專利名稱：作為局部殺微生物藥和避孕藥的蘇拉明及其衍生物的制作方法
相關(guān)申請的交叉引用本發(fā)明要求2002年3月26日提交的美國臨時申請系列號60/367,273的權(quán)益，在此全文引用作為參考。
關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或發(fā)展的聲明本發(fā)明部分由避孕劑研究與發(fā)展(CONRAD)計劃資助(基金號HRN-A-00-98-00020-00)，該計劃是美國國際發(fā)展局(USAID)與東弗吉尼亞醫(yī)學(xué)院(EVMS)的一項合作協(xié)議。政府對本發(fā)明有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
本發(fā)明主要涉及局部制劑中的蘇拉明及其衍生物，及其作為殺微生物避孕藥預(yù)防性傳播疾病(STD)和懷孕的用途。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，蘇拉明及其衍生物顯示對抗STD病原體的強(qiáng)活性，并且顯示抗精子活性，單獨或與其它精子功能抑制劑(包括殺精子劑)和/或其它微生物劑(包括抗病毒劑)聯(lián)合使用，它們構(gòu)成有效的陰道避孕殺微生物藥。
STD的越來越普及是一個影響發(fā)達(dá)國家和欠發(fā)達(dá)國家的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。在欠發(fā)達(dá)國家中，獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的流行對人類的生命造成破壞性損害。貧窮、人口過多和文化習(xí)俗使避孕套無法普及，受其限制，這些國家的人免疫缺陷病毒(HIV)感染的人口顯著增多，有時達(dá)到生育年齡人口的三分之一。因此迫切需要發(fā)展可有效對抗性傳播病原體(特別是HIV)和懷孕的安全、預(yù)防性、女性控制的藥物。
壬苯醇醚-9(N-9)是一種非離子型表面活性劑，是當(dāng)前美國市場上唯一獲得FDA批準(zhǔn)的殺精子藥。其它表面活性劑，如苯扎氯銨，在加拿大和歐洲可以作為殺精子制劑的一部分。由于它們對脂類的作用，這些表面活性劑在體外顯示抗-HIV活性，破壞病毒包膜，滅活病毒?？上В瑢τ贜-9已經(jīng)清楚地證實，這些表面活性劑單獨在體內(nèi)似乎不引起明顯的保護(hù)作用。使用N-9的幾次臨床試驗顯示HIV感染的發(fā)病率沒有減少(Rowe，Lancet.，3491074 1997；Hira等人，Int J.STD AIDS.，8(4)243-50 1997；Martin等人，Sex.Transm.Dis.，24(5)279-283，1997；Roddy等人，N.Engl.J.Med.，339(8)504-10 1998；Van Damme等人，Lancet.，360(9338)971-72002)。實際上已經(jīng)證實，N-9實際上增加了生殖器炎癥(Stafford等人，J.Acquir Immune DeficSyndr.Hum.Retrovirol.17(4)327-31 1998)、泌尿道感染(Fihn等人，Am.J.Epidemiol.，144(5)512-20 1996)、外陰陰道念珠菌病(Geiger和Foxman，Epidemiology.7(2)182-7 1996)和生殖器潰瘍(Feldblum，Genitourin Med.72(6)451-2 1996)的危險。最近的一項研究(Fichorova等人，J.Infect.Dis.184(4)418-28 2001)顯示N-9對陰道上皮有細(xì)胞毒性，并且誘發(fā)促炎細(xì)胞因子的釋放，后者又補(bǔ)充作為HIV靶標(biāo)的免疫細(xì)胞，從而有利于組織侵入。
由于這些原因，仍然需要研制一種局部制劑，該制劑對粘膜和粘膜微生物區(qū)系無害，有效對抗HIV和其它STD病原體，如單純皰疹病毒(HSV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)(NG)和沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)(CT)，同時提供避孕保護(hù)。
發(fā)明概述現(xiàn)發(fā)現(xiàn)包含蘇拉明或其衍生物的組合物可有效作為避孕藥，并有效抑制性傳播疾病的傳播。因此，本發(fā)明提供了抑制性傳播疾病傳播的方法和避孕方法。在此也提供包含蘇拉明或其衍生物的組合物，以及用這些組合物包被或浸漬的裝置。
本發(fā)明的第一方面提供抑制性傳播疾病傳播的方法。在本發(fā)明的一種形式中，該方法包括局部(優(yōu)選陰道)施用蘇拉明或其衍生物。在本發(fā)明的某些形式中，蘇拉明可以在一種組合物中與一種或多種抗微生物劑共施用。
本發(fā)明的第二方面提供避孕方法。在一個實施方案中，該方法包括向陰道施用可有效抑制精卵受精、從而防止懷孕的量的蘇拉明或其衍生物。在某些實施方案中，蘇拉明可以與一種或多種抗微生物劑和/或精子功能抑制劑共施用。
本發(fā)明的第三方面提供可以有利地用于抑制性傳播疾病傳播并抑制精卵受精的局部用藥組合物。在一個實施方案中，該組合物包含藥物可接受的載體和可有效抑制性傳播疾病傳播并抑制精卵受精的量的表面活性劑和蘇拉明或其衍生物。
本發(fā)明的第四方面提供向陰道或子宮施用蘇拉明的裝置。在一個實施方案中，該裝置包括適合插入陰道內(nèi)的一種固體支持物。該支持物有利地用含有表面活性劑和蘇拉明或其衍生物的組合物包被或浸漬。
本發(fā)明的第五方面提供同時抑制性傳播感染和抑制精卵受精的方法。在本發(fā)明的一種形式中，該方法包括向雌性哺乳動物陰道內(nèi)、向子宮頸或向子宮施用一種組合物，該組合物含有可有效抑制性傳播感染和精卵受精的量的蘇拉明。性傳播感染可由微生物引起，如淋病奈瑟氏球菌、沙眼衣原體、蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)、杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)、肉芽腫鞘桿菌(Calymmatobacteriumgranulomatis)、生殖道支原體(Mycoplasma genitalium)、解脲尿支原體(Ureaplasma urealyticum)、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、人皰疹病毒6、水痘-帶狀皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、陰道毛滴蟲(Trichomona vaginalis)和白假絲酵母(Candida albicans)。
附圖簡述

圖1顯示蘇拉明8，8′-(羰基二(亞氨基-3，1-亞苯基羰基亞氨基(4-甲基-3，1-亞苯基)羰基亞氨基))二-1，3，5-萘三磺酸的六鈉鹽。
圖2是顯示隨蘇拉明和壬苯醇醚-9的指定濃度變化的精子活動性和存活力，更詳細(xì)的描述見實施例1。
圖3的棒圖顯示蘇拉明對人精子透明帶結(jié)合和倉鼠卵穿透的影響，更詳細(xì)描述見實施例1。HZA，半透明帶(hemizona)試驗；HEPT，倉鼠卵穿透試驗。
圖4是顯示隨蘇拉明濃度變化的精子透明質(zhì)酸酶活性，更詳細(xì)的描述見實施例1。
圖5顯示隨預(yù)先確定的蘇拉明濃度變化的指定細(xì)胞中剩余的感染性，更詳細(xì)的描述見實施例2。VBI-BaL，使用嗜單核細(xì)胞的HIV-1 BaL株的病毒進(jìn)入抑制試驗；CTC，細(xì)胞-細(xì)胞傳播試驗；VBI-IIIB，使用嗜淋巴細(xì)胞的HIV-1 EB株的病毒進(jìn)入抑制試驗；API，活性藥物成分(蘇拉明藥物成分)。
圖6顯示在存在或不存在粘蛋白的情況下，蘇拉明對HIV-1上皮細(xì)胞傳播的抑制，更詳細(xì)的描述見實施例2。
圖7顯示蘇拉明的抗皰疹活性和細(xì)胞毒性，更詳細(xì)的描述見實施例2。
圖8的棒圖顯示隨蘇拉明濃度變化的對巨細(xì)胞病毒與成纖維細(xì)胞結(jié)合的抑制，更詳細(xì)的描述見實施例2。
圖9顯示用不同濃度的蘇拉明處理后，沙眼衣原體的滴度，更詳細(xì)的描述見實施例2。
圖10的棒圖顯示通過淋病奈瑟氏球菌(MSIIA)增殖(生長)試驗測定，隨蘇拉明指定濃度變化的淋病奈瑟氏球菌的生長，更詳細(xì)的描述見實施例2。
圖11的棒圖顯示隨蘇拉明指定濃度變化的陰道細(xì)胞存活力，更詳細(xì)的描述見實施例3。
圖12的棒圖顯示隨蘇拉明和壬苯醇醚9(N-9)濃度變化的來自人陰道細(xì)胞上清液的指定白介素的濃度。人陰道(VK-2)細(xì)胞在存在或不存在指定組合物的情況下培養(yǎng)6小時，更詳細(xì)的描述見實施例3。
圖13顯示蘇拉明對乳桿菌生長的影響，更詳細(xì)的描述見實施例3。r2(相關(guān)性系數(shù))＝0.996。TD，倍增時間。
優(yōu)選實施方案描述現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，局部制劑中的蘇拉明及其衍生物具有抑制STG感染傳播和減少精卵受精(即精子使卵子受精)概率的組合效能。申請人發(fā)現(xiàn)，局部施用蘇拉明及其衍生物可有效抑制STD的傳播并防止懷孕。
本發(fā)明的第一方面提供了抑制性傳播疾病傳播的方法。在本發(fā)明的一種形式中，該方法包括局部施用或以其它方式施用蘇拉明或其衍生物，一般是向感染部位局部施用。
蘇拉明是一種多磺酸化萘基脲，其化學(xué)名稱為8，8′-(羰基二(亞氨基-3，1-亞苯基羰基亞氨基(4-甲基-3，1-亞苯基)羰基亞氨基))二-1，3，5-萘三磺酸。圖1顯示了蘇拉明六鈉鹽的結(jié)構(gòu)。蘇拉明可以在市場上購買到，也以下列化學(xué)名和商品名為人所知Antrypol、Bayer 205、Fourneau309、Germanin、Moranyl、Naganol、Naganin、蘇拉明(Suramin)、Naphuride鈉。以前已證實，蘇拉明抑制多種生長因子的體內(nèi)活性和自身免疫病及過敏性疾病(美國專利號5,158,940)，具有強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)抑制活性(Jentsch等人，J.Gen.Virol.，682183-2192 1987)和抗增殖活性(Nakajima等人，J.Biol.Chem.，266(15)9661-61991)。
