專利名稱：嵌合胰腺的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是增加哺乳動物受體胰腺量的方法、組織和組合物。
背景技術(shù)：
自發(fā)或原發(fā)性糖尿病是糖類、脂肪和蛋白代謝的慢性紊亂，其特征在于其絕對或相對胰島素不足、禁食性高血糖、糖尿和向動脈粥樣硬化、微血管病、腎病和神經(jīng)病變發(fā)展的驚人趨勢的完全表現(xiàn)形式。葡萄糖未充分使用是所有糖尿病患者的特征，但是僅一些具有因β細(xì)胞損失導(dǎo)致的清楚明確的嚴(yán)重胰島素不足。大量其他糖尿病患者罹患與對外周組織胰島素的明顯抗性相關(guān)的胰島素分泌反應(yīng)損害。
短語“自發(fā)性糖尿病”包含具有上述共同特征的一組異質(zhì)疾病。已經(jīng)鑒定了該疾病的至少兩個主要和幾個少見的變型。一個主要變型-胰島素依賴性糖尿病(IDDM)(I型)占糖尿病患者的大約10％。第二個主要變型-非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)(II型)代表全部糖尿病患者的剩余90％。缺乏使用外源制備的胰島素的規(guī)律胰島素替代療法和/或仔細(xì)監(jiān)測糖尿病患者的飲食，這種患者會經(jīng)歷廣泛的衰弱癥狀，其中一些可進(jìn)展為昏迷并最終死亡。
在哺乳動物中，胰腺是負(fù)責(zé)維持血糖正常的主要器官。通常，成熟哺乳動物胰腺由稱作背側(cè)胰腺和腹側(cè)胰腺的2個胰芽(或原基)發(fā)育而來。在發(fā)育過程中這些原基將融合形成胰腺，盡管背側(cè)原基首先出現(xiàn)并產(chǎn)生胰腺的大部分。腹側(cè)原基出現(xiàn)于膽管旁邊并形成胰腺頭部和鉤突部分。
成熟胰腺具有外分泌(消化)和內(nèi)分泌(激素)功能。外分泌功能包括分泌酶幫助消化。胰腺激素功能包括至少分泌胰島素和胰高血糖素，兩種激素一起幫助調(diào)節(jié)血液葡萄糖水平。在內(nèi)分泌胰腺內(nèi)部，是組織成稱作胰島的區(qū)域的β細(xì)胞產(chǎn)生和分泌胰島素。胰高血糖素是由胰島內(nèi)部的α細(xì)胞分泌的。
已經(jīng)做了很多嘗試通過手術(shù)方法來替代糖尿病受體中胰腺量和/或功能。例如，將來自人尸胰腺的消化和分離的胰島移植給免疫抑制的糖尿病人是建立的治療糖尿病的方法，但是是實驗性方法。在現(xiàn)有技術(shù)條件下，這個技術(shù)的主要限制是可利用進(jìn)行移植的人胰腺組織的供應(yīng)不足。此外，在消化和分離步驟過程中胰島組織可能損失或退化，而且移植后僅一部分被移植的胰島移入宿主。胰島內(nèi)β細(xì)胞的量增加也可能是次佳的，因為這種移植物顯示出擴(kuò)充β細(xì)胞群的潛力有限。此外，免疫抑制和任何尸體移植中涉及的有關(guān)問題可能十分重要。
本領(lǐng)域也已知未成熟完整大鼠胎胰腺同基因移植到大鼠腎被膜下間隙、前眼室、睪丸、皮下袋、第三心室和頰袋。這種工作也包括胰島素處理對所移植組織的生長和分化的作用。
也已知膠原酶消化和分離的成熟大鼠和倉鼠胰島移植給倉鼠皮膚皺褶和紋狀肌組織，其中分離的胰島重新形成血管。已知至少兩個免疫抑制方案，環(huán)孢菌素A(CsA)和15-脫氧精胍菌素(DOS)對這種異種移植有用。類似地，已知分散發(fā)育中大鼠胰腺(切碎、分離和膠原酶消化)注射到四氧嘧啶糖尿病大鼠的腹膜腔或腎囊下部位至少短暫逆轉(zhuǎn)它們的糖尿病。
豬胎胰腺的分離胰島簇也已經(jīng)用作人糖尿病患者的異種移植物。因此，已知從豬胎分離胰島并將胰島注射到人糖尿病患者的靜脈。這種步驟的一個顯著問題是需要用環(huán)孢菌素、潑尼松龍和硫唑嘌呤維持免疫抑制。另外的問題是這種移植物無助于受體達(dá)到循環(huán)葡萄糖水平的控制。
現(xiàn)有方法的缺點是明顯的。分散和聚集細(xì)胞方法需要大量供體組織并且通常每個受體需要多個供體。也需要強(qiáng)勁的免疫抑制幫助避免移植細(xì)胞的急性排斥。而且，在分散形式細(xì)胞和聚集移植物的情況下，實際植入可能難以控制并且未曾產(chǎn)生單一發(fā)育中嵌合器官。除了其它差異，現(xiàn)有的完整成年或未成熟胰腺組織的植入所利用的組織發(fā)育得比本發(fā)明的組織實質(zhì)上更高并且沒有集中于腹膜作為移植位置。結(jié)果，現(xiàn)有技術(shù)顯示超急性和/或急性血管排斥風(fēng)險增加以及多余和不必要外分泌胰腺功能發(fā)生的可能。僅本發(fā)明允許發(fā)育為新形成血管的嵌合胰腺器官，該器官具有內(nèi)分泌但沒有外分泌功能，同時基本上避免或降低了至少超急性和急性血管移植排斥。
