專利名稱：抗C5aR抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及結合C5aR并可用于診斷和治療方法中的抗體。
背景技術：
每種補體蛋白C3-C5的蛋白裂解都生成了具有稱為過敏毒素(anaphylatoxins)的信號分子的陽離子氨基末端片段(6-9)。這些片段中最有效的片段C5a引發(fā)出最廣泛的效應。C5a是“完全的”促炎性介質(zhì)，被認為是作為白細胞遷移和浸潤、顆粒結合型蛋白水解酶(granule-bound proteolytic enzymes)的釋放、活性氧和氮源自由基的生成、血流和毛細血管通透性改變的炎性反應的成分并具有收縮平滑肌的能力。C5a在次納摩爾到納摩爾水平引發(fā)所有髓系細胞(中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞、巨噬細胞和單核細胞)的化學趨化作用以及引起血管通透性增加，前列腺素和循環(huán)白細胞顯著地增強了血管通透性。更高納摩爾濃度的C5a引發(fā)了NADPH氧化酶的脫顆粒和活化。這種生物活性的廣度與其他的炎性介質(zhì)形成了鮮明對比。在類風濕關節(jié)炎、銀屑病、膿毒癥、再灌注損傷以及成人呼吸窘迫綜合征的發(fā)病機制中都已經(jīng)涉及到C5a[1，2]。
C5aR包括一段延伸的N末端細胞外結構域。該大型的N末端結構域是典型的與包括IL-8和fMet-Leu-Phe(FMLP)受體家族的肽結合的G-蛋白結合受體，C5aR的結構符合于七個跨膜受體家族，緊接于細胞外N-末端之后的是七個被螺旋間結構域所連接的交互地作為細胞內(nèi)和細胞外環(huán)的跨膜螺旋，以細胞內(nèi)C-末端結構域為終點。
用C5aR拮抗劑對C5a效應的抑制可以減輕C5a所介導的急性炎性反應且不影響其他的補體成分。至今為止，先前已經(jīng)描述了C5aR肽拮抗劑和抗C5a受體抗體。例如，WO95/00164描述了直接對抗于C5a受體N-末端肽(殘基9-29)的抗體。然而，目前仍需要可供替代的和/或改良的C5aR拮抗劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了一種與C5aR的N-末端結構域以外的區(qū)域具有反應性的新的單克隆抗體，它對抑制C5a與C5aR的結合是高度有效的。這些單克隆抗體已經(jīng)被稱為7F3、6C12和12D4。
因此，在一個方面，本發(fā)明提供了一種與C5aR的N-末端結構域以外的細胞外環(huán)具有反應性的抗體，其中抗體減少或抑制了C5a與C5aR的結合。
我們的“細胞外環(huán)(extracellular loop)”的意思是C5aR的第一個細胞外環(huán)(殘基95到110)、或第二個細胞外環(huán)(殘基175到206)或第三個細胞外環(huán)(殘基265-283)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體與包括C5aR的第二個細胞外環(huán)(殘基175到206)的表位具有反應性。
在另一個方面，本發(fā)明提供了一種抗體，所述抗體和MAb7F3與C5aR的同一個表位具有反應性，其中抗體減少或抑制了C5a與C5aR的結合。
在另一個方面，本發(fā)明提供了一種抗體，所述抗體和MAb6C12與C5aR的同一個表位具有反應性，其中抗體減少或抑制了C5a與C5aR的結合。
在另一個方面，本發(fā)明提供了一種抗體，所述抗體和MAb12D4與C5aR的同一個表位具有反應性，其中抗體減少或抑制了C5a與C5aR的結合。
在另一個方面，本發(fā)明提供了一種與C5aR結合的抗體，其中抗體競爭性地抑制了MAb 7F3與C5aR的結合。
在另一個方面，本發(fā)明提供了一種與C5aR結合的抗體，其中抗體競爭性地抑制了MAb 6C12與C5aR的結合。
在另一個方面，本發(fā)明提供了一種與C5aR結合的抗體，其中抗體競爭性地抑制了MAb 12D4與C5aR的結合。
在本發(fā)明的這些方面的一個優(yōu)選的具體實施方案中，在存在C5aR或一種含有C5aR的細胞外環(huán)的多肽的情況下，通過抗體-抗體競爭性分析測定了相對結合特異性(comparative binding specificity)。
還在另一個方面，本發(fā)明提供了一種包含與分別由SEQ ID NO19和SEQ ID NO21所示的序列基本相同的輕鏈和/或重鏈序列的抗體，其中抗體減少或抑制了C5a與C5aR的結合。
還在另一個方面，本發(fā)明提供了一種包含至少一個與分別由SEQID NO26、SEQ ID NO27或SEQ ID NO28所示的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環(huán)序列基本相同的CDR環(huán)序列的抗體，其中抗體減少或抑制了C5a與C5aR的結合。
在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體包括至少兩個，更優(yōu)選的至少三個與分別由SEQ ID NO26、SEQ ID NO27和SEQ ID NO28所示的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環(huán)序列基本相同的CDR環(huán)序列。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，抗體包括至少一個基本上由SEQID NO19所示的可變輕鏈序列的24到39、55到61、或94到102位氨基酸殘基所確定的CDR環(huán)序列。優(yōu)選地，抗體包括至少兩個，更優(yōu)選的至少三個基本上由SEQ ID NO19所示的可變輕鏈序列的24到39、55到61、和94到102位氨基酸殘基所確定的CDR環(huán)序列。
還在另一個方面，本發(fā)明提供了一種包含分別與SEQ ID NO15及SEQ ID NO17所示序列基本相同的輕鏈和/或重鏈序列的抗體，其中抗體減少或抑制了C5a與C5aR的結合。
還在另一個方面，本發(fā)明提供了一種包含至少一個與分別由SEQID NO29、SEQ ID NO30或SEQ ID NO31所示的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環(huán)序列基本相同的CDR環(huán)序列的抗體，其中抗體減少或抑制了C5a與C5aR的結合。
在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體包括至少兩個，更優(yōu)選的至少三個與分別由SEQ ID NO29、SEQ ID NO30和SEQ ID NO31所示的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環(huán)序列基本相同的CDR環(huán)序列。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，抗體包括至少一個基本上由SEQID NO15所示的可變輕鏈序列的24到39、55到61、或94到102位氨基酸殘基所確定的CDR環(huán)序列。優(yōu)選地，抗體包括至少兩個，更優(yōu)選的至少三個基本上由SEQ ID NO15所示的可變輕鏈序列的24到39、55到61、和94到102位氨基酸殘基所確定的CDR環(huán)序列。
還在另一個方面，本發(fā)明提供了一種包含分別與SEQ ID NO23及SEQ ID NO25所示序列基本相同的輕鏈和/或重鏈序列的抗體，其中抗體減少或抑制了C5a與C5aR的結合。
還在另一個方面，本發(fā)明提供了一種包含至少一個與分別由SEQID NO32、SEQ ID NO33或SEQ ID NO34所示的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環(huán)序列基本相同的CDR環(huán)序列的抗體，其中抗體減少或抑制了C5a與C5aR的結合。
在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體包括至少兩個，更優(yōu)選的至少三個與分別由SEQ ID NO32、SEQ ID NO33和SEQ ID NO34所示的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環(huán)序列基本相同的CDR環(huán)序列。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，抗體包括至少一個基本上由SEQID NO23所示的可變輕鏈序列的24到39、55到61、或94到102位氨基酸殘基所確定的CDR環(huán)序列。優(yōu)選地，抗體包括至少兩個，更優(yōu)選的至少三個基本上由SEQ ID NO23所示的可變輕鏈序列的24到39、55到61、和94到102位氨基酸殘基所確定的CDR環(huán)序列。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，C5aR是人C5aR。
在本發(fā)明的一個實施方案中，抗體也通過其他的中性粒細胞化學引誘物(chemoattractant)，特別是CXCR1和CXCR2配體例如IL-8，抑制中性粒細胞的激活。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，抗體為單克隆或重組抗體。優(yōu)選地，單克隆或重組抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
