專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)菌芽胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在誘發(fā)免疫應(yīng)答中芽胞的應(yīng)用、誘發(fā)所述免疫應(yīng)答的方法、以及制備所述芽胞的方法。
感染是導(dǎo)致人群死亡的首要原因。在過(guò)去100年中，環(huán)境衛(wèi)生及接種疫苗對(duì)人類(lèi)健康做出了最重要的貢獻(xiàn)，它們的存在顯著地減少了因感染性疾病而導(dǎo)致的死亡。
不斷改進(jìn)的接種疫苗策略一直起著至關(guān)重要的作用，這主要基于以下幾個(gè)原因。
首先，可以提供更佳水平的免疫性，從而對(duì)抗主要是通過(guò)粘膜表面而進(jìn)入體內(nèi)的病原體。疫苗一般是雙親給予。然而，許多疾病利用胃腸(GI)道作為主要入口。因而，霍亂和傷寒是通過(guò)攝入病原體傷寒沙門(mén)菌(Salmonella typhi)和霍亂弧菌(Vibrio cholera)并其后在(霍亂弧菌)移殖或穿過(guò)粘膜上皮易位(傷寒沙門(mén)菌S.typhi)(嵌入胃腸道)所引起。類(lèi)似地，TB起初是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculi)對(duì)肺的感染所引起。經(jīng)注射的免疫法產(chǎn)生血清應(yīng)答(體液免疫)，其包括主要的IgG應(yīng)答，而IgG應(yīng)答在預(yù)防感染時(shí)是較少有效的。這是為何許多疫苗部分有效或給出較短保護(hù)時(shí)間的一個(gè)原因。
第二，提供無(wú)針的給藥途徑。目前接種疫苗程序的一個(gè)主要問(wèn)題是至少需要一次注射(例如，破傷風(fēng)疫苗)。雖然保護(hù)持續(xù)10年，但兒童起初要通過(guò)注射給予3個(gè)劑量，然后每5年要給予加強(qiáng)劑量。在發(fā)達(dá)國(guó)家許多人由于“害怕注射”將不選擇采用加強(qiáng)劑量。相反，發(fā)展中國(guó)家破傷風(fēng)死亡率較高，原因就在于使用了重復(fù)使用過(guò)的針頭或未經(jīng)消毒過(guò)的針頭。
第三，安全性得到改善，副作用被降至最低。許多疫苗由活生物組成，其以某種方式被變得非致病的(被減弱)或被滅活。雖然在原理上，這被認(rèn)為是安全的，但有證據(jù)表明必須開(kāi)發(fā)更安全的方法。例如，在1949年(Kyoto事件)68個(gè)兒童因接受受污染的白喉疫苗而致死(Health 1996)。同樣，在1995年的Cutter事件中，105個(gè)兒童發(fā)生脊髓灰質(zhì)炎。研究發(fā)現(xiàn)，脊髓灰質(zhì)炎疫苗沒(méi)有用福爾馬林進(jìn)行正確滅活。許多其它疫苗，例如，MMR(麻疹-腮腺炎-風(fēng)疹)疫苗和百日咳疫苗(Health，1996)受副作用傳聞的影響。
第四，為發(fā)展中國(guó)家提供經(jīng)濟(jì)型疫苗，這些國(guó)家薄弱的儲(chǔ)運(yùn)設(shè)施有礙于免疫計(jì)劃的有效實(shí)施。在疫苗必須進(jìn)口的發(fā)展中國(guó)家，需要正確的保存和分配疫苗。對(duì)于發(fā)展中國(guó)家而言，用于在冷凍、適宜的衛(wèi)生條件下維護(hù)疫苗的相關(guān)費(fèi)用是相當(dāng)巨大的。對(duì)某些疫苗而言，如口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗和BCG疫苗，這些疫苗在2-8℃僅存活1年(Health，1996)?，F(xiàn)在對(duì)發(fā)展中國(guó)家來(lái)說(shuō)，對(duì)能夠在環(huán)境溫度下長(zhǎng)期存儲(chǔ)的強(qiáng)壯疫苗是首先要考慮的問(wèn)題。這類(lèi)疫苗應(yīng)該具備熱穩(wěn)定性，能夠耐受劇烈的溫度變化以及干燥的狀況。最后，一種易于生產(chǎn)的疫苗將會(huì)為發(fā)展中國(guó)家?guī)?lái)巨大的好處，并且應(yīng)該具有在該國(guó)生產(chǎn)的潛力。
人們已尋求改善這些問(wèn)題的方法。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種用遺傳密碼進(jìn)行遺傳修飾的芽胞，包括至少一種編碼抗原的遺傳結(jié)構(gòu)以及作為嵌合基因的芽胞外殼蛋白，所述遺傳修飾的芽胞具有所述抗原，其表達(dá)為具有所述芽胞外殼蛋白的融合蛋白。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，使用芽胞給予疫苗將消除對(duì)注射的需要以及在發(fā)展中國(guó)家與針有關(guān)的問(wèn)題。除此之外，芽胞是穩(wěn)定的并且耐熱和干燥，因而克服了在發(fā)展中國(guó)家存儲(chǔ)疫苗的問(wèn)題。芽胞易于生產(chǎn)，并可以低成本生產(chǎn)，這使根據(jù)本發(fā)明的疫苗的生產(chǎn)是經(jīng)濟(jì)的并且最后，作為非病原體以及其目前作為口服前生命期的(probiotic)的應(yīng)用，枯草桿菌(Bacillus subtilis)的使用使得其成為比那些目前可獲得的疫苗系統(tǒng)更安全的疫苗系統(tǒng)。
本發(fā)明的另外的優(yōu)點(diǎn)在于，芽胞在粘膜表面誘發(fā)免疫應(yīng)答。這使該接種疫苗對(duì)抗粘膜病原體更有效，例如，傷寒沙門(mén)菌、霍亂弧菌、以及結(jié)核分枝桿菌。
在粘膜表面釋放的疫苗在對(duì)抗那些經(jīng)粘膜途徑感染的疾病時(shí)將更有效。疫苗給予的粘膜途徑可以包括口服、鼻內(nèi)途徑和/或直腸途徑。
優(yōu)選地，芽胞是芽胞桿菌屬(Bacillus species)。
優(yōu)選地，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞是芽胞桿菌屬。
遺傳密碼包括DNA或cDNA。應(yīng)當(dāng)知道，術(shù)語(yǔ)“遺傳密碼”包括密碼子使用的簡(jiǎn)并性。
優(yōu)選地，遺傳結(jié)構(gòu)包括至少部分芽胞外殼蛋白基因和至少部分抗原基因，以嵌合基因的形式。