本發(fā)明的嵌合胰腺實質(zhì)上增加或至少能夠增加宿主內(nèi)的有功能重量，在宿主內(nèi)建立至少接近正常水平的血糖(glycemia)。這至少由下列事實反映1)植入時未成熟胰腺組織移植物中缺乏胰島素和移植兩周后發(fā)育中胰島中存在這種分泌的胰島素；和2)鏈脲菌素糖尿病大鼠中未成熟胰腺組織的移植和隨該組織發(fā)育和成熟宿主所產(chǎn)生的血糖正常之間延遲大約30天。
因此，并鑒于任何現(xiàn)有方法不能產(chǎn)生人糖尿病的有效治療，需要開發(fā)將未成熟胰腺組織移植給哺乳動物受體來增加受體胰腺量的新方法、組織和組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個實施方案涉及增加哺乳動物受體胰腺量(pancreaticmass)的新方法，包括從哺乳動物供體收獲未成熟胰腺組織和在允許胰腺組織變得形成血管和成熟，由此發(fā)育為在受體中至少產(chǎn)生胰島素的有功能的嵌合內(nèi)分泌胰腺的條件下將所述組織移植到哺乳動物受體的腹膜腔。
本發(fā)明的另一個實施方案是適合移植到哺乳動物受體腹膜腔用于增加該哺乳動物受體胰腺量的哺乳動物未成熟胰腺組織。
本發(fā)明的另一個實施方案是免疫抑制移植到哺乳動物受體腹膜腔內(nèi)的未成熟胰腺組織移植物的受體來降低移植組織排斥機(jī)會的免疫抑制組合物和方法。
本發(fā)明的另一個實施方案是共刺激阻斷移植到哺乳動物受體腹膜腔的未成熟胰腺組織移植物的受體的免疫反應(yīng)來降低移植組織排斥機(jī)會的受體共刺激阻斷組合物和方法。
本發(fā)明的另一個實施方案包括處理收獲的組織增強(qiáng)移植后組織生長和發(fā)育的組合物和方法。這個實施方案可以包括在移植前將適合移植到哺乳動物受體腹膜腔的分離的哺乳動物未成熟胰腺組織與生長因子共同孵育，增加哺乳動物受體中移植組織的移植后生長和發(fā)育。
在這里的每個實施方案中，未成熟胰腺組織可以包含胎兒哺乳動物胰腺組織，它在收獲時基本上未被供體形成血管和基本上不含抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明的一個目的是提供將未成熟哺乳動物胰腺組織移植給哺乳動物受體增加該受體的胰腺量的方法、組織和組合物。
在下文中，其它方面和特征一部分是明顯的，一部分將被指出。


圖1A是移植到小鼠網(wǎng)膜(omentum)后14天的胚胎(E)第28天的豬后腎(pm)。
圖1B和1C顯示了移植到小鼠網(wǎng)膜后14天的豬后腎的蘇木精(hemotoxylin)和伊紅(“H&E”)染色的石蠟包埋切片。腎小球被標(biāo)為(g)；圖1D圖解了移植到小鼠網(wǎng)膜后14天的已發(fā)育豬后腎用小鼠特異性內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記抗CD31染色的石蠟包埋切片。在豬后腎中描繪了染色陽性(CD31陽性)的小鼠來源的血管結(jié)構(gòu)(箭頭和箭頭尖)；顯示了A&B(A)及C和D的放大率。
圖2A是移植到小鼠網(wǎng)膜后14天的豬后腎(m)；圖2B-2E顯示了移植的后腎的H&E染色切片。腎小球被標(biāo)為(g)，顯示了A&B(B)，C，D和E的放大率；圖3A是來自E12.5 Lewis大鼠胚胎的十二指腸(duo)的切片照片。背側(cè)胰腺原基(dp)和腹側(cè)胰腺原基(vp)被標(biāo)出；圖3B是去除十二指腸的dp和vp的H&E染色切片；圖3C是圖3B和3C所示背側(cè)胰腺的高倍視圖，顯示了管泡狀細(xì)胞(tubulo-acinar cells)的凝聚束(condensing cord)(箭頭)；圖4A顯示了從E12.5 Lewis大鼠胚胎獲得的胰腺原基的H&E染色切片；圖4B顯示了抗胰島素抗體染色的原基的相鄰切片，組織切片中顯示沒有陽性染色；圖4C至4F顯示了移植后兩周的胰腺原基，4C和4E顯示了對照染色切片，4D和4F顯示了抗胰島素抗體的染色。箭頭描繪了胰島為陽性染色結(jié)構(gòu)；圖5A是移植到成年Lewis大鼠腹膜后6周的腹側(cè)胰腺原基的對照抗體染色的切片。陰性染色組織用箭頭描繪；圖5B是抗胰島素抗體染色的相鄰切片。箭頭描繪了胰島組織。該組織經(jīng)歷了生長，移植后2周時存在更多胰島。
圖5C和5D分別是另一個對照抗體染色切片和另一個抗胰島素染色切片的高倍視圖。