抗體可以是任何一種同型(isotype)。然而在本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案中，抗體是IgG2a型或IgG3型抗體。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，抗體是一種選自由MAb 7F3、MAb 6C12和MAb 12D4組成的組的單克隆抗體。
在另一個方面，本發(fā)明提供了一種保藏于ECACC、保藏號為00110609的雜交瘤。
在另一個方面，本發(fā)明提供了一種保藏于ECACC、保藏號為02090226的雜交瘤。
在另一個方面，本發(fā)明提供了一種保藏于ECACC、保藏號為02090227的雜交瘤。
可以理解的是，也可以生成本發(fā)明的抗體的各種化學衍生物。例如，通過本領域已知的技術可以制得包含結合有一種標記物例如放射性同位素或其他示蹤分子的本發(fā)明抗體的免疫綴合物。同樣的，抗體可以結合于一種用于治療的分子，由于抗體結合的特異性，該分子可以定向于所需的作用部位。
因此，在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的抗體和治療劑的綴合物。
可以理解的是，一系列的治療劑可以用于本發(fā)明。優(yōu)選的藥物包括介導細胞死亡或蛋白失活的藥物。治療劑可以是本領域已知的大量毒素的任一種毒素。毒素可以是假單胞菌外毒素或它的衍生物。在優(yōu)選的實施方案中，毒素是PE40。
還在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的抗體以及一種可測定的標記物的綴合物。
可測定的標記物可以是本領域已知的任何一種合適的標記物。例如，標記物可以是放射性標記物、熒光標記物、酶標記物或?qū)Ρ葎?br> 還在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，該核酸分子包含編碼本發(fā)明抗體的序列。
還在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的抗體和藥用可接受的載體的組合物。
還在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種抑制帶有C5aR的細胞和它們的配體相互作用的方法，該方法包括將細胞暴露于本發(fā)明的抗體。
還在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種抑制細胞內(nèi)C5aR活性的方法，該方法包括將細胞暴露于本發(fā)明的抗體。
還在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種治療目標對象的涉及中性粒細胞遷移(migration)的疾病的方法，該方法包括給目標對象施用本發(fā)明的抗體。
本領域人員可以理解的是，本發(fā)明的抗體也可以用于測定、定量和/或定位表達C5aR的細胞。
因此，在本發(fā)明的另一個方面提供了一種診斷目標對象的涉及中性粒細胞遷移的疾病的方法，該方法包括將來自目標對象的樣品和本發(fā)明的綴合物接觸，并測定綴合物和樣品之間的免疫特異性結合。
在診斷方法中可以使用各種免疫檢測法。這樣的免疫檢測法包括使用例如放射免疫檢測、ELISA、“三明治”免疫檢測、沉淀反應、凝膠擴散沉淀反應、免疫擴散檢測、凝集檢測、補體固定檢測、免疫放射量檢測、熒光免疫檢測等競爭性和非競爭性檢測體系。體外和體內(nèi)檢測都可以被使用。
來自目標對象的樣品可以包括任何體液，例如外周血、血漿、淋巴液、腹腔積液、腦脊液、或胸腔積液或任一身體組織。利用組織學樣品或組織碎片或體液可以進行體外結合。利用本領域已知的任何方法(例如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、動脈內(nèi)等)通過注射綴合物可以完成體內(nèi)結合，因此可以測定免疫特異的結合。
另外，可以使用成像技術，其中第一抗體被結合于適當?shù)某上駱擞浳?。可以體內(nèi)施用標記的抗體以確定C5aR在目標對象中的定位。
因此，在本發(fā)明的另一個方面提供了一種診斷目標對象的涉及中性粒細胞遷移的疾病的方法，該方法包括在能形成抗體和呈遞C5aR的細胞之間的復合物的條件下將用成像試劑標記的本發(fā)明的抗體施用于目標對象，并將復合物成像。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，涉及中性粒細胞遷移的疾病是C5aR所介導的疾病。優(yōu)選地，疾病是一種免疫性疾病。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了一種將治療劑轉運到目標對象中的炎癥部位的方法，方法包括將本發(fā)明的綴合物施用于目標對象。
在本發(fā)明的進一步的方面提供了一種將遺傳物質(zhì)引入到呈遞C5aR的細胞中的方法，方法包括將細胞和本發(fā)明的抗體接觸，其中抗體連接或結合有遺傳物質(zhì)。
在優(yōu)選的實施方案中，呈遞C5aR的細胞選自粒細胞、白細胞例如單核細胞、巨噬細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞、肥大細胞和包括T細胞的淋巴細胞、樹突狀細胞、以及非髓系細胞例如內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞。
也被本發(fā)明所包含的是確定與C5aR結合的其他配體或其他物質(zhì)的方法，包括哺乳動物C5aR功能的抑制劑和/或增強劑。例如，利用上述抗體或片段的競爭性檢測法可以確定有著與本發(fā)明的抗體或它們的功能性片段一樣的結合特異性的試劑。因此，本發(fā)明也包括確定與C5aR結合的配體或其他物質(zhì)，包括受體功能的抑制劑(例如拮抗劑)或增強劑(激動劑)。在一個實施方案中，將自然表達C5aR的細胞或已經(jīng)被加工成表達引入到宿主細胞的核酸所編碼的C5aR或變異體的宿主細胞用于確定及評價配體、受體功能的抑制劑或增強劑的有效性的檢測中。這些細胞也用于測定表達的受體蛋白或多肽的功能。


圖1顯示了對單克隆抗體7F3的流式細胞檢測的結果。這些結果說明7F3特異地與轉染了C5aR的L1.2細胞發(fā)生反應。
圖2顯示了包含一組包括7F3的單克隆抗體的125I C5a配體結合檢測的結果。
圖3顯示了單克隆抗體7F3對125I C5a配體結合的劑量反應性抑制。
圖4顯示了用轉染了C5aR的L1.2細胞和一組包括7F3、6C12和12D4的單克隆抗體所進行的化學趨化試驗的結果。
圖5顯示了單克隆抗體7F3對轉染了C5aR的L1.2細胞的化學趨化作用的完全抑制。
圖6顯示了單克隆抗體7F3對C5a介導的中性粒細胞化學趨化作用的完全抑制。
圖7顯示了單克隆抗體7F3、6C12和12D4對C5a介導的中性粒細胞化學趨化作用的抑制。
圖8顯示了單克隆抗體7F3、6C12和12D4對IL-8介導的中性粒細胞化學趨化作用的抑制。
圖9顯示了測定C5aR N-末端肽PEPI對抗-C5aR MAb與用人C5aR轉染的L1.2細胞結合的競爭性抑制的試驗的結果。
圖10顯示了存在或不存在C5aR N-末端肽PEPI時測定MAb 7F3對純化中性粒細胞的FACS染色的試驗的結果。
圖11顯示了MAb 7F3、6C12和12D4的可變輕鏈DNA序列的比對。
圖12顯示了MAb 7F3、6C12和12D4的可變重鏈DNA序列的比對。
圖13顯示了MAb 7F3、6C12和12D4的可變輕鏈蛋白質(zhì)序列的比對。
圖14顯示了MAb 7F3、6C12和12D4的可變重鏈蛋白質(zhì)序列的比對。
序列表說明SEQ ID NO1人C5aR蛋白序列SEQ ID NO26C12可變輕鏈PCR引物SEQ ID NO36C12可變輕鏈PCR引物SEQ ID NO46C12可變重鏈PCR引物SEQ ID NO56C12可變重鏈PCR引物SEQ ID NO67F3可變輕鏈PCR引物SEQ ID NO77F3可變輕鏈PCR引物SEQ ID NO87F3可變重鏈PCR引物SEQ ID NO97F3可變重鏈PCR引物SEQ ID NO10 12D4可變輕鏈PCR引物SEQ ID NO11 12D4可變輕鏈PCR引物SEQ ID NO12 12D4可變重鏈PCR引物SEQ ID NO13 12D4可變重鏈PCR引物SEQ ID NO14 6C12可變輕鏈(DNA)序列SEQ ID NO15 6C12可變輕鏈(蛋白質(zhì))序列SEQ ID NO16 6C12可變重鏈(DNA)序列SEQ ID NO17 6C12可變重鏈(蛋白質(zhì))序列
SEQ ID NO18 7F3可變輕鏈(DNA)序列SEQ ID NO19 7F3可變輕鏈(蛋白質(zhì))序列SEQ ID NO20 7F3可變重鏈(DNA)序列SEQ ID NO21 7F3可變重鏈(蛋白質(zhì))序列SEQ ID NO22 12D4可變輕鏈(DNA)序列SEQ ID NO23 12D4可變輕鏈(蛋白質(zhì))序列SEQ ID NO24 12D4可變重鏈(DNA)序列SEQ ID NO25 12D4可變重鏈(蛋白質(zhì))序列SEQ ID NO26 7F3可變重鏈CDR1環(huán)SEQ ID NO27 7F3可變重鏈CDR2環(huán)SEQ ID NO28 7F3可變重鏈CDR3環(huán)SEQ ID NO29 6C12可變重鏈CDR1環(huán)SEQ ID NO30 6C12可變重鏈CDR2環(huán)SEQ ID NO31 6C12可變重鏈CDR3環(huán)SEQ ID NO32 12D4可變重鏈CDR1環(huán)SEQ ID NO33 12D4可變重鏈CDR2環(huán)SEQ ID NO34 12D4可變重鏈CDR3環(huán)具體實施方式
C5aR結構SEQ ID NO1提供了人C5aR的氨基酸序列。
