/平方毫米表示。所選切片的密度取平均得到每個(gè)動(dòng)物的密度均值(Zhang et al.，2001)。
圖15顯示接受DETANONOate給藥的年輕成年大鼠腦內(nèi)細(xì)胞增殖。在齒狀回(圖15A)，SVZ(圖15B)和OB(圖15C)中觀察到BrdU活性細(xì)胞數(shù)顯著增加。齒狀回中大于95％的新生細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記NeuN和MAP2，表明這些細(xì)胞有整合到組織中的潛能。SVZ和OB中的細(xì)胞不能被雙標(biāo)記的免疫組織化學(xué)鑒定。但在形態(tài)上它們和增殖細(xì)胞相似。側(cè)室SVZ中的祖細(xì)胞遷移到嗅球(Alvarez-Buylla et al.，2000)。因此這些數(shù)據(jù)明確表明NO在發(fā)育大腦中和細(xì)胞增殖，遷移有關(guān)，在成年大腦中誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和遷移。在這些研究中僅細(xì)胞增殖在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組都測定，細(xì)胞增殖的行為和功能的影響未測定。但是，有數(shù)據(jù)支持齒狀回中的細(xì)胞增殖可以改善小鼠的學(xué)習(xí)(Gould和Gross，2002)。
年輕成年大鼠(3-4月)通過NO供體誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生，在老齡鼠中檢測這一現(xiàn)象是否存在。為驗(yàn)證這一假設(shè)，18個(gè)月雄性Wister大鼠接受DETANONOate處理，實(shí)驗(yàn)流程和年輕大鼠相同。圖16顯示三個(gè)腦區(qū)，齒狀回(圖16A)，SVZ(圖16B)，OB(圖16C)中的細(xì)胞增殖，描述方法同年輕鼠。和年輕大鼠一樣，DETANONOate顯著增加了增殖細(xì)胞數(shù)。生理鹽水處理組動(dòng)物，SVZ和齒狀回中的細(xì)胞增殖基線下降了約2個(gè)數(shù)量級(jí)。在老齡大鼠和年輕大鼠的SVZ和齒狀回中，DETANONOate增加細(xì)胞增殖的比率相近。老齡大鼠OB中增殖細(xì)胞數(shù)的相對(duì)增加沒有年輕大鼠幅度大。這可能因?yàn)楹湍贻p大鼠比較，老齡大鼠細(xì)胞喪失了遷移的潛能。
這些數(shù)據(jù)提供了新的重要的觀察結(jié)果。一個(gè)是細(xì)胞增殖在老齡動(dòng)物體內(nèi)可以像年輕動(dòng)物一樣被誘導(dǎo)，且增殖的百分?jǐn)?shù)也相似。然而，很明顯的，細(xì)胞增殖的絕對(duì)數(shù)量老齡大鼠比年輕大鼠降低了。老齡動(dòng)物細(xì)胞增殖的功能聯(lián)系未測定，因此我們沒有數(shù)據(jù)說明樞錐細(xì)胞增加是否可以改善功能。
NO供體增強(qiáng)中風(fēng)后的功能恢復(fù)已有數(shù)據(jù)顯示DETANONOate在非缺血年輕大鼠和內(nèi)陷中風(fēng)的年輕大鼠中誘導(dǎo)細(xì)胞增殖(Zhang et al.，2001)。中風(fēng)后一天開始治療可以得到顯著的功能效果。因此，數(shù)據(jù)顯示在動(dòng)物被誘導(dǎo)發(fā)生包括大腦中動(dòng)脈(MCA)的缺血中風(fēng)1天后給予可釋放NO的藥學(xué)試劑給藥，可以改善功能結(jié)果(Zhang et al.，2001)。
至于NO試劑誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生和功能改善的特異性，問題在于DETANONOate有特異性作用還是類似的可供給NO的其它試劑同樣有效，為檢測這個(gè)問題，大鼠用另一種NO供體，S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP，Sigma)處理，其結(jié)構(gòu)不同于DETANONOate。年輕雄性成年Wister大鼠接受內(nèi)陷MCA阻塞手術(shù)(Zhang et al.，1997)。內(nèi)陷MCA梗塞24小時(shí)后給大鼠靜脈注射SNAP，劑量30微克/千克，然后以300微克/千克/小時(shí)灌輸60分鐘。對(duì)功能結(jié)果測定，用轉(zhuǎn)圈試驗(yàn)評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)功能例如協(xié)調(diào)和平衡(Zhang et al.