如此處所用的“蘇拉明”包括蘇拉明及其藥物可接受的鹽，它們可有效抑制STD感染、抑制精卵受精。藥物可接受的鹽包括，例如堿金屬、堿土金屬、其它無毒金屬、銨和取代的銨鹽，例如但不限于鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鋁、鋅、銨、三甲基銨、三乙基銨、四丁基銨、吡啶鎓和取代的吡啶鎓鹽。優(yōu)選地，使用一種蘇拉明六鈉鹽。
蘇拉明的“衍生物”(類似物)在本領(lǐng)域公知，包括如Jentsch等人，J.Gen.Virol.，682183-2192(1987)和美國專利號5,173,509和6,121,320所述，這些文獻(xiàn)均在此全文引用作為參考。其它已知的蘇拉明衍生物如美國專利號6,121,320所述，后者描述了蘇拉明的NF110、NF032、NF201、NF023和NF103衍生物，以及如Firsching-Hauck等人，Anticancer Drugs 11(2)69-77(2000)和Gagliardi等人，CancerChemother.Pharmacol.41(2)117-24(1998)所述。這些衍生物能夠用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法合成，包括如Nickel P等人，Arzneim.-Forsch.36，1153-1157(1986)所述的方法。
現(xiàn)意外地發(fā)現(xiàn)，蘇拉明或其衍生物與此處描述的其它活性藥物組合產(chǎn)生協(xié)同作用。因此，在本發(fā)明的另一個實施方案中，此處所述的抑制性傳播疾病傳播的方法包括局部使用含有蘇拉明和一種或多種活性劑的組合物。如此處所定義的，活性劑包括抗微生物劑或顯示抗STD病原體活性的其它藥物?；钚詣┮部梢允且环N精子功能抑制劑，它能夠抑制精子的功能，以其他方式抑制精子使卵子受精，和/或以其他方式防止懷孕，例如通過殺死和/或功能滅活精子或通過對精子活性的其它作用?；钚詣┛赡苤辽儆须p重功能，如作為精子功能抑制劑以及作為抗微生物劑。
抗微生物劑可以具有對抗藻類、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(蠕蟲、原生動物)、病毒和亞病毒體的活性，因此，抗微生物劑可以是一種抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、抗病毒劑、抗寄生蟲劑和抗原生動物劑。抗微生物劑優(yōu)選地具有對抗傳染病，如性傳播疾病的活性。能夠引起這些疾病的微生物(和這些微生物所致疾病)的例子包括淋病奈瑟氏球菌(淋病)；沙眼衣原體(衣原體，性病淋巴肉芽腫)；蒼白密螺旋體(梅毒)；杜氏嗜血菌(軟下疳)；肉芽腫鞘桿菌(腹股溝肉芽腫)，生殖道支原體、解脲尿支原體(支原體)；人免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2(HIV，AIDS)；HTLV-1(1型嗜T淋巴細(xì)胞病毒)；1型和2型單純皰疹病毒(HSV-1和HSV-2)；EB病毒；巨細(xì)胞病毒；人皰疹病毒6；水痘-帶狀皰疹病毒；人乳頭瘤病毒(生殖器疣)；甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(病毒性肝炎)；陰道毛滴蟲(Trichomona vaginalis)(毛滴蟲病)；和酵母，如白假絲酵母(外陰陰道念珠菌病)?？刮⑸飫┮部赡芫哂袑蛊渌膊〉幕钚?，這些疾病通過體液接觸傳播，也可通過性接觸傳播，通過施用根據(jù)本發(fā)明的化合物能夠預(yù)防。因此，短語“性傳播疾病(STDs)”在此解釋為包括能夠在性接觸過程中傳播的任何疾病，無論生殖器是或不是產(chǎn)生病理變化的部位。
適宜的抗病毒劑包括，例如病毒滅活劑，如此處所述的非離子型、陰離子型和陽離子型表面活性劑，和C31G(氧化胺和烷基甜菜堿)、聚雙胍、二十二烷醇、酰基肉堿類似物、辛基甘油，和抗微生物肽，如爪蟾抗菌肽、短桿菌肽、protegrins和retrocyclins。溫和的表面活性劑有利地可以在此處所述的組合物中用作抗病毒劑。在一個實施方案中，用于抑制STD感染的蘇拉明組合物包含一種抗病毒表面活性劑，它不是通過與蘇拉明相同的機(jī)制抑制致STD的微生物。更優(yōu)選地，抗病毒表面活性劑是脫水山梨糖醇單月桂酸酯。可以在此處所述組合物中使用的其它抗病毒劑包括核苷酸或核苷類似物，如tenofovir、阿昔洛韋、金剛烷胺、雙脫氧肌苷、膦甲酸、更昔洛韋、利巴韋林、阿糖腺苷、扎西他賓和齊多夫定?？梢允褂玫钠渌共《緞┌ǚ呛塑漳孓D(zhuǎn)錄酶抑制劑，如UC-781(thiocarboxanilide)、吡啶酮、TIBO、奈韋拉平、地拉夫定、calanolide A、capravirine和efavirenz。在這些逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑中，顯示口服生物利用度較差的藥物及其類似物特別適于與蘇拉明組合陰道施用，以預(yù)防HIV的性傳播?？梢耘c蘇拉明組合使用的其它抗病毒劑包括HIV進(jìn)入阻斷劑類的藥物，如cyanovirin-N、環(huán)糊精類、角叉藻聚糖類、硫酸化或磺酸化聚合物、苦杏仁酸縮合聚合物、單克隆抗體、趨化因子受體拮抗劑，如TAK-779、SCH-C/D和AMD-3100，和融合抑制劑，如T-20和1249。
合適的抗細(xì)菌劑包括抗生素，如氨基糖甙類、頭孢菌素，包括第一代、第二代、第三代頭孢菌素，大環(huán)內(nèi)酯類，包括紅霉素、青霉素，包括天然青霉素、青霉素酶抗性青霉素、氨基青霉素、廣譜青霉素；磺胺類，四環(huán)素類，氟喹諾酮類，甲硝唑，和泌尿道抗菌劑。
合適的抗真菌劑包括兩性霉素B、制霉菌素、灰黃霉素、氟胞嘧啶、氟康唑、碘化鉀、intraconazole、clortrimazole、咪康唑、酮康唑和托萘酯。
合適的抗原生動物劑包括抗瘧劑，如氯喹、伯氨喹、乙胺嘧啶、奎寧、fansidar和甲氟喹；殺阿米巴劑，如dioloxanide、吐根堿、雙碘喹啉、甲硝唑、巴龍霉素和奎吖因；噴他脒羥乙磺酸鹽、阿托喹酮和依氟鳥氨酸。
根據(jù)此處所述方法制備的本發(fā)明的蘇拉明組合物，一般通過向感染部位局部輸送該組合物施用或使用。感染部位可以是已經(jīng)存在感染的部位(實際感染部位)或可能發(fā)生感染的部位(未感染個體的潛在感染部位)。因此，通過接觸目的部位的或目的部位周圍的皮膚或粘膜，這些組合物可以局部輸送到外陰，包括陰道腔、陰莖和肛門直腸和口腔。粘膜或皮膚表面還可包括肛周和肛門內(nèi)側(cè)。例如，為了抑制STD感染，可以通過接觸任何潛在的或?qū)嶋H的感染部位，包括陰道、肛門直腸或口腔，施用本發(fā)明的蘇拉明組合物，以在親密舉動中防止STD感染。當(dāng)向陰道腔施用時，組合物也可以施用到子宮的任一部分，包括子宮內(nèi)和子宮頸上，包括子宮頸內(nèi)和表面的粘膜和/或內(nèi)側(cè)。而且，當(dāng)配制為潤滑劑時，組合物可以施加到外生殖器和內(nèi)部粘膜表面，以減少潤滑不足導(dǎo)致的微創(chuàng)傷，也可以防止活STD病原體通過受到損傷的、病變的或健康的皮膚或粘膜傳播。
一個劑量的藥物組合物優(yōu)選地由一個或多個藥物劑量單位組成。選擇的劑量可以對哺乳動物例如人施用，使用任何已知的給藥方法，包括此處所述的方法，例如，作為栓劑和凝膠向陰道、直腸或子宮施用。例如，通過在裝置(包括海綿、子宮帽、衛(wèi)生栓、避孕隔膜或子宮內(nèi)裝置)上作為潤滑劑使用，或者通過作為栓劑、灌洗器、卵形體(ovule)、凝膠或其它可控輸送裝置使用該組合物，蘇拉明組合物可以陰道內(nèi)施用。盡管將組合物置于避孕套上能夠使一些組合物轉(zhuǎn)移到粘膜表面，并為這些表面提供一定程度的保護(hù)，但是這種施用的主要好處包括對避孕套使用者的保護(hù)。通過子宮內(nèi)輸送裝置，如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的子宮內(nèi)裝置(IUDs)，蘇拉明組合物可以被施加到子宮的任一部分。本領(lǐng)域公知的涂藥器，如當(dāng)前商業(yè)上用來輸送殺精子凝膠或抗酵母化合物的涂藥器，也可以用來陰道內(nèi)施用組合物。
一般施用可抑制或以其它方式預(yù)防STD感染有效量的蘇拉明組合物。該量是指，當(dāng)對需要的哺乳動物施用時，足以實現(xiàn)抑制STD感染傳播的蘇拉明的量。換句話說，該劑量可有效預(yù)防進(jìn)入部位的STD感染，或者預(yù)防致STD微生物的復(fù)制。對于抑制STD感染的傳播，蘇拉明的有效量可能隨多種因素而變化，例如將要通過阻斷其進(jìn)入或停止它在感染部位復(fù)制而抑制的致STD微生物。例如，適當(dāng)配制本發(fā)明的蘇拉明組合物，以抑制人免疫缺陷病毒(HIV)(包括但不限于HIV-1和HIV-2)、單純皰疹病毒(HSV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、淋病奈瑟氏球菌(NG)和沙眼衣原體(CT)。優(yōu)選地，蘇拉明的有效量是有效抑制本領(lǐng)域公知的和此處描述的任何可能的致STD微生物傳播的量。盡管這些量也可能變化，但是蘇拉明的用量一般為約0.1％(每1克制劑1mg蘇拉明)到約30％(300mg/g)，優(yōu)選地約1％(10mg/g)到約5％(50mg/g)；或者以一種方式使用，其中輸送系統(tǒng)釋放足夠的蘇拉明來保持此重量體積百分濃度。當(dāng)存在于含抗微生物劑的組合物中時，所用組合物中蘇拉明的量也將隨使用的具體抗微生物劑而不同，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。組合物中抗微生物劑的量例如隨有關(guān)疾病的性質(zhì)和組合物中蘇拉明的量而不同，也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。可以對STD個體或?qū)⑴cSTD個體有性接觸的個體施用這些量。
