專利名稱：生長因子和蛋白酶的組合的制作方法
背景本發(fā)明涉及組合物，其包含為促進(jìn)動(dòng)物或人類損傷愈合的目的通過混合兩種組分(1)包含與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子；和(2)胞外基質(zhì)降解蛋白酶而形成的組合。這兩種組分可以在給予待治療受試者之前預(yù)組合，或者以相繼的方式給予受試者。更具體地，本發(fā)明涉及角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(″KGF″)與纖溶酶、纖溶酶原、纖溶酶原激活劑或其功能上的生物學(xué)等同體(equivalent)的組合，該組合用于治療涉及上皮起源的細(xì)胞或者KGF可能影響的其它細(xì)胞類型的損傷。另外，本發(fā)明涉及試劑盒，其具有帶生長因子的容器以及帶胞外基質(zhì)降解蛋白酶的容器。各容器的內(nèi)含物可以處于載體溶液(例如水、緩沖液、鹽溶液、增稠劑、乳劑或軟膏)之中，或者與載體溶液一起凍干置于第三容器內(nèi)，以備用戶重建組分。本發(fā)明進(jìn)一步的目標(biāo)是利用試劑盒的組分用于創(chuàng)傷愈合的目的。例如，混合試劑盒的組分并置于損傷處，或者將試劑盒中單個(gè)組分以前后或相繼的次序置于損傷處。備選地，可以購買或制造試劑盒的組分或生物學(xué)等同體，并隨所述的方法用于促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的目的。
上皮細(xì)胞占人體所有細(xì)胞的三分之一。皮膚中的上皮細(xì)胞被稱之為角質(zhì)形成細(xì)胞。上皮細(xì)胞也見于嘴、鼻腔、胃腸道、陰道及其它器官或組織如肺和角膜的表襯。涉及上皮細(xì)胞的損傷或創(chuàng)傷以許多不同的形式發(fā)生，包括切傷、燒傷和潰瘍。它們可能是急性或慢性的。實(shí)例包括壓迫性潰瘍、靜脈淤積潰瘍、糖尿病足瘍、十二指腸潰瘍、潰瘍性結(jié)腸炎、口蹄潰瘍、角膜潰瘍。不痊愈及慢痊愈的創(chuàng)傷稱之為慢性創(chuàng)傷?？诨蚰c粘膜形式的慢性創(chuàng)傷在接受化療的癌癥患者中頻繁發(fā)生。它們是主要的健康議題，且由于人口老化愈加如此。
內(nèi)皮細(xì)胞是人體中另一個(gè)大的細(xì)胞群。它們構(gòu)成所有血管的表襯。70kg成人脈管系統(tǒng)排布有～1,000m2內(nèi)皮細(xì)胞。在老齡人群中，與心臟病、中風(fēng)相關(guān)的血管損傷以及更低的末端局部缺血是最重要的醫(yī)學(xué)議題之一。涉及大血管的心臟病可用某些手術(shù)操作治療，例如血管成形術(shù)和旁路手術(shù)。然而，對(duì)于涉及小血管的疾病狀況，尚無有效的治療。最近，發(fā)展了有前景的新的這些血管病的治療方法，即治療性血管生成，它包括遞送促進(jìn)新血管形成的血管生成生長因子。由L-精氨酸和血管生成生長因子組成的治療混合物在美國專利No.6,239,172中公布，用于治療內(nèi)皮機(jī)能障礙相關(guān)病，其全部內(nèi)容特此并入作為參考。
在建立組織結(jié)構(gòu)和完整性以及維持其正常功能中，胞外基質(zhì)是為細(xì)胞提供支持和錨定的重要纖維基質(zhì)。其組分包括膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparin sulfate proteoglycan)、透明質(zhì)酸以及彈性蛋白。在創(chuàng)傷的情況下，受損組織內(nèi)或表面的由血纖蛋白纖維形成的血塊構(gòu)成了另一種基質(zhì)組分。在創(chuàng)傷愈合或正常組織生長期間，為使細(xì)胞穿過該基質(zhì)遷移，遷移細(xì)胞周圍的基質(zhì)降解是必需的。盡管不希望被理論束縛，已知有許多酶參與該降解過程，包括膠原酶、金屬蛋白酶以及纖溶酶。存在復(fù)雜的系統(tǒng)調(diào)節(jié)這些酶的活性。它們中有許多是作為無活性的酶原由細(xì)胞產(chǎn)生的，需要例如由另一種酶激活才具有功能。這些酶中有些在細(xì)胞表面具有受體，從而限制其在細(xì)胞附近的活性。
KGF是成纖維細(xì)胞生長因子(″FGF″)家族的成員，并且也已知稱之為成纖維細(xì)胞生長因子-7(″FGF-7″)(Werner，Cytokine & GrowthFactor Reviews 9153-165，1998)。該家族的成員已其結(jié)合肝素(heparin)的能力為特征，在介導(dǎo)生長因子及其受體之間的相互作用中起著關(guān)鍵作用(Schlessiger等，Cell 83357-360，1995)。FGF家族原型aFGF(FGF-1)和bFGF(FGF-2)已被廣泛研究。KGF于1989年首次分離(Rubin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86802-806(1989))。隨后，克隆了KGF基因并且在細(xì)菌中表達(dá)了KGF。Finch等，Science 245，752-755(1989)；Ron等，J.Biol.Chem.2682984-2988(1993)；Rubin等，美國專利No.5,741,642。獨(dú)特之處在于它是由間質(zhì)起源的細(xì)胞產(chǎn)生的，但主要地作用于上皮起源的細(xì)胞。KGF刺激上皮細(xì)胞的增殖和分化(Aaronson等，Annals of the New York Academy of Sciences 638，62-77，1991)。
成熟KGF是163個(gè)氨基酸的多肽。結(jié)構(gòu)和誘變研究已證明肝素和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于接近分子中央的部分。包括殘基23-144的KGF片段(Δ23 KGF-R144Q)保留了原始的生物學(xué)活性連同提高的熱穩(wěn)定性(Osslund等，Protein Science 71681-1690(1998))。美國專利No.5,677,278(“′278專利”)公開了截短的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子片段(Δ23KGF或缺失N-端頭23個(gè)氨基酸的KGF)，其與成熟全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子相比，促有絲分裂活性表現(xiàn)出至少2-倍的提高?！?78專利還涉及截短的KGF與毒素分子的綴合物，用于治療上皮過度增生病。而且，′278專利涉及含截短的KGF和藥學(xué)上可接受的載體的治療組合物，以及其用于創(chuàng)傷愈合目的的用途。′278的全部內(nèi)容特此并入作為參考。
存在四類FGF受體(″FGFR″)，F(xiàn)GFR1-FGFR4。已經(jīng)鑒定了多種FGFR同工型。雖然aFGF與所有四類FGFR都結(jié)合，但已知KGF僅與FGFR2 IIIb同工型結(jié)合。KGF在皮膚創(chuàng)傷中高度表達(dá)。已在損傷后的膀胱和腎臟中以及在炎性腸病觀察到增加的KGF表達(dá)。與其它生長因子不同，KGF在愈合期間持續(xù)高水平表達(dá)(Werner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6896-6900，1992)。動(dòng)物研究證明向創(chuàng)傷局部施用KGF加速愈合(Staiano-Coico等，J.Exp.Med.178865-878(1993)；Pierce等，J.Exp.Med.179831-840(1994)；Wu等，Arch.Surg.131660-666(1996))。在實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的大腸炎中已證明系統(tǒng)給藥KGF減輕損傷。在置于輻射和/或化療的動(dòng)物中，KGF也保護(hù)上皮細(xì)胞。此外，糖皮質(zhì)激素治療已知延遲創(chuàng)傷愈合，可抑制KGF表達(dá)。用于控釋遞送肽及生長因子的組合物和裝置的用途已在美國專利No.6,187,330(“′330專利”)中公開?！?30專利專利的發(fā)明可用于局部遞送血管生成堿性成纖維細(xì)胞生長因子或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，并且其全部內(nèi)容特此并入作為參考。
在美國專利No.5,965,530(′530專利”)中，證明KGF作用于其它類型的細(xì)胞，并且其全部內(nèi)容特此并入作為參考。根據(jù)動(dòng)物中深入的體內(nèi)研究，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)KGF刺激除角質(zhì)形成細(xì)胞之外的多種類型細(xì)胞增殖、生長和分化。對(duì)KGF體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)的這種較好的理解能夠更廣地利用該多肽作為治療劑，適當(dāng)?shù)嘏渲茷樗幬锝M合物，用于特異性地治療折磨或影響組織和器官例如真皮附件、肝、肺及胃腸道的疾病狀態(tài)和醫(yī)學(xué)病情。除了上皮起源的細(xì)胞，最近證明KGF作用于微血管內(nèi)皮細(xì)胞，但并非來自大血管如大動(dòng)脈的那些細(xì)胞。它刺激微血管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化性和增殖，并在大鼠角膜中誘發(fā)血管生成。Gillis等，Journal of Cell Science 1122049-2057(1999)。
最近鑒定了與KGF相似的生長因子，命名為FGF-10或KGF-2(Yamasaki等，Journal of Biological Chemistry 27115918-19521(1996)；Beer等，Oncogene.152211-2218(1997)；Igarashi等，Journal ofBiological Chemistry.27313230-13235(1998)；Jimenez和Rampy，Journal of Surgical Research.81238-242(1999))。它處于同一個(gè)FGF家族，并與KGF享有54％的氨基酸同一性。它也主要作用于上皮細(xì)胞。不過，與KGF不同，F(xiàn)GF-10也與FGFR1結(jié)合，并且更牢固地與肝素結(jié)合。FGF-10似乎不如KGF那樣高度在皮膚創(chuàng)傷中表達(dá)，盡管發(fā)現(xiàn)局部施用FGF-10促進(jìn)愈合過程。
除了KGF和FGF-10，存在能夠刺激上皮細(xì)胞的其它生長因子。這些生長因子包括表皮生長因子(″EGF″)、肝細(xì)胞生長因子(″HGF″)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(″TGF-α″)、胰島素樣生長因子I(″IGF-I″)以及酸性成纖維細(xì)胞生長因子(″aFGF″)。不過，這些生長因子也作用于其它類型的細(xì)胞例如成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞和肌細(xì)胞。