圖5E和5F是抗胰島素抗體染色的組織切片，其中待連接導(dǎo)管上皮的發(fā)育中導(dǎo)管狀胰島用箭頭描繪；圖6圖解了移植后大約十五周的胰腺原基，顯示出腹膜脂肪包繞的基質(zhì)內(nèi)胰島組織的嵌合器官結(jié)構(gòu)，箭頭描繪胰島；圖6A是H&E染色切片；圖6B是對照染色的切片；圖6C和6D是抗胰島素染色的切片；
圖7A顯示了移植后十五周恢復(fù)的胰腺組織切片，箭頭表示胰島；圖7B為了對比，顯示了來自新生大鼠的背側(cè)胰腺原基切片，腺泡細(xì)胞用箭頭尖表示，而胰島用箭頭表示；圖8A顯示了胰島內(nèi)細(xì)胞的電子顯微鏡圖像，其中細(xì)胞被含有代表結(jié)晶胰島素(箭頭)的偏心濃密核的神經(jīng)分泌顆粒填充；圖8B顯示了顆粒的更高放大圖像；圖9顯示了同基因移植、未手術(shù)對照和誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在三十五天期間的對比葡萄糖水平；圖10顯示了同基因移植、未手術(shù)對照和誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在四個月期間的對比葡萄糖水平；圖11A是顯示異種移植(xeno-transplanted)(大鼠給載體處理的小鼠)未成熟胰腺組織在移植后四周的橫截面的玻片；圖11B是顯示異種移植(大鼠給共刺激阻斷處理的小鼠)未成熟胰腺組織在移植后四周的橫截面的玻片；和圖12顯示了顯示不同染色方案的異種移植大鼠胰腺的橫截面圖12A顯示了對照血清；圖12B顯示了突出產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞的抗胰島素抗體的使用；和圖12C顯示了突出胰島的組合Gomori染色(每欄用箭頭標(biāo)明)。
詳細(xì)說明提供下列詳細(xì)說明書幫助那些本領(lǐng)域技術(shù)人員實施本發(fā)明。本說明書不應(yīng)被解釋為過分限制本發(fā)明，因為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以在不背離本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的精神或范圍的情況下作出這里討論的實施方案的改動和變型。
本申請中引用的所有出版物、專利、專利申請、數(shù)據(jù)庫和其它參考文獻(xiàn)，這里參考的所有相關(guān)申請和其中引用的所有參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容并入作為參考，如同在這里全部重新敘述和如同具體和單獨指明每個出版物、專利、專利申請、數(shù)據(jù)庫或其它參考文獻(xiàn)并入作為參考。
本發(fā)明的一個實施方案涉及增加哺乳動物受體的胰腺量的新方法，包括從哺乳動物供體收獲未成熟胰腺組織和在允許胰腺組織被起源于宿主的血管形成血管和成熟，由此發(fā)育為在受體中至少產(chǎn)生胰島素的有功能的嵌合內(nèi)分泌胰腺的條件下將所述組織移植到哺乳動物受體的腹膜腔中。該未成熟胰腺組織可以包括未成熟哺乳動物胰腺組織，它在收獲時至少基本上未被供體形成血管和至少基本上不含抗原呈遞細(xì)胞。
一個優(yōu)選的實施方案包括從至少一個胚胎哺乳動物供體，優(yōu)選豬供體，收獲未成熟胰腺組織，所述組織包括至少一個基本上未形成血管的背側(cè)、腹側(cè)或背側(cè)和腹側(cè)組合胰腺原基，基本上不含抗原呈遞細(xì)胞。所述組織移植到糖尿病人患者的腹膜腔，在鄰近腸系膜上動脈分支的部位。移植后，所述組織形成血管和成熟，由此發(fā)育為在受體中至少產(chǎn)生胰島素的有功能的嵌合內(nèi)分泌胰腺。所述優(yōu)選方法也可以包括將免疫抑制或共刺激阻斷給予受體的免疫系統(tǒng)來輔助預(yù)防移植組織排斥。
所述優(yōu)選方法也可以包括處理該組織以增加該組織移植后生長和發(fā)育的方法和組合物。
可以基于已知移植方案以及各種因素包括類似的生理學(xué)、器官大小、抗原譜、供體可利用性和胰腺內(nèi)分泌功能的類似性來選擇與宿主相容的合適哺乳動物供體。
人受體的優(yōu)選哺乳動物供體可以是飼養(yǎng)為無病原體和可能有一些人蛋白如衰變加速因子和CD59轉(zhuǎn)基因的豬，或α-gal轉(zhuǎn)移酶缺陷豬。豬是對于人受體的優(yōu)選異種供體，原因是，除了其它因素，它們可比較的器官大小和它們作為供體的一般可利用性。此外，豬和人的葡萄糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過程和胰島素分泌調(diào)節(jié)非常相似。
此外，對于同種異體移植給人受體，可以優(yōu)選人未成熟胰腺組織。