優(yōu)選地，抗原基因位于芽胞外殼蛋白基因的3′端?？商鎿Q地，該抗原基因可位于芽胞外殼蛋白基因的5′端或在芽胞外殼蛋白基因的內(nèi)部。
優(yōu)選地，遺傳結(jié)構(gòu)包括在嵌合基因的5′端的芽胞外被啟動(dòng)基因(啟動(dòng)子)。
該遺傳結(jié)構(gòu)包括質(zhì)?；蚱渌d體，其中嵌合基因是位于由至少部分amyE基因位于側(cè)面的多克隆位點(diǎn)。可替換地，該遺傳結(jié)構(gòu)可包括質(zhì)?；蚱渌d體，其中嵌合基因是位于由至少部分thrC基因位于側(cè)面的多克隆位點(diǎn)。應(yīng)當(dāng)明白，本發(fā)明并不限于在amyE基因和thrC基因中插入。插入任何基因是容許的，只要生物的生長(zhǎng)和芽胞形成不受損害，即，插入就其功能作用而言是多余的。
優(yōu)選地，該遺傳結(jié)構(gòu)是用來(lái)通過(guò)雙交換重組轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)母細(xì)胞?？商鎿Q地，該遺傳結(jié)構(gòu)可以是整合載體，例如p JH101，其用來(lái)通過(guò)單交換重組轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)母細(xì)胞。
抗原優(yōu)選為至少破傷風(fēng)毒素片段C或不穩(wěn)定毒素B亞單位之一?？商鎿Q地，該抗原可以是任何抗原，其適合用于誘發(fā)免疫應(yīng)答。
芽胞外殼蛋白優(yōu)選為cotB?？商鎿Q地，該芽胞外殼蛋白是選自由cotA、cotC、cotD、cotE、以及cotF組成的組?？商鎿Q地，該芽胞外殼蛋白是選自由cotG、cotH、cotJA、cotJC、cotM、cotSA、cotS、cotT、cotV、cotW、cotX、cotY、以及cotZ組成的組。
芽胞可以通過(guò)口服或鼻內(nèi)或直腸途徑給予。芽胞可以利用所述口服或鼻內(nèi)或直腸途徑的一種或多種給予。
芽胞的口服給予可以適當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)片劑、膠囊劑、或液體混懸劑或乳劑?？商鎿Q地，這些芽胞可以借助于Dischaler或Turbohaler、以細(xì)散劑或氣霧劑的形式給予。
鼻內(nèi)給予可以適當(dāng)?shù)匾约?xì)散劑或鼻噴霧劑或改進(jìn)的Dischaler或Turbohaler的形式。
直腸給予可以適當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)栓劑。
根據(jù)本發(fā)明的芽胞在給予之前被熱滅活，以致它們不會(huì)發(fā)芽進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。
根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的芽胞，用作活性藥物組合物。
根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供了至少兩種不同的遺傳修飾的芽胞，每種修飾的芽胞表達(dá)至少一種不同的抗原，根據(jù)本發(fā)明用作活性藥物組合物。
根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供制備遺傳修飾的芽胞的方法，該方法包括以下步驟制備遺傳密碼，包括至少一種編碼抗原的遺傳結(jié)構(gòu)和作為嵌合基因的芽胞外殼蛋白；利用所述至少一種遺傳結(jié)構(gòu)來(lái)轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)母細(xì)胞；誘導(dǎo)所述轉(zhuǎn)化的母細(xì)胞以形成芽胞；分離生成的遺傳修飾的芽胞。
這些芽胞在給予之前被熱滅活，以致它們不會(huì)發(fā)芽進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。
根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供了一種組合物，包括根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的芽胞，該芽胞與藥用賦形劑或載體結(jié)合。
適當(dāng)?shù)乃幱幂d體對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的并且取決于藥物組合物是否用于口服、直腸或鼻給藥。
根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的芽胞，用于內(nèi)科治療的方法。
根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的芽胞，用于制備藥劑、以及用于內(nèi)科治療的方法。
內(nèi)科治療的方法優(yōu)選為通過(guò)給予疫苗使人或動(dòng)物對(duì)疾病具有免疫力。
根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供一種內(nèi)科治療的方法，該方法包括以下步驟對(duì)需要內(nèi)科治療的人或動(dòng)物，口服或鼻內(nèi)或直腸給予根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的芽胞；所述遺傳修飾的芽胞誘發(fā)免疫應(yīng)答，用于預(yù)防疾病。
本發(fā)明將僅用實(shí)施例的方法進(jìn)行描述，并參照附圖，其中

圖1顯示通過(guò)免疫熒光檢測(cè)CotB和TTFC的存在?？莶輻U菌株的芽胞形成是通過(guò)重懸浮法進(jìn)行誘導(dǎo)(1)，并在芽胞形成開(kāi)始后5小時(shí)取樣。樣品用兔抗CotB和小鼠抗TTFC抗血清、接著用抗兔IgG-FITC(綠色熒光素，A和C組)和抗小鼠IgG-TRITC(紅色熒光素，B和D組)結(jié)合物進(jìn)行標(biāo)記。A和B組，PY79(野生型)；C和D組，RH103(CotB-TTFC表達(dá)株)。