人C5aR的各種結構域如下所示氨基酸1-37細胞外結構域-N-末端氨基酸38-61 跨膜結構域氨基酸62-71 細胞內(nèi)結構域氨基酸72-94 跨膜結構域氨基酸95-110細胞外結構域-細胞外環(huán)1氨基酸111-132 跨膜結構域氨基酸133.-.149 細胞內(nèi)結構域氨基酸150.-.174 跨膜結構域氨基酸175.-.206 細胞外結構域-細胞外環(huán)2氨基酸207.-.227 跨膜結構域氨基酸228.-.242 細胞內(nèi)結構域氨基酸243.-.264 跨膜結構域氨基酸265.-.283 細胞外結構域-細胞外環(huán)3氨基酸284.-.307 跨膜結構域氨基酸308.-.350 細胞內(nèi)結構域-C-末端微生物保藏詳情產(chǎn)生稱為7F3的單克隆抗體的雜交瘤在2000年11月6日保藏于ECACC、保藏號為00110609。
產(chǎn)生稱為6C12(6C12 M12)的單克隆抗體的雜交瘤在2002年9月2日保藏于ECACC、保藏號為02090226。
產(chǎn)生稱為12D4(12D4-P9)的單克隆抗體的雜交瘤在2002年9月2日保藏于ECACC、保藏號為02090227。
這些保藏是根據(jù)布達佩斯條約而進行的。這保證了從保藏日起可將存活的培養(yǎng)物保藏30年。這些生物體可依照布達佩斯條約的條款自ECACC獲得，這可確保在得到授權后，公眾可長期地且不受限制地獲得培養(yǎng)物的子代。
本申請的受讓人同意，假使保藏的培養(yǎng)物在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下失活或丟失或被破壞，其在接到通知后將立即以同樣的培養(yǎng)物的存活標本對其進行替換。獲得保藏的培養(yǎng)物并不意味著得到如下許可，即可以違背任何政府的授權機構依據(jù)其專利法所授予的專利權而實施本發(fā)明。
單克隆和重組抗體本發(fā)明者已經(jīng)生成了如在此所描述的特異于C5aR并被稱為7F3、6C12和12D4的鼠單克隆抗體。驚奇地，這些單克隆抗體(MAb)能基本上或完全阻斷C5a與C5aR的結合。特別是，MAb 7F3是完全的中和抗體。
與其他已知的抗C5aR抗體不同，7F3、6C12和12D4是與C5aR的N-末端結構域以外的區(qū)域發(fā)生反應。相信7F3、6C12和12D4是主要與C5aR的第二個細胞外環(huán)(殘基175到206)發(fā)生反應。例如，通過將第二個細胞外環(huán)的殘基181和192從酪氨酸突變?yōu)楸奖彼釒缀跬耆K止了MAb 12D4與C5aR的反應。在包含C5aR突變L2-FF的結合研究中觀察到了這種抑制作用(Farzan et al.，J.Exp.Med.，1931059-1065，2001)。
因為細胞外環(huán)和N-末端結構域有著相似的構象以及十分接近，這些MAb也可以同時結合于其他的細胞外環(huán)或N-末端結構域的一個區(qū)域。
驚奇地，已經(jīng)顯示MAb 7F3、6C12和12D4也能抑制其他化學引誘物配體(chemoattractant ligand)對中性粒細胞的活化。這些其他化學引誘物配體的實例包括CXCR1和CXCR2配體IL-8、ENA-78和GPC-2。這種抑制不同的化學引誘物受體(chemoattractant receptor)功能的能力提供了其他已知的抗C5aR分子所不具有的少見的和意想不到的好處。特別是能抑制多個中性粒細胞化學引誘物受體功能的抗C5aR分子是治療免疫性疾病的極為有效的治療劑。
在一個方面，本發(fā)明提供了單獨地結合于C5aR的細胞外環(huán)，優(yōu)選的為第二個細胞外環(huán)或聯(lián)合結合于其他環(huán)或結構域的抗體。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了與C5aR結合并有著與MAb 7F3、6C12和12D4任何一個抗體一樣或相似的抗原決定簇特異性的抗體。
本發(fā)明所用的“抗體”包括完整分子以及能與抗原決定簇結合的它們的片段，例如Fab、F(ab’)2、和Fv。這些抗體片段保持了一些與它們的抗原或受體選擇性結合的能力并被如下所定義1.Fab，含有抗體分子的單價抗原結合片段的片段，通過用酶木瓜蛋白酶將整個抗體降解生成一個完整的輕鏈和一個重鏈的一部分可以生成該片段。
2.Fab′，通過用胃肽酶處理整個抗體以及通過隨后的還原可生成一個完整的輕鏈和重鏈的一部分可以獲得的抗體分子的片段；每個抗體分子得到兩個Fab′片段。
3.(Fab′)2，通過用胃肽酶處理整個抗體但沒有隨后的還原可以獲得的抗體的片段；(Fab′)2是用兩個二硫鍵連接的兩個Fab′片段的二聚體；4.Fv，定義為含有表示為兩條鏈的輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)的遺傳加工的片段；以及5.單鏈抗體(“SCA”)，定義為含有用適當?shù)亩嚯倪B接物連接輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)并作為遺傳學融合的單鏈分子的遺傳加工分子。
制作這些片段的方法是本領域已知的。(見例如，Harlow and Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork(1988)，在此一起并入?yún)⒖?。
在本發(fā)明中所使用的名詞“表位”指的是抗原上與抗體的抗原結合部結合的任一抗原決定簇?？乖瓫Q定簇通常包括分子的化學活性的表面基團，例如氨基酸或糖側鏈并通常有著特異的三維結構特性以及特異的電荷特性。
利用將表達C5aR的細胞、完整的C5aR或含有一個或多個細胞外環(huán)的片段用作為接種抗原可以制備本發(fā)明的抗體。如果需要，用于接種動物的肽可以來源于翻譯的cDNA或化學合成，并將其純化并連接到載體蛋白上。這些常用的化學結合于肽的載體包括鎖眼形銅藍蛋白(KLH)、甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、破傷風類毒素。然后結合肽可以被用于接種動物(例如鼠或兔)。
如果需要，多克隆抗體可以被進一步純化，例如通過將抗體結合到結合于底物的肽并將其洗脫來提純抗體。本領域人員知道各種免疫學技術中用于純化和/或濃縮多克隆抗體和單克隆抗體的常用技術，見例如，Coligan，et al.，Unit 9，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，并入?yún)⒖?。
利用任何通過連續(xù)培養(yǎng)的細胞系生產(chǎn)抗體分子的技術可以制備單克隆抗體，這些例如雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術、以及EBV雜交瘤技術(Kohler et al.Nature 256，495-497，1975；Kozbor et al.，J.Immunol.Methods 81，31-42，1985；Cote et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，2026-2030，1983；Cole et al.，Mol.Cell Biol.62，109-120，1984)。
本領域已知的方法可以從抗體表達庫中識別并分離出與C5aR細胞外環(huán)結合的抗體。例如，一種用于識別和分離與C5aR細胞外環(huán)結合的抗體結合結構域的方法是噬菌體載體體系。該載體體系已經(jīng)被用于表達來自大腸桿菌的鼠抗體庫(Huse，et al.，Science，2461275-1281，1989)和來自人抗體庫(Mullinax，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.，878095-8099，1990)的Fab片段的聯(lián)合庫。該方法也可以被應用于表達能與預先選擇的配體結合的單克隆抗體的雜交瘤細胞系。利用本領域一般人員熟知的技術按各種方法可以生成分泌所需的單克隆抗體的雜交瘤，在此不必重復。這些技術的細節(jié)被描述于參考文獻中如Monoclonal Antibodies HybridomasANew Dimension in Biological Analysis，Edited by Roger H.Kennett，et al.，Plenum Press，1980；和U.S.4,172,124，并入?yún)⒖肌?br> 另外，生產(chǎn)具有“人源化”抗體的不同組合的嵌合抗體分子的方法是本領域已知的，并包括鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的組合(Cabily，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，813273，1984)，or by grafting the murine-antibodycomplementarity determining regions(CDRs)onto the human framework(Riechmann，et al.，Nature 332323，1988)。
本發(fā)明進一步提供了本發(fā)明的抗C5aR抗體或它們的生物活性片段的嵌合抗體。在此所使用的名詞“嵌合抗體”指的是來自一種物種的抗體可變區(qū)與來自不同的物種的抗體恒定區(qū)組合成的一種抗體或同樣指的是CDR移植抗體。利用重組DNA技術構建嵌合抗體已被描述于例如Shaw，et al.，J.Immun.，1384534(1987)，Sun，LK.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84214-218(1987)。
任何一個上述的抗體或生物學活性的抗體片段都可以被用于生產(chǎn)CDR移植及嵌合抗體?！癈DR”或“互補決定區(qū)”或“高變區(qū)”被定義為形成促成抗原結合位點形成的三維環(huán)結構的抗體的輕鏈和重鏈的氨基酸序列。