上皮細(xì)胞的遷移，同許多其它細(xì)胞一樣，被認(rèn)為與尿激酶纖溶酶原激活劑(″uPA″)及其受體(″uPAR″)的表達(dá)密切相關(guān)(Morioka等，J.Invest.Dermatol.88418-423，1987；Romer等，J.Invest.Dermatol.102519-522，1994)。uPAR的作用是使uPA介導(dǎo)的血纖蛋白溶解或蛋白水解集中于細(xì)胞表面。uPAR與單鏈的失活uPA或scuPA結(jié)合，然后它轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚詢涉渦PA。已證明KGF提高上皮細(xì)胞中uPA的表達(dá)(Tsuboi等，J.Invest.Dermatol.10149-53，1993；Zheng等，EuropeanJournal of Cell Biology 69128-134，1996)。uPA將纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶。纖溶酶原是90 kDa的糖蛋白，并且包括5個(gè)kringle結(jié)構(gòu)域和一個(gè)蛋白酶結(jié)構(gòu)域。激活通過在單肽鍵(Arg 561-Val 562)處切割纖溶酶原發(fā)生。兩條鏈在激活后仍以二硫鍵交聯(lián)在一起。纖溶酶原通過纖溶酶原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合于細(xì)胞表面，然后它很容易被uPAR-結(jié)合的uPA激活。組織纖溶酶原激活劑(tPA)也激活纖溶酶原，但不具有細(xì)胞表面受體，并且需要結(jié)合到血纖蛋白上取得最佳的酶活。缺失頭4個(gè)或所有5個(gè)kringle結(jié)構(gòu)域的纖溶酶原被稱之為小-纖溶酶原或微-纖溶酶原。它們作為纖溶酶原可被類似地激活。Komorowicz等，Biochemistry379112-9118(1998)。
纖溶酶/纖溶酶原是血纖蛋白溶解的關(guān)鍵酶(Collen，Thrombosisand Haemostasis 82259-270，1999)。它負(fù)責(zé)降解血纖蛋白凝塊及其它胞外基質(zhì)組分，但它也參與金屬蛋白酶和生長因子例如TGF-β的激活。除了uPA和tPA，纖溶酶原也可被其它酶激活，包括鏈激酶、葡萄球菌激酶以及普通吸血蝙蝠纖溶酶原激活劑。最近的研究證明纖溶酶對(duì)創(chuàng)傷愈合至關(guān)重要。纖溶酶原基因敲除小鼠作為血纖蛋白過度沉積的結(jié)果表現(xiàn)出延遲的皮膚創(chuàng)傷愈合，這依次防止角質(zhì)形成細(xì)胞遷移(Romer等，Nature Medicine 2287-292，1996)。如果這些小鼠中纖維蛋白原基因也缺失，則創(chuàng)傷愈合能力得以拯救(Bugge等，Cell 87709-19，1996)。在動(dòng)脈和角膜損傷的愈合中也觀察到纖溶酶的重要性(Carmeliet等，Circulation 963180-91(1997)；Kao等，InvestigativeOphthalmology & Visual Science 39502-508(1998))。在慢性靜脈脛潰瘍中，已觀察到纖溶酶缺陷(Hoffman等，J.Invest.Dermatol.1111140-4，1998)。此外，uPA和/或tPA基因缺失作為血纖蛋白過度沉積的結(jié)果也導(dǎo)致延遲的創(chuàng)傷愈合(Bugge等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA935899-5904(1996)；Heymans等，Nature Medicine.51135-1142(1999))。纖溶酶已被用作治療創(chuàng)傷的局部制劑，并且也平價(jià)為可注射治療血栓癥。
血管生成的起始步驟包括內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，并且也涉及胞外基質(zhì)的蛋白水解降解。uPA和uPAR的表達(dá)在遷移的內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)(Carmeliet和Collen，Trends in Cardiovascular Medicine 7271-281，1997)。盡管不希望被理論束縛，纖溶酶原激活劑和纖溶酶原引發(fā)在血管生成中起重要作用的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)。利用基因敲除小鼠的研究證明uPA-缺陷型小鼠表現(xiàn)出受損的血管再形成，即使是在用已知的血管生成生長因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)治療后(Heymans等，NatureMedicine.51135-1142，1999)。
除了纖溶酶/纖溶酶原，存在其它可能參與血纖蛋白降解的酶。一種此類酶是金屬蛋白酶(MMP)，其具有20個(gè)成員。MMP-12和-14已知降解血纖蛋白。纖溶酶原缺陷小鼠中的創(chuàng)傷愈合嚴(yán)重延遲，但創(chuàng)傷最終痊愈。相反，如果對(duì)這些小鼠施用廣譜MMP抑制劑(如galardin)，則創(chuàng)傷愈合被完全終止(Lund等，EMBO J.，18，4645-4656，1999)。MMP-14對(duì)血纖蛋白的降解也參與內(nèi)皮細(xì)胞的遷移(Hiraoka等，Cell，95，365-377，1998)。
凝血酶抑制劑和重組纖溶酶原激活劑的用途已被用于調(diào)節(jié)創(chuàng)傷愈合過程的產(chǎn)品。例如，美國專利No.6,174,855公開了使用凝血酶抑制劑生產(chǎn)用于調(diào)節(jié)體內(nèi)創(chuàng)傷愈合過程的產(chǎn)品，尤其是抑制或預(yù)防血纖蛋白相關(guān)的粘附和/或疤痕組織形成，以及用于調(diào)節(jié)體內(nèi)創(chuàng)傷愈合過程的產(chǎn)品，包括多糖(如殼聚糖)和基于肽的低分子量凝血酶抑制劑，并且其全部內(nèi)容特此并入作為參考。另外，美國專利No.6,033,664(“′664專利”)公開了利用非細(xì)菌纖溶酶原激活劑生產(chǎn)局部醫(yī)藥制品，用以治療緩慢或不痊愈的創(chuàng)傷。另外，′664專利涉及包括生理學(xué)上可接受的載體和有效量的非細(xì)菌纖溶酶原激活劑的組合物，其中排除tPA，并將其全部內(nèi)容特此并入作為參考。
盡管存在所有的這些進(jìn)展，仍急需能夠有效治療涉及上皮起源的細(xì)胞的損傷的制劑。如早先所陳述的，現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)損傷可用多種蛋白來源的生長因子或蛋白生長因子的混合物治療。另外，現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)緩慢痊愈的損傷可用蛋白水解酶治療。組合使用蛋白生長因子和蛋白水解酶輔助創(chuàng)傷愈合是違反直覺的，即使蛋白生長因子和酶的功能似乎是令人稱贊的。這種推理最明顯的理由是蛋白水解酶行使水解(消化)蛋白的能力。因而，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，蛋白生長因子(如KGF)和消化蛋白的酶(如纖溶酶原)的組合作為創(chuàng)傷愈合的療法最初似乎是起反作用的。然而，本發(fā)明提供了這樣的結(jié)果，它表明了通過生長因子和蛋白水解酶組合的協(xié)同效應(yīng)。尤其期望此類組合制劑得以生產(chǎn)并基于其在體內(nèi)條件下復(fù)雜的相互作用加以利用。
概述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及包含通過混合兩組分形成的組合物(1)與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子；和(2)胞外基質(zhì)降解蛋白酶，用以在受試者例如包括人類的動(dòng)物的損傷中促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的目的。兩組分可在給予受試者前“預(yù)混”，或者兩組分可相繼給予受試者。更具體地，本發(fā)明涉及使用酸性成纖維細(xì)胞生長因子(成纖維細(xì)胞生長因子-1)、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(成纖維細(xì)胞生長因子-7)、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子-2(成纖維細(xì)胞生長因子-10)、表皮生長因子、轉(zhuǎn)移生長因子-α、轉(zhuǎn)化生長因子-β、胰島素樣生長因子、肝細(xì)胞生長因子或這些生長因子中任一功能上的生物學(xué)等同體聯(lián)合纖溶酶/纖溶酶原、小纖溶酶/小纖溶酶原、微纖溶酶/微纖溶酶原、尿激酶纖溶酶原激活劑、組織纖溶酶原激活劑、鏈激酶或這些激活劑功能上的生物學(xué)等同體和/或用于促進(jìn)動(dòng)物或人類損傷愈合的目的的蛋白酶。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及裝有生長因子容器和胞外基質(zhì)降解蛋白酶容器的試劑盒。各容器的內(nèi)含物可以處于載體溶液中(例如水、緩沖液、生理鹽水、增稠劑、乳劑或膏劑)，或者與載體溶液在第三容器中凍干，以備用戶重建組分。混合試劑盒的組分并置于動(dòng)物或人類的損傷處，用于促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的目的。備選地，試劑盒的個(gè)別組分可以前后或相繼的次序置于損傷處。
本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及通過使用與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子與胞外基質(zhì)降解蛋白酶組合治療動(dòng)物或人類損傷的方法。該方法涉及使用本文所述的試劑盒或其單獨(dú)組分。例如，混合試劑盒的組分，并置于損傷處，或者可將試劑盒的單獨(dú)組分以前后或相繼的次序置于損傷處。備選地，可以購買或制造試劑盒的組分或生物學(xué)等同體，并以所述的方法用于促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的目的。
附圖的簡短說明

圖1.用多種蛋白酶處理KGF。KGF(1.74μM)用多種蛋白酶以所示的濃度于37℃處理1小時(shí)，然后置于凝膠電泳。蛋白用考馬斯亮藍(lán)染色。凝膠圖像利用NIH image 1.62分析。顯示了凝膠泳道的掃描特征。KGF及其切割片段(～16kDa)分別以閉合和開口的箭頭表示。所示分子量范圍內(nèi)的蛋白酶條帶用星號(hào)表示。標(biāo)準(zhǔn)的分子量(kDa)顯示在頂部。電泳方向以實(shí)心箭表示。
圖2.胰蛋白酶、纖溶酶和胰凝乳蛋白酶在KGF上的切割位點(diǎn)。通過～16kDa切割片段(見表1)的N-端序列分析鑒定的切割位點(diǎn)以箭頭表示。成熟KGF(163個(gè)氨基酸)的氨基酸自N-端起連續(xù)編號(hào)。
圖3.用胰蛋白酶或纖溶酶以多種酶濃度消化KGF和FGF-10。KGF(1.74μM)或FGF-10(1.74μM)用胰蛋白酶或纖溶酶以多種濃度消化。電泳和蛋白染色與圖1相同。KGF及其切割片段(dN23KGF)的OD大小與FGF-10及其切割片段(～16kDa)的一起顯示。
3a)KGF和纖溶酶；3b)KGF和胰蛋白酶；3c)FGF-10和纖溶酶；以及3d)FGF-10和胰蛋白酶。
圖4.胰蛋白酶或纖溶酶對(duì)KGF延長的消化。電泳和蛋白染色與圖1相同。
4a)KGF(1.74μM)用胰蛋白酶(1380nM)或纖溶酶(960nM)消化。在于37℃溫育后1小時(shí)或6小時(shí)取樣。顯示了胰蛋白酶或纖溶酶處理后KGF(對(duì)照沒有酶處理)及其切割片段(dN23KGF)的OD大??；和
4b)KGF(1.74μM)用纖溶酶(2400nM)消化。在于37℃溫育后30分鐘或3小時(shí)取樣。顯示了切割片段(dN23KGF)的OD大小。
圖5.細(xì)胞增殖測定。KGF用胰蛋白酶、纖溶酶或胰凝乳蛋白酶在與圖1相同的條件下處理，除了各酶的酶濃度高2倍。反應(yīng)混合物與FBS混合，并于含0.5％FBS的EMEM中稀釋，之后施加給Balb/MK細(xì)胞。在于37℃溫育48小時(shí)后，添加MTT染料。另外溫育4小時(shí)后添加細(xì)胞裂解液。細(xì)胞在濕室中保持過夜，之后測量570nm的OD。
圖6.在血纖蛋白凝膠和角質(zhì)形成細(xì)胞介導(dǎo)的血纖蛋白溶解中，KGF和纖溶酶原(″Plg″)組合對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和增殖的影響。