本發(fā)明的方法中提到的“抑制”是指，相對于未處理的個體，發(fā)生指定活動的發(fā)生率或普及率至少降低。這些術(shù)語可能包括哺乳動物的預(yù)防性處理，或相對于未處理的哺乳動物，疾病發(fā)病率降低。傳播STD感染的“抑制”是指，相對于未處理的個體，在親密接觸之前或之后立即處理個體，導(dǎo)致STD感染的傳播減少。在這種情況下，不受任何具體作用機(jī)制的限制，在感染部位中和導(dǎo)致STD感染的微生物，或防止微生物在感染部位復(fù)制，可導(dǎo)致傳播STD的抑制。這種STD感染的抑制是在彼此充分接觸足以發(fā)生STD感染的至少兩個人之間。例如，可以在有性接觸的兩個人之間或母親與孩子之間(垂直傳播)抑制STD感染。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以抑制多種STD感染。例如，蘇拉明和此處所述的組合物，可以用來對抗藻類、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(蠕蟲、原生動物)類的微生物。例如，蘇拉明組合物可以根據(jù)本發(fā)明的方法使用，以抑制由多種微生物引起的疾病的傳播，這些微生物包括淋病奈瑟氏球菌(淋病)；沙眼衣原體(衣原體，性病淋巴肉芽腫)；蒼白密螺旋體(梅毒)；杜氏嗜血菌(軟下疳)；肉芽腫鞘桿菌(腹股溝肉芽腫)、生殖道支原體、解脲尿支原體(支原體)；人免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2(HIV，AIDS)；HTLV-1(1型嗜T淋巴細(xì)胞病毒)；1型和2型單純皰疹病毒(HSV-1和HSV-2)；EB病毒；巨細(xì)胞病毒；人皰疹病毒6；水痘-帶狀皰疹病毒；人乳頭瘤病毒(生殖器疣)；甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(病毒性肝炎)；陰道毛滴蟲(Trichomona vaginalis)(毛滴蟲病)；和酵母，如白假絲酵母(外陰陰道念珠菌病)。這些微生物引起的疾病在以上括號中給出。
在本發(fā)明的其它形式中，STD感染可能由細(xì)菌引起。這類細(xì)菌的例子包括淋病奈瑟氏球菌、沙眼衣原體、蒼白密螺旋體、杜氏嗜血菌、肉芽腫鞘桿菌、生殖道支原體和解脲尿支原體。在其它實施方案中，STD感染可能由病毒引起，包括HIV-1、HIV-2、HTLV-1、1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、人皰疹病毒6、水痘-帶狀皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒。在本發(fā)明的其它實施方案中，STD感染可能由病毒引起，如HTLV-1、EB病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒。在其它實施方案中，STD感染可能由白假絲酵母和陰道毛滴蟲(Trichomona vaginalis)引起。
本發(fā)明的另一方面提供了避孕或以其它方式防止懷孕的方法。在一種形式中，該方法包括向陰道施用可有效抑制精卵受精以及防止懷孕的量的蘇拉明或其衍生物。在本發(fā)明的其它實施方案中，蘇拉明或其衍生物可以與不同的精子功能抑制劑組合，因為在此發(fā)現(xiàn)這種組合在避孕方面發(fā)揮協(xié)同作用。含有任選地與此處所述活性劑組合的蘇拉明及其衍生物的組合物，也設(shè)想用于此處所述的方法。
提高蘇拉明的避孕特性的精子功能抑制劑可以選自，例如表面活性劑，包括非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑和陰離子型表面活性劑；殺精子劑，如壬苯醇醚-9(α-(4-壬基苯基)-ω-羥基九(氧乙烯)；其它精子滅活劑，如硫酸化或磺酸化的聚合物，如磺酸聚苯乙烯、苦杏仁酸縮合聚合物、環(huán)糊精；抗微生物肽，如短桿菌肽、爪蟾抗菌肽、indolicidin和蜂毒肽；和酸性緩沖組合物，如BufferGel和AcidForm。非離子型表面活性劑包括，例如脫水山梨糖醇單月桂酸酯、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇、對二異丁基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚氧乙烯(10)油基醚和onyx-ol。合適的陰離子型表面活性劑包括但不限于烷基磺酸鈉和烷基苯磺酸鈉。陽離子型表面活性劑包括，例如，季銨表面活性劑，如十六烷基氯化吡啶鎓和苯扎氯銨。兩性離子表面活性劑，如?；鈮A類似物和C31G，尤其適合它們?nèi)岷偷钠つw及粘膜刺激特性。
對于抑制精子-卵母細(xì)胞受精，或者以其它方式防止懷孕，本發(fā)明的蘇拉明組合物直接或間接陰道內(nèi)施用。例如，通過在避孕套或其它裝置(包括海綿、子宮帽、衛(wèi)生栓、避孕隔膜、或子宮內(nèi)裝置)上作為潤滑劑，或者通過作為栓劑、灌洗器、ovule、凝膠或其它可控輸送裝置施用組合物，蘇拉明組合物可以陰道內(nèi)施用。通過子宮內(nèi)輸送裝置，如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的子宮內(nèi)裝置(IUDs)，蘇拉明組合物可以被施加到子宮的任何部分。本領(lǐng)域公知的涂藥器，如當(dāng)前商業(yè)上用來輸送殺精子凝膠或抗酵母化合物的涂藥器，也可以用來施用組合物。
一般施用有效量的蘇拉明組合物。在此處描述的避孕方法中，這種有效量是指當(dāng)對需要的哺乳動物施用時，足以抑制精卵受精和胚胎形成的蘇拉明的量。對于其避孕劑性質(zhì)，蘇拉明的有效量是指，通過阻斷精子進(jìn)入卵子，抑制精子-受精能力或通過其它方法，有效降低精卵受精可能性的量。蘇拉明的量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，蘇拉明可以為有效的量存在，優(yōu)選地，每克組合物約1到約300mg，優(yōu)選地約5到約100mg/g，或者0.0001-90％，優(yōu)選地約0.01到約30％，或約0.5％到約10％組合物重量。在本發(fā)明的實踐中也可以有效地使用較高和較低的量。
而且，精卵受精的“抑制”是指相對于未處理的個體，懷孕，即導(dǎo)致懷孕的精卵受精的發(fā)生減少。在這種情況下，蘇拉明可能以多種不同方式起作用。例如，通過阻斷精子受體與透明帶，可以抑制受精。此外，也可以抑制透明質(zhì)酸酶或受精所需的其它精子-酶相互作用。它也可以凝集精子，妨礙通過女性生殖道正常的上升或轉(zhuǎn)運。無論機(jī)制如何，也不受此處所述組合物的作用機(jī)理的任何具體理論限制，精卵受精的抑制導(dǎo)致本發(fā)明的蘇拉明局部藥物組合物的有效避孕特性。
在此處所述方法中使用的組合物可包含不會負(fù)面影響或以其它方式影響組合物成分(包括抗微生物劑、精子功能抑制劑、蘇拉明或蘇拉明衍生物)的殺微生物和/或避孕效能的其它藥物。例如，藥物組合物中可以使用固體、液體或固體與液體混合物的藥物可接受的載體、稀釋劑、載體(vehicle)或賦形劑。合適的生理學(xué)可接受的、基本上惰性的載體包括水、聚乙二醇、礦物油或礦脂(petrolatum)、丙二醇、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、纖維素衍生物、多聚羧酸、連接的聚丙烯酸，如聚羰乙烯；和其它聚合物，如聚(賴氨酸)、聚(谷氨酸)、聚(馬來酸)、聚(乳酸)、熱聚天冬氨酸酯和脂肪-芳香樹脂；甘油、淀粉、乳糖、二水硫酸鈣、白陶土、蔗糖、滑石、明膠、果膠、金合歡膠、硬脂酸鎂、硬脂酸、糖漿、花生油、橄欖油、鹽水溶液等。
在本發(fā)明的方法中有用的此處所述的藥物組合物還可含有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的稀釋劑、填料、粘合劑、濕潤劑、防腐劑、酸和其它成分。例如，合適的防腐劑在本領(lǐng)域公知，包括，例如對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、對羥苯甲酸丁酯、苯甲酸和芐醇。
在本發(fā)明的方法中使用的組合物可以以適于局部施用的任何形式使用。例如，本發(fā)明的組合物可以是本領(lǐng)域公知的多種形式，包括液體形式或洗液形式，水包油或油包水乳劑，水凝膠組合物，泡沫、薄膜、噴霧劑、軟膏、陰道栓劑、栓劑、膠囊、片劑、膠凍劑、乳膏、脂質(zhì)體形式，或者為了向已經(jīng)施用或接觸的皮膚或表面緩釋或控釋生物活性物質(zhì)，包埋于基質(zhì)中的其它形式。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物是水性組合物。最優(yōu)選地，這些組合物是水性凝膠組合物。
本發(fā)明的另一方面，提供了同時抑制性傳播疾病或感染并抑制精卵受精的方法。本發(fā)明的蘇拉明組合物可有效地同時抑制引起STD的微生物(包括HIV、單純泡疹病毒、巨細(xì)胞病毒、沙眼衣原體和淋病奈瑟氏球菌)的粘膜進(jìn)入，以及在雌性哺乳動物中抑制精卵受精。在這種情況下，向雌性哺乳動物陰道內(nèi)施用蘇拉明組合物，其用量為足以在雌性哺乳動物中抑制精卵受精并抑制STD或感染的殺微生物避孕劑的量。STD的抑制可以通過如下方式發(fā)生，例如阻止引起STD的微生物進(jìn)入子宮頸-陰道粘膜，和/或阻止這些微生物在雌性哺乳動物中復(fù)制和生長。
現(xiàn)在參考具體實施例說明上述方法、組合物和裝置。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例旨在說明優(yōu)選實施方案，并非有意限制本發(fā)明的范圍。
實施例1抗精子活性精子固定(Immobilization)如Sander FV和Cramer SD.，Hum.Fertil.6134-153(1941)所述，利用Sander Cramer試驗測定對精子固定的影響。該試驗可以用來評價避孕組合物的精子固定效能。在室溫(即25℃)下，向調(diào)節(jié)到指定數(shù)量(例如每毫升6千萬個活動精子)的精液中加入連續(xù)稀釋的每種待測組合物。終點是所有精子在20秒內(nèi)固定的最大稀釋度。結(jié)果表示為最小有效濃度，單位為毫克每毫升。
顯示20mg/mL的蘇拉明沒有明顯的精子固定活性。另外，當(dāng)使用10和5mg/mL蘇拉明鈉進(jìn)行實驗時，來自標(biāo)本的所有精子都是活動的。在使用1對數(shù)倍濃度(1-10,000μg/mL)或2倍連續(xù)稀釋度(5-0.07mM)以精子漸進(jìn)活動性和膜完整性作為終點的更詳細(xì)的劑量應(yīng)答研究中，蘇拉明鈉與溶劑對照未顯示顯著性差異，即它不誘導(dǎo)精子漸進(jìn)活動性和存活力的改變(圖2)。相反，平行檢測的商品殺精子劑壬苯醇醚-9(N-9)顯示已知的精子固定作用。在次最佳劑量的時間依賴性研究中，不同于N-9，蘇拉明鈉顯示不改變精子活動性，甚至在長時間溫育(例如30分鐘)后同樣如此。在1mM時，如《WHO人精液和精子-宮頸粘液相互作用實驗室檢測手冊》第4版，WHO組織，Cambridge University Press，pp.30-33，1999所述，通過CASA(計算機(jī)輔助精液分析)檢測，精子活動參數(shù)沒有顯著改變。甚至在更高濃度時(例如7.5mg/mL)，精子活動特征似乎也沒有顯著不同于對照(溶劑處理的)精子。