在此所用的名詞“CDR移植”抗體指的是至少輕鏈和/或可變結構域的一個或多個CDR序列的一部分已經(jīng)被來自有著對給定抗原或受體有著不同的結合特異性的抗體的CDR序列的同源部分所取代的氨基酸序列的抗體。
該同源CDR序列被稱為被“移植”到底物或受體抗體上。“供體”抗體是提供CDR序列的抗體，以及接受取代序列的抗體為“底物”抗體。本領域人員聯(lián)合利用在此所提供的教義和本領域熟知的方法(見Borrebaeck，C.A.，Antibody EngineeringA Practical Guide，W.H.Freeman and Company，New York，1992，并入?yún)⒖?可以容易地生成這些CDR移植抗體。
本發(fā)明也提供了生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體的細胞系。利用能識別相關單克隆抗體的基本反應模式的常規(guī)篩選技術可以完成對生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體的細胞系的分離。因此，如果被測試的單克隆抗體能結合于C5aR并阻斷C5a介導的生物學活性，那么被測定的單克隆抗體和本發(fā)明的細胞系所生產(chǎn)的單克隆抗體是等價的。
利用同與C5aR(例如具有C5aR的細胞、例如帶有C5aR的轉染體、單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和嗜堿性粒細胞)結合的特異性MAb相互競爭的能力可以識別具有與MAb 7F3、6C12或12D4同樣的或相似的表位特異性的抗體。利用受體嵌合(Rucker et al.，Cell 87437-446(1996))或其他本領域已知的其他技術可以繪制MAb 7F3、6C12或12D4的任何一個抗體的結合位點。
不需要過多的試驗也可能確定單克隆抗體是否具有和本發(fā)明的單克隆抗體一樣的特異性，這可通過是否前者抑制了后者對包含C5aR細胞外環(huán)的肽的結合來明確。如果被測試的單克隆抗體與本發(fā)明的單克隆抗體相互競爭，表現(xiàn)為本發(fā)明的單克隆抗體結合的減少，那么這兩種單克隆抗體結合于同一個或緊密相關的表位。
確定單克隆抗體是否具有和本發(fā)明的單克隆抗體的特異性的另一個方法是將被測試的單克隆抗體與推測抗體與之發(fā)生反應的肽預先孵育，然后加入本發(fā)明的單克隆抗體以明確本發(fā)明的單克隆抗體是否被抑制了其與肽結合的能力。如果本發(fā)明的單克隆抗體被抑制，那么所有的可能是被測試的單克隆抗體有著同樣的或功能等價的本發(fā)明的單克隆抗體的抗原決定簇的特異性。利用適當?shù)碾囊部梢赃M行本發(fā)明的單克隆抗體的篩選并確定單克隆抗體是否阻斷了C5a與C5aR的結合。
通過利用本發(fā)明的單克隆抗體可以生成抗獨特型抗體，它能用于篩選單克隆抗體以識別該抗體是否具有和本發(fā)明的單克隆抗體一樣的結合特異性。這些抗體也可以被用于接種的目的(Herlyn，et al.，Science，232100，1986)。利用熟知的雜交瘤技術可以生產(chǎn)這些抗獨特型抗體(Kohler and Milstein，Nature，256495，1975)?？躬毺匦涂贵w是一種識別相關細胞系所生成的單克隆抗體上所存在的獨特的決定簇的抗體。這些決定簇定位于抗體的高變區(qū)。這是與給定的表位結合的區(qū)域(抗原結合部)，因此它決定了抗體的特異性。通過用相關的單克隆抗體接種動物可以制備抗獨特型抗體。被接種的動物將識別并應答于接種抗體的獨特型決定簇，以及生成抗這些獨特型決定簇的抗體。通過使用特異于用于接種第二個動物的細胞系所產(chǎn)生的本發(fā)明的單克隆抗體的接種動物的抗獨特型抗體，可以識別具有與用于接種的雜交瘤抗體相同的抗原決定簇的其他克隆。兩個細胞系的單克隆抗體的獨特型同一性證明這兩個單克隆抗體對同一個抗原決定簇有著相同的識別。因此，通過使用抗獨特型抗體，可以識別其他的表達有著相同抗原決定簇特異性的單克隆抗體的雜交瘤。
利用抗獨特型技術也可以生成模仿抗原決定簇的單克隆抗體。例如，制得的抗第一個單克隆抗體的抗獨特型單克隆抗體在高變區(qū)將有結合結構域，它是第一個單克隆抗體所結合的抗原決定簇的“圖像”。因此，既然抗獨特型單克隆抗體的結合結構域能有效地作用為一種抗原，那么抗獨特型單克隆抗體可以被用于免疫接種。
通過已知的技術可以生成包含本發(fā)明的任一MAb的抗原決定簇結合位點的抗體片段。例如，首先通過從儲存的雜交瘤中獲得MAb 7F3，然后處理抗體(例如通過蛋白水解消化)獲得它的高變區(qū)，利用這些可以獲得合適的抗體片段。
同樣的，利用例如在此描述的標準的重組DNA方法可以在適當?shù)乃拗髦锌寺〕鼍幋a高變區(qū)的DNA。
本發(fā)明優(yōu)選的抗體包括與MAb 7F3、6C12或12D4的可變區(qū)或一個或多個CDR環(huán)基本相同的可變區(qū)或一個或多個CDR環(huán)?？梢岳斫獾氖?，在序列列表中所示的可變區(qū)或CDR環(huán)可以修飾后用于本發(fā)明。通常的，進行保持序列的結合特異性的修飾?？梢赃M行保守取代，例如，不影響抗體的結合特異性。因此，在一個實施方案中，可以進行氨基酸取代，例如從1、2或3到10、20或30的取代提供了保留有基本相同的結合特異性的修飾序列。然而，在一個可選擇的實施方案中，可以有意地進行本發(fā)明抗體的氨基酸序列的修飾以減少抗體的生物學活性。例如保持了能與C5aR結合但缺少功能性效應結構域的修飾抗體可以用作為C5aR的生物學活性的抑制劑。
氨基酸取代也可以包括使用非天然發(fā)生的類似物，例如用于增加施用的治療性抗體的血漿半衰期。
通常，比較于序列列表中所描述的相應的可變區(qū)或CDR環(huán)，優(yōu)選的變異體或衍生物的少于20％、10％或5％的氨基酸被改變。
在本發(fā)明的全文中，和序列列表中所示的可變區(qū)的其中一個區(qū)域“基本相同”的序列可以包括與可變區(qū)至少20個，優(yōu)選的至少50個氨基酸至少80％、85％或90％一致的，優(yōu)選的在氨基酸水平至少95或98％一致的氨基酸序列。對于那些已知的對結合特異性的關鍵序列的區(qū)域應當考慮同源性，而不是那些非關鍵的相鄰序列。
可以用肉眼或更常見的，是在易得的序列比較程序的幫助下進行同源性比較。這些商品化可獲得的計算機程序可以計算出兩個或多個序列之間的同源百分比。
可以計算出相鄰序列的同源百分比，也就是說將一個序列與其他序列排成一列，并將一個序列的氨基酸與其他序列的相應的氨基酸進行直接比較，逐個殘基的比較。這被稱為“無缺口”比對。通常的，這些無缺口比對只能在一個相當小數(shù)目的殘基上進行(例如少于50個相鄰的氨基酸)。
盡管這是個非常簡單和一致的方法，但是它未能考慮到，例如當進行整體的比較時，在一個其他的完全一致的序列對中，一個殘基的插入或缺失將造成其之后的氨基酸殘基脫離出比對，因此顯著地造成了同源％的減少。因此，絕大多數(shù)的比較方法都被設計為生成考慮到可能的插入和缺失而不極大地降低整體的同源性積分的最佳比對。通過在序列比對中插入“缺口”達到這一點，使得盡量地最大化局部的同源性。
大多數(shù)比對程序可以修改缺口補償。然而，在使用序列比較軟件時，優(yōu)選的使用缺省值。例如，當使用GCG Wisconsin Bestfit程序包(見下)時，氨基酸序列的缺省補充值為缺口-12以及每個延伸-4。
因此，對同源百分比最大值的計算首先要求考慮缺口補償生成最佳比對。進行這些比對的適當?shù)挠嬎銠C程序是GCG Wisconsin Bestfit程序包(University of Wisconsin，U.S.A.；Devereux et al.，1984，Nucleic AcidsResearch 12387)。其他可以進行序列比較的軟件實例包括，但不局限于BLAST軟件包(見Ausubel et al.，1999 ibid-Chapter 18)、FASTA(Atschul et al.，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS比較工具套組。BLAST和FASTA都能用于離線或在線搜索(見Ausubel et al.，1999ibid，7-58頁至7-60頁))。然而優(yōu)選的使用GCG Bestfit軟件包。
盡管最終的同源％能被以同源性的方式所測定，但是比對程序本身通常不是根據(jù)于非全有即全無的配對比較。取而代之的是，常使用一種標度相似的積分模型，它根據(jù)化學相似性或進化距離將積分分配到每個對比較中。常用的這種模型的實施例是BLOSUM62模型-BLAST程序套組的缺省模型。GCG Wisconsin程序常使用公共缺省值或如果提供的自定義符號比較表(進一步詳情見用戶手冊)。優(yōu)選的使用GCG程序包的公共缺省值或在其他軟件的缺省模型，例如BLOSUM62。
一旦軟件已經(jīng)生成最佳比對，就可以計算出同源％，優(yōu)選的序列一致性％。軟件通常將這作為序列比較的一部分并生成一個用數(shù)字表示的結果。
抗體的人源化將本發(fā)明的抗體人源化是優(yōu)選的，也就是利用分子模型技術生成的抗體，其中抗體的人源部分被最大化同時很少或不丟失鼠抗體的可變區(qū)形成的結合親和力。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一個嵌合抗體，包括用于人源化或渲染來自鼠單克隆抗體例如7F3、C612或12D4的非免疫原性高變區(qū)的人框架區(qū)域的氨基酸序列以及來自人抗體的恒定區(qū)的氨基酸序列。
下面描述的方法被應用于人源化眾多的各種動物抗體?？梢允褂玫膬刹椒椒ò?a)選擇用作為用于人源化的人框架的人抗體序列，以及(b)確定出應當選擇動物單克隆抗體的哪個可變區(qū)殘基插入到所選擇的人框架中。
第一步包括對可獲得的序列信息的最佳的可獲得的人框架序列的選擇。這種選擇方法是根據(jù)以下的選擇標準。