圖2顯示粘膜免疫后的系統(tǒng)應(yīng)答。在用表達(dá)CotB-TTFC的重組枯草桿菌芽胞口服(A組)或鼻內(nèi)(B組)免疫以后，血清抗TTFC特異IgG應(yīng)答。7只小鼠為一組用表達(dá)CotB-TTFC的芽胞(RH103；●)或非重組芽胞(PY79；○)進(jìn)行口服或鼻內(nèi)免疫(↑)。1.67×1010芽胞的劑量用于每個(gè)口服劑量而1.1×109芽胞的劑量用于鼻內(nèi)途徑，并且通過(guò)ELISA對(duì)來(lái)自各組的單個(gè)血清樣品測(cè)定TTFC特異性IgG。對(duì)來(lái)自自然對(duì)照組(△)和用4mg/劑量的提純TTFC蛋白口服免疫組(◇)的血清也進(jìn)行了測(cè)定。數(shù)據(jù)表示為算術(shù)平均值而誤差線(xiàn)條是標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖3顯示抗體同種型(isotype)分布圖。用表達(dá)CotB-TTFC(RH103)的重組芽胞或非重組(PY79)枯草桿菌芽胞口服免疫后54天或鼻內(nèi)免疫后48天的抗TTFC抗體同種型分布圖，如在圖2A和圖2B的圖例中所描述的。TTFC特異性IgG1、IG2a、IgG2b、IgG3、IgM、以及IgA同種型是通過(guò)間接ELISA進(jìn)行測(cè)定。還測(cè)定了來(lái)自自然對(duì)照組的血清。終點(diǎn)滴度計(jì)算為血清的稀釋度，其和1/40稀釋度的混合預(yù)先免疫血清產(chǎn)生相同的光密度。數(shù)據(jù)表示為算術(shù)平均值而誤差線(xiàn)條是標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖4顯示TTFC特異性排泄物IgA應(yīng)答。7只小鼠為一組用表達(dá)CotBTTFC的重組芽胞(RH103)或非重組芽胞(PY79)進(jìn)行口服免疫(A組)或鼻內(nèi)免疫(B組)，如分別在圖2A和圖2B的圖例中所描述的。新鮮排泄物顆粒收集自這些經(jīng)免疫的小鼠以及自然 組，然后測(cè)定TTFC特異性IgA的存在，如在實(shí)施例2的材料和方法部分所描述的。終點(diǎn)滴度計(jì)算為排泄物提取物的稀釋度，其和未稀釋的預(yù)先免疫排泄物提取物產(chǎn)生相同的光密度。數(shù)據(jù)表示為算術(shù)平均值而誤差線(xiàn)條是標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖5顯示抗芽胞血清IgG和粘膜IgA應(yīng)答。7只小鼠為一組用表達(dá)CotB-TTFC的重組芽胞(●)或非重組芽胞(○)通過(guò)口服(A和B組)或鼻內(nèi)途徑(C和D組)進(jìn)行免疫(↑)，如在圖2的圖例中所描述的。通過(guò)間接ELISA對(duì)各個(gè)樣品測(cè)定枯草桿菌芽胞外被特異性血清IgG(A和C組)或芽胞外被特異性排泄物IgA(B和D組)。還測(cè)定了來(lái)自自然組(△)的血清。終點(diǎn)IgG滴度計(jì)算為血清的稀釋度，其和1/40稀釋度的混合預(yù)先免疫血清產(chǎn)生相同的光密度。終點(diǎn)IgA滴度計(jì)算為排泄物提取物的稀釋度，其和未稀釋的預(yù)先免疫排泄物提取物產(chǎn)生相同的光密度。數(shù)據(jù)表示為算術(shù)平均值而誤差線(xiàn)條是標(biāo)準(zhǔn)偏差。
現(xiàn)參照下述非限制性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。
實(shí)施例1構(gòu)造了嵌合基因，其中TTFC或LTB基因序列在框架內(nèi)(inframe)被融合到特異性cot基因。然后將這些結(jié)構(gòu)引入枯草桿菌的染色體。然后證實(shí)嵌合基因的表達(dá)并利用近親交配小鼠(黑色C57近親交配)進(jìn)行免疫。然后測(cè)定免疫應(yīng)答。除非另有說(shuō)明，cot基因指cotA、cotB、cotC、cotD、cotE、以及cotF。
表1重組嵌合基因
1放置在amyE基因座(部位)2放置在thrC基因座a)嵌合基因的構(gòu)造PCR(聚合酶鏈反應(yīng))被用來(lái)擴(kuò)增特異性cot基因以使擴(kuò)增cot基因序列的3′端可以融合到攜帶TTFC或LTB的5′端的類(lèi)似PCR產(chǎn)物的5′端。通過(guò)限制性消化PCR產(chǎn)物獲得了連接PCR產(chǎn)物。這是通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中利用攜帶包埋的限制部位的引物。合適的克隆載體(見(jiàn)下文)用識(shí)別cot基因的5′端和抗原基因的3′端的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行限制酶切(切割)。切割的PCR產(chǎn)物連接于切割的載體而重組體則利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行確定。
(在該方法中，cot基因在5′端攜帶其自身的啟動(dòng)基因序列是必需的。)b)用于染色體插入的載體載體pDG364的主要特點(diǎn)是amyE基因的右和左旁側(cè)臂(稱(chēng)作amyE前部和amyE后部)?？寺〉腄NA(即，cot抗原嵌合體)利用一般的PCR技術(shù)被引入多克隆位點(diǎn)，然后證實(shí)該克隆，而選擇的質(zhì)?？寺∮米R(shí)別有關(guān)主鏈序列(例如，PstI)的酶通過(guò)消化作用進(jìn)行直線(xiàn)化。直線(xiàn)化的DNA現(xiàn)用來(lái)轉(zhuǎn)化枯草桿菌的反應(yīng)潛能細(xì)胞。通過(guò)利用質(zhì)粒(氯霉素耐藥性)攜帶的抗生素抗性基因來(lái)選擇轉(zhuǎn)化體。直線(xiàn)化的質(zhì)粒將僅通過(guò)雙交換重組事件進(jìn)行整合，其中利用amyE的前和后旁側(cè)臂用于重組。在該過(guò)程中，克隆的DNA被引入amyE基因而amyE基因在該過(guò)程中被滅活。這種程序?qū)?duì)染色體的損傷降至最低程度并且不會(huì)損害細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、或芽胞形成。因?yàn)椴迦氲幕蚯逗象w是在染色體中的amyE基因座，所以該基因是處于正常cot基因座的反式。例如，當(dāng)cotA基因被融合到TTFC并被引入amyE基因座時(shí)，在染色體的別處也存在正常cotA基因。因而，細(xì)胞現(xiàn)在是部分二倍體，它攜帶一個(gè)正常cotA基因和一個(gè)嵌合基因。