宮頸粘液穿透作用牛宮頸粘液獲自Humagen(Charlottesville，VA)，形式是預(yù)包裝的扁平毛細(xì)管(Penetrak)，冷凍保存，在實驗前融化。利用改進(jìn)的一端檢測(One End Test)(MOET)[(Doncel G.F.，《屏障避孕藥》，Wiley-Liss，Mauck C.K.等人編著，pp.147-162(1994)的描述]檢測化合物(如此處所述的蘇拉明鈉)對精子穿透宮頸粘液的影響。含有待測化合物的每種測試組合物均在鹽水溶液中稀釋，即每升水9克NaCl。打開宮頸粘液的試管。將開口端置于含有溶于鹽水的待測化合物的容器中。待測化合物在試管內(nèi)擴(kuò)散30分鐘。從正常健康供體中獲得的精液標(biāo)本然后用緩沖液稀釋為每毫升6千萬個活動精子，并與待測化合物樣品(即蘇拉明鈉)混合。然后將含有待測化合物樣品的試管重新插入含有混合溶液的容器中，在37℃、5％二氧化碳孵箱中貯存60分鐘。然后從孵箱中取出容器和試管，在顯微鏡下目視分析試管，分析最前面的活動精子沿試管的遷移。結(jié)果表示為與對照樣品相比的遷移百分?jǐn)?shù)。在對照樣品中，試管與不含化合物的鹽水溫育。
利用同時一端試驗(SOET)檢測待測化合物的快速阻斷作用，特別是通過精子活動性的改變發(fā)揮這種作用，該方法在Doncel G.F.，《屏障避孕藥》，Wiley-Liss，Mauck C.K.等人編著，pp.147-162(1994)]中描述。SOET類似于MOET，不同之處在于含有待測化合物的溶液與精液標(biāo)本混合，然后將含有牛宮頸粘液的毛細(xì)管的一端插入待測化合物與精液標(biāo)本的混合物中，在37℃、5％二氧化碳孵箱中貯存60分鐘。記錄最前面的活動精子的穿入距離，結(jié)果表示為與對照樣品(即不含化合物的鹽水)相比的遷移百分?jǐn)?shù)。在SOET中，如果不被待測化合物阻止，精子能夠在接觸后立即遷移到試管內(nèi)。
劑量依賴性研究表明，當(dāng)在MOET試驗中檢測50mg/mL(5％)的蘇拉明鈉時，對精子穿入只有較低的抑制。在25mg/mL或更低時，沒有發(fā)現(xiàn)顯著的精子阻礙。在5％時，硫酸葡聚糖顯示比蘇拉明鈉更強(qiáng)的抑制作用。作為比較，N-9在300μg/mL(0.03％)時完全阻止精子穿入。KY Jelly(KY)是一種商品陰道潤滑劑和蘇拉明鈉的KY溶液，顯示相同程度的抑制(約40％)，與相同濃度的單獨的蘇拉明鈉顯著不同(約4％)。在任何濃度時均未觀察到顯著的精子凝集(表1)。
表1.蘇拉明的宮頸粘液阻斷活性
精子的存活力如Jeyendran R.S.等人，J.Reprod.Fertil.，70219-28(1984)所述，通過精子膜完整性評價估計精子的存活力。精子標(biāo)本等份與蘇拉明或N-9待測化合物溫育。加入1.5mL Ham′s F10終止反應(yīng)。離心精子，沉淀重懸浮于200μL培養(yǎng)基中。將100μL精子懸液加入900μL低滲膨脹試驗(HOST)介質(zhì)中30分鐘評價精子的存活力。卷曲的精子尾反映完整的精子膜通透性，表明是活精子。每個標(biāo)本顯微鏡檢查最少200個細(xì)胞。
精子膜完整性評價結(jié)果在圖2中顯示。當(dāng)蘇拉明處理的標(biāo)本(10-0.001mg/mL)與溶劑處理的對照相比較時，精子存活力未見顯著性差異。在15分鐘共溫育后，在劑量和時間依賴的實驗中，活動性和存活力都顯示非常相似的應(yīng)答模式，表明蘇拉明不是一種殺精子化合物。
人精子-透明帶結(jié)合如Burkman L.J.等人，F(xiàn)ertil.Steril.，49688-697(1988)所述，利用半透明帶(hemizona)試驗測定精子獲能以及與卵子細(xì)胞的透明帶結(jié)合的能力。簡言之，在該試驗中，活動的正常精子在含有牛血清白蛋白的培養(yǎng)基中分離，觸發(fā)獲能。用游泳(swiming-up)技術(shù)分離活動的人精子，在37℃、5％CO2下，與1mM蘇拉明或溶劑對照培養(yǎng)基在覆蓋礦物油的100μL培養(yǎng)基小滴中溫育15分鐘。然后精子與被透明帶(卵子細(xì)胞的非細(xì)胞包被)環(huán)繞的死卵子細(xì)胞溫育。對應(yīng)于一個卵細(xì)胞的對分半透明帶各置于檢測(蘇拉明)和對照(溶劑)小滴中，再溫育4小時。充分洗滌精子-半透明帶復(fù)合物，在倒置顯微鏡下計數(shù)與透明帶外表面結(jié)合的獲能的精子。與一個半透明帶結(jié)合的蘇拉明處理的精子的數(shù)量除以與另一半透明帶結(jié)合的未處理的(對照)精子的數(shù)量，計算半透明帶指數(shù)(HZI)。
圖3顯示半透明帶試驗的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)蘇拉明是一種強(qiáng)精子-透明帶結(jié)合抑制劑，在1mM時產(chǎn)生92％的人精子結(jié)合抑制(HZI＝0.08±0.01，n＝9)(圖3)。在精子-表面水平上阻斷透明帶受體和/或干擾信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以介導(dǎo)這種抑制。
精子-卵膜結(jié)合和穿入利用倉鼠卵穿入試驗(HEPT)，通過評價精子的卵細(xì)胞穿入能力，預(yù)測人精子的授精能力，如Yanagimachi R.等人，Biol.Reprod.，15471-6(1976)所述。通過蛋白酶處理溶解倉鼠卵的透明帶，隨后向不含透明帶的卵中添加人精子。在將精-卵復(fù)合物置于聚賴氨酸包被的載玻片上，并覆蓋以22×22mm蓋玻片之后，用標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡(放大60倍)評價精子的結(jié)合和穿入。通過計數(shù)位于卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的精子核，對精子結(jié)合并進(jìn)入卵的能力進(jìn)行評分。通過比較與卵表面結(jié)合的精子數(shù)量與被穿入卵的百分比，檢測待測化合物的作用。
使用蘇拉明鈉作為待測化合物的HEPT試驗的結(jié)果在圖3中顯示。蘇拉明鈉顯示降低精子與倉鼠的無透明帶卵細(xì)胞的結(jié)合(約75％抑制)，并且在體外完全消除了這些卵的精子穿入/受精(n＝28個卵細(xì)胞)。
精子透明質(zhì)酸酶活性利用透明質(zhì)酸水解試驗評價蘇拉明鈉的透明質(zhì)酸酶抑制特性。透明質(zhì)酸酶是一種重要的精子酶，與對卵丘的穿入有關(guān)。該酶的抑制使精子不能穿過卵的外被(vestments)，從而妨礙了精子-卵母細(xì)胞的相互作用，最終阻礙了受精。
通過測定透明質(zhì)酸水解的程度(即由酶活性形成的N-乙酰葡糖胺反應(yīng)性物質(zhì)的濃度)定量測定透明質(zhì)酸酶活性。制備含有下列成分的反應(yīng)混合物待測化合物(不同濃度的蘇拉明鈉)；0.1M乙酸鈉；0.15M氯化鈉；pH調(diào)節(jié)為5.5；乙酸緩沖液中所含的7.2單位綿羊睪丸透明質(zhì)酸酶(Sigma，Type III；H-2251)；0.3mg/ml透明質(zhì)酸(Sigma，來自牛玻璃體液；H-7630)。該酶與待測藥物(1mg/ml，用于篩選目的)預(yù)溫育10分鐘，之后通過加入透明質(zhì)酸開始反應(yīng)。用Aronson和Davidson(J.Biol.Chem.241 437-40，1967)的方法測定酶反應(yīng)。反應(yīng)混合物在室溫下溫育30分鐘。通過測量545nm的吸光度，用β-二甲基氨基苯甲醛通過量熱法測定反應(yīng)產(chǎn)物(Reissig等人，J.Biol.Chem.217959-966，1965)。在1mg/ml的篩選濃度時不顯示抑制的化合物被認(rèn)為是無活性的。如果待測藥物在篩選濃度時顯示抑制，則生成劑量應(yīng)答曲線，利用曲線擬合軟件能夠根據(jù)該曲線確定IC50值。
圖4顯示用蘇拉明鈉檢測的透明質(zhì)酸酶活性測定的結(jié)果。蘇拉明鈉被證明是透明質(zhì)酸酶的一種不可逆的強(qiáng)抑制劑，顯示IC50＝約22μg/mL。1mg/mL誘導(dǎo)100％的抑制(圖4)。
頂體反應(yīng)如Cummins J.M.等人，J.Androl.，1298-103(1991)所述，利用頂體反應(yīng)離子載體攻擊試驗(ARIC)測定對鈣離子載體(一般是A23187)反應(yīng)的精子的比例，進(jìn)行頂體反應(yīng)。更具體而言，該試驗用來確定蘇拉明鈉是否影響離子載體誘導(dǎo)的精子的頂體反應(yīng)，因而改變精子穿入卵的能力。結(jié)果表示為對照(未處理的精子)頂體反應(yīng)的百分抑制。使用蘇拉明鈉的ARIC的結(jié)果在表2中顯示。
表2.蘇拉明對人精子頂體反應(yīng)的影響
根據(jù)表2，蘇拉明鈉似乎既不刺激自發(fā)頂體反應(yīng)(頂體損失)也不阻斷Ca2+離子載體誘導(dǎo)的反應(yīng)，如同關(guān)于其它硫酸化和磺酸化化合物(特別是聚合物)所描述的。
兔避孕效能試驗借助人工陰道從雄性新西蘭白(NZW)兔中采集精液，合并，并用改進(jìn)的Tyrode′s白蛋白乳酸丙酮酸(TALP)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為每毫升5千萬個活動精子。通過靜脈內(nèi)注射200IU人絨毛膜促性腺激素(hCG)，誘導(dǎo)雌性排卵。按照離體(體外)混合方案，如Anderson R.A.等人J.Androl.，21862-875(2000)所述，授精前精子與指定的蘇拉明待測化合物在試管中37℃溫育15分鐘(0.5mL)。如果根據(jù)該方案蘇拉明組合物顯示避孕活性，則檢測制劑，該制劑在授精前15-30分鐘在陰道內(nèi)施用(1mL)。在這種情況下，精子-化合物接觸在體內(nèi)在陰道內(nèi)發(fā)生。受精和化合物的施用用一個柔性的12cm長的聚氨酯導(dǎo)管進(jìn)行。兩個方案的主要終點是在受精11天后計數(shù)的植入部位的數(shù)量和妊娠率。這些部位通過目視觀察試管計數(shù)。