在一個優(yōu)選實施方案中，未成熟胰腺組織可以包括至少一個胚胎背側(cè)或胰腺原基，它在收獲的時候在供體中基本上未形成血管。所述組織可以進(jìn)一步包括背側(cè)和腹側(cè)原基兩者，一個或多個這樣的原基，完整胰腺(背側(cè)和腹側(cè)原基或融合原基)，或來自一個或多個供體的這種組織。盡管優(yōu)選使用完整原基，但是包括這種組織的未消化、未離解部分也在本發(fā)明未成熟胰腺組織的范圍內(nèi)。
可以在適當(dāng)發(fā)育階段從至少一個供體收獲未成熟胰腺組織，即，在背側(cè)和腹側(cè)原基變?yōu)槿诤现傲⒓椿蛑髷?shù)天，和供體血管形成和抗原呈遞細(xì)胞在該組織內(nèi)產(chǎn)生和分布之前。優(yōu)選，在未成熟胰腺開始形成和可以從供體組織分割出來之后很快，和來源于胰腺內(nèi)或來自胰腺外部的血管存在之前收獲未成熟胰腺組織。特別優(yōu)選在血管形成前收獲，因為從中獲得胰腺原基的發(fā)育中胚胎尚未形成成熟抗原呈遞細(xì)胞，或者如果它們已經(jīng)形成，但尚未遷移到無血管的胰腺原基中。在這個時候，可以認(rèn)為該未成熟胰腺組織不含或至少基本上不含抗原呈遞細(xì)胞。
胰腺發(fā)育中太遲收獲的組織，例如已經(jīng)具有可見血管的組織可能含有更多抗原呈遞細(xì)胞和細(xì)胞表面抗原，因此存在更多被受體排斥的威脅。在發(fā)育和血管形成的優(yōu)選時間收獲的組織將基本上不含抗原呈遞細(xì)胞，這意味著與血管形成的移植物移植或含有抗原呈遞細(xì)胞的那些相比，至少非同基因移植物移植中超急性和急性血管排斥的機(jī)會大大降低。
收獲胰腺組織的具體發(fā)育階段將根據(jù)供體物種而變化。在大鼠中，胰腺在22天妊娠期的第11-12天形成，收獲未成熟胰腺組織的優(yōu)選時間是大約12天至大約13天之間。在小鼠中，胰腺在19天妊娠期的大約第10-11天形成，優(yōu)選的收獲時間是從大約第11天至大約第12天。在豬中，胰腺在115天妊娠期的第16-18天形成，優(yōu)選收獲時間是從大約第20天至大約第38天，更優(yōu)選的收獲時間是大約第25天至大約第35天和最優(yōu)選的收獲日期是大約第29天。在人中，胰腺在270天妊娠期的第31-40天形成，優(yōu)選的收獲時間是從大約第40天至大約第50天或妊娠的前三月早期。
在本發(fā)明的一個方面中，受體是哺乳動物并且可以是任何年齡。優(yōu)選的受體是人，更優(yōu)選他是II型或I型糖尿病人患者。在另一個優(yōu)選實施方案中，這種受體由于罹患上面提及疾病之一而顯示出有功能的胰腺量減輕。
一個優(yōu)選方法包括在允許未成熟胰腺組織變得形成血管和成熟，由此發(fā)育為在受體中至少產(chǎn)生胰島素的有功能的內(nèi)分泌嵌合胰腺的條件下，將包括胚胎哺乳動物供體的至少一個完整胰腺原基的未成熟胰腺組織植入哺乳動物受體的腹膜腔。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知方法將該胰腺組織植入受體腹膜腔。
在一個實施方案中，胰腺組織被植入接近受體的鄰近腸系膜上動脈分支的網(wǎng)膜，和優(yōu)選被植入網(wǎng)膜囊(pouch of omentum)。使用這里所述技術(shù)移植的未成熟胰腺組織最初無血管形成，和因此生長和至少部分通過受體血管變得形成血管，發(fā)育為至少一個嵌合內(nèi)分泌胰腺。嵌合胰腺的特征是成熟和有功能胰島的形成，它們至少可以產(chǎn)生胰島素并使其外在化，可能還有胰高血糖素和生長抑素。
受體的血管形成可能促進(jìn)移植異種組織的接受。更具體地，移植的時候，移植物中缺乏現(xiàn)存血管形成和移植組織和受體之間缺乏血管吻合(anastomosis)有助于至少避免組織的超急性和急性血管排斥。因此，本發(fā)明的異種移植能夠避免多種嚴(yán)重類型器官排斥中的兩種和形成血管和發(fā)育為宿主內(nèi)有功能的嵌合器官。
對于未成熟胰腺組織的同種異體移植，任何胚胎原基可以移植到需要這種移植物的相同物種的受體。如果需要，可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法如混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實施供體和受體之間MHC(主要組織相容性復(fù)合體)單倍型匹配。