除pDG364之外，另一個(gè)合適的載體是pDG1664。該載體幾乎相同于pDG364，但在下述方面不同i)它攜帶紅霉素耐藥性基因erm。這使得可以利用紅霉素而不是氯霉素來(lái)選擇轉(zhuǎn)化的枯草桿菌細(xì)胞，以及
ii)它攜帶thrC基因的前和后部分而不是amyE基因的前和后部分。thrC是多余的。
克隆的最后途徑是利用整合載體。存在許多這樣的載體，但pSGMU2或pJH101是優(yōu)選的。在此方法中，克隆中的cot基因和固有的染色體cot基因可借助于共有的同源性將cot抗原嵌合體引入染色體。在單交換重組以后，帶有cot抗原嵌合體的整個(gè)質(zhì)粒在cot基因的染色體位置被引入染色體。因而，在這情況下，固有的cot基因被修飾。這與pDG364/pDG1664載體相反，其是放置在別處并且不會(huì)修飾固有的cot基因。
c)多抗原呈遞為了在芽胞外被上實(shí)現(xiàn)多抗原呈遞，必需使用兩種不同的質(zhì)粒載體，例如pDG364和pDG1664。一個(gè)嵌合基因形成在pDG364中并且該嵌合體在amyE基因座被引入而第二個(gè)嵌合體形成在pDG1664中并且在thrC基因座被引入。在這種情況下，每個(gè)轉(zhuǎn)化事件需要單獨(dú)的抗生素抗性選擇。應(yīng)當(dāng)知道，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何有關(guān)技術(shù)都可以用來(lái)在芽胞外被上產(chǎn)生多抗原呈遞。
d)菌株的證實(shí)已證實(shí)攜帶示于表1的嵌合體的同基因株可以表達(dá)外來(lái)抗原。特別地，利用已建立的程序，菌株獲得生長(zhǎng)并被誘導(dǎo)從而形成芽胞。在誘導(dǎo)芽胞形成以后約20-24小時(shí)收獲芽胞并利用SDS-DTT提取法或NaOH提取法回收總的芽胞外殼蛋白。使用抗TTFC或抗LTB抗體的蛋白質(zhì)印跡被用來(lái)證明外來(lái)抗原的存在。在cotE和cotF嵌合體中蛋白質(zhì)的水平通常較低。該證實(shí)證明，這些抗原不易發(fā)生偶然的蛋白水解或降解。
TTFC可以在thrC基因座表達(dá)而來(lái)自amyE基因座的LTB具有相同水平的基因表達(dá)。
菌株的最后證實(shí)涉及確定芽胞的抗性性能是否以任何方式受到影響。制備了各個(gè)菌株的芽胞懸浮液(示于表1)。這些芽胞懸浮液在80℃加熱30分鐘并顯示出在熱處理前后攜帶大約相同數(shù)目的活芽胞單位。外來(lái)抗原的表達(dá)對(duì)芽胞抗性性能沒(méi)有影響。
e)腹膜內(nèi)免疫從每個(gè)示于表1的重組菌株制備芽胞并且通過(guò)重復(fù)洗滌提純懸浮液以除去污染的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。然后這些懸浮液在65℃熱處理以滅活任何殘余的營(yíng)養(yǎng)(未形成芽胞的細(xì)胞)，接著用來(lái)通過(guò)腹膜內(nèi)途徑配藥給小鼠，劑量為1×109芽胞/ml，時(shí)間為0、14、和28天。其后取血清樣品并通過(guò)ELISA確定抗體滴度。與自然小鼠或用非重組芽胞免疫的小鼠相比，所有結(jié)構(gòu)都給出較高水平的血清IgG。這些結(jié)果表明，TTFC和LTB嵌合體均是致免疫的且能夠誘發(fā)免疫應(yīng)答。
f)粘膜免疫性為了實(shí)現(xiàn)粘膜免疫性使用了兩種方法口服給藥和鼻內(nèi)給藥。對(duì)于口服給予表達(dá)TTFC融合蛋白的芽胞，在35天內(nèi)使用多劑量并通過(guò)胃內(nèi)灌服將1×1010芽胞/劑量給予黑色C57近親交配小鼠。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間取尾部流出血(tail bleeds)和排泄物樣品并分析尾部流出血中的血清IgG和排泄物樣品中的IgA。研究發(fā)現(xiàn)，具有高水平的抗TTFC IgG和IgA。已觀(guān)察到，在用表達(dá)LTB的芽胞(未示出)對(duì)小鼠口服免疫以后，具有類(lèi)似高水平的免疫性(IgG和IgA兩者)。
類(lèi)似地，用表達(dá)LTB的芽胞對(duì)小鼠的鼻內(nèi)給藥是利用1×109芽胞/劑量來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中利用微量取樣器來(lái)給予芽胞(20μl)，時(shí)間為0、14、和28天。產(chǎn)生了高水平的粘膜免疫性，這證明利用鼻內(nèi)遞藥途徑芽胞具有作為粘膜疫苗載體的潛力。我們已觀(guān)察到，在用表達(dá)TTFC的芽胞對(duì)小鼠鼻內(nèi)免疫以后，具有類(lèi)似高水平的免疫性(IgG和IgA兩者)。
利用表達(dá)TTFC和LTB兩者的芽胞，在口服和鼻內(nèi)免疫以后，我們能夠獲得類(lèi)似高水平的抗TTFC和抗LTB IgG和IgA。
g)劑量在試驗(yàn)研究中，我們知道，約1×109芽胞/劑量是口服免疫所需的芽胞的最小劑量而1×108芽胞/劑量是鼻內(nèi)免疫所需的芽胞的最小劑量。用其它的給藥方案(有許多)則可能使用更低的劑量。
根據(jù)本發(fā)明的芽胞可用于呈現(xiàn)任何生物活性分子。例如，用于工業(yè)應(yīng)用的酶。
任何芽胞形成物種可用于異源抗原呈遞。然而，其它芽胞形成微生物不可能攜帶芽胞外殼蛋白的相同補(bǔ)體。確實(shí)，一些芽胞樣板如芽胞桿菌仙人山屬(Bacillus cereus)可僅含有一種cat蛋白。然而，對(duì)我們收集的cotA、cotB、cotC、cotD、cotE、以及cotF使用抗血清，則可能識(shí)別來(lái)自芽胞樣板的外被的同源或交叉反應(yīng)外殼蛋白，然后通過(guò)反求遺傳學(xué)克隆這些基因。
根據(jù)本發(fā)明的芽胞也可以和佐劑一起使用。這些佐劑可以包括霍亂毒素、殼聚糖、或抑肽酶。