離體試驗根據(jù)表3，按照“離體混合”形式，其中精子在體外與含或不含蘇拉明鈉的培養(yǎng)基溫育，1mM(1.4mg/mL)濃度使妊娠率(PR)抑制86％(1/7)，也使植入部位的數(shù)量(IS)從對照組的6.4±0.9減少到檢測組的1。0.1mg/mL的濃度不顯著降低PR，盡管它使IS從7.7±1.2略降到4.4±0.8。百分之五(5％)的濃度完全防止妊娠(0/7)。結(jié)果在表3中顯示。
表3.在離體精子混合后，蘇拉明鈉的避孕效能
在授精前，合并的兔精子與不同濃度的蘇拉明在體外混合15分鐘。用hCG誘導(dǎo)雌性排卵，然后與5千萬個處理的或未處理的活動精子/mL(0.5mL)在陰道內(nèi)受精。在授精11天后評價妊娠和植入部位。
體內(nèi)試驗陰道內(nèi)施用KY Jelly(KY)中的5％蘇拉明鈉或羧甲基纖維素(CMC)，隨后人工授精，使PR下降75％(2/8)。為了證實可能提高蘇拉明效能的一種潛在加成效應(yīng)，向蘇拉明鈉/KY制劑中加入一種溫和的非離子型表面活性劑脫水山梨糖醇單月桂酸酯，進(jìn)行預(yù)研究。對照、2％脫水山梨糖醇、2％蘇拉明鈉和2％脫水山梨糖醇+2％蘇拉明鈉的PR分別為100％、100％、44％和0％(表4)。5％蘇拉明與0.1％N-9在KY中組合的另外一個實驗也顯示協(xié)同效應(yīng)。
表4.陰道內(nèi)施用后蘇拉明鈉的避孕效能和表面活性劑的協(xié)同效應(yīng)
在用hcG誘導(dǎo)排卵之前，向雌性陰道內(nèi)施用對照和檢測制劑(1mL)。
15-30分鐘后，雌性用未處理的合并的正常兔精子(每毫升5千萬個活動精子，0.5mL)授精。
根據(jù)表5，當(dāng)以不同濃度(5％-1.25％)在基于carbopol的陰道潤滑劑凝膠Replens中配制蘇拉明時，協(xié)同效應(yīng)是明顯的。甚至研究的最低劑量，1.25％，也是100％避孕(PR＝0％)。對照組的PR(單獨的Replens)為100％。
表5.蘇拉明制劑的避孕效能-劑量應(yīng)答
向雌兔陰道內(nèi)施用0.75mL化合物，15-30分鐘后用合并的兔精子授精。植入部位在授精11天后顯示。
本發(fā)明化合物的抗精子和避孕活性在表6中概括。
表6.蘇拉明組合物的抗精子和避孕活性的概括
實施例2抗微生物活性抗HIV的活性HIV傳染性的抑制病毒結(jié)合抑制試驗VBIAIIIBMT-2細(xì)胞、化合物和病毒(HIV-1 IIIB)在96孔板中混合在一起，在37℃下溫育2小時。在溫育期結(jié)束時，離心96孔板10分鐘，用多通道移液器吸出約175μL培養(yǎng)基，替換為175μL新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)物然后在37℃下溫育6天。利用XTT(2，3-二(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-5-[(苯氨基)羰基]-2H-四唑鎓氫氧化物)染料還原試驗，通過測定光密度(O.D.)的降低百分?jǐn)?shù)，測定病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)的調(diào)節(jié)。病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)和除去培養(yǎng)基引起的機(jī)械假象通過顯微鏡觀察證實(Anderson R.A.等人，J.Androl.，21862-875(2000))。在此提供了該試驗的結(jié)果。
C-MAGI/Ba-L試驗C-MAGI/Ba-L試驗用MAGI-CCR-5細(xì)胞進(jìn)行。該細(xì)胞系保存在含有10％FBS、100U/ml青霉素、300sμg/mL谷氨酸鹽和如上所述的選擇抗生素的DMEM培養(yǎng)基中。在試驗前，將細(xì)胞以每孔1×104個細(xì)胞的濃度置于96孔平底組織培養(yǎng)板中，并在不含抗生素的情況下溫育過夜。次日，除去培養(yǎng)基，加入病毒和化合物(100μL病毒(HIVBa-L)+100μL化合物)。將培養(yǎng)物溫育2小時，以促進(jìn)病毒附著。溫育后，從孔中吸出培養(yǎng)基，替換為不含化合物的新鮮培養(yǎng)基，洗滌兩次，最后在新鮮培養(yǎng)基中37℃溫育2天。溫育后，吸出培養(yǎng)基，通過化學(xué)發(fā)光法檢測β-半乳糖苷酶活性的誘導(dǎo)。使用一種化學(xué)發(fā)光底物，按照廠商說明書(Tropix)，檢測β-半乳糖苷酶活性。利用線性回歸確定TC50和IC50，計算治療指數(shù)或抗病毒指數(shù)。在此提供了本試驗的結(jié)果。
基于ME-180的局部殺微生物試驗將ME-180宮頸上皮細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞的密度置于96孔平底微孔板的內(nèi)部孔中，溫育過夜。慢性感染的H9細(xì)胞(H9-SK1)用200μg/ml絲裂霉素C(Sigma)在完全培養(yǎng)基中處理1小時，充分洗滌，以每毫升4×105重懸浮。使用的絲裂霉素C的濃度可在48小時處理時間內(nèi)殺死慢性感染的細(xì)胞，病毒對ME-180細(xì)胞的細(xì)胞-細(xì)胞傳播有充足的時間，而確保病毒終點定量不包括慢性感染細(xì)胞的作用。向含有ME-180細(xì)胞的每個孔中加入抗病毒化合物和慢性感染的細(xì)胞(2×104個細(xì)胞)，溫育6小時。共培養(yǎng)后，充分洗滌該單層細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基。在感染24和48小時后除去培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基，以去除死亡的淋巴細(xì)胞。在感染后的第6天，吸取上清液樣品，通過p24ELISA分析病毒含量(Phillips DM等人，1995，J Virol Methods，Mar，52(1-2)1-13)。下面提供了該試驗的結(jié)果。
細(xì)胞-細(xì)胞傳播(CTC)試驗HIV-1-感染的SupT1細(xì)胞(IIIB株)，由于預(yù)先在37℃下暴露于絲裂霉素C(200μg/mL)1小時而被殺死，將其與每種藥物和P4-R5(MAGI)細(xì)胞溫育，37℃2小時。溫育后，洗滌細(xì)胞，替換為新培養(yǎng)基。在感染48小時后，利用Galacto-Star試驗定量測定成功傳播及隨后的復(fù)制事件。感染的細(xì)胞表示為模擬感染后感染細(xì)胞的百分比。在每個試驗中，重復(fù)檢測三個孔的濃度。此處提供了該試驗的結(jié)果。
外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中的臨床分離株P(guān)BMC分離和活化(blasting)通過ficoll hypaque梯度分離從正常肝炎和HIV-1陰性供體中獲得外周血單核細(xì)胞(PBMCs)。簡言之，抗凝化血液用不含Ca++和Mg++的Dulbecco′s磷酸緩沖液(PBS)1∶1稀釋，在50ml離心管中在14mL淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)中分層。然后以600×g離心試管30分鐘。從形成的界面上輕輕吸出PBMCs層，隨后通過低速離心用PBS洗滌2次。計數(shù)單核細(xì)胞，通過臺盼藍(lán)染料排阻法測定存活力，將細(xì)胞重懸浮于補(bǔ)充有15％FBS(加熱滅活的)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和10μg/mL慶大霉素以及20U/mL重組IL-2(R&DSystems，Minneapolis，MN)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。IL-2包含于培養(yǎng)基中，用于保持由PHA促有絲分裂刺激啟動的細(xì)胞分裂。然后保存培養(yǎng)基直到使用，每3天將1/2培養(yǎng)體積更換為新鮮的含有IL-2的培養(yǎng)基。大部分試驗都用活化3天的PBMCs開始。此處提供了該試驗的結(jié)果。
PBMC測定計數(shù)用PHS和IL-2刺激的至少兩個供體的人外周血單核細(xì)胞，通過臺盼藍(lán)染料排阻法測定存活力，并等量混合。利用供體群的庫使各個供體之間的變異最小化，這種變異是由于HIV感染在性質(zhì)和數(shù)量上的差異，以及主要淋巴細(xì)胞群體對PHA和IL-2的總體應(yīng)答。細(xì)胞以1×106細(xì)胞/mL的濃度重懸浮于不含酚紅、補(bǔ)充有15％胎牛血清(加熱滅活的)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10μg/mL慶大霉素和IL-2(20U/mL，R&D Systems，Minneapolis，MN)的RPMI 1640中。然后將50微升細(xì)胞分配到標(biāo)準(zhǔn)形式的96孔圓底微孔板的內(nèi)部60個孔中。每塊板都含有細(xì)胞對照孔(只含細(xì)胞)、病毒對照孔(細(xì)胞加病毒)和實驗孔(藥物加細(xì)胞加病毒)。向微孔板中加入連續(xù)稀釋的化合物，隨后加入適當(dāng)?shù)念A(yù)滴定的HIV-1株。平板然后在37℃、5％CO2下溫育6小時，以大約300×g離心10分鐘，用多通道移液器吸出175μL上清液，替換為不含化合物的新鮮培養(yǎng)基。每孔的終體積均為200μL。所有樣品均一式三份測定，用一塊不含病毒的重復(fù)板測定化合物的毒性。培養(yǎng)板在37℃、5％CO2和潮濕環(huán)境下溫育6天，之后收集上清液分析RT活性，并通過XTT染料還原法分析平行板的細(xì)胞存活力。也用顯微鏡檢查孔，記錄任何異常。此處提供了該試驗的結(jié)果。