6a)將細(xì)胞種植到24孔板的血纖蛋白凝膠上(1000細(xì)胞/孔)，然后用KGF、纖溶酶原或其組合處理。在于37℃溫育5天后，到達(dá)并粘附于板表面的細(xì)胞在胰蛋白酶消化后用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)；和6b)在24孔板的由或未由KGF預(yù)處理(37℃3小時(shí))的Balb/MK細(xì)胞(5000細(xì)胞/孔)上形成有或無纖溶酶原的血纖蛋白凝膠。于37℃溫育3小時(shí)后，從各孔取出殘余的血纖蛋白凝膠連同培養(yǎng)基，并在10,000g離心5分鐘。通過BCA測定確定上清中可溶蛋白的濃度。
圖7.創(chuàng)傷液對(duì)KGF的切割。KGF用在術(shù)后2天或4天從完整厚度的豬皮收集的創(chuàng)傷液在存在或不存在bdelin時(shí)處理。通過凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜上的蛋白用抗-KGF抗體探測。
7a)10μl反應(yīng)體積中在術(shù)后2天或4天收集的創(chuàng)傷液(5μl)對(duì)KGF的切割；和7b)12.5μl反應(yīng)體積中多種量的Bdelin抑制4天創(chuàng)傷液(5μl)對(duì)KGF的切割。標(biāo)準(zhǔn)分子量(kDa)示于頂部。電泳方向以實(shí)心箭標(biāo)示。
圖8.纖溶酶對(duì)天然KGF的切割。從小鼠成纖維細(xì)胞系929細(xì)胞中分離的天然KGF用纖溶酶連同重組人類KGF一起處理。處理后，通過凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜上，并用兔抗-KGF C-末端抗體探測。重組KGF及其切割片段(dN23KGF；～16kDa)分別以閉合和開口的箭頭標(biāo)示，而天然KGF及其切割片段(～16kDa)分別以閉合和開口的箭標(biāo)示。標(biāo)準(zhǔn)分子量(kDa)示于頂部。電泳方向以實(shí)心箭標(biāo)示。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明縮寫下列縮寫將在文中使用aFGF，酸性成纖維細(xì)胞生長因子；Arg，精氨酸；BCA，bicinchoninic acid；bFGF，堿性成纖維細(xì)胞生長因子；CMC，羧甲基纖維素；dN23KGF，缺失N-端頭23各氨基酸的KGF分子；EGF；表皮生長因子；FGF，成纖維細(xì)胞生長因子；HGF，肝細(xì)胞生長因子；IGF-I，胰島素樣生長因子I；KGF，角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子；Ser，絲氨酸；tPA，組織纖溶酶原激活劑；轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)；轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)；uPA，尿激酶纖溶酶原激活劑；uPAR，纖溶酶原激活劑受體。
術(shù)語術(shù)語“創(chuàng)傷”是指組織和器官完整性的外部或內(nèi)部的任何破壞。它也與術(shù)語“損傷”互換使用。創(chuàng)傷可能涉及許多不同類型的細(xì)胞，包括上皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，以及多種免疫細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞。涉及上皮起源的細(xì)胞的損傷包括那些處于皮膚、粘膜表面、口腔、消化道、眼睛或肺中或其表面的損傷。
術(shù)語“重組蛋白”是指在原核或真核系統(tǒng)中由攜帶編碼該蛋白的合適的表達(dá)載體產(chǎn)生的蛋白或蛋白的活性部分。編碼蛋白的DNA序列可以是合成的，或者利用本領(lǐng)域眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)由細(xì)胞mRNA克隆的。
術(shù)語“核酸表達(dá)載體”是指任何類型的基因構(gòu)建體，包含編碼能夠轉(zhuǎn)錄的RNA的核酸。術(shù)語“表達(dá)載體”也可與之互換使用。
如本文所用的，術(shù)語生長因子、胞外基質(zhì)降解蛋白酶或纖溶酶原激活劑“功能上的生物學(xué)等同體”，是天然具有或者被改造包含不同的氨基酸序列，而同時(shí)與野生型生長因子、酶或酶激活劑相比又具有相似或改善的生物學(xué)活性的多肽。
術(shù)語“載體”是指將核酸遞送到細(xì)胞或生物體內(nèi)的任何介質(zhì)。實(shí)例包括質(zhì)粒載體、病毒載體、脂質(zhì)體或陽離子脂質(zhì)。
術(shù)語“切割”是指將分子切開或拆分為兩個(gè)或多個(gè)片段，可能(possibility)是至少一個(gè)片段是不能再被切開的穩(wěn)定產(chǎn)物，如用給定技術(shù)所檢測的那樣，并且可能保留全部或多數(shù)與該分子相關(guān)的原始活性。
術(shù)語“降解”是指將分子切開或拆分為用給定技術(shù)不可檢測的小片段。
術(shù)語“相關(guān)酶”是指在功能、特異性、結(jié)構(gòu)上與另一個(gè)有關(guān)的酶，或者是相同酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的一部分。
術(shù)語“相關(guān)生長因子”是指在功能或結(jié)構(gòu)上與另一個(gè)有關(guān)的生長因子。
分子生物學(xué)技術(shù)包括那些用于核酸和蛋白分子分離、純化、生產(chǎn)、分析、修飾和操縱的技術(shù)。重組DNA技術(shù)是指那些用于分離、純化和操縱DNA序列的技術(shù)。這些技術(shù)在Current Protocols of MolecularBiology(Ausubel等編輯，vol.1-4，John Wiley & Sons)以及MolecularCloning(Sambrook J等，vol.1-3，第二版，1989，Cold Spring HarborPress)中有充分描述。這些技術(shù)的實(shí)例包括核酸或蛋白的分離和純化、逆轉(zhuǎn)錄、PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、體外誘變、限制性酶切、克隆到多種(質(zhì)粒)載體中、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化以及原核(細(xì)菌)或真核細(xì)胞(酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物)中的蛋白表達(dá)。
雖然現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)創(chuàng)傷或損傷可用蛋白水解酶或蛋白生長因子獨(dú)立治療，但同時(shí)使用兩者最初似乎是不合直覺的，即使蛋白生長因子和酶的功能似乎是令人稱贊的。這種推理最明顯的理由是蛋白水解酶行使水解(消化)蛋白的能力。因而，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，蛋白生長因子(如KGF)和消化蛋白的酶(如纖溶酶)的組合作為創(chuàng)傷愈合的療法最初似乎是起反作用的，達(dá)不到目標(biāo)的。然而，本發(fā)明提供了這樣的結(jié)果，它表明了通過生長因子和蛋白水解酶組合的協(xié)同效應(yīng)。尤其期望此類組合制劑得以生產(chǎn)并基于其在體內(nèi)條件下復(fù)雜的相互作用加以利用。
發(fā)現(xiàn)人類KGF在N-端Arg23-Ser24鍵處可由纖溶酶或胰蛋白酶切割，并且所得的片段dN23KGF(缺失N-端頭23個(gè)氨基酸的KGF)是穩(wěn)定的、抵抗酶消化的。需要注意的是用胰蛋白酶時(shí)，只有高酶濃度導(dǎo)致dN23KGF輕微降解。此外，uPA和tPA，其將纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，對(duì)KGF沒有作用。同樣重要的是，dN23KGF仍然具有與完整KGF一樣的活性。由胰凝乳蛋白酶去除另外兩個(gè)氨基酸產(chǎn)生dN25KGF(缺失N-端頭25個(gè)氨基酸的KGF)，具有降低的生物學(xué)活性。這些結(jié)果與以前通過重組DNA技術(shù)對(duì)KGF的功能結(jié)構(gòu)域分析一致，即，可去除KGF N-末端直到氨基酸23(精氨酸)而不喪失任何生物學(xué)活性(Ron等，J.Biol.Chem.268，2984-2988(1993)；Osslund等，Protein Science 7，1681-1690(1998))。纖溶酶在精氨酸或賴氨酸殘基處切割蛋白，而且因?yàn)楦鶕?jù)其一級(jí)序列(即它具有10個(gè)精氨酸和17個(gè)賴氨酸殘基)，KGF中存在許多潛在的纖溶酶切割位點(diǎn)，在Arg23特定位點(diǎn)切割產(chǎn)生穩(wěn)定的活性片段(dN23KGF)是出乎預(yù)料的。
也發(fā)現(xiàn)KGF被創(chuàng)傷液中的纖溶酶切割，并且從成纖維細(xì)胞中分離的天然KGF也被纖溶酶切割，產(chǎn)生具有與由重組KGF獲得的dN23KGF相同大小的C-末端片段。此外，纖溶酶原和KGF的組合協(xié)同地提高角質(zhì)形成細(xì)胞介導(dǎo)的血纖蛋白溶解以及角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和增殖。因而，盡管不希望被理論束縛，似乎KGF和纖溶酶在創(chuàng)傷愈合期間或上皮再形成過程中作用于上皮細(xì)胞功能的兩個(gè)獨(dú)立而協(xié)同的方面；KGF刺激上皮細(xì)胞增殖，而纖溶酶(或者間接地纖溶酶原激活劑)通過清除血纖蛋白凝塊和相關(guān)胞外基質(zhì)組分促進(jìn)其遷移。
盡管不希望被理論束縛，dN23KGF可能具有增強(qiáng)的生物學(xué)活性，該活性可能不會(huì)由所用的當(dāng)前的體外測定系統(tǒng)顯示，并且可能歸因于許多因素，包括對(duì)細(xì)胞受體的親和力和/或蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提高。同時(shí)，切割也可作為整個(gè)生長因子降解過程的初始步驟。′278專利披露對(duì)于Δ23KGF(缺失N-端頭23個(gè)氨基酸的KGF分子)觀察到提高的促有絲分裂活性，這與dN23KGF相似，如果不是完全相同的話。
血漿中的纖溶酶原濃度很高(1.5-2μM或135-180μg/ml)(Collen和Lijnen，F(xiàn)ibrinolysis and the Control of Hematostasis，in TheMolecular Basis of Blood Diseases(G.S.Stamatoyannopoulos，A.W.Nienhuis，P.W.Majerus和H.Varmus編輯).W.B.Saunders Co(1994)，Pages 725 to 752)。未詳細(xì)檢測創(chuàng)傷或創(chuàng)傷液中的纖溶酶濃度。據(jù)報(bào)道，角膜創(chuàng)傷愈合期間淚液中的纖溶酶濃度為～37.9μg/ml(van Setten等，Current Eye Research 81293-1298，1989)。盡管不希望被理論束縛，可能的最高纖溶酶濃度是血漿中假設(shè)不涉及特異性富集機(jī)制的急性纖溶酶原濃度。創(chuàng)傷中的纖溶酶濃度很可能受uPA和/或tPA的表達(dá)水平以及創(chuàng)傷情況的影響。本實(shí)驗(yàn)所用的最高纖溶酶濃度是2400nM或213μg/ml，這超出體內(nèi)條件下可能的最高生理學(xué)濃度。在該濃度的1/5時(shí)，纖溶酶徹底切割1.74μM或33μg/ml的KGF。在所有測試的纖溶酶濃度下在延長的37℃溫育期內(nèi)，切割片段(dN23KGF)僅有最低程度(＜5％)的或者沒有降解。