(1)同源性百分比將要被人源化的動物單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列最優(yōu)化比對并優(yōu)選地和所有已知的人抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列進行比較。
一旦序列被如此比較，記錄下殘基的同源性并確定出同源性百分比。所有的其他因素都是相同的，需要選擇與動物抗體有著最高同源性百分比的人抗體。
(2)序列的不確定性然后評價已知的人抗體鏈序列中未識別殘基和/或模糊序列的存在，就是序列的不確定性。最常見的這種不確定性是在序列分析過程中因為氨的丟失將一種氨基酸錯誤地鑒別為另一種氨基酸，例如不準確的鑒別谷氨酸殘基，而實際存在于蛋白中的殘基是谷氨酰胺殘基。所有的其他因素是相同的，需要選擇有著盡可能小的不確定性的人抗體鏈。
(3)針區(qū)間隔(Pin-region Spacing)抗體鏈的可變區(qū)含有結構域內(nèi)二硫鍵。構成這些二硫鍵的半胱氨酸殘基之間的距離(殘基數(shù)目)被稱為針區(qū)間隔[Chothia et al，J.Mol.Biol.196901(1987)]。所有的其他因素是相同的，最需要的是所選擇的人抗體的針區(qū)間隔是與動物抗體的針區(qū)間隔相似或完全一致。也要求人序列的針區(qū)間隔與已知抗體的3維結構的針區(qū)間隔相似，以促進計算機模型設計。
根據(jù)前述的標準，選擇具有所需特性的最佳的全部組合的人抗體(或抗體)作為動物抗體人源化的框架。所選擇的重鏈和輕鏈可以來自相同的或不同的人抗體。
本發(fā)明的方法的第二步包括確定出應當選擇哪個動物抗體的可變區(qū)序列用于移植到人框架中。選擇方法根據(jù)以下的選擇標準(1)殘基選擇在動物抗體序列中評價兩類潛在的可變區(qū)殘基，第一種被稱為“最小化殘基”。這些最小化殘基包含CDR結構環(huán)加上所需的任何其他的殘基，所述殘基如計算機模型設計所示，支持和/或定位CDR結構環(huán)。
潛在的可變區(qū)殘基的其他類型被稱為“最大化殘基”。它們包含最小化殘基加上任何其他的殘基，所述殘基如計算機模型設計所示，落于約10的CDR結構環(huán)殘基內(nèi)并具有水溶液可進入的表面[Lee et al，J.Biol.Chem.55379(1971)](2)計算機模型設計為了識別潛在的可變區(qū)殘基，在(a)需被人源化的動物抗體的可變區(qū)序列；(b)選擇的人抗體框架序列，以及(c)所有可能的組合抗體包括移植有各種最小和最大化動物抗體殘基的人抗體框架序列方面進行計算機模型設計。
利用適合于蛋白模型設計的軟件進行計算機模型設計，以及從(a)有著與動物抗體的可變區(qū)氨基酸序列幾乎完全一致的可變區(qū)氨基酸序列以及(b)有著已知的3維結構的抗體中獲得結構信息?？梢允褂玫能浖嵗荢YBYL Biopolymer Module軟件(Tripos Associates)?？梢垣@得結構信息的抗體可以是但不必是人抗體。
根據(jù)在前述分析中得到的結果，選擇含有計算機模型設計生成的與動物抗體的可變區(qū)最接近的動物可變區(qū)的重組鏈用于人源化。
抗體的同型(isotypes)
在特定的條件下，對于它們的診斷或治療作用，一種同型的單克隆抗體可能比另一種同型的單克隆抗體更為優(yōu)選。例如，從抗體介導的細胞裂解的研究中已知伽瑪-2a和伽瑪-3同型的未修飾的鼠單克隆抗體在裂解靶細胞上通常比伽瑪-1同型的抗體更為有效。認為這種不同的作用是因為伽瑪-2a和伽瑪-3同型能更有效地參與靶細胞的裂解破壞的能力。通過利用子系選擇技術分開轉換變異體，從分泌不同同型的單克隆抗體的母系雜交瘤中繼發(fā)地制備出單克隆抗體的特殊的同型(Steplewski，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，828653，1985；Spira，et al.，J.Immunol.Methods，74307，1984)。因此，本發(fā)明的單克隆抗體將包括有著MAb7F3、6C12和12D4的任何一個抗體的特異性的型轉換變異體。
體外檢測本發(fā)明的單克隆抗體適合于體外應用，例如它們在免疫檢測中可以被應用于液體相或結合到固體相載體上。這些抗體可以用于監(jiān)測樣品中的C5aR水平。同樣的，抗獨特型抗體用于測定樣品中的C5a水平。另外，在這些免疫測定中的單克隆抗體可以被以各種方式可測定地標記。能利用本發(fā)明的單克隆抗體的免疫檢測類型的實施例是以直接或間接形式進行的競爭性和非競爭性免疫檢測。這些免疫檢測的實施例是放射性免疫檢測(RIA)和三明治(免疫測定)檢測。利用前向、反向或同步方式進行的免疫檢測包括對生理樣品的免疫組化檢測可以用本發(fā)明的單克隆抗體進行對抗原的檢測。本領域人員知道或可以輕易地明白不需要過度試驗的其他免疫檢測方式。
本發(fā)明的抗體可以結合于多種不同的載體并被用于測定C5aR的存在。熟知的載體的實例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、天然的和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵礦。根據(jù)本發(fā)明的目的這些抗體的性能可以是可溶性或不可溶性的。本領域人員知道其他的用于結合單克隆抗體的合適載體，或能用常規(guī)試驗明確這些載體。
在一個實施方案中，將自然表達C5aR的細胞或含有編碼C5aR或它的變異體的重組核酸序列的細胞用于本發(fā)明的結合檢測。細胞被保持在適合于受體表達的條件下。在適合于結合的條件下(例如在合適的結合緩沖液中)將這些細胞和抗體或片段接觸，并用標準技術測定結合。為了測定結合，測定出相對于適宜的對照物的結合程度(例如比較于不存在抗體時測定的背景、比較于與第二種抗體的結合(也就是標準抗體)、比較于抗體對非轉染細胞的結合)。含有受體或含有受體的脂質(zhì)體的例如膜碎片的細胞碎片可用于替代整個細胞。
結合抑制檢測也可以用于識別結合于C5aR以及抑制C5a和C5aR或功能性變異體結合的抗體或它們的片段。例如，可以進行結合檢測，其中檢測或測定了比較于不存在抗體時C5a結合，C5a結合的減少(存在有抗體)?？梢詫▎为毜暮?或重組的哺乳動物C5aR或它們的功能性變異體的組合物與C5a及抗體同時接觸，或一個接一個的貫序接觸?？贵w存在時的配體結合程度的減少是抗體對結合抑制的提示。例如，配體的結合可以被減少或消除。
確定與C5aR結合的抗體存在的其他方法是可獲得的，例如其他合適的結合檢測，或監(jiān)測受體結合所觸發(fā)的事件，包括信號功能和/或?qū)毎磻?例如白細胞聚集)的刺激的方法。用這種方式所識別的抗體可以被進一步地評價以確定它們在結合后是否能作用為抑制C5aR的其他功能或評價它們的治療性應用。
信號分析配體或例如激動劑的增強劑與C5aR的結合可以形成通過G蛋白結合受體的信號，并刺激了G蛋白和其他細胞內(nèi)信號分子的活性。利用任何適宜的方法可以監(jiān)測化合物(例如抗體或它們的片段)對信號功能的誘導。這樣的檢測可以被用于識別C5aR的抗體激動劑。在檢測中利用配體或增強劑可以測定抗體或它們的功能性片段的抑制活性，并評價抗體抑制配體或增強劑所誘導的活性的能力。
本領域已知的方法或其他合適的方法(見，例如Neote，K.et al.，Cell，72415-425，1993；Van Riper et al.，J.Exp.Med.，177851-856，1993；Dahinden，C.A.et al.，J.Exp.Med.，179751-756，1994)可以檢測G蛋白活性，例如將GTP水解為GDP，或受體結合所觸發(fā)的之后的信號事件，例如對細胞內(nèi)(細胞漿)游離鈣濃度的快速的和一過性增加的誘導。
例如，利用雜合G蛋白結合受體的Sledziewski et al.的功能性檢測可以被用于檢測配體或增強劑結合于受體并激活G蛋白的能力(Sledziewski et al.，U.S.Pat.No.5,284,746)。
在存在被測定的抗體或它們的片段時可以進行這些檢測，以及利用已知的方法和/或在此所描述的方法測定抗體或片段一致配體或增強劑所誘導的活性的能力。
化學趨化和細胞刺激的檢測化學趨化檢測也可用于評價抗體或它們的功能性片段阻斷配體與C5aR的結合和/或抑制與配體和受體結合所相關的功能的能力。這些檢測以化合物細胞外或細胞內(nèi)所誘導的細胞的功能性遷移為基礎?？梢杂萌魏芜m當?shù)姆绞皆u價化學趨化作用，例如，利用96孔化學趨化板的檢測、或利用其他技術驗證的方法來評價化學趨化作用。例如，Springeret al.(Springer et al.，WO 94/20142，published Sep.15，1994；see alsoBerman et al.，Immunol.Invest.17625-677(1988))描述了體外經(jīng)內(nèi)皮趨化檢測的應用。也已經(jīng)描述了跨內(nèi)皮遷移到膠原質(zhì)中(Kavanaugh et al.，J.Immunol.，1464149-4156(1991))。鼠L1-2前B細胞或其他能化學趨化的適宜的宿主細胞的穩(wěn)定轉染體可以被用于化學趨化檢測。
通常，化學趨化檢測監(jiān)測適宜細胞(例如白細胞(例如淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞))直接運動或遷移到或通過屏障(例如內(nèi)皮，或濾膜)，朝向增加水平的化合物，從屏障的第一個表面向相反的第二個表面。膜或濾膜提供了便利的屏障，因此可以監(jiān)測適宜細胞直接運動或遷移到或通過濾膜，朝向增加水平的化合物，從濾膜的第一個表面向相反的第二個表面。在一些檢測中，用例如ICAM-1、纖維結合素或膠原的物質(zhì)包被所述的膜以促進粘附。這些檢測提供了體外近似的白細胞“歸巢”。