本發(fā)明嵌合內(nèi)分泌胰腺的血管形成和成熟的適合條件也可以包括使用手術(shù)前或后方法和組合物促進(jìn)移植組織發(fā)育和發(fā)揮功能以及預(yù)防移植物排斥。在同基因移植和一些情況的同種異體移植中，可能沒有移植胰腺組織的宿主排斥，因此，可以免去免疫抑制和/或共刺激方法和組合物。此外，本發(fā)明未成熟胰腺組織可以被改變而適用于本發(fā)明，這可通過用生長因子和增加其在宿主內(nèi)生長和發(fā)育，產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞在宿主內(nèi)的發(fā)育，和降低移植排斥可能性的其它化合物和組合物處理實現(xiàn)。
本發(fā)明的另一個實施方案是用于未成熟胰腺組織移植到哺乳動物受體腹膜腔來增加哺乳動物受體的胰腺量的受體共刺激阻斷組合物和方法(見實施例方案1和方案2)。正如已知的，CD4+T細(xì)胞在無血管形成、急性、T細(xì)胞介導(dǎo)的同種和異種移植排斥中起著主要作用。因此，已經(jīng)證明通過阻斷受體T細(xì)胞反應(yīng)的共刺激對準(zhǔn)CD4+T細(xì)胞的活化和/或功能來對抗這種排斥在本發(fā)明中有效。對準(zhǔn)和下調(diào)宿主對移植組織的T細(xì)胞反應(yīng)的合適免疫調(diào)節(jié)試劑和方法可以使用并包括在本發(fā)明中。
第一個這種方法包括可以在移植之前、移植過程中和之后給予受體的CTLA4Ig(Genetics Institute，Cambridge MA)和抗CD2(Pharmingen，San Diego CA)的組合物。
共刺激阻斷的第二個方法包括也可以在移植之前、移植過程中和之后給藥的抗CD11a(Pharmingen，San Diego CA)，抗CD45RB(克隆23G2，Pharmingen，San Diego CA)和抗CD154(克隆MR1，Pharmingen，SanDiego CA)的組合物。
至少在異種移植的情況下，本發(fā)明可以包括對受體的免疫抑制方法和組合物。這通常通過在移植后免疫抑制受體來進(jìn)行。環(huán)孢菌素A(CSA)處理可以提供足夠的免疫抑制來預(yù)防供體組織的排斥。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中已知預(yù)防移植排斥的CSA處理方法。Gruber(1992)，Transplantation 541-11描述了局部免疫抑制技術(shù)。在美國專利5,560,911中，公開了抗自然發(fā)生的人抗動物抗體上獨特型的抗體用于抑制異種移植排斥。也已知抗淋巴細(xì)胞球蛋白預(yù)防移植排斥(Lacy etal.(1981)，Diabetes 30285-291)。作為免疫抑制的替代，可以在移植前處理植入的胰腺，降低其抗原性。Faustman WO 92/04033(1992)公開了通過表面修飾降低移植物免疫原性的示例方法。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，給予接受未成熟胰腺組織的受體的免疫抑制組合物將基于使用已經(jīng)證明較少致糖尿病的那些免疫抑制試劑。例如，對于這里所述的移植目的，皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢菌素A或他克莫司的使用可能是有限的。成功免疫抑制治療的實例可以基于Edmonton方法(Shapiro et al，2000)中使用的那些，它需要長期高劑量sirolimus(不致糖尿病的)，長期低劑量他克莫司(致糖尿病的)和短期daclizumab。
通過移植前，但在收獲后，在冰冷(大約4攝氏度)條件下制備或保存它，可以使未成熟胰腺組織適合移植。本發(fā)明可以進(jìn)一步包括通過使分離的哺乳動物未成熟胰腺組織接觸生長因子、生長培養(yǎng)基和增加移植后組織生長和發(fā)育的其它化合物和組合物，使胰腺組織適合移植。一個這種組合物可以包括收獲后和移植前HamsF12Dulbecco′s改良Eagles培養(yǎng)基(優(yōu)選50-100ul的50∶50混合物)中的肝細(xì)胞生長因子(優(yōu)選10-9M)和VEGF(優(yōu)選5ug/ml)。在一個優(yōu)選實施方案中，該組織與所述組合物在4攝氏度孵育3/4-3小時。