實(shí)施例2材料和方法芽胞的制備枯草桿菌(B.subtilis)株RH103(amyE∷cotB-tetC)和其同基因原種PY79一起被用于所有免疫作用(2)。RH103已在別處進(jìn)行描述(3)并且攜帶破傷風(fēng)毒素片段C(TTFC；47kDa)到外芽胞外殼蛋白CotB(59kDa)的C末端的融合。嵌合cotB-tetC基因被攜帶在枯草桿菌的amyE基因座并且因而處于內(nèi)源性cotB基因的反式。RH103或PY79的芽胞形成是在DSM(Difco芽胞形成培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中利用消耗法進(jìn)行，如在別處所述(1)。在開(kāi)始芽胞形成后22小時(shí)收獲芽胞形成培養(yǎng)物。芽胞的提純懸浮液如Nicholson和Setlow所述(1)進(jìn)行制備，其中利用溶菌酶處理以斷裂任何殘余的芽胞囊細(xì)胞，接著在1M NaCl、1M KCl和水(兩次)中洗滌。包括有PMSF以抑制蛋白水解。在最后懸浮在水中后，芽胞在68℃處理1小時(shí)以殺死任何殘余細(xì)胞。接著，在-20℃冷凍前立即滴定芽胞懸浮液的CFU/ml。利用該方法我們能夠可靠地在每升DSM培養(yǎng)物中產(chǎn)生6×1010芽胞。對(duì)于每批以這種方法制備的芽胞，檢測(cè)了在芽胞外殼蛋白的提取物中106kDa雜交CotB-TTFC蛋白的存在，該方法是借助于蛋白質(zhì)印跡并利用多克隆TTFC抗血清。
免疫熒光顯微鏡檢查通過(guò)重懸浮法(1)誘導(dǎo)枯草桿菌株(PY79，RH103)以形成芽胞。在開(kāi)始形成芽胞后的規(guī)定時(shí)間收集樣品并利用Harry等人描述的程序(4)(具有下述改進(jìn))直接固定在重懸浮介質(zhì)中。懸浮在GTE-溶菌酶(50mM葡萄糖，20mM Tris-HCl pH7.5，10mM EDTA，溶菌酶2mg/ml)之后，樣品(10μl)被立即施加于顯微鏡蓋玻片(BDH)，其已經(jīng)用0.01％(w/v)的多聚L-賴(lài)氨酸(Sigma)進(jìn)行處理。4分鐘后，從蓋玻片吸出該液體，然后允許其在室溫完全干燥2小時(shí)。蓋玻片在PBS pH7.4中洗滌3次，在室溫下用PBS中的2％的BSA阻斷15分鐘，然后再洗滌9次。在室溫下樣品用兔抗CotB和小鼠抗TTFC血清保溫45分鐘，洗滌3次，然后進(jìn)一步用抗兔IgG-FITC和抗小鼠IgG-TRITC結(jié)合物(Sigma)在室溫下保溫45分鐘。3次洗滌后，蓋玻片被固定于顯微鏡玻璃片并在NikonEclipse E600熒光顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。利用Nikon DMX1200數(shù)字?jǐn)z像機(jī)拍攝圖像，用Lucia GF軟件處理，并以TIFF格式保存。
TTFC蛋白重組TTFC是制備在來(lái)自pET28b表達(dá)載體(Novagen)的大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3 pLys)中，其攜帶融合到C末端多組氨酸標(biāo)簽的tetC基因。在誘導(dǎo)細(xì)菌后，觀(guān)察到高水平的表達(dá)，而TTFC的提純則是借助于細(xì)胞溶胞產(chǎn)物流過(guò)鎳親合柱來(lái)進(jìn)行。
通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)了冼脫的TTFC-組氨酸蛋白的完整性，而濃度則利用BioRad DC蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行確定。
間接ELISA用于測(cè)定抗原特異性血清和粘膜抗體平皿涂布以50μl/孔的特異性抗原(2μg/ml，在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液中)并留在室溫過(guò)夜?？乖翘崛〉难堪鈿さ鞍谆蛱峒兊腡TFC蛋白。在37℃用PBS中的0.5％BSA阻斷1小時(shí)后，利用2倍稀釋系列施加血清樣品，其中稀釋系列起始于在ELISA稀釋劑緩沖液中的1/40稀釋(0.1M Tris-HCl，pH7.4；3％(w/v)NaCl；0.5％(w/v)BSA；10％(v/v)羊血清(Sigma)；0.1％(v/v)Triton-X-100；0.05％(v/v)吐溫-20)。每個(gè)平皿攜帶陰性對(duì)照(1/40稀釋的預(yù)先免疫血清)、陽(yáng)性對(duì)照(來(lái)自用TTFC蛋白或芽胞雙親免疫小鼠的血清)的重復(fù)孔。在加入抗小鼠HRP結(jié)合物(除Serotec用于子類(lèi)之外，全部獲自Sigma)之前，平皿在37℃保溫2小時(shí)。板在37℃再保溫1小時(shí)，然后利用底物TMB(3，3′，5，5′-四甲基-聯(lián)苯胺；Sigma)進(jìn)行顯影。利用2M H2SO4停止反應(yīng)。繪制了每個(gè)樣品的稀釋曲線(xiàn)而終點(diǎn)滴度計(jì)算為稀釋度，其和1/40稀釋度的混合預(yù)先免疫血清產(chǎn)生相同的光密度。利用Mann-Whitney U檢驗(yàn)在組之間進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)比較。大于0.05的p值被認(rèn)為是不顯著的。對(duì)于排泄物IgA的ELISA分析，我們按照Robinson等人的程序(5)，其中利用大約0.1克排泄物顆粒，其已經(jīng)懸浮在帶有BSA(1％)和PMSF(1mM)的PBS中，在4℃保溫過(guò)夜，然后在ELISA之前保存于-20℃。對(duì)于每個(gè)樣品，終點(diǎn)滴度計(jì)算為稀釋度，其和未稀釋的預(yù)先免疫排泄物提取物產(chǎn)生相同的光密度。
免疫作用7只或8只小鼠(雌性，C57 BL/6，8周)為一組被口服、鼻內(nèi)或通過(guò)腹膜內(nèi)途徑給予表達(dá)CotB-TTFC(RH103)的芽胞懸浮液或?qū)φ盏姆潜磉_(dá)芽胞(菌株P(guān)Y79)懸浮液。對(duì)于口服和鼻內(nèi)給藥，用氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行輕微麻醉?？诜捅莾?nèi)途徑使用多次給藥方案，其先前用于最佳粘膜免疫(6、5)。還包括自然、非免疫對(duì)照組。口服給藥還包括一組7只小鼠，其接受4μg/劑量的經(jīng)提純的TTFC蛋白。
a)在0.15ml體積中含有1.67×1010芽胞的口服免疫是通過(guò)胃內(nèi)灌服法在0、2、4、18、20、22、34、35、以及36天給予。血清樣品在-1、17、33、以及54天收集，而排泄物在-2、17、33、以及52天收集。
b)鼻內(nèi)免疫使用在20μl的體積中有1.11×109芽胞的劑量并利用微量取樣器在0、2、16、17、30、以及31天給藥。血清樣品在-1、15、29、及48天收集。排泄物在-1、15、29、以及47天收集。