例如，可以檢測或測定對細胞在合適的容器(一個容納裝置)中遷移的抑制，細胞從第一個室遷移進或通過微孔膜進入到含有測試抗體的第二個室，該室與第一個室被膜分開。選擇用于監(jiān)測反應于化合物的特異性遷移的具有適宜孔徑大小的膜，例如硝化纖維、聚碳酸酯。例如可以使用約3-8微米，以及優(yōu)選的約5-8微米的孔徑大小。濾膜上的孔徑大小可以是統(tǒng)一的或在合適的孔徑大小范圍內(nèi)。
為了評價遷移和對遷移的抑制，利用標準技術(例如顯微鏡)可以測定遷移進濾膜的距離、跨過濾膜仍粘附于濾膜的第二個表面的細胞數(shù)目、和/或聚集于第二個室的細胞數(shù)目。在一個實施方案中，用可測定的標記物(例如，放射性同位素、熒光標記物、抗原或抗原決定簇標記物)標記細胞，并通過用適宜的方法(例如通過測定放射活性、熒光、免疫監(jiān)測)測定粘附于膜和/或出現(xiàn)于第二個室的標記物可以測定在存在或不存在抗體或片段時的遷移?？梢詼y定相對于一個合適對照物(例如，比較于不存在抗體時測定的背景遷移、比較于第二種化合物(也就是標準化合物)所誘導的遷移程度、比較于抗體所誘導的未轉染細胞的遷移)的抗體激動劑所誘導的遷移的程度。在一個實施方案中，特別是對于T細胞、單核細胞或表達C5aR的細胞，可以監(jiān)測跨內(nèi)皮遷移。在該實施方案中，測定了經(jīng)內(nèi)皮細胞層的遷移。為了制備細胞層，可以將內(nèi)皮細胞培養(yǎng)在微孔濾膜或膜上，隨意地用例如膠原、纖維結合素或其他的細胞外基質(zhì)蛋白的物質(zhì)包囊化，以促進內(nèi)皮細胞的連接。優(yōu)選地，培養(yǎng)內(nèi)皮細胞直到形成了融合的單層細胞。各種哺乳動物的內(nèi)皮細胞可以被用于形成單層細胞，包括例如靜脈、動脈或微血管內(nèi)皮細胞，例如人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Clonetics Corp，San Diego，Calif.)。為了評價應答于特殊哺乳動物受體的化學趨化作用，優(yōu)選的是同種哺乳動物的內(nèi)皮細胞。而且來自異源的哺乳動物物種或?qū)俚膬?nèi)皮細胞也可以被使用。
通常的，通過檢測細胞定向地遷移進或通過膜或濾膜來進行檢測，遷移方向朝向化合物的增加水平，從濾膜的第一個表面向濾膜的相反的第二個表面，其中濾膜在第一個表面含有內(nèi)皮細胞層。定向遷移發(fā)生于從與第一個表面相鄰的區(qū)域，進入或通過膜，朝向化合物位于的濾膜的相反側。第二個表面的相鄰區(qū)域中的化合物濃度要高于第一個表面的相鄰區(qū)域的化合物濃度。
在一個用于測定抗體抑制劑的實施方案中，將包括能遷移和表達C5aR的細胞的組合物放置于第一個室中。將含有一個或多個能誘導第一個室內(nèi)細胞的化學趨化的配體或增強劑的組合物(具有化學趨化功能)放置于第二個室中。優(yōu)選的在將細胞放置于第一個室前不久，或和細胞同步，將包含測試抗體的組合物放置于，優(yōu)選的第一個室內(nèi)。
能與受體結合并抑制配體或增強劑所誘導的表達C5aR的細胞的化學趨化的抗體或它們的功能性片段在本檢測中是受體功能的抑制劑(例如刺激功能的抑制劑)。存在抗體時的配體或增強劑誘導的遷移程度的減少是抑制活性的提示?？梢赃M行單獨的結合研究以確定抑制是否是抗體與受體結合的結果或通過不同的機制發(fā)生的。
下面描述了(見炎癥模型)監(jiān)測應答于組織內(nèi)注射化合物(例如化學因子或抗體)的組織內(nèi)白細胞浸潤的體外監(jiān)測。這些體內(nèi)歸巢模型測定了細胞應答于配體或增強劑并通過移動和化學趨化到炎癥部位的能力，以及測定抗體或它們的片段阻斷這種移動的能力。
除了所述的方法，利用含有受體的合適的宿主細胞，通過監(jiān)測活性受體所誘導的細胞反應測定抗體或片段對C5aR的刺激功能的作用。
C5aR的其他配體、抑制劑或增強劑的鑒定能用于測定本發(fā)明的抗體和片段的結合及功能的上述檢測能用于鑒定與C5aR或它們的功能變異體結合的其他配體和其他物質(zhì)，以及C5aR功能的抑制劑和/或增強劑。例如，利用所述的抗體或它們的部分的競爭性檢測能鑒別與本發(fā)明的抗體或它們的功能性部分有著一樣或相似的結合特異性的物質(zhì)。因此，本發(fā)明也包括鑒別與C5aR結合的受體的配體或其他物質(zhì)、以及受體功能的抑制劑(拮抗劑)或增強劑(激動劑)的方法。在一個實施方案中，將具有C5aR蛋白或它們的功能性變異體的細胞(例如，白細胞、細胞系或已經(jīng)被加工成表達引入到所述細胞的核酸所編碼的哺乳動物的C5aR蛋白或功能變異體的合適的宿主細胞)應用于鑒定并評價與受體結合的配體或其他物質(zhì)，包括受體功能的抑制劑或增強劑的作用的方法中。這些細胞也用于評價表達的受體蛋白或多肽的功能。
根據(jù)本發(fā)明，在合適的檢測中可以鑒定與受體結合的配體和其他物質(zhì)、受體功能的抑制劑和增強劑，并進一步地評價治療作用。受體功能的拮抗劑可以用于抑制(減少或阻止)受體活性，以及配體和/或激動劑可以用于誘導(觸發(fā)或增強)其中所示的正常的受體功能。因此，本發(fā)明提供了一種治療炎性疾病包括自身免疫疾病和移植排異的方法，包括將受體功能的拮抗劑施用于個體(例如哺乳動物)。本發(fā)明進一步提供了一種通過將受體功能的新的配體或激動劑施用于個體刺激受體功能的方法，提供了一種選擇性刺激白細胞功能的新措施，例如它在治療感染性疾病和癌癥上是有用的。
在此所用的C5aR蛋白的“配體”指的是與哺乳動物C5aR蛋白結合的特殊類型的物質(zhì)，包括天然配體和天然配體的合成和/或重組形式。在優(yōu)選的實施方案中，與C5aR蛋白結合的配體具有高度的親和力。
在此所用的“拮抗劑”是一種抑制(減少或阻止)C5aR蛋白的至少一個功能特征例如結合活性(例如配體結合、增強劑結合、抗體結合)、信號活性(例如哺乳動物G蛋白的激活、對細胞漿游離鈣濃度的快速和暫時增加的誘導)和/或細胞反應功能(例如，化學趨化的刺激、白細胞的細胞外分泌或炎性介質(zhì)的釋放)的物質(zhì)。名詞拮抗劑包括與受體結合的物質(zhì)(例如，抗體、天然配體的突變體、小分子量的有機分子、配體結合的其他競爭性抑制劑)以及抑制受體功能而不結合于其上的物質(zhì)(例如，抗獨特型抗體)。
在此所用的“激動劑”是一種增強(誘導、引起、增強或增加)C5aR蛋白的至少一個功能特征例如結合活性(例如配體、抑制劑和/或增強劑結合)、信號活性(例如哺乳動物G蛋白的激活、對細胞漿游離鈣濃度的快速和暫時增加的誘導)和/或細胞反應功能(例如，化學趨化的刺激、白細胞的細胞外分泌或炎性介質(zhì)的釋放)的物質(zhì)。名詞激動劑包括與受體結合的物質(zhì)(例如抗體、來自其他物種的天然配體的同源物)，以及促進受體功能而不結合于其上的物質(zhì)(例如通過激活相關蛋白)。在優(yōu)選的實施方案中，激動劑是天然配體的同源物。
因此，本發(fā)明也涉及一種檢測或鑒定與C5aR或它們的結合配體的變異體結合的物質(zhì)的方法，包括配體、拮抗劑、激動劑和其他與C5aR或功能性變異體結合的其他物質(zhì)。根據(jù)本方法，可以組合測試的物質(zhì)、本發(fā)明的抗體或抗原結合片段(例如，有著和7F3一樣或相似的抗原決定簇特異性的抗體，以及它們的抗原結合片段)以及含有C5aR或它們的配體結合變異體的組合物。在適合于抗體或抗原結合片段與C5aR結合的條件下混合上述的成分，并根據(jù)在此所描述的方法或其他合適的方法直接或間接地檢測或測定抗體或片段與C5aR的結合。相對于合適的對照物(例如缺少測試的物質(zhì))，所形成的復合物量的減少提示該物質(zhì)結合到上述的受體或變異體。包含C5aR的組合物可以是帶有重組C5aR或它們的配體結合變異體的細胞的膜碎片。抗體或它們的片段可以被一種例如放射性同位素、旋轉標記物、抗原或抗原決定簇標記物、酶標記物、熒光基團和化學發(fā)光基團的標記物所標記。
炎癥模型體內(nèi)炎癥模型是可獲得的，它可用于評價本發(fā)明的抗體和片段體內(nèi)作為治療劑的作用。例如，將化學因子以及與C5aR發(fā)生反應的抗體或它們的片段皮內(nèi)注射到合適的動物中，例如兔、鼠、豚鼠或獼猴，并監(jiān)測白細胞的浸潤(見例如Van Damme，J.et al.，J.Exp.Med.，17659-65(1992)；Zachariae，C.O.C.et al.，J.Exp.Med.1712177-2182(1990)；Jose，P.J.et al.，J.Exp.Med.179881-887(1994))。在一個實施方案中，皮膚活檢組織學評價白細胞的浸潤(例如嗜酸性粒細胞、粒細胞)。在另一個實施方案中，將能化學趨化和外溢的標記的細胞(例如，表達C5aR的穩(wěn)定轉染的細胞)施用于動物。在將標記的細胞施用于試驗動物之前、同時或之后，將測試的抗體或片段施用于測試動物。比較于無抑制劑時的浸潤程度，抗體存在時浸潤程度的減少是抑制的提示。
診斷和治療應用本發(fā)明的抗體和片段在各種應用上都是有用的，包括研究、診斷和治療性應用。在一個實施方案中，用合適的標記物(例如熒光標記物、化學發(fā)光標記物、同位素標記物、抗原或表位標記物或酶標記物)標記這些抗體。例如，它們可以用于分離和/或純化受體和它們的部分，并研究受體的結構(例如構象)和功能。
另外，可以將本發(fā)明的各種抗體用于檢測C5aR或測定例如T細胞(例如CD8+細胞、CD45RO+細胞)、單核細胞和/或轉染了受體基因的細胞上的受體的表達。因此，它們也能用于診斷或研究目的的的應用，例如細胞分選(例如流式細胞術、熒光活化細胞分選)。