收獲的組織可以用各種生長因子和生長促進(jìn)劑或其組合來處理，以增加移植發(fā)育。例如，使收獲的組織接觸肝細(xì)胞生長因子(HGF)可以增加β細(xì)胞增殖和增加體內(nèi)胰島量。類似地，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)可以用于增加胰島的血管形成。可以采用來設(shè)計和實現(xiàn)增加發(fā)育和成熟方案的其它生長因子除了其它的，包括表皮生長因子(EGF)家族配體，它可以調(diào)節(jié)器官培養(yǎng)中維持的胰腺原基內(nèi)內(nèi)分泌細(xì)胞的譜系決定；β動物纖維素(BTC)，它支持β細(xì)胞分化；和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG-4)，它影響產(chǎn)生抑生長素的β細(xì)胞的發(fā)育；類視黃醇拮抗劑，它抑制體外腺泡分化；轉(zhuǎn)化生長因子家族(TGFs)的成員、生長因子(IGFs)、胃泌素、活化素A和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)家族的成員。
移植物特別是β細(xì)胞發(fā)育的增加，可以通過手術(shù)后給受體施用胰島素來增加，特別是外源胰島素。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括移植后將外源胰島素給予患者而增加移植組織發(fā)育的步驟。
發(fā)育足夠時間后，證明本發(fā)明的移植組織能夠分泌胰島素。通過組織移植到腹膜腔，分泌的胰島素直接釋放到受體門靜脈系。因此，使用本發(fā)明方法和組合物移植未成熟胰腺組織有助于增加受體的有功能內(nèi)分泌量(mass)。
而且，在發(fā)育足夠時間后，證明嵌合胰腺缺乏外分泌胰腺組織。實際上，它由圖7所示的胰島和基質(zhì)組織組成。因此，不需要設(shè)計從嵌合胰腺排出外分泌胰腺分泌物的方法。
實施例下列實施例描述了本發(fā)明的實施方案。從對這里公開發(fā)明的說明書或?qū)嵤┑睦斫?，本文?quán)利要求范圍內(nèi)的其它實施方案對本領(lǐng)域技術(shù)人員將很明顯。說明書和實施例一起旨在被認(rèn)為僅僅為了示例，本發(fā)明的范圍和精神由實施例之后的權(quán)利要求來表示。
豬至小鼠移植的共刺激阻斷方案方案1在這個實施例中，發(fā)育中豬后腎組織(發(fā)育中腎原基)從供體豬移植到小鼠受體。處理方法包括在移植前2天和1天，移植當(dāng)天和移植后第5天處理給受體C57B1/6J小鼠施與CTLA4Ig組合物，0.5mg/天；和在移植當(dāng)天和移植后第3，7和10天給予抗CD2組合物，0.5mg。圖1A顯示了移植到小鼠網(wǎng)膜后14天的豬后腎(m)。圖1B和1C顯示了石蠟包埋后腎的H&E染色的切片。腎小球被標(biāo)為(g)。圖1D圖解了小鼠特異性抗CD31(6)染色的石蠟包埋切片。豬后腎中描繪了血管(箭頭)和腎小球毛細(xì)血管環(huán)(箭頭尖)。這些血管和環(huán)來源于小鼠(小鼠特異性抗CD31染色陽性)。腎小球(g)被標(biāo)出。因此，證明移植的豬組織沒有被大鼠受體排斥，和事實上，在其發(fā)育過程中得到發(fā)育和被受體血管化。
方案2也通過豬至小鼠后腎移植來示例這個方法和組合物。用如下物質(zhì)處理受體小鼠抗CD11a，在移植當(dāng)天和移植后第0，1，7和14天靜脈注射0.2mg；抗CD45RB，在移植前第3天和2天靜脈注射0.2mg，移植前1天0.3mg和移植當(dāng)天和移植后第1-10天0.1mg；和抗CD154，移植前一天，移植當(dāng)天和移植后第2和4天靜脈注射0.25mg。圖2A所示的是移植到小鼠網(wǎng)膜后14天的豬后腎(m)。圖2B-2E顯示了H&E染色切片。圖2B中標(biāo)出了輸尿管(u)。描繪了生腎帶(發(fā)育中腎單位)(圖2C和D的箭頭)。圖2D和2E中標(biāo)出了腎小球(g)。再次，移植后圖證明了宿主內(nèi)形成血管和發(fā)育的后腎，而沒有排斥。
胚胎胰腺原基的移植導(dǎo)致胰島形成在解剖顯微鏡下從E12.5 Lewis大鼠胚胎手術(shù)收獲由背側(cè)和腹側(cè)胰腺組成的胰腺原基，并在無菌條件下懸于冰上鹽水溶液(見圖3A)。取出后2小時內(nèi)，胰腺原基植入成年Lewis大鼠的網(wǎng)膜內(nèi)。移植后兩周，殺死成年Lewis大鼠，取出胰腺移植物進(jìn)行組織學(xué)分析。蘇木精和伊紅染色的組織團(tuán)塊的固定石蠟包埋切片的組織學(xué)檢查揭示移植的胰腺原基已經(jīng)生長并發(fā)育為含有胰島的組織。
圖3A所示的是來自E12.5 Lewis大鼠胚胎的十二指腸(duo)的切片照片。背側(cè)胰腺(dp)和腹側(cè)胰腺(vp)被標(biāo)出。圖3B所示的是除去十二指腸的背側(cè)和腹側(cè)胰原基的H&E染色切片。圖3C是3B所示背側(cè)和腹側(cè)胰腺原基的更高倍視圖。