，2000)，粘性去除試驗(yàn)測定前肢體感運(yùn)動(dòng)不對(duì)稱性(Schallert et al.，2000)，治療前和治療后2，4，7和14天測體重。中風(fēng)14天后將動(dòng)物處死測梗塞體積(Zhang et al.，1997)。圖17顯示生理鹽水和SNAP處理組的梗塞體積和功能性結(jié)果測量值。對(duì)照組和非對(duì)照處理組(圖17A)間大腦梗塞體積無顯著差異。然而，中風(fēng)4天后轉(zhuǎn)圈試驗(yàn)(圖17B)和粘性去除試驗(yàn)(圖17C)的結(jié)構(gòu)有顯著改善，這些效果一直持續(xù)到中風(fēng)14天后動(dòng)物被處死。動(dòng)物體重(圖17D)，作為一般生理健康指標(biāo)，中風(fēng)7天后和生理鹽水對(duì)照組比較，顯著增加。這些數(shù)據(jù)明確表明NO供體如SNAP治療不影響大腦梗塞體積(圖17A)，對(duì)動(dòng)物功能改善有顯著的好處。因此，治療的作用是一種修復(fù)治療，而不是神經(jīng)保護(hù)治療。這些數(shù)據(jù)表明藥學(xué)試劑，如NO供體，可以增強(qiáng)中風(fēng)后的功能。這些動(dòng)物功能的改善和大腦的變化和重塑相關(guān)。神經(jīng)發(fā)生，細(xì)胞增殖以及血管發(fā)生和突觸蛋白水平提高是由NO供體分子誘導(dǎo)的。
NO是一種可溶性鳥苷酸環(huán)化酶激活劑，導(dǎo)致靶細(xì)胞內(nèi)cGMP增加(Ignarro，1989；Garthwaite和Boulton，1995)。cGMP和軸突延伸的變化以及神經(jīng)元連接的修飾相關(guān)(Williams et al.，1994)。cGMP可能在促進(jìn)大腦可塑性中起了重要作用。大鼠接受NO供體處理后大腦cGMP水平增加，表明NO供體進(jìn)入大腦(Zhang et al.，2001)。另一種誘導(dǎo)大腦cGMP增加的方法是抑制降解cGMP酶的活性。磷酸二酯酶5(PDE5)高度特異性水解cGMP(Corbin和Francis，1999；Kotera etal.，2000)。所以，一種在腦內(nèi)降低cGMP降解，因而提高cGMP水平的方法是降低或抑制PDE5。為測定PDE5抑制劑化合物給藥后的作用，在中風(fēng)發(fā)生24小時(shí)后連續(xù)7天給成年雄性大鼠喂服sildenafil(2毫克/千克)。圖18顯示大腦內(nèi)有PDE5存在。通過一個(gè)功能結(jié)果測定試驗(yàn)顯示，給動(dòng)物喂服Sildenafil顯著改善功能(Zhang et al.，2002)。此療效并不是通過降低大腦梗塞產(chǎn)生的，和其它NO供體相似。因此，這些數(shù)據(jù)顯示cGMP是中風(fēng)后重要的大腦可塑性調(diào)節(jié)因子。此可塑性也可改善功能反應(yīng)。
總體而言，這些數(shù)據(jù)表明影響NO和cGMP的試劑可以改變正常，老化的，損傷的大腦。不僅細(xì)胞增殖和血管發(fā)生增加了，而且能獲得顯著的功能療效。另外有基于細(xì)胞的方法誘導(dǎo)中風(fēng)和神經(jīng)損傷后大腦的重塑和功能的改善。有一種有臨床效果的方法，是采用細(xì)胞群，如骨髓基質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞注射嚙齒類動(dòng)物后進(jìn)入大腦，引起產(chǎn)生多種神經(jīng)營養(yǎng)因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而重塑大腦，產(chǎn)生顯著的功能效果(Review，Chopp和Li.，2002)。
圖15包括柱狀圖，顯示非缺血年輕成年大鼠在接受DETANONOate或生理鹽水處理后14和42天，齒狀回(圖15A)，室下區(qū)(圖15B)，嗅球(圖15C)中的BrdU免疫活性細(xì)胞數(shù)。*p＜0.05和**p＜0.01vs生理鹽水處理組。
圖16包括柱狀圖，顯示非缺血老齡大鼠在接受DETANONOate或生理鹽水處理后14和42天，齒狀回(圖16A)，室下區(qū)(圖16B)，嗅球(圖16C)中的BrdU免疫活性細(xì)胞數(shù)。*p＜0.05和**p＜0.01vs生理鹽水處理組。
圖17顯示SNAP處理對(duì)梗塞體積(圖17A)，轉(zhuǎn)圈試驗(yàn)(圖17B)，粘性去除試驗(yàn)(圖17C)和體重(圖17D)的影響。*p＜0.05和**p＜0.01vs生理鹽水處理組。n＝8每組。