用于細(xì)胞存活力和化合物細(xì)胞毒性的XTT染色通過在含有細(xì)胞和化合物、不含病毒的重復(fù)微孔板中測定四唑鎓染料XTT(2，3-二(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-5-[(苯氨基)羰基]-2H-四唑鎓氫氧化物)的減少，獲得待測物質(zhì)的TC50值。代謝活性細(xì)胞中的XTT被線粒體酶NADPH氧化酶代謝為可溶性甲月替產(chǎn)物。每日制備XTT溶液，為PBS中的1mg/mL貯存液。在PBS中制備15mg/mL的Phenzaine甲基硫酸鹽(PMS)溶液，貯存于暗處和-20℃下。在使用前立即用PBS 1∶100稀釋PMS，加入40μL/mL XTT溶液，制備XTT/PMS貯存液。向平板的每孔中加入50微升XTT/PMS，平板在37℃下溫育4小時。對于每次試驗，根據(jù)經(jīng)驗確定4小時溫育，這處于使用指定數(shù)量細(xì)胞的MTS染料還原的線性應(yīng)答范圍內(nèi)。使用粘性平板密封材料代替蓋子，將密封的平板反轉(zhuǎn)數(shù)次，以混合可溶性甲月替產(chǎn)物，用Molecular Devices SpectraMax Plus 96孔板格式的分光光度計在450nm下讀數(shù)。此處提供了該試驗的結(jié)果。
逆轉(zhuǎn)錄酶試驗測定無細(xì)胞上清液中的逆轉(zhuǎn)錄酶活性，它是病毒復(fù)制的一個量度。氚標(biāo)記的胸苷三磷酸(NEN)(TTP)以5 Ci/mL重懸浮于蒸餾水中。制備Poly rA和oligo dT貯存液，保存于-20℃下。每天新鮮制備RT反應(yīng)緩沖液，其含有125μL 1.0M EGTA、125μL dH2O、110μL 10％SDS、50μL 1.0M Tris(pH 7.4)、50μL 1.0M DTT和40μL 1.0MMgCl2。這三種溶液以2份TTP、1份poly rA∶oligo dT和1份反應(yīng)緩沖液的比例混合在一起。將10微升(10μL)該反應(yīng)混合物置于圓底微孔板中，加入15μL含病毒的上清液，混合。平板在37℃下溫育60分鐘。反應(yīng)后，將反應(yīng)體積點樣到DE8 1紙片上，用5％磷酸鈉緩沖液洗滌5次，各5分鐘，用蒸餾水洗滌2次各1分鐘，用70％乙醇洗滌2次各1分鐘，然后干燥。向每份樣品中加入Opti-Fluor O，利用Wallac 1450 Microbetaplus液閃計數(shù)儀定量摻入的放射性。此處提供了該試驗的結(jié)果。
與樹狀細(xì)胞結(jié)合的HIV對T細(xì)胞的感染(DC/T試驗)用NSI/R5 Ba-L株以10-3的感染復(fù)數(shù)感染單核細(xì)胞衍生的樹狀細(xì)胞(MO-DC)，單獨培養(yǎng)，或者以1∶1或1∶10的比例與自體同源的CD4(+)T細(xì)胞一起培養(yǎng)。在感染前1小時，向MO-DC中加入連續(xù)稀釋的蘇拉明，在感染過程中保持存在。感染后，充分洗滌細(xì)胞，加入與預(yù)溫育時相同濃度的化合物。培養(yǎng)基和化合物每周更換兩次。2周后通過ELISA測定上清液中的HIV Ag，利用線性回歸(Vanham G等人，AIDS2000，142299-2311)計算EC50值(50％有效濃度)。此處提供了該試驗的結(jié)果。
結(jié)果以前報告蘇拉明在體外保護(hù)T細(xì)胞對抗由嗜人T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV-III)引起的感染、復(fù)制和細(xì)胞病變(Mitsuya H等人Science，Oct；226(4671)172-4，1984；Balzarini J.等人Int.J.Cancer.，37451-7，1986)。而且，也在卡波西肉瘤或AIDS相關(guān)復(fù)征患者中檢測，獲得部分成功的結(jié)果(Broder S.等人，Lancet.，2(5456)627-30，1985)。然而，蘇拉明從未被評價或打算用作預(yù)防HIV性傳播的陰道內(nèi)或直腸內(nèi)方法。全身毒性和較差的治療指數(shù)是不再繼續(xù)臨床試驗的主要原因。這些原因，以及蘇拉明的長半衰期和高蛋白質(zhì)結(jié)合特性，妨礙了他人認(rèn)識到可以局部施用蘇拉明來預(yù)防性傳播。
在此發(fā)現(xiàn)蘇拉明鈉具有對抗HIV-1的嗜淋巴細(xì)胞和嗜單核細(xì)胞株的高活性(在病毒進(jìn)入試驗中，對IIIB的IC50＝7.3μg/mL[72小時溫育]和18.5μg/mL[2小時溫育]，對Bal為0.34和5.5μg/mL[2小時溫育])(圖5)。它在不依賴CD4的上皮細(xì)胞傳播試驗(ME-180試驗；IC50＝24.5μg/mL)(圖6)、依賴CD4的細(xì)胞-細(xì)胞傳播試驗(CTC試驗；IC50＝93.5μg/mL)(圖5)和樹狀細(xì)胞(DC)/T淋巴細(xì)胞模型(IC50＝17μg/mL)中也有效(結(jié)果在表7中顯示)。
表7.HIV從樹狀細(xì)胞向T細(xì)胞傳播的抑制
在多種濃度的蘇拉明存在下，BaL(R5 HIV-1)感染的DC單獨培養(yǎng)，或者以兩種比例與自體同源的T淋巴細(xì)胞一起培養(yǎng)。
在ME-180試驗中加入粘蛋白模擬宮頸陰道分泌物不會顯著降低蘇拉明的活性(圖6)。在KY Jelly中配制2％的蘇拉明，其抗病毒活性保持完整。有趣的是，在Replens(一種基于carbopol的陰道潤滑劑)中配制蘇拉明具有顯著的協(xié)同效應(yīng)，特別是在蘇拉明對抗不含細(xì)胞的和細(xì)胞結(jié)合的HIV-1 IIIB的抗病毒活性方面(表8)。
表8.蘇拉明制劑的抗HIV活性
數(shù)據(jù)代表50％抑制濃度(IC50)。
靶細(xì)胞是表達(dá)CD4/復(fù)合受體的HeLa細(xì)胞。溫育時間2小時。
本發(fā)明的組合物和方法的預(yù)防方面在本發(fā)明之前未被完全了解。例如，在本發(fā)明之前，已知HIV在接觸后不到2小時內(nèi)感染陰道粘膜(Hu J等人，J Virol 2000 Jul；74(13)6087-95)，直腸粘膜同樣在較短時間內(nèi)感染。然而，報道的旨在描述蘇拉明抗HIV活性的所有試驗都使用延長的溫育(天)，其中化合物在整個溫育期間均存在。盡管這種評價模式適于治療用途，但是不適于描述預(yù)防HIV陰道或直腸傳播的方法，其中藥物應(yīng)當(dāng)在感染窗口期起作用，窗口期從性接觸時開始，一旦化合物降到有效濃度以下(例如，由于泄露或稀釋)，或者病毒被恢復(fù)的酸性陰道pH滅活，即終止。
另外，陰道和直腸粘膜中存在的上皮細(xì)胞和樹狀細(xì)胞能夠感染或傳播活病毒，甚至在初始感染幾天后仍然如此。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，蘇拉明能夠阻斷不依賴CD4的上皮細(xì)胞和樹狀細(xì)胞感染，沒有這兩個事件就不可能預(yù)防性傳播。
為了預(yù)防HIV的粘膜傳播，包括如此處所述的宮頸-陰道HIV感染，應(yīng)當(dāng)獲得關(guān)于組合物功能和有效性的許多關(guān)鍵實驗數(shù)據(jù)。例如，化合物或組合物應(yīng)當(dāng)a)在與病毒接觸不到2小時內(nèi)滅活病毒或抑制HIV進(jìn)入，因為這是病毒感染陰道粘膜的公認(rèn)的時間范圍；b)有效對抗細(xì)胞結(jié)合的病毒，這是精液中HIV荷載的重要成分(即阻斷細(xì)胞-細(xì)胞傳播)；c)阻斷上皮細(xì)胞的感染，以及攜帶CD4的細(xì)胞；d)阻斷樹狀細(xì)胞(粘膜傳播的主要靶標(biāo)之一)的HIV感染和傳播；e)抑制嗜單核細(xì)胞HIV-1株(，在性傳播中居支配地位)。
現(xiàn)證明，蘇拉明具有上述所有特征。而且，在此也證實，蘇拉明對陰道上皮或乳桿菌(控制病原微生物生長的產(chǎn)過氧化氫細(xì)菌)沒有毒性，并且顯示對陰道細(xì)胞的抗炎癥活性(即抑制陰道分泌促炎細(xì)胞因子)。后一個發(fā)現(xiàn)使蘇拉明成為一種可與表面活性劑、病毒滅活劑、抗微生物劑和殺微生物劑組合的理想藥物，因為它們的性質(zhì)-顯示促炎活性，這是有利于HIV粘膜傳播的一個特征。而且，還沒有證實當(dāng)陰道施用時，蘇拉明顯示可以忽略的生物利用度。
如果一種化合物沒有上述特征，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，不能推薦該化合物或組合物作為HIV性傳播的預(yù)防藥物。
對抗HSV的活性蘇拉明抗HSV活性的評價是根據(jù)Herold等人，J.Virol.，703461-3469(1996)所述的方法。該化合物用磷酸緩沖液(PBS)連續(xù)稀釋(1000μg/ml到1.0μg/ml)，每個稀釋度與兩個連續(xù)稀釋的(10-5和10-6)HSV(2型333株)的每一個混合。病毒工作滴度分別為約103和104噬斑形成單位(pfu)每ml。每種混合物的樣品(1ml)一式兩份接種于25cm2搖瓶底上洗滌并排干的CaSki細(xì)胞(一種人宮頸上皮細(xì)胞系，獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)匯合單層上。每種培養(yǎng)物中的最初滴度(如不加待測藥物的對照培養(yǎng)物所示)以pfu/ml為單位給出。將搖瓶溫育2小時，之后除去培養(yǎng)基(含有病毒和待測化合物)，用PBS洗滌細(xì)胞。細(xì)胞在補(bǔ)充1％血清和0.5％甲基纖維素的培養(yǎng)基199中培養(yǎng)3天，為了防止次級噬斑的形成，培養(yǎng)基中含有抗-HSV抗體。通過相差顯微鏡用姬姆薩染色細(xì)胞，以計數(shù)病毒噬斑。對稀釋度校正后，根據(jù)噬斑數(shù)推斷病毒滴度。數(shù)值對對照滴度5×108pfu/ml校正。數(shù)據(jù)表示為病毒滴度和在對照細(xì)胞培養(yǎng)物(不暴露于待測藥物)中計數(shù)的噬斑的百分?jǐn)?shù)。在100μg/ml時顯示沒有活性的待測化合物被認(rèn)為沒有作為抗HSV劑的活性。根據(jù)噬斑形成單位(pfu)/ml隨化合物濃度改變的圖，用曲線擬合軟件(TableCurve 2D，版本3.02)估計使病毒滴度減少50％所需的化合物濃度(IC50)。
蘇拉明鈉對HSV-2也高度有效，在噬斑測定中在100μg/mL時顯示病毒感染100％抑制。結(jié)果在圖7中顯示。在檢測的最高濃度(1000μg/mL)時沒有顯著的細(xì)胞毒性，蘇拉明對HSV-2和HSV-1的IC50分別為1和30μg/mL。
對抗巨細(xì)胞病毒的活性在巨細(xì)胞病毒結(jié)合試驗中，在單獨的培養(yǎng)基或含有1-1000μg/mL蘇拉明的培養(yǎng)基存在下，氚化的鼠巨細(xì)胞病毒(MCMV)與NIH3T3成纖維細(xì)胞在固定(0.4％低聚甲醛)的24孔板中溫育，37℃2小時(振搖)。然后充分洗滌細(xì)胞，用1％SDS和triton X-100裂解。用閃爍計數(shù)儀定量裂解物的放射性(cpm)。