c)經(jīng)腹膜內(nèi)途徑免疫，在0.15ml體積中含有1.5×109芽胞，在0、14、及28天給予。血清樣品在-1、7、22、36、以及43天收集。
破傷風(fēng)毒素激發(fā)在最初口服免疫后60天，RH103免疫的小鼠被皮下注射破傷風(fēng)毒素的等效于10或20 LD50的激發(fā)劑量。經(jīng)提純的毒素(20μg蛋白/Lf；Lf＝結(jié)絮單位)被懸浮在無(wú)菌的0.9％NaCl。首次實(shí)驗(yàn)確定破傷風(fēng)毒素的LD50為0.0003 Lf(即，1 LD50＝6ng蛋白)而注射體積是200μl/小鼠。仔細(xì)地監(jiān)測(cè)這些動(dòng)物的破傷風(fēng)癥狀，而出現(xiàn)麻痹癥狀的小鼠則人道地給予安樂(lè)死。在14天后未顯示癥狀的個(gè)體則被認(rèn)為是免疫的。接受TTFC提純蛋白口服免疫的小鼠用10 LD50進(jìn)行激發(fā)。自然小鼠或用PY79芽胞免疫的小鼠則用2 LD50進(jìn)行激發(fā)。
提取芽胞外殼蛋白芽胞外殼蛋白是利用SDS-DTT提取緩沖液提取自高密度(＞1×1010芽胞/ml)芽胞懸浮液，如在別處(1)所詳細(xì)描述的。
通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定提取蛋白的完整性而濃度則是利用BioRad DC蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。
播散(dissemination)實(shí)驗(yàn)Balb/c小鼠(雌性，5周)連續(xù)5天被口服給予1×109芽胞/劑量的菌株SC2362(rrnO-lacZ cat)。SC2362提供Lac顯型(表現(xiàn)型)，其可識(shí)別為在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(含有Xgal)上的藍(lán)色菌落，以及氯霉素耐藥性(5μg/ml；由cat基因編碼)。在其后的時(shí)間點(diǎn)，4只小鼠為一組被處死并按下述順序解剖樣本器官和組織。
首先，收集新鮮排泄物顆粒，其后通過(guò)吸入CO2殺死動(dòng)物并用70％酒精消除污染。通過(guò)將3ml無(wú)菌PBS注射進(jìn)腹腔，接著溫和按摩，來(lái)收集腹膜巨噬細(xì)胞。然后利用21規(guī)格針和注射器收集腹膜滲出物，并立即處理。然后打開(kāi)腹腔并將肝切除。腸被分類(lèi)并除去腸系膜。接著收集脾和腎，其后定位并切除派爾集合淋巴結(jié)，以避免來(lái)自腸腔內(nèi)容物的污染(周?chē)M織也被切除，作為陰性對(duì)照)。最后，收集頸腺和下頜下腺。在器官之間無(wú)菌解剖儀器是變化的。通過(guò)在1ml PBS中用3ml玻璃珠(2mm和4mm直徑的混合物)旋轉(zhuǎn)使樣品勻漿化，然后立即平皿培養(yǎng)CFU(在含有Xgal和氯霉素的營(yíng)養(yǎng)瓊脂上)以確定總活細(xì)胞計(jì)數(shù)或在平皿接種之前熱處理(65℃，1小時(shí))以確定芽胞計(jì)數(shù)。
結(jié)果在芽胞表面上異源抗原的表面表達(dá)表達(dá)TTFC(作為嵌合體融合到芽胞外殼蛋白CotB)的重組芽胞(RH103)已在別處描述(3)。在評(píng)估對(duì)表達(dá)TTFC的芽胞的免疫應(yīng)答之前，通過(guò)免疫熒光我們證實(shí)了TTFC是表面暴露的，如圖1所示。利用抗TTFC和CotB的多克隆血清，我們可以檢測(cè)芽胞形成培養(yǎng)物中的TTFC，其中培養(yǎng)物是在開(kāi)始芽胞形成以后5小時(shí)收集的。我們也可以在4小時(shí)和6小時(shí)檢測(cè)CotB和TTFC(數(shù)據(jù)未顯出)。芽胞囊細(xì)胞被用于標(biāo)記，因?yàn)槠渌芯恳驯砻鳎咚降谋尘皹?biāo)記禁止使用釋放的內(nèi)生芽胞(4)。我們的研究表明用抗TTFC血清標(biāo)記的完整的卵圓形前芽胞。用cotB抗血清標(biāo)記在重組和非重組芽胞中檢測(cè)CotB(A和C組)。
在腹膜內(nèi)注射表達(dá)TTFC的重組芽胞以后血清抗TTFC應(yīng)答在開(kāi)始口服和鼻內(nèi)免疫之前，我們利用實(shí)驗(yàn)研究來(lái)評(píng)估重組芽胞的免疫原性。8只C57小鼠為一組被注射(腹膜內(nèi))重組或非重組芽胞。我們的免疫程序使用標(biāo)準(zhǔn)方案，即三次注射(含有1.5×109芽胞/劑量)重組RH103芽胞(表達(dá)雜交CotB-TTFC)或非重組PY79芽胞。在先前的研究(3)中，RH103芽胞顯示出攜帶大約9.75×10-5pg的TTFC多肽/芽胞，因而我們的免疫劑量將含有0.15μg的TTFC。用RH103芽胞的免疫導(dǎo)致1.5×103的峰值抗TTFC IgG滴度，由間接ELISA確定(數(shù)據(jù)未示出)，其顯著不同(p＜0.05)于對(duì)照組(對(duì)于PY79組為1.1×102而對(duì)于自然組為0.8×101)，這說(shuō)明當(dāng)呈現(xiàn)在芽胞表面時(shí)TTFC被穩(wěn)定表達(dá)且是適當(dāng)?shù)刂旅庖叩摹?br> 在口服和鼻內(nèi)免疫以后血清抗TTFC應(yīng)答為了測(cè)定粘膜和系統(tǒng)應(yīng)答的誘導(dǎo)，7只小鼠為一組通過(guò)口服(1.67×1010芽胞/劑量；1.65μg TTFC/劑量)或鼻內(nèi)(1.11×109芽胞/劑量；0.11μg TTFC/劑量)進(jìn)行免疫。注意，在技術(shù)上，通過(guò)鼻途徑不可能給予更大的劑量。如圖2A所示，小鼠用RH103(CotB-TTFC)芽胞口服免疫到33天給出大于1×103的滴度，顯著高于(p＜0.05)給予非重組芽胞(PY79)的小鼠、給予提純TTFC蛋白(4μg/劑量)的小鼠、或?qū)φ兆匀唤M。TTFC蛋白沒(méi)有用作鼻內(nèi)途徑的對(duì)照，因?yàn)橄惹暗墓ぷ饕驯砻鞅沁f送TTFC(用低劑量，即小于10μg/劑量)并不是致免疫的(8)。