并非所有的生長因子蛋白在降解條件下都是穩(wěn)定的。例如，F(xiàn)GF-10是同一FGF家族的另一成員，并且由于其與KGF的相似性，也被稱之為KGF-2。KGF和FGF-10都主要地作用于上皮細(xì)胞，但就肝素結(jié)合強(qiáng)度、受體結(jié)合特異性以及創(chuàng)傷中的表達(dá)水平而言有差異。我們的實(shí)驗(yàn)證明FGF-10被纖溶酶和胰蛋白酶降解，沒有穩(wěn)定的切割片段。這些結(jié)果進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了KGF與存在于創(chuàng)傷環(huán)境中的蛋白酶效應(yīng)有關(guān)的獨(dú)特性。
從而，可制備KGF和纖溶酶/纖溶酶原獨(dú)特的組合，并用于治療涉及上皮細(xì)胞的損傷。此種組合用FGF-10不能實(shí)現(xiàn)，至少和纖溶酶(活性酶)不行。盡管不希望被理論束縛，當(dāng)恰當(dāng)?shù)嘏渲朴谒幬锝M合物中時(shí)，這種組合能夠?qū)?duì)于上皮再形成過程(即刺激上皮細(xì)胞增殖/分化并通過清除血纖蛋白凝塊和相關(guān)的胞外基質(zhì)組分促進(jìn)其遷移)必不可少的兩個(gè)獨(dú)立但協(xié)同的功能結(jié)合起來。的確，該組合在體外測定系統(tǒng)中展示了對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和遷移的協(xié)同刺激。另外，當(dāng)KGF被創(chuàng)傷液中的纖溶酶切割時(shí)，它加強(qiáng)了KGF和纖溶酶/纖溶酶原組合的生理學(xué)相關(guān)性和潛在的益處。該觀念可進(jìn)一步由分離自成纖維細(xì)胞的天然KGF也被纖溶酶切割，產(chǎn)生具有與由重組KGF所獲得的dN23KGF相同大小的C-末端片段的發(fā)現(xiàn)加強(qiáng)。
從而，本發(fā)現(xiàn)優(yōu)選的實(shí)施方案是胞外基質(zhì)降解蛋白酶和與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子的組合，其用于治療涉及上皮起源的細(xì)胞或生長因子可能影響的任何其它細(xì)胞類型的創(chuàng)傷或疾病狀況。該組合如下實(shí)現(xiàn)1)在施用前或期間，在物理上一齊混合兩者；2)一個(gè)在前一個(gè)繼后施用；或3)使用輪流的治療方案(即，在一個(gè)治療周期內(nèi)用一個(gè)治療疾病狀況，之后在下一個(gè)治療周期內(nèi)用另一個(gè)治療)。
優(yōu)選生長因子不被活性形式的胞外基質(zhì)降解蛋白酶失活。另外，生長因子與上皮細(xì)胞功能相關(guān)，并且優(yōu)選是KGF或相關(guān)的生長因子。而且，蛋白酶直接或間接地與胞外基質(zhì)降解相關(guān)，并且優(yōu)選是纖溶酶/纖溶酶原或相關(guān)的酶。該組合被用于治療涉及上皮細(xì)胞及生長因子可能影響的其它細(xì)胞類型的創(chuàng)傷或損傷。生長因子和酶可作為天然蛋白從人類或動(dòng)物血液、組織或培養(yǎng)的細(xì)胞中分離，或者作為重組蛋白通過重組DNA技術(shù)在原核或真核系統(tǒng)中生產(chǎn)。
由于可對(duì)根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和/或蛋白進(jìn)行修飾和/或改變，而同時(shí)獲得具有相似或改善特征的分子，此類生物學(xué)上的功能等同體也涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。
A.修飾的多核苷酸和多肽生物學(xué)功能等同體可包括被改造以包含不同序列而同時(shí)保留編碼“野生型”或標(biāo)準(zhǔn)蛋白的能力的多核苷酸。這可由于遺傳密碼子的簡并性實(shí)現(xiàn)，即編碼同一氨基酸的多密碼子的存在。在一個(gè)實(shí)例中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可能希望在多核苷酸中引入限制性酶識(shí)別序列，而不破壞該多核苷酸編碼蛋白的能力。
在另一個(gè)實(shí)例中，多核苷酸可以是(并編碼)具有更加顯著變化的生物學(xué)功能等同體。蛋白結(jié)構(gòu)中某些氨基酸可被其它氨基酸取代而與結(jié)構(gòu)的交互結(jié)合能力沒有可感知的損失，例如象抗體的抗原結(jié)合區(qū)、底物分子、受體等的結(jié)合位點(diǎn)。所謂的“保守”變化不破壞蛋白的生物學(xué)活性，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)變化并不沖擊該蛋白實(shí)施其原意功能的能力。因而發(fā)明人考慮可在本文公開的基因和蛋白序列中進(jìn)行多種變化，而依然實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
就功能等同體而言，熟練技術(shù)人員將充分理解，“生物學(xué)上的功能等同體”蛋白和/或多核苷酸定義中所固有的，是在保留分子可接受水平的等同生物學(xué)活性的同時(shí)，在分子限定部分可能進(jìn)行的改變數(shù)目有個(gè)限度的概念。生物學(xué)上的功能等同體因而在文中被定義為其中選擇的氨基酸(或密碼子)可被取代的那些蛋白(和多核苷酸)。
B.改變的氨基酸本發(fā)明在許多方面有賴于在細(xì)胞中介由合適多核苷酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯合成肽和多肽。這些肽和多肽將包括20個(gè)“天然”氨基酸，及其翻譯后修飾。不過，體外肽合成允許使用修飾的和/或不尋常的氨基酸，而不偏移本發(fā)明的總體范圍。
C.模擬物除了上文所討論的生物學(xué)功能等同體，本發(fā)明人也考慮結(jié)構(gòu)上相似的化合物，其可配制以模擬本發(fā)明的肽或多肽的關(guān)鍵部分。此類化合物，可稱之為肽模擬物，可以與本發(fā)明的肽相同的方式利用，因而也是功能等同體。
模擬蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)元件的某些模擬物由Johnson等(1993)描述。利用肽模擬物潛在的基本原理在于蛋白的肽主鏈存在主要是為了以促進(jìn)分子相互作用的方式定位氨基酸側(cè)鏈，例如抗體和/或抗原。從而設(shè)計(jì)肽模擬物以允許類似于天然分子的分子相互作用。
肽模擬物概念某些成功的應(yīng)用集中于已知是高度抗原性的蛋白內(nèi)β-轉(zhuǎn)角的模擬物。有可能多肽內(nèi)的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)可通過以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的算法預(yù)測，如本文所討論的那樣。一旦確定了轉(zhuǎn)角的組成氨基酸，可構(gòu)建模擬物以實(shí)現(xiàn)氨基酸側(cè)鏈中必要元件相似的空間取向。
其它方法集中于利用含多二硫鍵的小蛋白作為引誘結(jié)構(gòu)模板，用以生產(chǎn)模擬大蛋白的生物學(xué)活性構(gòu)象。Vita等(1998)。某些毒素中看起來進(jìn)化上保守的結(jié)構(gòu)基序是小(30-40氨基酸)的、穩(wěn)定的并高度允許突變。該基序由在內(nèi)部核心以三個(gè)二硫鍵橋接的β片層和α螺旋組成。
利用環(huán)狀L-五肽和具有D-氨基酸的那些環(huán)狀五肽已成功地模擬了β-II轉(zhuǎn)角。Weisshoff等(1999)。并且，Johannesson等(1999)報(bào)道了具有反向轉(zhuǎn)角誘導(dǎo)性質(zhì)的雙環(huán)三肽。
產(chǎn)生特定結(jié)構(gòu)的方法已在本領(lǐng)域公開。例如，α螺旋模擬物在美國專利No.5,446,128、5,710,245、5,840,833和5,859,184中公開。這些結(jié)構(gòu)使得肽或蛋白更加熱穩(wěn)定，并且也提高對(duì)蛋白水解降解的抗性。也公開了6、7、11、12、13及14元的環(huán)結(jié)構(gòu)。
例如，產(chǎn)生構(gòu)象上受限的β轉(zhuǎn)角和β凸起的方法在美國專利No.5,440,013、5,618,914和5,670,155中公開。β-轉(zhuǎn)角允許改變側(cè)鏈取代基而不改變相應(yīng)的主鏈構(gòu)象，并通過標(biāo)準(zhǔn)合成操作在肽中摻入了合適的界標(biāo)。其它類型的模擬轉(zhuǎn)角包括反向轉(zhuǎn)角和γ轉(zhuǎn)角。反向轉(zhuǎn)角模擬物公開在美國專利No.5,475,085和5,929,237中，而γ轉(zhuǎn)角模擬物公開在美國專利No.5,672,681和5,674,976中。
另外，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案可如實(shí)施例10所概括的以多種技術(shù)制備。此種組合可用多種替代酶或生長因子制備是有可能的。與胞外基質(zhì)降解基質(zhì)直接或間接相關(guān)的替代酶的實(shí)例包括uPA、tPA、鏈激酶、葡萄球菌激酶、普通吸血蝙蝠纖溶酶原激活劑、胰蛋白酶、膠原酶、彈性蛋白酶和金屬蛋白酶。也可以利用與纖溶酶享有相同特異性的酶。與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的替代生長因子的實(shí)例包括EGF、FGF-10、TGF-α、TGF-β、IGF-I、HGF和aFGF。尤其是，F(xiàn)GF-10可與纖溶酶原(無活性酶原)或相關(guān)酶組合是有可能的。
受最近證明KGF也刺激其它細(xì)胞類型(包括微血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞)的發(fā)現(xiàn)的啟示，上述組合也可用于治療涉及這些細(xì)胞的疾病狀況。也已知纖溶酶原和纖溶酶原激活劑通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移參與血管生成。在治療不同細(xì)胞類型時(shí)，有可能組合中的KGF可用不同的生長因子替換，只要生長因子不被基質(zhì)降解蛋白酶失活或降解。
實(shí)施例1胰蛋白酶、纖溶酶和胰凝乳蛋白酶對(duì)KGF的切割利用若干蛋白酶處理由Promega(Madison，Wis.)或PeproTech(Rocky Hill，N.J.)獲得的重組人類KGF(163個(gè)氨基酸)。胰蛋白酶(13,000單位/mg蛋白)、胰凝乳蛋白酶(60單位/mg蛋白)以及豬纖溶酶(3.2單位/mg蛋白)或人血纖溶酶(5.7單位/mg蛋白)由SigmaChemical Co獲得。人類尿液兩鏈尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)(100,000單位/mg蛋白)和人類組織纖溶酶原激活劑(tPA)由Calbiochem(San Diego，Calif.)獲得。將KGF和酶都融解在TN緩沖液(25mM Tris，150mM NaCl，pH7.4)中。它們以所示的濃度混合，并于37℃水浴溫育1小時(shí)或更長時(shí)間，之后與等體積樣品緩沖液混合，并置于15％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上在變性條件下電泳。當(dāng)染料(溴酚蘭)前移到接近凝膠終端時(shí)終止電泳。蛋白條帶通過考馬斯亮蘭染色觀察。染色凝膠的圖像利用帶CCD相機(jī)的GS-5000數(shù)字成像系統(tǒng)(AlphaInfotech Co.)在允許以全灰級(jí)別獲取的設(shè)置下獲取。蛋白條帶的光密度分析利用公共結(jié)構(gòu)域NIH Image 1.62程序(由美國國立衛(wèi)生研究院研發(fā))在Macintosh計(jì)算機(jī)上進(jìn)行。測量各帶的未校準(zhǔn)光密度(OD)。僅在同一凝膠上的條帶之間進(jìn)行比較。