為了確定E12.5的胰腺原基中是否存在胰島素的免疫反應(yīng)性，我們實施了另外的染色。圖4A顯示了從E12.5 Lewis大鼠胚胎獲得的胰腺原基的H&E染色切片。圖4B顯示了抗胰島素抗體染色的相鄰切片。在E12.5中沒有檢測到胰島素的陽性染色。
完整胰腺原基移植到Lewis大鼠網(wǎng)膜兩周后，組織經(jīng)歷了分化。圖4C所示的是對照抗體染色的切片，4D是相鄰的胰島素染色切片。描繪了相應(yīng)的陰性(4C)和陽性(4D)組織(箭頭尖)。4E所示的是另一個移植胰腺，移植后2周的對照染色切片，4F是相鄰的胰島素染色的切片。描繪了胰島(箭頭)。顯示了A&B(A)，C&D(C)和E&F(E)的放大率。
為了表征2周以上胰腺原基的生長和發(fā)育和胰島素免疫反應(yīng)的模式，我們檢測了E12.5胰腺原基移植后6或15周，宿主腹膜中存在的結(jié)構(gòu)。圖5A所示的是移植到成年Lewis大鼠腹膜后6周，來源于胰腺原基的對照抗體染色的切片。圖5B所示的是抗胰島素抗體染色的相鄰切片。描繪了胰島組織(箭頭)。圖5C和5D所示的是另一個對照抗體染色切片(圖5C)和抗胰島素抗體染色的相鄰切片(圖5D)的高倍視圖。圖5E-F是抗胰島素抗體染色的切片，其中描繪了保持與導(dǎo)管上皮(d)連接的發(fā)育中導(dǎo)管狀胰島(箭頭)。顯示了A&B(A)，C&D(C)及E和F的放大率。
圖6圖解了移植后15周的胰腺原基。圖6A所示的是H&E染色切片，和圖6B是對照血清染色的切片。圖6C所示的是相應(yīng)抗胰島素抗體染色的切片。圖6D顯示了放大的胰島，用抗胰島素抗體染色。箭頭描繪胰島。A中顯示了A-C的放大率和D中顯示了放大率。“器官”是新的，由被腹膜脂肪包繞的基質(zhì)內(nèi)的胰島組織組成。在腹膜中沒有提示活躍的外分泌活動的炎癥反應(yīng)。
組合Gomori方法將β細(xì)胞染成紫色和腺泡細(xì)胞染成亮粉色。圖7A所示的是移植后15周的發(fā)育了的胰腺原基切片。圖7B中顯示了新生大鼠背側(cè)胰腺的切片。描繪了胰島(箭頭)和腺泡細(xì)胞(箭頭尖)。正如所預(yù)期的，圖7B中存在組合Gomori陽性(亮粉色)腺泡組織。相比之下，圖7A中僅存在被未染色基質(zhì)包繞的胰島組織。(B)顯示了放大率。
用電子顯微鏡觀察描述β細(xì)胞是否含胰島素顆粒。圖8A顯示了胰島內(nèi)的細(xì)胞。其細(xì)胞質(zhì)被含有代表結(jié)晶胰島素的偏心濃密核的神經(jīng)分泌顆粒填充(箭頭)。圖8B所示的是顆粒的更高放大圖像。
通過胰腺原基移植治療鏈脲菌素糖尿病測定基線血液葡萄糖水平(第0天)后，在Lewis大鼠中誘導(dǎo)鏈脲菌素糖尿病。對照組(對照，n＝8)接受載體代替鏈脲菌素。鏈脲菌素或載體后第5天，測定血液葡萄糖水平。在一些鏈脲菌素糖尿病大鼠中，10個胰腺原基移植到腹膜(n＝3個移植物)。其它大鼠接受假手術(shù)(n＝7個糖尿病)。在載體或鏈脲菌素給予后第14，28和35天早上8點再次測定葡萄糖水平。如圖9所示，與對照相比，在第5，14，28和35天，糖尿病大鼠中葡萄糖水平升高。相比之下，第35天，對照和移植的(以前血糖高)大鼠之間的葡萄糖水平?jīng)]有差異。**那天與對照的p＜0.01；*那天與對照的P＜0.05，Dunnetts多比較程序。
在10個胰腺原基移植給移植組后18周，使用Brown et al，Diabetes 309-13(1981)所述方法對對照大鼠的第二組(n＝6)，糖尿病大鼠(n＝4)和移植的(以前血糖高)大鼠(n＝6)實施葡萄糖耐受檢測。大鼠過夜禁食，用毛巾包裹緊，并給予D-葡萄糖，以0.5g/kg體重的劑量快速注射到尾靜脈。隨后從尾靜脈收集血液樣品。使用10，20和30分鐘值測定葡萄糖消失(％/分鐘)速度的k值。對照大鼠和糖尿病大鼠葡萄糖消失的k值(％/分鐘)分別是2.92±0.44和0.48±0.26，與Brown et al報道的值可比較(對照＞糖尿病，p＜0.01)。移植大鼠的k值是2.82±0.46，與對照沒有顯著差異和與糖尿病動物相比明顯增加。
每周測定大鼠葡萄糖水平用于產(chǎn)生圖9所示的數(shù)據(jù)。血糖量正常持續(xù)了4個月(16周)(圖10)。
胚胎胰腺原基的異種移植將E12.5 Lewis大鼠胰腺原基移植到C57B1/6J小鼠的網(wǎng)膜中。完全和以前的一樣用共刺激阻斷劑處理一些宿主小鼠[hCTLA4-Ig移植當(dāng)天(0天)和移植后第2和第4天腹膜內(nèi)注射0.2mg；抗CD45RB(克隆23G2)移植前3天(-3天)至0天靜脈注射0.1mg，和移植后第1-10天腹膜內(nèi)注射0.1mg；和抗CD154在移植后0，2和4天腹膜內(nèi)注射0.25mg]。其它小鼠用載體注射液處理。