圖18顯示非缺血大鼠皮層(圖18A和18B中的N)和大鼠缺血后2小時(shí)-7天同側(cè)皮層中PDE5A1(圖18A)和PDE5A2(圖18B)mRNA的RT-PCR結(jié)果。M＝標(biāo)記物，N＝非缺血大鼠，2小時(shí)，4小時(shí)，1天，2天和7天＝缺血后時(shí)間。
結(jié)論基于NO和cGMP的藥物治療誘導(dǎo)大腦的變化，促進(jìn)中風(fēng)后功能的恢復(fù)，誘導(dǎo)正常年輕和老齡動(dòng)物細(xì)胞增殖和神經(jīng)發(fā)生。這些數(shù)據(jù)，和其它對(duì)于細(xì)胞治療促進(jìn)大腦可塑性的研究，為治療神經(jīng)退化疾病和神經(jīng)損傷開創(chuàng)了新的機(jī)遇。
在本申請(qǐng)的全文中，對(duì)各種不同公開文獻(xiàn)，包括美國專利，的作者、年份，專利號(hào)都注明資料來源。公開文獻(xiàn)的全部引證列于下面。這些公開文獻(xiàn)和專利的公布在這里通過參考文獻(xiàn)全部包括在本申請(qǐng)內(nèi)，為了更充分地描述與本發(fā)明有關(guān)的技術(shù)情況。
本發(fā)明已以解說性的方式進(jìn)行了描述，并可理解已用的術(shù)語是有意的寧可保持說明字的本意而不限制。
顯而易見，本發(fā)明的許多改進(jìn)和變化是可能借助于上面的教導(dǎo)。因此可以理解在本發(fā)明描述的范圍內(nèi)，除特別的描述之外本發(fā)明都可能實(shí)施。
參考文獻(xiàn)Burke and Olson，“酵母人工染色體載體克隆文庫的制備”，Methods inEnzymology，Vol.194，“酵母遺傳和分子生物學(xué)指南”，編輯C.Guthrieand G.Fink，Academic Press，Inc.，第17章，pp.251-270(1991)。
Capecchi，“同源重組改變基因組”Science2441288-1292(1989)。
Davies et al.，“酵母人工染色體定向改變用于品系內(nèi)基因轉(zhuǎn)移”，NucleicAcids Research，Vol.20，No.11，pp.2693-2698(1992)。
Dickinson et al.，“用插入型載體進(jìn)行高頻基因定向”，Human MolecularGenetics，Vol.2，No.8，pp.1299-1302(1993)。
Duff and Lincoln，“含人APP基因的酵母人工染色體治病突變插入及在ES細(xì)胞中的表達(dá)”Research Advances in Alzheimer’s Disease andRelated Disorders，1995。
Huxiey et al.，“酵母人工染色體通過細(xì)胞融合轉(zhuǎn)移到小鼠細(xì)胞后其中的人HPRT基因有功能”，Genomics，9742-750(1991)。
Jakobovits et al.，“人源酵母人工染色體的種系傳遞和表達(dá)”，Nature，Vol.362，pp.255-261(1993)。
Lamb et al.，“400kb淀粉樣蛋白前體基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)”，Nature Genetics，Vol.5，pp.22-29(1993)。
Pearson and Choi“酵母人工染色體獲得的人b-淀粉樣蛋白前體基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá)”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993.9010578-82。
Rothstein，“定向，破裂，替代和等位補(bǔ)救酵母中整合DNA轉(zhuǎn)化”Methods in Enzymology，Vol，194，“酵母遺傳和分子生物學(xué)指南”，編輯C.Guthrie and G.Fink，Academic Press，Inc.，第19章，pp.281-301(1991)。
Schedl et al.，含酪氨酸酶基因的酵母人工染色體在轉(zhuǎn)基因小鼠體中拷貝數(shù)依賴性表達(dá)”，Nature，Vol.362，pp.258-261(1993)。
Stauss et al.，“含鼠a1(1)膠原蛋白基因座的酵母人工染色體的種系傳遞”，Science，Vol，259，pp.1904-1907(1993)。
Gilboa，E，Eglitis，MA，Kantoff，PW，Anderson，WF；“逆轉(zhuǎn)錄病毒載體克隆基因的轉(zhuǎn)化和表達(dá)”.BioTechniques4(6)504-512，1986。
Cregg JM，Vedvick TS，Raschke WC“外源基因在Pichia pastoris中表達(dá)的最新進(jìn)展”，Bio/Technology11905-910，1993。