結(jié)果顯示胰蛋白酶、纖溶酶和胰凝乳蛋白酶切割KGF(1.74μM)產(chǎn)生～16kDa的片段(圖1)。由胰蛋白酶和纖溶酶產(chǎn)生的片段表現(xiàn)出相同的大小，而胰凝乳蛋白酶產(chǎn)生的片段似乎稍微更小。相同的條件下，TPA和uPA對(duì)KGF沒有作用(圖1)。當(dāng)提高uPA和tPA的濃度16倍分別到3.04μM和4.16μM時(shí)，KGF保持完整。uPA和tPA的天然底物纖溶酶原作為酶活的對(duì)照。uPA和tPA分別在1.2nM和0.1μM時(shí)徹底切割或激活2.4μM纖溶酶原。這些結(jié)果表明uPA和tPA對(duì)KGF沒有任何影響。
實(shí)施例2
KGF的切割位點(diǎn)對(duì)由胰蛋白酶、纖溶酶或胰凝乳蛋白酶產(chǎn)生的片段進(jìn)行N-末端序列分析。在凝膠電泳分離后，將用胰蛋白酶、纖溶酶或胰凝乳蛋白酶消化的KGF(2μg)轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜(Millipore，Bedford，MA.)上。蛋白由0.1％考馬斯亮蘭在40％甲醇和10％乙酸中染色20秒，然后在40％甲醇中脫色。然后用去離子水洗膜并風(fēng)干。將酶產(chǎn)生的～16kDa片段切下利用Edman測序法在Hewlett-Packard G1000A自動(dòng)化蛋白測序儀上進(jìn)行N-末端氨基酸序列分析。測序結(jié)果允許鑒定切割位點(diǎn)。這樣，所有的酶在N-末端切割KGF，胰蛋白酶和纖溶酶在Arg23-Ser24處，而胰凝乳蛋白酶在Tyr25-Asp26處(表1，圖2)。因此，胰蛋白酶和纖溶酶產(chǎn)生dN23KGF(缺失N-端頭23個(gè)氨基酸的KGF)而胰凝乳蛋白酶產(chǎn)生dN25KGF(缺失N-端頭25個(gè)氨基酸的KGF)。
利用綴合于KLH(Sigma-Genosys，Woundlands，Tex.)的合成肽產(chǎn)生兔抗-KGF C-末端肽(CGKKTKKEQKTAHFLPMAIT)抗體。纖溶酶處理或未處理的KGF通過電泳分離，并印跡到Immobilon-P膜上。膜用抗-肽抗體探測，用堿性磷酸酶綴合的抗-兔IgG和酶底物BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚膦酸鹽/硝基蘭四唑)檢測。結(jié)果顯示dN23KGF同KGF一樣，與抗-肽抗體強(qiáng)烈反應(yīng)，表明dN23KGF C-末端是完整的，或者說未發(fā)生涉及多于C-末端20個(gè)氨基酸的切割。這與dN23KGF的大小(～16kDa)一致，另外缺失C-末端20個(gè)氨基酸將會(huì)使dN23KGF的大小降至～14kDa。
從而，dN23KGF在N-末端與Δ23KGF-144Q和Δ23KGF完全相同。如數(shù)據(jù)所提示的，假如在dN23KGF的C-末端不發(fā)生切割，它在C-末端可能也與后者相同。Δ23KGF-144Q和Δ23KGF都已經(jīng)證明具有增強(qiáng)的促有絲分裂效應(yīng)或熱穩(wěn)定性或兩者兼而有之。
實(shí)施例3酶濃度對(duì)dN23KGF穩(wěn)定性的影響酶消化于37℃如實(shí)施例1進(jìn)行1小時(shí)，但在多種酶濃度下。結(jié)果證明KGF的切割是酶濃度依賴性的。利用13.8nM或更高的胰蛋白酶實(shí)現(xiàn)完整KGF(1.74μM)＞50％的切割(圖3b)。事實(shí)上，幾乎所有的KGF分子在13.8nM時(shí)切割，并且在13.8nM時(shí)實(shí)現(xiàn)相當(dāng)可觀的切割。在另一方面，纖溶酶在480nM時(shí)切割所有的KGF分子，但在48nM時(shí)僅切割其中小部分，這小于胰蛋白酶在1.38nM時(shí)所切割的(圖3a和3b)。人或豬纖溶酶獲得相同的結(jié)果。因而，在KGF切割中纖溶酶不如胰蛋白酶有效，小～34倍(圖3a和3b)。
觀察到盡管KGF分子全部或幾乎全部被切割，但胰蛋白酶在高酶濃度(1380nM)時(shí)產(chǎn)生的dN23KGF片段比較低酶濃度(138nM和13.8nM)時(shí)產(chǎn)生的分別小17％和20％(圖3b)。這表明dN23KGF在高胰蛋白酶濃度(1380nM)時(shí)被進(jìn)一步降解到某種程度。不過，該觀察結(jié)果也證明將胰蛋白酶濃度從13.8到138nM提高10倍，不顯著增加dN23KGF片段的降解。
除去KGF N-末端頭23個(gè)氨基酸導(dǎo)致14％的質(zhì)量降低。與該計(jì)算相一致的是，通過光密度測量觀察到在測試的所有酶濃度下(480和960nM)纖溶酶實(shí)現(xiàn)100％切割時(shí)，dN23KGF占原始KGF的90％(圖3a和4)。這表明dN23KGF在所用的濃度下對(duì)纖溶酶是穩(wěn)定的。類似地，在較低酶濃度下(138和13.8nM)用胰蛋白酶時(shí)，dN23KGF占原始KGF的86％，盡管在高酶濃度(1380nM)時(shí)由于進(jìn)一步降解它僅占71％(圖3b)。
盡管不希望被理論束縛，纖溶酶在血纖蛋白溶解中的作用是降解血纖蛋白。作為酶活對(duì)照，利用與KGF消化相同的條件用纖溶酶和胰蛋白酶處理纖維蛋白原。纖溶酶在48nM或更高時(shí)將纖維蛋白原(490nM)徹底地降解為較小的片段，盡管在4.8nM時(shí)僅最小程度地降解。胰蛋白酶同纖溶酶一樣，也可以切割血纖蛋白(纖維蛋白原)，產(chǎn)生相似的切割產(chǎn)物。Komorowicz等，Biochemistry 379112-9118(1998)。在13.8nM時(shí)胰蛋白酶與在4.8-48nM濃度的纖溶酶以相似的程度切割纖維蛋白原(490nM)。因而，與高34倍的KGF效率相比，在纖維蛋白原降解中，胰蛋白酶至多僅比纖溶酶有效3倍。這樣，纖溶酶似乎能更為有效地切割纖維蛋白原而不是KGF。
實(shí)施例4延長的酶消化對(duì)dN23KGF穩(wěn)定性的影響為進(jìn)一步評(píng)價(jià)暴露于胰蛋白酶或纖溶酶的dN23KGF的穩(wěn)定性，延長37℃下的消化并在多個(gè)時(shí)間取樣。酶以比實(shí)現(xiàn)完全切割更高的濃度使用(圖3a和3b)。結(jié)果證明與溫育1小時(shí)后產(chǎn)生的dN23KGF的量相比，在另外5小時(shí)的溫育之后，用960nM(86μg/ml)的纖溶酶僅再有5％的降低(圖4a)。此外，隨著纖溶酶濃度升至2,400nM(213μg/ml)，當(dāng)將溫育30分鐘后的產(chǎn)生的dN23KGF的量與另外溫育2.5小時(shí)后的量進(jìn)行比較時(shí)，再次只觀察到5％的降低(圖4b)。
用1380nM(33μg/ml)的胰蛋白酶，另外溫育5小時(shí)后，dN23KGF的量有18％的降低(圖4a)。有些觀察到的用胰蛋白酶或纖溶酶的dN23KGF量的降低可能歸因于非酶相關(guān)因子，例如粘附于試管表面和/或自身降級(jí)。溫育期間此類損失很明顯，特別是反應(yīng)中總蛋白濃度低(如KGF對(duì)照)且延長溫育周期時(shí)；KGF對(duì)照另外溫育5小時(shí)后，注意到27％的降低(圖4a)。在相同的摩爾酶濃度下，胰蛋白酶反應(yīng)中的總蛋白濃度(w/v)將比纖溶酶反應(yīng)中的濃度低3倍。
綜上所述，這些結(jié)果，連同實(shí)施例3中所描述的那些結(jié)果，證明dN23KGF對(duì)纖溶酶消化是穩(wěn)定的。它對(duì)胰蛋白酶消化也相對(duì)穩(wěn)定，特別是在較低的酶濃度時(shí)。
實(shí)施例5dN23KGF的生物學(xué)活性使用小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞系Balb/MK。Weissman和Aaronson，Cell32599-606(1983)。細(xì)胞在具有10％FBS和5ng/ml表皮生長因子(Promega，Madison，Wis.)的低鈣培養(yǎng)基EMEM(Biofluids，Washington，D.C.)中培養(yǎng)。對(duì)于增殖測定，將細(xì)胞以1-3×103細(xì)胞/孔種植到96孔板中并于37℃溫育過夜。KGF在與圖1中相同的條件下用酶處理，除了各酶的酶濃度高2倍，以確保KGF的完全切割，這通過凝膠電泳驗(yàn)證。
KGF或酶處理的KGF首先與等體積的FBS混合，然后在含0.5％FBS的EMEM中進(jìn)行系列稀釋，之后添加給細(xì)胞(100μl/孔)。37℃溫育48小時(shí)后，用來自Promega(Madison，WI.)的試劑盒(CellTiter 96)進(jìn)行MTT(四唑鹽)增殖測定。簡要地，向孔中添加MTT染料(15μl/孔)，37℃溫育4小時(shí)后，添加增溶液(100μl/孔)。板在濕室中保持過夜，之后測量570nm的光密度(OD)。
結(jié)果證明胰蛋白酶或纖溶酶產(chǎn)生的dN23KGF依然同完整KGF有一樣的活性。胰凝乳蛋白酶產(chǎn)生的片段(dN25KGF)比完整KGF活性低(圖5)。酶單獨(dú)對(duì)細(xì)胞增殖沒有作用。
實(shí)施例6纖溶酶原和KGF組合對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和增殖以及角質(zhì)形成細(xì)胞介導(dǎo)的血纖蛋白溶解的影響血纖蛋白凝膠涂敷表面上的角質(zhì)形成細(xì)胞遷移測定被用來評(píng)估纖溶酶原和KGF組合對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和增殖的影響。Balb/MK細(xì)胞如上培養(yǎng)。將EMEM(3mg/ml)中的人類無纖溶酶原纖維蛋白原(Calbiochem，San Diego，CA.)與0.02單位/ml的牛凝血酶(Sigma Chemical Co，St.Louis，Mo.)混合，然后置于24孔板(0.5ml/孔)中。板于37℃保持3小時(shí)，以形成血纖蛋白凝膠。用胰蛋白酶從燒瓶中取Balb/MK細(xì)胞，用含10％FBS的EMEM洗滌3次，懸浮于含10％FBS的EMEM(無EGF)中，并種植到血纖蛋白凝膠(1000細(xì)胞/孔)中。溫育過夜后，除去培養(yǎng)基并替換為含纖溶酶原(0、1或5μg/ml)、KGF(0或50ng/ml)或者纖溶酶原和KGF的EMEM。然后細(xì)胞在37℃培養(yǎng)。在24小時(shí)后在纖溶酶原存在下清晰可見血纖蛋白凝膠上單個(gè)細(xì)胞周圍的清晰消化圈。對(duì)照(僅培養(yǎng)基)和KGF處理的細(xì)胞在48小時(shí)后也注意到微弱的消化圈，而且KGF處理細(xì)胞周圍的消化圈看起來比對(duì)照細(xì)胞更突出。單個(gè)細(xì)胞周圍清晰消化圈的出現(xiàn)表明血纖蛋白溶解是細(xì)胞介導(dǎo)的過程；細(xì)胞具有纖溶酶原結(jié)合位點(diǎn)并表達(dá)激活纖溶酶原的uPA。48小時(shí)后，用5μg/ml纖溶酶原(有或無KGF)處理的細(xì)胞消化穿過血纖蛋白凝膠，并粘附于板表面。培養(yǎng)5天后，依然只有用5μg/ml纖溶酶原處理的徹底消化穿過血纖蛋白凝膠。不過，只有用纖溶酶原(5μg/ml)和KGF組合處理的那些細(xì)胞增殖了(圖6a)。這些結(jié)果表明對(duì)于角質(zhì)形成細(xì)胞穿過血纖蛋白凝膠遷移并增殖，KGF和纖溶酶原都是必要的，并且KGF在纖溶酶/纖溶酶原存在下有功能。當(dāng)首先將纖溶酶原和/或KGF摻入到血纖蛋白凝膠時(shí)獲得相同的結(jié)果。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)纖溶酶/纖溶酶原和KGF組合對(duì)血纖蛋白基質(zhì)清除的影響，進(jìn)行角質(zhì)形成細(xì)胞的血纖蛋白消化測定。該測定是基于纖溶酶消化產(chǎn)生的血纖蛋白切割片段是可溶的事實(shí)。將角質(zhì)形成細(xì)胞(Balb/MK)種植到24孔板中(5000細(xì)胞/孔)。細(xì)胞在具有10％FBS的EMEM中于37℃培養(yǎng)24小時(shí)，然后在無FBS的EMEM中培養(yǎng)另外24小時(shí)。部分細(xì)胞首先用KGF(50ng/ml)處理3小時(shí)。然后洗滌細(xì)胞，并接受處于有或無纖溶酶原(10μg/ml)的無血清EMEM(5mg/ml)中的0.5ml纖維蛋白原溶液。在施用前向纖維蛋白原溶液中現(xiàn)加入凝血酶(0.02單位t/ml)。然后細(xì)胞培養(yǎng)另外3小時(shí)。從各孔取出殘余的血纖蛋白凝膠連同培養(yǎng)基，并在10,000g離心5分鐘。取上清，并通過BCA測定確定其蛋白含量。無血清EMEM用作為本底對(duì)照。結(jié)果證明僅有纖溶酶原誘導(dǎo)顯著的血纖蛋白溶解(圖6b)。含纖溶酶原的血纖蛋白凝膠空孔中未觀察到血纖蛋白溶解。用KGF預(yù)處理細(xì)胞進(jìn)一步使纖溶酶原誘導(dǎo)的血纖蛋白溶解增加幾乎20％(圖6b)。同等重要的是，KGF和纖溶酶原聯(lián)合治療導(dǎo)致更多的細(xì)胞呈現(xiàn)遷移細(xì)胞表型，即它們是具有長胞漿突出物的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。這些結(jié)果證明KGF和纖溶酶原協(xié)同促進(jìn)血纖蛋白溶解，并促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移。盡管不希望被理論束縛，它們最可能反映KGF提高角質(zhì)形成細(xì)胞中uPA表達(dá)的事實(shí)，從而導(dǎo)致將更多的纖溶酶原轉(zhuǎn)化纖溶酶，這依次增加了血纖蛋白溶解。