蘇拉明鈉對CMV也有效，在結(jié)合試驗中顯示IC50＝50μg/mL，如圖8所見。
對抗沙眼衣原體(CT)的活性根據(jù)Cooper M.D.等人，J.Gen.Microbiol.，1361109-1115(1990)所述進(jìn)行衣原體增殖的抑制。在實驗前，快速融化(37℃)凍存的沙眼衣原體(血清型E/UW-5/CX)，通過溫和的超聲處理懸浮。制成1∶10連續(xù)稀釋的細(xì)菌懸液，從10-1到10-7。
在存在或不存在檢測藥物的情況下，對(蓋玻片上的)HeLa單層接種100μL不同稀釋度的衣原體(原生小體)。檢測0.1、1.0、10、100和1000μg/ml的蘇拉明化合物。1小時后，洗滌單層，除去游離的衣原體和待測藥物，溫育48小時。
去除培養(yǎng)基，HeLa單層用甲醇固定，洗滌，用Kallsted衣原體培養(yǎng)確認(rèn)用熒光素偶聯(lián)的單克隆抗體處理。標(biāo)記抗體與細(xì)胞的反應(yīng)在室溫(即25℃)下在潮濕容器中(避光)進(jìn)行30分鐘。用水洗滌細(xì)胞，向載玻片上滴加一滴封固劑，放上蓋玻片。衣原體感染產(chǎn)生的包涵體用熒光顯微鏡顯示為綠色熒光。數(shù)據(jù)報告為每毫升未稀釋的衣原體滴度的包涵體形成單位數(shù)量，并在每個實驗中根據(jù)對照培養(yǎng)物(不含待測藥物)調(diào)節(jié)為2.6×107IFU/ml的對照值。在1000μg/ml時顯示無活性的化合物被認(rèn)為沒有作為抗衣原體藥物的活性。所有數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，用曲線擬合(TableCurve 2D，版本3.02；Jandel Scientific)軟件生成劑量-應(yīng)答曲線。
蘇拉明鈉在100μg/mL時使CT增殖抑制75％(IC50＝28μg/mL)(圖9)。在2mg/mL時，基本上完全抑制(對照滴度1×10-5，蘇拉明鈉滴度0.08×10-5)。
淋病奈瑟氏球菌(GC)淋球菌生長抑制淋球菌生長抑制試驗通過Anderson R.A.等人，J.Androl.，21862-875；2000的方法進(jìn)行。簡言之，從局部非并發(fā)的淋病病例分離淋病奈瑟氏球菌(通過革蘭氏染色、氧化酶反應(yīng)性和糖酵解證實)。通過在GC培養(yǎng)液中稀釋為0.5 McFarland標(biāo)準(zhǔn)(每ml約108集落形成單位)，調(diào)節(jié)對數(shù)期培養(yǎng)物的滴度。用不含添加物的培養(yǎng)液(對照)1∶10稀釋，待測藥物的每個1∶10連續(xù)稀釋度為1mg/ml-1.0μg/ml。培養(yǎng)物在37℃下溫育4小時。在GC培養(yǎng)液中制備4個1∶10連續(xù)稀釋度，每個稀釋度的一部分接種到GC瓊脂板上。將平板溫育過夜，在亮視野顯微鏡下計數(shù)獲得的淋球菌菌落。每個蘇拉明濃度的數(shù)據(jù)表示為每ml原始對數(shù)期細(xì)菌懸液的集落形成單位(CFU)的數(shù)量。
根據(jù)圖10(檢測1-1000μg/mL蘇拉明的試驗)，沒有明顯的劑量-應(yīng)答。然而，蘇拉明鈉在1mg/mL時完全抑制GC生長(增殖試驗)。
表9概括了本發(fā)明的蘇拉明組合物的抗微生物活性。
D2(氨基酸序列Arg-Val-Asn-Leu-Arg-IIe-Ala-Leu-Arg-Tyr)肽的軌道通過3D自相關(guān)方法描述，通過主要成分分析來分析數(shù)據(jù)。這提供了由包含在軌道期間見到的所有構(gòu)彖的2第一主要成分定義的主要計劃。D2肽軌道用作軌道參考，所有計算出的軌道被投射入其主要計劃中。(圖2)免疫抑制肽顯示良好定義的普通構(gòu)彖空間特征有以下幾點PCA維數(shù)PC1最?。?2.0；最大＝2.0PC2最?。?2.0；最大＝1.0PC3最?。?1.0；最大＝1.0設(shè)計了定義為bc肽的下列肽表3
過平板接種希望的細(xì)胞，MTT試驗評價多種化合物對細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。在處理當(dāng)天，從孔中仔細(xì)吸出培養(yǎng)基，替換為含有不同濃度的待測化合物的新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞與多種化合物溫育6小時，用新鮮培養(yǎng)基洗滌，然后加入MTT，平板在37℃下溫育足以使MTT通過與代謝活性細(xì)胞反應(yīng)形成甲月替晶體的一段時間。甲月替晶體在37℃下在含有溶于0.01M HCl的10％SDS的溶液中溶解過夜。用微孔板讀數(shù)器(Dynex)在540nm和690nm的參考波長下測量每孔的吸光度。
使用商品ELISA試劑盒(R&D Diagnostics，Minneapolis，MN)，按照廠商說明書，測定在化合物-細(xì)胞溫育6小時后收集的上清液中的白介素水平(參見Fichorova R.N.等人，J.Infect.Dis.184(4)418-28，2001)。
如上所述，在MTT試驗中，以10mg/mL-10μg/mL的濃度與人陰道細(xì)胞系(VK2)溫育30分鐘、6小時和24小時，蘇拉明鈉沒有顯示細(xì)胞毒性證據(jù)(圖11)。在使用不同細(xì)胞系，如MT-2、HeLa、CaSKi等的抗微生物試驗中描述的細(xì)胞毒性作用的缺乏支持了這一發(fā)現(xiàn)。在與硫酸葡聚糖、硫酸纖維素和N-9的比較研究中，蘇拉明鈉的細(xì)胞毒性最低。
使蘇拉明制劑能夠作為預(yù)防HIV性傳播的陰道方法的另一個因素是證實它對陰道環(huán)境沒有不利的影響。蘇拉明被證明對于陰道上皮內(nèi)側(cè)和乳桿菌(阻止病原細(xì)菌生長的有益細(xì)菌)是安全的。而且，蘇拉明不誘導(dǎo)促炎反應(yīng)，并且減少表面活性劑引起的炎癥。表面活性劑(如壬苯醇醚-9)在臨床試驗中的失敗，不是因為它們的殺病毒活性較差，而是因為它們引起炎癥(Van Damme L.等人，Lancet.，360(9338)971-7，2002；Fichorova R.N.等人，J.Infect.Dis.184(4)418-28，2001)，顯示與抗炎癥活性的蘇拉明的組合似乎是理想的。
促炎細(xì)胞因子在ELISA試驗中，蘇拉明鈉不誘導(dǎo)培養(yǎng)的陰道細(xì)胞釋放IL-1β。這與N-9和其它表面活性劑的作用完全不同。如圖12部分所見，使用IL-1α、IL-6、IL-8和IL-18獲得類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。沒有促炎細(xì)胞因子的刺激。此外，蘇拉明鈉也降低了N-9誘導(dǎo)的陰道細(xì)胞釋放IL-1和IL-8，因此具有抗炎癥活性(圖12)。這種活性應(yīng)當(dāng)與減少作為HIV感染靶標(biāo)的白細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)。
乳桿菌生長5mg/mL(檢測的最高濃度)蘇拉明鈉對加氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)的生長沒有抑制作用(生長率為對照的107％)(圖13)。
下面表10顯示了局部毒性活性的概括表10蘇拉明組合物的局部毒性活性
實施例4藥代動力學(xué)主要由于全身副作用，蘇拉明作為一種治療劑已經(jīng)被放棄，因此對于作為陰道預(yù)防性抗STD病原體方法的用途(這種應(yīng)用)的可行性，證明陰道腔的低生物利用度是關(guān)鍵。
對雌性大鼠(n＝6)每kg施用30mg化合物，在鹽水中單次靜脈內(nèi)給藥，或陰道內(nèi)給藥，每天兩次，共5天，在KY jelly中配制。選擇的單劑量是估計的人劑量(250mg)的10倍。在進(jìn)行該研究期間未觀察到臨床體征。對于靜脈內(nèi)給藥，在開始給藥后1小時(第一個時間點)在血漿中測到相對高濃度的蘇拉明鈉(平均值＝563μg/mL)。長平均半衰期值(68.5hr)和小平均清除值(1.75mL/hr)提示，按照這種給藥途徑，蘇拉明鈉似乎被緩慢地清除。計算平均分布體積為147mL/kg。
對于陰道內(nèi)給藥，在最后一次給藥3.5小時后在血漿中檢測到相對低濃度的化合物(平均值＝17.7μg/mL)。長平均半衰期值(132hr，約5.5天)和小平均清除值(0.006mL/hr)提示，在陰道內(nèi)給藥后，蘇拉明鈉似乎被緩慢地清除。
根據(jù)陰道內(nèi)施用的總劑量(90mg)計算的生物利用度在0.8％，可以忽略。在靜脈內(nèi)接受化合物溶液的雌性大鼠的所選組織(陰道、肺、肝和腎)中未觀察到組織學(xué)損傷。
由于口服后的全身吸收極差，蘇拉明在過去靜脈內(nèi)施用。而且，由于高蛋白質(zhì)結(jié)合親和力，以大劑量(克級)施用。大劑量靜脈內(nèi)施用的蘇拉明顯示副作用，降低了它作為一種全身HIV藥物的治療指數(shù)。因此，臨床試驗沒有放大，該化合物沒有進(jìn)一步研究。然而，在作為粘膜(陰道)殺微生物藥和避孕藥的預(yù)期用途中，較差的全身吸收是一個優(yōu)點，因為這使它的作用限制在施用部位，并且防止了全身副作用的發(fā)展。如上所述，所進(jìn)行的藥代動力學(xué)研究證實在陰道施用后生物利用度可以忽略(＜1％)。
表11列出了藥代動力學(xué)分析的小結(jié)。
表11.藥代動力學(xué)分析小結(jié)，顯示以30mg/kg的劑量靜脈內(nèi)輸注和陰道內(nèi)施用后，雌性大鼠血漿中蘇拉明的平均值和多個藥代動力學(xué)參數(shù)
IV30mg/kg的單次靜脈內(nèi)劑量Ivag30mg/kg的陰道內(nèi)劑量，每天兩次，共5天AUC(I)血漿濃度與時間曲線下從時間0到無限遠(yuǎn)的面積AUC(tf)血漿濃度與時間曲線下從時間0到給藥后144小時的面積CL血漿清除率Cmax最高可觀察濃度
Kel清除常數(shù)Tmax到Cmax的時間t1/2末期半衰期Vdss穩(wěn)態(tài)時的表觀分布體積本說明書中提到的所有公開文獻(xiàn)均在此引入作為參考，如同每個公開文獻(xiàn)具體、分別地引入作為參考。
盡管已經(jīng)參照具體實施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，能夠做進(jìn)一步修飾。本申請旨在涵蓋總體上遵循本發(fā)明原則的本發(fā)明的所有變化、用途或改變，包括與本公開內(nèi)容的如下偏離其在本發(fā)明所屬的領(lǐng)域內(nèi)已知或?qū)俪Ｒ?guī)實踐，可適用于如以下權(quán)利要求范圍所述的必要特征。