本發(fā)明的抗C5aR抗體在診斷應用上是有用的。通常地，診斷性檢測用于測定抗體或它們的片段與C5aR結合所形成的復合物的形成。對于診斷目的，將抗體或抗原結合片段標記或未標記。抗體或片段可以被直接標記。可以使用各種標記物，包括但不局限于，放射性核素、熒光劑、酶底物、酶共因子、酶抑制劑和配體(例如生物素、半抗原)。本領域人員知道多種適合的免疫檢測(見，例如，U.S.Pat.Nos.3,817,827；3,850,752；3,901,654和4,098,876)。組織樣品的免疫組化也可以用于本發(fā)明的診斷性方法中。當抗體或片段未被標記時，利用例如凝集檢測的合適的方法可以測定抗體或片段。未標記的抗體或片段也可以和另一種(也就是一種或多種)能用于檢測例如與第一抗體(例如抗獨特型抗體或其他特異于未標記免疫球蛋白的抗體)發(fā)生反應的標記抗體(例如第二抗體)的抗體的合適的試劑，或其他合適的試劑(例如標記的蛋白A)聯(lián)合使用。
也可以制備用于檢測生物樣品中C5aR蛋白存在的試劑盒。這些試劑盒將包括與C5aR結合的抗體或它們的片段，以及一種或多種適合于檢測抗體或片段與C5aR之間的復合物存在的輔助試劑。可以以凍干的形式提供本發(fā)明的抗體組合物，它可以單獨地或聯(lián)合其他的特異于其他抗原決定簇的抗體一起使用。標記的或未標記的抗體可以和輔助成分(例如緩沖劑，例如Tris、磷酸和碳酸、穩(wěn)定劑、賦形劑、生物殺滅劑和/或惰性蛋白，例如牛血清白蛋白)一起包含于試劑盒中。例如，可以提供抗體和輔助成份的凍干混合物，或者輔助成份可以被單獨提供給用戶聯(lián)合使用。這些輔助材料通常要小于基于活性抗體量的5％重量，以及總量至少是基于抗體濃度的0.001％重量。采用第二抗體能結合于單克隆抗體的容器，例如單獨的小瓶或罐，試劑盒可以提供這些抗體。如果存在第二抗體，它通常是被標記的，并按和上述的抗體制備一樣的方式進行制備。
同樣，本發(fā)明也涉及一種檢測和/或定量檢測細胞表達的C5aR的方法，其中將包含細胞或它的片段(例如膜碎片)的組合物在適合于抗體或片段結合的條件下與同C5aR結合的抗體或它的功能性片段接觸，并監(jiān)測結合。對抗體的檢測以及抗體和C5aR之間復合物形成的提示說明了受體的存在。例如，如同在標題“結合檢測”所述的一樣，可以測定抗體和細胞的結合。該方法可以用于檢測來自個體(例如一個樣品，例如一種體液、例如血、唾液或其他合適的樣品)的細胞上C5aR的表達。例如，通過流式細胞儀也可以測定T細胞或單核細胞表面上C5aR的表達水平，并且表達的水平(例如，染色強度)可以與疾病易感性、進展或危險相關。
受體的作用為化學趨化白細胞在全身的遷移，特別是遷移到炎癥部位。通過三步過程調(diào)節(jié)炎性細胞遷移出血管，該過程包括白細胞和內(nèi)皮細胞粘附蛋白以及細胞特異性化學引誘物及活化因子的相互作用(Springer，T.A.，Cell，76301-314(1994)；Butcher，E.C.，Cell，671033-1036(1991)；Butcher，E.C.and Picker，L.J.，Science(Wash.D.C.)，27260-66(1996))。它們是(a)白細胞選擇素和內(nèi)皮細胞糖之間的低親和力的相互作用；(b)白細胞化學引誘物受體和化學趨化/活化因子之間的高親和力的相互作用；以及(c)白細胞整合素和免疫球蛋白超家族的內(nèi)皮細胞粘附蛋白之間的緊密結合。不同的白細胞亞群表達不同的選擇素、化學引誘物和整合素群。另外，炎癥改變了內(nèi)皮粘附蛋白的表達以及化學引誘物和白細胞活化因子的表達。因此，在調(diào)節(jié)白細胞循環(huán)到血管外部位的選擇性上有著很大的差異。第二個步驟是關鍵的，其中對白細胞化學引誘物受體的激活被認為是引起了從選擇素介導的細胞翻轉為整合素介導的緊密結合的過渡。這使得白細胞準備遷移到血管周圍部位?；瘜W引誘物/化學引誘物受體的相互作用對于經(jīng)內(nèi)皮遷移和組織內(nèi)定位也是關鍵的(Campbell，J.J.，et al.，J.Cell Biol.，134255-266(1996)；Carr，M.W.，etal.，Immunity，4179 187(1996))。這種遷移是被化學引誘物的濃度梯度所指導的并朝向炎性病灶。
C5aR對于白細胞聚集有著重要作用。C5aR可能是一種作用于中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、T細胞或T細胞亞群或單核細胞遷移到特定的炎癥部位的關鍵的化學引誘物受體，所以可以將抗C5aR MAb用于抑制(減少或阻止)白細胞遷移，特別是和中性粒細胞阻止損傷所相關的遷移，例如再灌注損傷和卒中、T細胞功能不全，例如自身免疫病、或過敏反應或單核細胞所介導的疾病，例如粥樣硬化癥。
因此，在研究和治療性應用中也可以將本發(fā)明的抗體和它們的片段用于調(diào)節(jié)受體功能。例如，在此所描述的抗體和功能性片段可以作為抑制(減少或阻止)(a)與受體的結合(例如配體、抑制劑或增強劑)，(b)受體信號功能，和/或(c)刺激功能的抑制劑。作為受體功能抑制劑的抗體可以直接或間接地(例如通過引起構象改變)阻斷配體或增強劑的結合。例如，抗體可以通過抑制配體的結合或通過脫敏作用(有或沒有對配體結合的抑制)抑制受體功能。與受體結合的抗體也可以作為受體功能的激動劑，觸發(fā)或刺激受體功能，例如結合于受體引發(fā)的受體的信號或刺激功能(例如白細胞聚集)。
因此，本發(fā)明提供了一種抑制哺乳動物(例如人患者)內(nèi)白細胞聚集的方法，包括給哺乳動物施用有效量的本發(fā)明的抗體或功能性片段。本發(fā)明也提供了一種抑制與C5aR活性相關的其他作用的方法，例如嗜堿性粒細胞釋放組胺以及嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和中性粒細胞釋放顆粒。施用本發(fā)明的抗體或片段可以造成病態(tài)的改善或消除。
單克隆抗體也可以用于免疫治療免疫相關疾病。結合于本發(fā)明的單克隆抗體，在此所用的名詞“免疫治療地”或“免疫治療”指的是預防性和治療性給藥。因此，可以將單克隆抗體施用于高?；颊咭詼p少免疫性疾病的可能性和/或嚴重性，以及施用于已經(jīng)證實有活動性疾病的患者，例如革蘭氏染色陰性細菌感染引起的膿毒癥。
抗體或它們的功能性片段可以用于治療過敏、粥樣斑塊形成、過敏性反應、惡性腫瘤、慢性和急性炎癥、組胺和IgE介導的過敏反應、休克、和類風濕關節(jié)炎、粥樣硬化、多發(fā)硬化、異體移植排異、纖維化疾病、哮喘、炎性腎小球疾病或任何免疫復合物相關性疾病。
用C5aR受體功能的抑制劑(包括抗體或它們的合適片段)可以治療的人或其他物種的疾病或病變包括但不局限于(a)炎性或過敏性疾病及病變，包括呼吸道過敏性疾病，例如哮喘、過敏性鼻炎、高敏性肺病、高敏性肺炎、間質(zhì)性肺病(ILD)(例如，特發(fā)性肺纖維化，或與類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、系統(tǒng)性硬化癥、干燥綜合征、多發(fā)性肌炎或皮肌炎相關的ILD)；過敏性或高敏性反應，藥物過敏(例如對青霉素、頭孢菌素)、昆蟲刺咬過敏；炎性腸病，例如克隆病和潰瘍性結腸炎；脊柱關節(jié)??；硬皮病；銀屑病和炎性皮膚病變例如皮炎、濕疹、遺傳性過敏性皮炎、過敏性接觸性皮炎、蕁麻疹；血管炎(例如，壞死性、皮膚性和高敏性血管炎)；(b)自身免疫病，例如關節(jié)炎(例如類風濕關節(jié)炎、銀屑病關節(jié)炎)、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、幼年發(fā)病糖尿病、腎病例如腎小球腎炎、自身免疫性甲狀腺炎、白塞病；(c)移植物排異(例如在移植中)，包括同種異體排異或移植物抗宿主?。?d)動脈粥樣硬化；(e)具有白細胞皮膚或器官浸潤的腫瘤；(f)可以治療的其他疾病或病變(包括C5aR介導的疾病或病變)，其中非所需的炎癥反應被抑制，這包括當不局限于再灌注損傷、卒中、成人呼吸窘迫綜合征、某些血液腫瘤、細胞因子相關的毒性(例如，感染性休克、內(nèi)毒素休克)、多發(fā)性肌炎、皮肌炎、類天皰瘡、Alzheimers病以及包括結節(jié)病的肉芽腫疾病。
本發(fā)明的抗C5aR抗體可以阻斷一個或多個配體的結合，因此阻斷了導致上述疾病的下游的一個或多個事件的連鎖反應。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體用于治療膿毒癥、卒中或成人呼吸窘迫綜合征。
可以用C5aR功能的增強劑治療的人或其他物種的疾病或病變包括，但不局限于免疫抑制，例如那些免疫缺陷綜合征的個體，例如AIDS、進行放療或化療的個體、自身免疫病的治療或其他藥物治療(例如糖皮質(zhì)激素的治療)，這些都造成免疫抑制；以及因為受體功能的先天性缺陷或其他病因造成的免疫抑制。
給藥方式根據(jù)本發(fā)明的一個免疫治療的方法需要在免疫性疾病發(fā)病之前(預防)或之后(治療)將本發(fā)明的治療劑通過注射或輸注給藥。
本發(fā)明的一個或多個抗體或片段可以通過合適的途徑施用于個體，可以單獨施用或聯(lián)合(之前、同步或之后)其他藥物或試劑施用。例如本發(fā)明的抗體可以和其他的單克隆或多克隆抗體(例如，聯(lián)合了與化學因子受體結合的抗體，包括但不局限于CCR2和CCR3)或和抗TNF或其他的抗炎癥藥物或和血漿制品例如商品化可獲得伽瑪球蛋白和免疫球蛋白制品聯(lián)合用于預防或治療性治療。本發(fā)明的抗體或片段可以用作為單獨給藥的組合物，并與抗生素和/或抗微生物藥物一起聯(lián)合施用。
施用有效量的抗體或片段(也就是一個或多個抗體或片段)。優(yōu)選劑量為在給藥的條件下能獲得所需的治療(包括預防)作用的有效量，例如有效地抑制C5aR功能并因此抑制炎癥反應的劑量。
各種給藥途徑是可能的，它包括但不必局限于口服、飲食、局部、腸外(例如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下注射)、吸入(例如經(jīng)氣管、經(jīng)眼、經(jīng)鼻或經(jīng)口吸入、經(jīng)鼻滴入)，這依賴于所治療的疾病或病變。其他合適的給藥方法也可以包括可充電的或可生物降解的裝置以及緩釋多聚體裝置。也可以將本發(fā)明的藥物組合物作為與其他藥物的聯(lián)合治療的一部分施用。