實(shí)施例7多種酶對(duì)FGF-10的降解FGF-10也稱之為KGF-2，是類似于KGF的FGF。因而FGF-10(R&D systems，Minneapolis，Minn.)用切割KGF的酶在與圖1相同的條件下處理。結(jié)果證明胰蛋白酶、纖溶酶和胰凝乳蛋白酶都切割FGF-10(19kDa)，但不產(chǎn)生穩(wěn)定的切割片段。纖溶酶和胰蛋白酶確實(shí)產(chǎn)生了瞬時(shí)的～16kDa片段，其顯然被進(jìn)一步降解。為確定在較低酶濃度時(shí)能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的FGF-10片段，F(xiàn)GF-10用胰蛋白酶和纖溶酶以多種濃度在與圖3a和3b中KGF相同的條件下處理。結(jié)果證明沒有哪種酶濃度下，～16kDa切割產(chǎn)物大于原始FGF-10的20％，盡管在所用的酶濃度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了完整FGF-10的完全切割(圖3c和3d)。這與這兩種酶對(duì)KGF的切割形成強(qiáng)烈對(duì)比；在完整分子實(shí)現(xiàn)完全或幾乎完全切割酶濃度下，切割產(chǎn)物(dN23KGF)占原始KGF的至少70％(圖3a和3b)。這表明胰蛋白酶或纖溶酶產(chǎn)生的FGF-10～16kDa片段以接近原始FGF-10初始切割的效率被進(jìn)一步降解。
實(shí)施例8創(chuàng)傷液對(duì)KGF的切割以及纖溶抑制BDelin的抑制作用在雌性小豬(40-45磅)的后背(背部)通過手術(shù)制備完整厚度的皮膚創(chuàng)傷。各創(chuàng)傷覆以浸泡了生理鹽水的紗布海綿敷料，然后是非滲透性的膜敷料。從術(shù)后2天和4天更換敷料期間取下的浸泡了生理鹽水的紗布海綿中收集創(chuàng)傷液。從4個(gè)不同的創(chuàng)傷中得到總計(jì)8個(gè)創(chuàng)傷液樣品并加以利用。KGF(0.25μg)與5μl創(chuàng)傷液在存在和不存在多種濃度的Bdelin(Sigma Chemical Co.St.Louis，Mo.)時(shí)在10或12.5μl反應(yīng)體積中混合。37℃溫育1小時(shí)后，混合物通過凝膠電泳分離，并印跡到Immobilon-P膜上。膜用羊抗-人KGF或兔抗-人KGF C-末端肽探測(見實(shí)施例2)。用堿性磷酸酶綴合的抗-羊IgG或抗-兔IgG和酶底物BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚膦酸鹽/硝基蘭四唑)檢測。光密度分析如實(shí)施例1進(jìn)行。結(jié)果證明創(chuàng)傷液切割KGF并產(chǎn)生與纖溶酶切割的(dN23KGF)相同大小的片段(圖7a)。切割主要發(fā)生在4天的創(chuàng)傷液中(圖7a)。4天的創(chuàng)傷處于上皮再形成過程的早期階段。切割以劑量依賴性方式被纖溶酶抑制劑bdelin抑制，并且產(chǎn)生的切割片段被所用的最高量的Bdelin(2.5μg)減少4.6倍(圖7b)。這表明創(chuàng)傷液中負(fù)責(zé)KGF切割的酶是纖溶酶，并且產(chǎn)生的片段是dN23KGF。創(chuàng)傷液產(chǎn)生的切割片段(dN23KGF)也與抗-KGF C-末端肽抗體強(qiáng)烈反應(yīng)。綜上所述，這些結(jié)果證明KGF可被創(chuàng)傷液中的纖溶酶切割，產(chǎn)生dN23KGF。
實(shí)施例9纖溶酶對(duì)天然KGF的切割。哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的天然KGF被糖基化且大小(24-28kDa)大于重組KGF。該實(shí)驗(yàn)是為了確定纖溶酶是否也切割從已知表達(dá)KGF的鼠929成纖維細(xì)胞中分離的天然KGF。細(xì)胞在具有5％FBS的DMEM中培養(yǎng)。收集培養(yǎng)基并通過0.2μm過濾器過濾。向各500ml培養(yǎng)基中添加0.5ml肝素-瓊脂糖珠子漿液(50％)。培養(yǎng)基室溫下振搖放置1小時(shí)。珠子用TN緩沖液洗滌，并置于旋轉(zhuǎn)柱上除去過量的緩沖液。用1M NaCl洗脫結(jié)合到珠子上的蛋白。洗脫液逆TN緩沖液透析。然后如上所述用人類纖溶酶處理。重組KGF用作對(duì)照。蛋白通過凝膠電泳分離，并印跡到Immobilon-P膜上。膜用兔抗-人KGF C-末端肽探測(見實(shí)施例2)。用堿性磷酸酶綴合的抗-兔IgG和酶底物BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚膦酸鹽/硝基蘭四唑)檢測。光密度分析如天然KGF象預(yù)期的那樣，確實(shí)具有比重組KGF更大的大小(26kDa)(圖8)。酶消化實(shí)驗(yàn)證明天然KGF被纖溶酶切割，產(chǎn)生具有與由同一酶由重組KGF產(chǎn)生的dN23KGF相同的大小的C-末端切割片段。
實(shí)施例10用于治療創(chuàng)傷或其它疾病狀況的KGF和纖溶酶/纖溶酶原組合或相關(guān)酶的組合配制和加工上述發(fā)現(xiàn)清楚地說明KGF和纖溶酶/纖溶酶原組合或相關(guān)酶的組合可用于治療涉及上皮細(xì)胞的創(chuàng)傷或其它疾病狀況。該組合不僅加速細(xì)胞增殖/分化，而且通過清除血纖蛋白凝塊和相關(guān)胞外基質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞遷移。組合通過物理混合KGF或選自但不限于列表A中的那些相關(guān)生長因子(0.00001％-0.1％(w/v)濃度)與纖溶酶/纖溶酶原或選自但不限于列表B中的那些相關(guān)胞外基質(zhì)降解蛋白酶(處于選自但不限于列表C中的那些藥學(xué)上可接受的載體中，0.0001％-1％(w/v)濃度)實(shí)現(xiàn)。所述組合可進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的選自但不限于列表D中的那些增稠劑。
列表A列表B列表C列表DEGF胰蛋白酶溶液CMCFGF-10 tPA 懸液白明膠HGFuPA 乳劑HPMCTGF-α鏈激酶 固體劑型HECTGF-β葡萄球菌激酶葡聚糖IGF-I 金屬蛋白酶 透明質(zhì)酸aFGF 果膠藻酸鹽殼聚糖列表A中的生長因子連同KGF，都已被證明刺激上皮細(xì)胞增殖。它們多數(shù)也已被證明刺激動(dòng)物和人類的創(chuàng)傷愈合，包括EGF、aFGF、KGF、FGF-10和TGF-β。在人類臨床研究中，它們已被用來治療多種類型的創(chuàng)傷，包括壓迫性潰瘍、靜脈淤積潰瘍和燒傷。在動(dòng)物研究(小鼠、大鼠、兔或豬)中，最常用完全或部分厚度的內(nèi)切或外切創(chuàng)傷。在多數(shù)情況下，將生長因子直接局部施用到創(chuàng)傷表面。各種生長因子劑量為0.1-100μg/cm2的典型范圍使用。生長因子或者處于生理鹽水、緩沖鹽溶液、藥膏中、或者處于膠原海綿基質(zhì)中應(yīng)用。某些制劑含增稠劑。在治療前，可清洗創(chuàng)傷或或去除碎片。治療后，創(chuàng)傷可用多種類型的敷料覆蓋，包括非粘附性可滲透或不可滲透的膜敷料，取決于創(chuàng)傷的類型和實(shí)際的創(chuàng)傷情況。使用多種類型的治療方案，包括每天一次及每周兩次。完整的療程可持續(xù)數(shù)周。結(jié)果通過多種標(biāo)準(zhǔn)判斷，包括上皮再形成、粒組織形成、血管生成、膠原含量、創(chuàng)傷破壞強(qiáng)度以及創(chuàng)傷閉合。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)中的一種或多種，在許多動(dòng)物和人類研究中使用這些生長因子取得了陽性結(jié)果。(Clark R.A.F.(編輯).The molecular and cellular biology of wound repair，Part II.Growth factor in soft tissue healing.pp 171-310.1996.Plenum press.New York；Robson和Smith，Topical use of growth factors to enhancehealing.In Cutaneous wound healing，Vincent F.(編輯.)pp379-398.2001.Martin Dunitz.London)在列表C中，固體劑量形式可以包括但不限于片劑、膠囊、粉末、膜、膠帶、海綿、泡末、墊片及其它基質(zhì)或組合物形式。保留了全部或部分原始活性的生長因子或酶的活性部分或片段或修飾形式可用在該組合中。例如，dN23KGF可代替KGF使用，而小纖溶酶/纖溶酶原可代替纖溶酶/纖溶酶原使用。另外，可使用活性形式的酶或者作為酶原失活形式使用。應(yīng)當(dāng)清楚如果使用活性酶例如纖溶酶與KGF組合，制劑中將會(huì)產(chǎn)生dN23KGF。在另一方面，如果使用失活酶如纖溶酶原，則不會(huì)產(chǎn)生dN23KGF。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及裝有具有生長因子(如列表A)的容器以及具有胞外基質(zhì)降解蛋白酶或激活劑(如列表B)的容器的試劑盒。各容器的內(nèi)含物可處于載體溶液(如列表C或列表D)中，或者與載體溶液(如列表C或列表D)凍干置于第三容器內(nèi)以備用戶重建組分。試劑盒用戶能夠明白將試劑盒組分混合并置于動(dòng)物或人類損傷處，用于促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的方案。備選地，試劑盒的單獨(dú)組分可以前后或相繼的次序置于損傷處。生長因子和酶都可以作為天然蛋白通過從人類或動(dòng)物血液、組織或培養(yǎng)的細(xì)胞中分離產(chǎn)生，或者作為重組蛋白通過重組DNA技術(shù)在原核或真核系統(tǒng)中產(chǎn)生。遞送核酸轉(zhuǎn)化用于本發(fā)明的器官、細(xì)胞、組織或生物體的合適的方法被認(rèn)為包括了如本文所述的或者本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)知曉的能夠?qū)⒑怂?如DNA)引入到器官、細(xì)胞、組織或生物體的幾乎任何方法。