權(quán)利要求
1.一種抑制性傳播疾病傳播的方法，包括陰道施用蘇拉明或其衍生物。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括共施用一種表面活性劑。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述表面活性劑選自非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑和陰離子型表面活性劑。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述表面活性劑選自脫水山梨糖醇單月桂酸酯、壬基苯氧基多乙氧基乙醇、對二異丁基苯氧基多乙氧基乙醇、聚氧乙烯(10)油基醚、onyx-ol、烷基磺酸鈉、烷基苯磺酸鈉、烷基酮、十六烷基氯化吡啶鎓和苯扎氯銨。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所表面活性劑是脫水山梨糖醇單月桂酸酯。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述性傳播疾病是由細(xì)菌引起的。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述細(xì)菌選自淋病奈瑟氏球菌、沙眼衣原體、蒼白密螺旋體、杜氏嗜血菌、肉芽腫鞘桿菌、生殖道支原體和解脲尿支原體。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述性傳播疾病是由病毒引起的。
9.權(quán)利要求8的方法，其進(jìn)一步包括共施用表面活性劑。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述蘇拉明向粘膜區(qū)局部施用。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述粘膜區(qū)選自陰道、直腸和口腔。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述粘膜區(qū)或皮膚表面位于外陰、肛周、肛門內(nèi)側(cè)和陰莖上。
13.權(quán)利要求8的方法，其中所述病毒選自HIV-1、HIV-2、HTLV-1、1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、人皰疹病毒6、水痘-帶狀皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒。
14.權(quán)利要求9的方法，其中所述病毒選自HTLV-1、EB病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述性傳播疾病是由選自白假絲酵母和陰道毛滴蟲的微生物引起的。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述性傳播疾病是由選自人免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、淋病奈瑟氏球菌和沙眼衣原體的微生物引起的。
17.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括共施用抗微生物劑。
18.權(quán)利要求13的方法，其中所述抗微生物劑選自抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、抗病毒劑、抗寄生蟲劑和抗原生動物劑。
19.權(quán)利要求13的方法，其中所述抗微生物劑是抗病毒劑。
20.權(quán)利要求15的方法，其中所述抗病毒劑具有對抗HIV-1的活性。
21.一種抑制由細(xì)菌引起的性傳播疾病傳播的方法，包括局部施用蘇拉明或其衍生物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述細(xì)菌選自淋病奈瑟氏球菌、沙眼衣原體、蒼白密螺旋體、杜氏嗜血菌、肉芽腫鞘桿菌、生殖道支原體和解脲尿支原體。
23.權(quán)利要求21的方法，其進(jìn)一步包括共施用表面活性劑。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述蘇拉明向粘膜區(qū)局部施用。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述粘膜區(qū)選自陰道、直腸和口腔。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述粘膜區(qū)或皮膚表面位于外陰、肛周、肛門內(nèi)側(cè)和陰莖上。
27.權(quán)利要求21的方法，其進(jìn)一步包括共施用抗細(xì)菌劑。
28.一種避孕方法，包括向陰道施用可有效抑制精卵受精的量的蘇拉明或其衍生物。
29.權(quán)利要求28的方法，其進(jìn)一步包括共施用表面活性劑。
30.權(quán)利要求28的方法，其進(jìn)一步包括共施用精子功能抑制劑。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述表面活性劑選自非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑和陰離子型表面活性劑。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述表面活性劑選自脫水山梨糖醇單月桂酸酯、壬基苯氧基多乙氧基乙醇、對二異丁基苯氧基多乙氧基乙醇、聚氧乙烯(10)油基醚、onyx-ol、烷基磺酸鈉、烷基苯磺酸鈉、烷基酮、十六烷基氯化吡啶鎓和苯扎氯銨。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所表面活性劑是脫水山梨糖醇單月桂酸酯。
34.權(quán)利要求28的方法，其進(jìn)一步包括共施用殺精子劑或精子功能抑制劑。
35.權(quán)利要求28的方法，其中所述蘇拉明以液體、洗液、水包油乳劑、油包水乳劑、脂質(zhì)體、凝膠、泡沫、薄膜、噴霧劑、軟膏、陰道栓劑、栓劑、膠囊、片劑、膠凍劑、乳膏的形式使用。
36.一種局部用藥組合物，其含有藥物可接受的載體和可有效抑制性傳播疾病傳播并抑制精卵受精量的表面活性劑和蘇拉明或其衍生物。
37.權(quán)利要求36的組合物，其中所述表面活性劑選自非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑和陰離子型表面活性劑。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述表面活性劑選自脫水山梨糖醇單月桂酸酯、壬基苯氧基多乙氧基乙醇、對二異丁基苯氧基多乙氧基乙醇、聚氧乙烯(10)油基醚、onyx-ol、烷基磺酸鈉、烷基苯磺酸鈉、烷基酮、十六烷基氯化吡啶鎓和苯扎氯銨。
39.一種用于向陰道或子宮施用蘇拉明的裝置，其包括適于插入陰道內(nèi)的固體支持物，該支持物用含有表面活性劑和蘇拉明或其衍生物的組合物浸漬或包被過。
40.權(quán)利要求39的裝置，其中所述固體支持物選自海綿、子宮帽、避孕隔膜和子宮內(nèi)裝置。
41.一種同時抑制性傳播感染并抑制精卵受精的方法，包括向雌性陰道內(nèi)、向子宮頸或子宮施用一種組合物，該組合物含有可有效抑制性傳播感染和精卵受精的量的蘇拉明，其中這種性傳播感染由微生物引起的，該微生物選自淋病奈瑟氏球菌、沙眼衣原體、蒼白密螺旋體、杜氏嗜血菌、肉芽腫鞘桿菌、生殖道支原體、解脲尿支原體、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、人皰疹病毒6、水痘-帶狀皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、陰道毛滴蟲和白假絲酵母。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述微生物選自人免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、淋病奈瑟氏球菌和沙眼衣原體。
43.權(quán)利要求41的方法，其進(jìn)一步包括共施用表面活性劑。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述表面活性劑選自非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑或陰離子型表面活性劑。
45.權(quán)利要求43的方法，其中所述表面活性劑選自脫水山梨糖醇單月桂酸酯、壬基苯氧基多乙氧基乙醇、對二異丁基苯氧基多乙氧基乙醇、聚氧乙烯(10)油基醚、onyx-ol、烷基磺酸鈉、烷基苯磺酸鈉、烷基酮、十六烷基氯化吡啶鎓和苯扎氯銨。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所表面活性劑是脫水山梨糖醇單月桂酸酯。
47.權(quán)利要求43的方法，其進(jìn)一步包括共施用精子功能抑制劑。
48.權(quán)利要求41的方法，其進(jìn)一步包括共施用抗微生物劑。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述抗微生物劑是抗病毒劑。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述抗病毒劑具有對抗HIV-1的活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過向?qū)嶋H或潛在感染部位局部施用蘇拉明或其衍生物抑制性傳播疾病的方法，以及通過陰道內(nèi)局部施用蘇拉明或其衍生物防止懷孕的方法。也提供了含有抗微生物劑和/或精子功能抑制劑的蘇拉明組合物，并且可以有利地用于本發(fā)明的方法中。也提供了一種同時抑制性傳播疾病和防止懷孕的方法。進(jìn)一步公開了用該局部用藥蘇拉明組合物浸漬或包被的裝置，可以用來施用此處所述的組合物。
文檔編號A61K47/10GK1642540SQ03806870
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月26日
發(fā)明者古斯塔沃·F·唐塞 申請人:東弗吉尼亞醫(yī)學(xué)院