研究發(fā)現(xiàn)，在鼻內(nèi)免疫以后48天有稍微更低水平的TTFC特異性IgG終點(diǎn)滴度(圖2B)。我們的數(shù)據(jù)表明，通過(guò)每一個(gè)途徑，自然和非重組免疫的滴度并不具有顯著差異(p＞0.05)。給予表達(dá)TTFC(融合到CotB)的芽胞的組比其相應(yīng)的對(duì)照組(p＜0.05)具有顯著更高的TTFC特異性IgG滴度對(duì)于口服組從33天算起而對(duì)于鼻內(nèi)組從29天算起。在未描述的工作中，我們還發(fā)現(xiàn)，在帶有或不帶有霍亂毒素(類(lèi)型Inaba 569B，0.33μg/劑量)的情況下口服給予的RH103芽胞在抗TTFC IgG滴度方面并不產(chǎn)生顯著差異。
血清抗TTFC抗體同種型對(duì)于來(lái)自粘膜免疫小鼠的血清還檢驗(yàn)是否存在TTFC特異性IgG、IgA和IgM抗體同種型以及IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3子類(lèi)(圖3)。用表達(dá)CotB-TTFC的RH103芽胞口服免疫的小鼠，在54天，顯示高水平的IgG1和IgG2b同種型。對(duì)于IgG1、IgG2a和IgG2b子類(lèi)，平均滴度顯著不同于兩個(gè)對(duì)照組的基準(zhǔn)滴度i)自然小鼠和ii)用非重組芽胞免疫的小鼠(p＜0.05)。對(duì)于IgG3、IgM和IgA子類(lèi)幾乎觀(guān)察不到變化。在鼻內(nèi)免疫的小鼠中，在48天的血清顯示IgG1、IgG2b和IgM子類(lèi)占優(yōu)勢(shì)。對(duì)于這些子類(lèi)，滴度顯著高于對(duì)照組(p＜0.05)。相反，在給予非重組芽胞組和自然組之間沒(méi)有觀(guān)察到在任何同種型中有顯著變化(p＞0.05)。
粘膜抗TTFC IgA應(yīng)答對(duì)于來(lái)自口服或鼻內(nèi)免疫小鼠的新鮮排泄物顆粒，通過(guò)ELISA測(cè)定了TTFC特異性分泌性IgA(sIgA)的存在(圖4)。通過(guò)每一種途徑用表達(dá)CotB-TTFC的芽胞的免疫誘發(fā)明顯的TTFC特異性sIgA應(yīng)答。在口服或鼻內(nèi)免疫小鼠的組中，TTFC特異性sIgA滴度在33天出現(xiàn)峰值(圖4A和4B)。排泄物TTFC特異性sIgA的終點(diǎn)滴度顯著高于對(duì)照組(p＜0.05)，而在對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異(非重組芽胞和自然組；p＞0.05)。
在口服免疫后防止遭受破傷風(fēng)毒素激發(fā)(challenge)在口服免疫后觀(guān)察到的高血清IgG滴度(＞103)是在潛在的保護(hù)水平。為了測(cè)試誘發(fā)的抗毒素應(yīng)答的生物活性和相聯(lián)的保護(hù)水平，用表達(dá)枯草桿菌芽胞(RH103)的CotB-TTFC口服免疫的小鼠用皮下給予的致死劑量的破傷風(fēng)毒素(10或20 LD50)進(jìn)行激發(fā)(表2)。
表2在口服免疫后保護(hù)小鼠免遭破傷風(fēng)毒素的致死系統(tǒng)激發(fā) 表2表示8只小鼠為一組的處理結(jié)果，其是在60天被皮下注射激發(fā)劑量的破傷風(fēng)毒素之前的0、2、4、18、20、22、34、35和36天用枯草桿菌的1.67×1010芽胞或4μg TTFC提純蛋白進(jìn)行口服免疫。在14天后沒(méi)有產(chǎn)生癥狀的個(gè)體被認(rèn)為是免疫的。
小鼠受到完全保護(hù)以免遭10 LD50的激發(fā)。在8只受20 LD50激發(fā)的小鼠當(dāng)中，1只小鼠在72小時(shí)后具有明顯的癥狀。所有自然小鼠和用野生型枯草桿菌芽胞(PY79)免疫的小鼠在2 LD50激發(fā)之后的72小時(shí)內(nèi)均顯示出明顯的破傷風(fēng)癥狀。用TTFC提純蛋白(4μg/劑量)進(jìn)行的口服免疫并不產(chǎn)生對(duì)抗10 LD50的保護(hù)作用并且所有小鼠在24小時(shí)內(nèi)顯示明顯的破傷風(fēng)癥狀。因而通過(guò)用表達(dá)CotB-TTFC的枯草桿菌芽胞口服免疫而誘發(fā)的系統(tǒng)抗體應(yīng)答是保護(hù)性的。
抗芽胞應(yīng)答除了抗TTFC應(yīng)答之外，還測(cè)定了在口服和鼻內(nèi)免疫以后的抗芽胞IgG和sIgA應(yīng)答(圖5)。用CotB-TTFC表達(dá)芽胞(RH103)和非重組芽胞(PY79)兩者進(jìn)行的口服免疫產(chǎn)生系統(tǒng)芽胞外被特異性IgG水平(圖5A)，其顯著高于自然組(p＜0.05)。不管使用重組或非重組芽胞在鼻內(nèi)免疫以后觀(guān)察到更低、但仍然顯著水平(p＜0.05)的芽胞外被特異性IgG滴度(圖5C)。
在口服免疫小鼠的排泄物中觀(guān)察到的芽胞外被特異性sIgA水平(圖5B)顯示對(duì)抗芽胞的顯著應(yīng)答。相對(duì)于非重組芽胞用于免疫，這些水平顯著更高(p＜0.05)。當(dāng)鼻內(nèi)途徑(圖5D)用于免疫時(shí)，觀(guān)察到芽胞外被特異性sIgA水平的類(lèi)似分布圖，其中在給予非重組芽胞的小鼠中IgA水平隨時(shí)間下降。再一次，芽胞外被特異性sIgA的水平顯著高于自然小鼠(p＜0.05)。
芽胞的擴(kuò)散近親交配Balb/c小鼠被每日給予1×109芽胞/劑量，連續(xù)5天。實(shí)驗(yàn)研究已表明這種連續(xù)給藥方案足以建立可恢復(fù)的和統(tǒng)計(jì)相關(guān)的計(jì)數(shù)。在最后給藥以后的時(shí)點(diǎn)，4只小鼠為一組被處死并解剖關(guān)鍵的淋巴器官。此外，收集排泄物，使勻漿化并確定計(jì)數(shù)。測(cè)定了在勻漿化組織和排泄物中的活細(xì)胞總計(jì)數(shù)和耐熱計(jì)數(shù)?；厥盏幕罴?xì)胞計(jì)數(shù)列于表3并顯示細(xì)菌從腸派爾集合淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)的恢復(fù)水平，表明與GALT的相互作用。
表3
表3顯示4只Balb/c小鼠為一組的處理結(jié)果，其連續(xù)5天口服給予枯草桿菌株SC2362(rrnO-lacZ)的1×109芽胞(總劑量，5×109)。給出的結(jié)果是每個(gè)小鼠器官的菌落形成單位的平均數(shù)，其是在給藥的最后一天之后指定的時(shí)間獲取的。表示為總計(jì)數(shù)(沒(méi)有熱處理)和芽胞計(jì)數(shù)(樣品65℃處理1小時(shí))。ND，未測(cè)定；NS，不顯著(每個(gè)樣品＜10個(gè)活細(xì)胞單位)。數(shù)據(jù)表示為算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