此類方法包括，但不限于直接遞送DNA，例如通過離體轉(zhuǎn)染；通過注射(美國專利No.5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，分別特此并入作為參考)，包括微注射(美國專利No.5,789,215，特此并入作為參考)；通過電穿孔(美國專利No.5,384,253，特此并入作為參考；通過磷酸鈣沉淀；通過使用DEAE-葡聚糖，繼之以聚乙二醇；通過直接超聲荷載；通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；通過微注射的槍轟擊(PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 94/09699和95/06128；美國專利No.5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，并且分別特此并入作為參考)；通過siliconcarbide纖維攪拌(美國專利No.5,302,523和5,464,765，分別特此并入作為參考)；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國專利No.5,591,616和5,563,055，分別特此并入作為參考)；通過PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(美國專利No.4,684,611和4,952,500，分別特此并入作為參考)；通過解析/抑制介導(dǎo)的DNA攝取以及此類方法的任何組合。通過應(yīng)用諸如此類的技術(shù)，可穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化器官、細(xì)胞、組織或器官。蛋白或DNA載體組合可配制為液體或干燥的形式。組合可以皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服、局部、鼻內(nèi)給藥，或者通過肺遞送，取決于疾病狀況和藥劑。熟練技術(shù)人員將會(huì)知曉，組合中任一組分的量可根據(jù)待治療的疾病狀況和給藥路徑改變，以能夠在臨床上有效。此外，不作為混合物或組合配制，酶和生長因子可分別配制，并在用前才混合到一起，或者首先施用酶(例如局部、口服、腸胃外或通過注射)，接著是生長因子，或者反之亦然。甚至可以使用交替的治療方案，使用生長因子治療期，之后是酶治療期或反之亦然。添加每一組分之間的時(shí)間可根據(jù)創(chuàng)傷情況和愈合狀態(tài)改變。本發(fā)明包括組合蛋白酶和生長因子以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞功能的協(xié)同作用的原理。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，其它實(shí)施方案可合并上述說明書和實(shí)施例中的概念、方法、生長因子、蛋白酶和裝置。說明書和文中所含的實(shí)施例并不旨在限制本發(fā)明的范圍，而只是用于舉例說明的目的。應(yīng)當(dāng)理解可建立本發(fā)明的其它實(shí)施方案，并落在本發(fā)明及權(quán)利要求的精神和范圍之內(nèi)。
表1由胰蛋白酶、纖溶酶和胰凝乳蛋白酶產(chǎn)生的KGF切割片段的N-末端序列酶 切割片段的N-末端原始產(chǎn)率重復(fù)產(chǎn)率(％)序列* (pmol)纖溶酶 S-Y-D-Y-M 2.6 88.3胰蛋白酶S-Y-D-Y-M 9.7 88.2胰凝乳蛋白酶D-Y-M-E-G 3.19ND*各序列僅在全長KGF氨基酸序列(163個(gè)氨基酸)中發(fā)現(xiàn)一處。其在序列中的位置見圖2。ND，未測。
權(quán)利要求
1.組合物，包含通過混合包含與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子和胞外基質(zhì)降解蛋白酶的成分形成的混合物。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子包括成纖維細(xì)胞生長因子(″FGF″)或其功能上的生物學(xué)等同體。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子包括角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(″KGF″)或其功能上的生物學(xué)等同體。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子包括表皮生長因子(″EGF″)、dN23KGF、KGF-2、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(″aFGF″)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(″TGF-α″)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(″TGF-β″)、胰島素樣生長因子-I(″IGF-I″)、肝細(xì)胞生長因子(″HGF″)或其功能上的生物學(xué)等同體。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括與纖溶酶、纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體相關(guān)的酶。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括小纖溶酶、小纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括微纖溶酶、微纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括胰蛋白酶、金屬蛋白酶、膠原酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶原激活劑或其功能上的生物學(xué)等同體。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中纖溶酶原激活劑包括尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、組織纖溶酶原激活劑(tPA)、鏈激酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
13.組合物，包括通過混合包括成纖維細(xì)胞生長因子和胞外基質(zhì)降解蛋白酶的成分形成的混合物。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中成纖維細(xì)胞生長因子包括角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(″KGF″)或其功能上的生物學(xué)等同體。
15.權(quán)利要求13的組合物，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括與纖溶酶、纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體相關(guān)的酶。
16.權(quán)利要求13的組合物，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
17.權(quán)利要求13的組合物，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
18.權(quán)利要求13的組合物，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括小纖溶酶、小纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
19.權(quán)利要求13的組合物，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括微纖溶酶、微纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
20.權(quán)利要求13的組合物，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括胰蛋白酶、金屬蛋白酶、膠原酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
21.權(quán)利要求13的組合物，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶原激活劑或其功能上的生物學(xué)等同體。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中纖溶酶原激活劑包括尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、組織纖溶酶原激活劑(tPA)、鏈激酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
23.權(quán)利要求13的組合物，其中成纖維細(xì)胞生長因子的濃度為0.00001％[w/v]-0.1％[w/v]，而胞外基質(zhì)降解蛋白酶的濃度為0.0001[w/v]-1％[w/v]。
24.權(quán)利要求13的組合物，進(jìn)一步包含載體。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中載體包括緩沖液、鹽溶液、增稠劑、乳劑或軟膏。
26.試劑盒，包含第一容器的第一載體中包含與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子的第一組分；以及第二容器的第二載體中包含胞外基質(zhì)降解蛋白酶的第二組分。
27.權(quán)利要求26的試劑盒，其中與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子包括成纖維細(xì)胞生長因子(″FGF″)或其功能上的生物學(xué)等同體。
28.權(quán)利要求26的試劑盒，其中與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子包括角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(″KGF″)或其功能上的生物學(xué)等同體。
29.權(quán)利要求26的試劑盒，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括與纖溶酶、纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體相關(guān)的酶。
30.權(quán)利要求26的試劑盒，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
31.權(quán)利要求26的試劑盒，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
32.權(quán)利要求26的試劑盒，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括小纖溶酶、小纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
33.權(quán)利要求26的試劑盒，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括微纖溶酶、微纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
34.權(quán)利要求26的試劑盒，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括胰蛋白酶、金屬蛋白酶、膠原酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
35.權(quán)利要求26的試劑盒，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶原激活劑或其功能上的生物學(xué)等同體。
36.權(quán)利要求35的試劑盒，其中纖溶酶原激活劑包括尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、組織纖溶酶原激活劑(tPA)、鏈激酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
37.權(quán)利要求26的試劑盒，其中第一載體與第二載體相同或不同。
38.權(quán)利要求26的試劑盒，其中第一載體包括水、緩沖液、鹽溶液、增稠劑、乳劑或軟膏。