圖11A顯示了移植到載體處理的C57B1/6J小鼠網(wǎng)膜后4周的Lewis大鼠胰腺原基。圖11B顯示了移植到用共刺激阻斷劑處理的C57B1/6J小鼠網(wǎng)膜后4周的Lewis大鼠胰腺原基。與圖11A所示的未分化組織相比，圖11B中可見胰島(箭頭)。
圖12顯示了移植到接受共刺激阻斷的成年C57B1/6J小鼠網(wǎng)膜后4周的第二個E12.5 Lewis大鼠胰腺原基。圖12A，對照血清；圖12B，抗胰島素抗體；圖12C，組合Gomori染色。描繪了胰島(箭頭)。
權(quán)利要求
1.一種增加哺乳動物受體胰腺量的方法，包括從至少一個哺乳動物供體收獲未成熟胰腺組織和在允許該胰腺組織變得形成血管和成熟、由此發(fā)育為在受體中至少產(chǎn)生胰島素的有功能嵌合內(nèi)分泌胰腺的條件下將所述組織植入哺乳動物受體的腹膜腔。
2.權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動物受體是人。
3.權(quán)利要求2的方法，其中哺乳動物供體是豬。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述組織的收獲是從供體妊娠期的大約第20天至大約第35天實施的。
5.權(quán)利要求2的方法，其中將所述組織植入鄰近供體腸系膜上動脈分支的部位。
6.權(quán)利要求5的方法，其中將所述組織植入供體網(wǎng)膜囊。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述組織包含至少一個基本上未形成血管、至少基本上不含抗原呈遞細(xì)胞的胰原基的至少一個未消化的、未離解的部分。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述原基至少包含腹胰原基。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述原基至少包含背胰原基。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述組織包含至少一個完整胰。
11.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括將至少一種免疫抑制組合物給予受體來降低所述受體對所述組織排斥的機(jī)會的步驟。
12.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括將至少一種共刺激阻斷組合物給予所述受體來降低所述受體對所述組織排斥的機(jī)會的步驟。
13.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括處理所述組織來增強(qiáng)該組織移植后生長和發(fā)育的步驟。
14.適合移植到哺乳動物受體腹膜腔內(nèi)來增加哺乳動物受體胰腺量的哺乳動物未成熟胰腺組織，所述組織包含至少一個基本上未形成血管，至少基本上不含抗原呈遞細(xì)胞的胰原基的至少一個未消化的、未離解的部分。
15.權(quán)利要求14的組織，其中通過在移植前和收獲后在冰冷條件下制備或保存它，使得所述組織適合移植。
16.權(quán)利要求14的組織，其中通過將所述組織接觸生長因子，使得所述組織適合移植。
17.權(quán)利要求14的組織，其中所述組織包含至少一個腹胰原基。
18.權(quán)利要求14的組織，其中所述組織包含至少一個背胰原基。
19.權(quán)利要求14的組織，其中所述組織包含至少一個完整胰。
20.一種治療需要這種治療的哺乳動物受體的糖尿病的方法，包括從至少一個哺乳動物供體收獲未成熟胰腺組織并在允許該胰腺組織變得形成血管和成熟、由此發(fā)育為在受體中至少產(chǎn)生胰島素的有功能嵌合內(nèi)分泌胰腺的條件下將所述組織植入哺乳動物受體的腹膜腔。
全文摘要
增加哺乳動物受體胰腺量的新方法、組織和組合物，包括從哺乳動物供體收獲未成熟胰腺組織和在允許該胰腺組織變得形成血管和成熟、由此發(fā)育為在受體中至少產(chǎn)生胰島素的有功能嵌合內(nèi)分泌胰腺的條件下將所述組織移植到哺乳動物受體的腹膜腔。本發(fā)明也包括適合移植到哺乳動物受體腹膜腔來增加該哺乳動物受體的胰腺量的哺乳動物未成熟胰腺組織，以及用于處理胰腺組織、受體免疫抑制和受體共刺激阻斷的方法和組合物。
文檔編號A61L27/00GK1643133SQ03806699
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月25日
發(fā)明者M·R·哈默曼 申請人:華盛頓大學(xué)