在表3中，PP/MLN是派爾集合(Peyer’s patches)淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)的縮寫(xiě)；SMG/CLN是下頜下腺和頸淋巴結(jié)的縮寫(xiě)；以及PM是腹膜巨噬細(xì)胞的縮寫(xiě)。
最有趣的是在下頜下腺和頸淋巴結(jié)中活細(xì)胞計(jì)數(shù)的恢復(fù)，而從肝和脾沒(méi)有顯著計(jì)數(shù)的恢復(fù)。細(xì)菌從頭和頸組織恢復(fù)而從廣泛擴(kuò)散的系統(tǒng)部位很少或沒(méi)有恢復(fù)表明芽胞可能已經(jīng)穿過(guò)鼻咽粘膜。當(dāng)細(xì)菌被從GIT清除時(shí)排泄物中的計(jì)數(shù)平穩(wěn)地下降，雖然在總和芽胞計(jì)數(shù)之間幾乎觀(guān)察不到差異。
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權(quán)利要求
1.一種用遺傳密碼進(jìn)行遺傳修飾的芽胞，包括至少一種編碼抗原的遺傳結(jié)構(gòu)以及作為嵌合基因的芽胞外殼蛋白，所述遺傳修飾的芽胞具有所述抗原，其表達(dá)為具有所述芽胞外殼蛋白的融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芽胞，其特征在于，所述芽胞是芽胞桿菌屬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的芽胞，其特征在于，所述遺傳結(jié)構(gòu)包括至少部分芽胞外殼蛋白基因和至少部分抗原基因，以嵌合基因的形式。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的芽胞，其特征在于，所述抗原基因是位于所述芽胞外殼蛋白基因的3′端。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的芽胞，其特征在于，所述遺傳結(jié)構(gòu)在所述嵌合基因的5′端包括芽胞外被啟動(dòng)基因。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的芽胞，其特征在于，所述抗原至少是破傷風(fēng)毒素片段C或不穩(wěn)定毒素B亞單位之一。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的芽胞，其特征在于，所述芽胞外殼蛋白是選自由cotA、cotB、cotC、cotD、cotE、cotF、cotG、cotH、cotJA、cotJC、cotM、cotSA、cotS、cotT、cotV、cotW、cotX、cotY、以及cotZ組成的組。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的芽胞，其特征在于，所述芽胞被熱滅活以致在使用中它不會(huì)發(fā)芽進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的芽胞，用于內(nèi)科疾病的治療。
10.一種組合物，包括至少兩種不同的如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的芽胞，其特征在于，所述至少兩種不同的芽胞表達(dá)至少兩種不同的抗原。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述組合物進(jìn)一步包括藥用賦形劑或載體。
12.一種組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一權(quán)利要求所述的芽胞，其中所述芽胞與藥用賦形劑或載體結(jié)合。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一權(quán)利要求所述的組合物，用于內(nèi)科疾病治療，優(yōu)選地，所述內(nèi)科疾病是炎癥、疼痛、激素不平衡、和/或腸障礙。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一權(quán)利要求所述的芽胞在制備用于治療內(nèi)科疾病的藥劑中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述內(nèi)科疾病是炎癥、疼痛、激素不平衡、和/或腸障礙。
15.一種內(nèi)科治療方法，所述方法包括以下步驟a)將根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一權(quán)利要求所述的芽胞給予需要醫(yī)療的人或動(dòng)物；b)所述遺傳修飾的芽胞誘發(fā)免疫應(yīng)答，用于預(yù)防疾病。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述芽胞是口服、鼻內(nèi)、或直腸給予。
17.一種制備遺傳修飾的芽胞的方法，所述方法包括以下步驟制備遺傳密碼，包括至少一種編碼抗原的遺傳結(jié)構(gòu)以及作為嵌合基因的芽胞外殼蛋白；利用所述至少一種遺傳結(jié)構(gòu)以轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)母細(xì)胞；誘導(dǎo)所述轉(zhuǎn)化的母細(xì)胞以形成芽胞；以及分離所述生成的遺傳修飾的芽胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用遺傳密碼進(jìn)行遺傳修飾的芽胞，包括至少一種編碼抗原的遺傳結(jié)構(gòu)以及作為嵌合基因的芽胞外殼蛋白，所述遺傳修飾的芽胞具有所述抗原，其表達(dá)為具有所述芽胞外殼蛋白的融合蛋白。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1639321SQ03805423
公開(kāi)日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月7日
發(fā)明者西蒙·邁克爾·卡廷 申請(qǐng)人:倫敦大學(xué)皇家霍洛威學(xué)院