39.權(quán)利要求26的試劑盒，其中第二載體包括水、緩沖液、鹽溶液、增稠劑、乳劑或軟膏。
40.試劑盒，包含第一容器中包含與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子的第一組分；第二容器中包含胞外基質(zhì)降解蛋白酶的第二組分；以及第三容器中包含載體的第三組分。
41.權(quán)利要求40的試劑盒，其中與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子包括成纖維細(xì)胞生長因子(″FGF″)或其功能上的生物學(xué)等同體。
42.權(quán)利要求40的試劑盒，其中成纖維細(xì)胞生長因子包括角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(″KGF″)或其功能上的生物學(xué)等同體。
43.權(quán)利要求40的試劑盒，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括與纖溶酶、纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體相關(guān)的酶。
44.權(quán)利要求40的試劑盒，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
45.權(quán)利要求40的試劑盒，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
46.權(quán)利要求40的試劑盒，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括小纖溶酶、小纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
47.權(quán)利要求40的試劑盒，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括微纖溶酶、微纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
48.權(quán)利要求40的試劑盒，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括胰蛋白酶、金屬蛋白酶、膠原酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
49.權(quán)利要求40的試劑盒，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶原激活劑或其功能上的生物學(xué)等同體。
50.權(quán)利要求49的試劑盒，其中纖溶酶原激活劑包括尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、組織纖溶酶原激活劑(tPA)、鏈激酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
51.權(quán)利要求40的試劑盒，其中載體包括緩沖液、鹽溶液、增稠劑、乳劑或軟膏。
52.治療動(dòng)物或人類損傷的方法，包括向損傷處施加包含通過混合包含與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子和胞外基質(zhì)降解蛋白酶的成分形成的混合物的組合物。
53.權(quán)利要求52的方法，其中與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子包括成纖維細(xì)胞生長因子(″FGF″)或其功能上的生物學(xué)等同體。
54.權(quán)利要求52的方法，其中與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子包括角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(″KGF″)或其功能上的生物學(xué)等同體。
55.權(quán)利要求52的方法，其中與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子包括表皮生長因子(″EGF″)、dN23KGF、KGF-2、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(″aFGF″)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(″TGF-α″)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(″TGF-β″)、胰島素樣生長因子-I(″IGF-I″)、肝細(xì)胞生長因子(″HGF″)或其功能上的生物學(xué)等同體。
56.權(quán)利要求52的方法，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括與纖溶酶、纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體相關(guān)的酶。
57.權(quán)利要求52的方法，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
58.權(quán)利要求52的方法，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
59.權(quán)利要求52的方法，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括小纖溶酶、小纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
60.權(quán)利要求52的方法，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括微纖溶酶、微纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
61.權(quán)利要求52的方法，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括胰蛋白酶、金屬蛋白酶、膠原酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
62.權(quán)利要求52的方法，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶原激活劑或其功能上的生物學(xué)等同體。
63.權(quán)利要求62的方法，其中纖溶酶原激活劑包括尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、組織纖溶酶原激活劑(tPA)、鏈激酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
64.權(quán)利要求52的方法，其中損傷涉及上皮起源的細(xì)胞，包括處于皮膚、口腔、消化道、粘膜表面、眼或肺之內(nèi)或之上的那些細(xì)胞。
65.權(quán)利要求52的方法，其中損傷涉及生長因子也影響的其它細(xì)胞類型，包括內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或肝細(xì)胞。
66.治療動(dòng)物或人類損傷的方法，包括向損傷處施加兩種組分(a)與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子；和(b)胞外基質(zhì)降解蛋白酶，其中組分(b)在組分(a)之后施加，或者組分(a)在組分(b)之后施加。
67.權(quán)利要求66的方法，其中與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子包括成纖維細(xì)胞生長因子(″FGF″)或其功能上的生物學(xué)等同體。
68.權(quán)利要求66的方法，其中與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子包括角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(″KGF″)或其功能上的生物學(xué)等同體。
69.權(quán)利要求66的方法，其中與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子包括表皮生長因子(″EGF″)、dN23KGF、KGF-2、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(″aFGF″)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(″TGF-α″)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(″TGF-β″)、胰島素樣生長因子-I(″IGF-I″)、肝細(xì)胞生長因子(″HGF″)或其功能上的生物學(xué)等同體。
70.權(quán)利要求66的方法，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括與纖溶酶、纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體相關(guān)的酶。
71.權(quán)利要求66的方法，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
72.權(quán)利要求66的方法，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
73.權(quán)利要求66的方法，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括小纖溶酶、小纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
74.權(quán)利要求66的方法，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括微纖溶酶、微纖溶酶原或其功能上的生物學(xué)等同體。
75.權(quán)利要求66的方法，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括胰蛋白酶、金屬蛋白酶、膠原酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
76.權(quán)利要求66的方法，其中胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括纖溶酶原激活劑或其功能上的生物學(xué)等同體。
77.權(quán)利要求66的方法，其中纖溶酶原激活劑包括尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、組織纖溶酶原激活劑(tPA)、鏈激酶或其功能上的生物學(xué)等同體。
全文摘要
一種將胞外基質(zhì)降解蛋白酶和與上皮細(xì)胞功能相關(guān)的生長因子組合在一起，而所述生長因子不會(huì)被所述蛋白酶降解的組合物。優(yōu)選地，所述蛋白酶為纖溶酶/纖溶酶原或相關(guān)酶，而生長因子為KGF或相關(guān)因子。該組合將上皮再形成過程或痊愈過程所必要的兩個(gè)獨(dú)立但協(xié)同作用的功能，即刺激上皮細(xì)胞增殖/分化和通過清除胞外基質(zhì)組分而促進(jìn)其遷移的兩個(gè)功能結(jié)合起來。該組合可以多種方式構(gòu)建，并且可用于治療創(chuàng)傷或者任何其它涉及上皮起源的細(xì)胞或所述生長因子可能影響的任何其它細(xì)胞類型的病癥。
文檔編號(hào)A61P17/02GK1643140SQ03806198
公開日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2003年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月29日
發(fā)明者倪亞煒, K·M·亞特斯 申請(qǐng)人:卡靈頓實(shí)驗(yàn)公司