Culver，1998.“人ADA基因的位點(diǎn)重組修復(fù)突變”(摘要)AntisenseDNA & RNA based therapeutics，F(xiàn)ebruary，1998，Coronado，CA。
Huston et al，1991“單鏈Fv類似物和融合蛋白的蛋白質(zhì)工程”Methodsin Enzymology(JJ Langone，編輯；Academic Press，New York，NY)20346-88。
Johnson and Birs，1991“大腸桿菌中單抗單鏈Fvb衍生物的構(gòu)建及其生產(chǎn)”Methods in Enzymology(JJ Langone，編輯；Academic Press，NewYork，NY)20388-99。
Mernaugh and Mernaugh，1995“噬菌體展示重組抗體概述”MolecularMethode in Plant Pathology(RP Singh and US Singh，編輯；CRC PressInc.，Boca Raton，F(xiàn)L)pp.359-365。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的方法，包括以下步驟，給需要促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的病人給予治療量的磷酸二酯酶抑制劑化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括給予病人的細(xì)胞治療。
3.一種促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的化合物，包含足以促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的有效量的磷酸二酯酶抑制劑。
4.如權(quán)利要求3所述的化合物，進(jìn)一步包括病人的細(xì)胞治療。
5.一種神經(jīng)發(fā)生促進(jìn)劑，包括帶有藥用載體的磷酸二酯酶抑制劑。
6.如權(quán)利要求5所述的神經(jīng)發(fā)生促進(jìn)劑，其中，所述磷酸二酯酶抑制劑增大組織中的氧化氮。
7.如權(quán)利要求6所述的神經(jīng)發(fā)生促進(jìn)劑，其中，所述磷酸二酯酶抑制劑是sildenafil。
8.一種增大神經(jīng)元產(chǎn)生的方法，通過在需要增大的位點(diǎn)給予有效量的磷酸二酯酶抑制劑。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括位點(diǎn)的細(xì)胞治療。
10.一種增加神經(jīng)功能的方法，通過給予病人有效量的磷酸二酯酶抑制劑。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，進(jìn)一步包括給予病人的細(xì)胞治療。
12.一種增加認(rèn)知和神經(jīng)功能的方法，通過給予病人有效量的磷酸二酯酶抑制劑化合物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，進(jìn)一步包括給予病人的細(xì)胞治療。
全文摘要
一種促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的方法，通過給予需要促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的病人治療量的磷酸二酯酶抑制劑化合物。一種用于神經(jīng)發(fā)生的化合物，含有足以促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的有效量的磷酸二酯酶抑制劑。一種促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的磷酸二酯酶抑制劑。一種增大腦細(xì)胞生成和促進(jìn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及受體改變的方法，通過在需要增大的位點(diǎn)給予有效量的磷酸二酯酶抑制劑化合物。一種提高神經(jīng)功能和認(rèn)知功能的方法，通過給予病人有效量的磷酸二酯酶抑制劑。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1638775SQ03804881
公開日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月4日
發(fā)明者邁克爾·喬普 申請(qǐng)人:亨利福爾德健康組織