根據(jù)給藥途徑以及所選擇的形式(例如溶液、乳劑、膠囊)，施用的抗體或片段的形式是不同的。一種包含抗體或它們的功能性片段的適宜的藥物組合物可以被制備于生理可接受的媒介或載體中。也可以使用抗體和/或片段的混合物。對于溶液或乳劑，合適的載體包括例如水溶液或乙醇/水溶液；對于乳劑或懸浮液，合適的載體包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸外媒介可以包括氯化鈉溶液、Ringer葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸化Ringer溶液或不揮發(fā)油。本領域人員所熟知的各種合適的水溶液載體包括水、緩沖水、緩沖鹽、多羥基化合物(例如甘油、丙烯乙二醇、液態(tài)的聚乙烯乙二醇)、葡萄糖溶液和糖膠。靜脈內(nèi)媒介可以包括各種添加劑、防腐劑、或液體、營養(yǎng)物或電解質(zhì)補充物(常見于Remington′sPharmaceutical Science，16th Edition，Mack，Ed.1980)。組合物可以按需隨意地包含有藥用可接受的輔助物質(zhì)使得其接近于生理狀態(tài)，例如pH調(diào)節(jié)和緩沖藥物、毒性調(diào)整藥物、例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和乳酸鈉。根據(jù)已知技術的凍干和再生技術可以將本發(fā)明的抗體和片段凍干用于保存以及在合適的載體中再生。根據(jù)本領域熟知的方法可以經(jīng)驗地確定活性成份在所選的媒介中的最佳濃度，并且這將依賴于所需的最終的藥用形式。對于吸入，可以將抗體或片段溶解并裝入合適的分散器中進行給藥(例如，噴霧器、霧化器或加壓氣霧分散器)。
施用本發(fā)明的單克隆抗體的劑量范圍是大到足夠產(chǎn)生所需作用的劑量，其中改善了免疫性疾病的癥狀或減少了感染的可能性或?qū)γ庖呦到y(tǒng)的過度刺激。劑量不應當大到引起相反的副作用，例如高粘滯綜合征、肺水腫、充血性心衰等。通常地，劑量隨著患者的年齡、一般條件、性別和疾病的程度而變化，并由本領域人員所確定。個人的家庭醫(yī)生可以因為任何的并發(fā)癥而調(diào)整劑量。劑量的變化可以從約0.1mg/kd到約300mg/kg，優(yōu)選的從約0.2mg/kg到約200mg/kg，最優(yōu)選的從約0.5mg/kg到約20mg/kg，每天施用一個或多個劑量，持續(xù)一天或幾天。
本領域人員可以理解，通過施用含有編碼抗體的核酸分子可以將本發(fā)明的抗體引入到目標對象中。核酸分子可以是DNA或RNA或含有DNA或RNA的嵌合分子的形式?？梢詫⒕幋a抗體的核苷酸序列克隆進表達載體中，其中將編碼藥物的序列和表達調(diào)節(jié)元件可操縱地連接。表達調(diào)節(jié)元件在本領域是熟知的并包括例如，啟動子、增強子和合適的起始及終止密碼子。
多種方法可以用于將編碼抗體的核酸分子體內(nèi)引入到靶細胞中。例如，可以在靶點注射裸核酸、可以將裸核酸包囊化成脂質(zhì)體，或可以通過病毒載體引入。
單獨的核酸分子或包囊化于例如陽離子脂質(zhì)體的核酸分子的直接注射可以被用于體內(nèi)將編碼TSP-1的核酸穩(wěn)定基因轉移進非分裂的或分裂的細胞(Ulmer et al.，Science 2591745-1748(1993))。另外，利用粒子轟擊方法可以將核酸轉移進各種組織中(Williams et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 882726-2730(1991))。
病毒載體可用于體內(nèi)將編碼抗體的核酸分子基因轉移到特定的細胞類型中。病毒是特異的感染物質(zhì)，它能感染特定的細胞類型并在其中繁殖。這種對感染特定細胞類型的特異性是特別適合于體內(nèi)將抗體定向到所選擇的細胞中。對病毒載體的選擇部分依賴于所定向的細胞類型。
能定向到特殊的細胞類型的特殊的病毒載體在本領域是熟知的。這些載體包括，例如，具有通用的或組織特異性啟動子的重組腺相關病毒載體(Lebkowski et al.U.S Pat.No.5,354,678)。重組腺相關病毒載體所具有的附加優(yōu)點是重組病毒可以穩(wěn)定地整合到甚至靜止的非增殖細胞的染色體中(Lebkowski et al.，Mol.Cell.Biol.83988-3996(1988))。
通過將組織特異性啟動子或增強子結合進載體可以構建病毒載體，使得能進一步地控制表達編碼抗體的細胞類型(Dai et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910892-10895(1992))。
逆轉錄病毒載體也適合于進行體內(nèi)轉送編碼抗體的核酸分子的方法。這些載體可以被構建成作用為感染粒子或作用為只進行單次首輪感染的非感染粒子。
利用組織特異性的配體或通過橋分子(bridging molecule)非共價地連接于核酸分子的抗體，受體所介導的DNA轉送方法也可以用于以組織特異性的方式將編碼抗體的核酸分子轉送到細胞內(nèi)(Curiel et al.，Hum.Gene Ther.3147-154(1992)；Wu and Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))。
例如，通過體外對同源細胞的轉染也可以進行在目標對象中獲得抗體表達的基因轉移。對于這種體外轉染所適合的細胞包括血細胞，因為利用本領域所熟知的方法容易操縱這些細胞并將它們重新導入到目標對象中。
多種方法可以進行通過體外轉染細胞的基因轉移，例如，磷酸鈣沉淀、二乙氨乙基葡聚糖、電穿孔、脂染或病毒感染。這些方法是本領域所熟知的(見，例如，Sambrook et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Springs Harbour Laboratory Press(1989))。一旦這些細胞被轉染，然后將它們移植或遷移回所治療的目標對象中。一旦這些引入體內(nèi)的細胞能產(chǎn)生抗體，這些抗體可以進入循環(huán)并在疾病或病變部位抑制血小板的聚集。
在整個申請中名詞“包括”或“含有”或“包含”應當被理解為意思是包括所述的元素、整體或步驟，或者是元素、整體或步驟的組，但不排除任何其他的元素、整體或步驟，或者是元素、整體或步驟的組。
本申請就收入的文獻、文件、材料、方案、文章等等所作的任何討論，其目的僅僅是用作本申請的背景，不能視為這等于認可這些內(nèi)容的部分或全部構成了在本申請各項權利要求的優(yōu)先權日之前已經(jīng)存在于澳大利亞的現(xiàn)有技術的一部分或者是本發(fā)明相關領域的公知常識。
現(xiàn)在下面的實施例將舉例說明本發(fā)明，它不會以任何方式進行限制。在此所引用的所有的參考文獻的內(nèi)容將一起并入?yún)⒖肌?br> 實施例材料和方法1.單克隆抗體的生成和流式細胞檢測用107L1.2 C5aR轉染的細胞[8]每隔2周腹腔內(nèi)接種C57BL/6鼠五到六次，生成與C5aR發(fā)生反應的單克隆抗體(MAb)。靜脈內(nèi)注射末次接種物。四天后，取出脾并如所述的用SP2/0細胞系融合細胞[9]。利用C5aR轉染的L1.2細胞、未轉染的L1.2細胞、或例如CXCR2或CX3CR1(V28)的無關受體轉染的L1.2細胞，利用熒光染色以及用FACScan(Becton Dickinson&Co.，Mountain View，CA)的分析來鑒別與C5aR發(fā)生反應的MAb。如同先前所描述的[10]，利用標準操作進行細胞的MAb染色。
2.配體結合檢測重組人C5a來自Sigma化學公司(St.Louis，MO)。125I-Bolton-Hunter-標記的補體C5a購自NEN-Dupont(Boston，MA)，其具有2200 Ci/mM的特異性活性。如先前所述的[9，11]進行C5a與L1.2 C5aR轉染體的結合。簡要的，在PBS中洗滌細胞一次并將細胞按107/ml濃度重懸于結合緩沖液(50mM Hepes，pH7.5，1mM CaCl，5mM MgCl2，0.5％BSA和0.05％疊氮化物)。將50ml(5×105細胞)水溶液分散到微離心管中，隨后加入冷的競爭劑以及1nM放射性標記的C5a。最終的反應容積為200μl。在室溫下孵育60分鐘后，用1ml含有0.5M NaCl的結合緩沖液洗滌細胞三次。然后將細胞計數(shù)。通過細胞與放射性標記的C5a的孵育能得到背景結合，并且它至少比未結合C5a高400倍。在整個試驗中使用復孔以及標準差始終是＜平均值的10％。
3.轉染體的化學趨化檢測刮取下C5aR轉染的L1.2細胞并在遷移培養(yǎng)基中洗滌，及按107細胞/ml重懸。在24孔組織培養(yǎng)板的每個孔中放入組織培養(yǎng)插入物(BectonDickinson&Co.，Mountain View，CA)，這形成了具有3mm直徑孔的聚對苯二酸乙二醇酯膜(polyethylene terepthalate membrane)所分隔的上室和下室。往24孔組織培養(yǎng)板的600μl檢測培養(yǎng)基中加入化學趨化的C5a(稀釋于檢測培養(yǎng)基)，使得其終濃度為1nM。將100T1中的100萬個細胞和來自含有抗體的雜交瘤的上清預先培養(yǎng)30分鐘。將細胞-上清混合物或純化的mAb加入到孔的上室中，并容許細胞在5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中遷移18個小時到下室。遷移后取出插入物并用FACScan將細胞計數(shù)。通過獲取為期30秒的事件得到相對細胞計數(shù)。發(fā)現(xiàn)這個方法有著極高的可重復性，并可對白細胞設門和除外碎片。
4.中性粒細胞化學趨化檢測細胞制備首先通過在室溫下40分鐘的葡聚糖沉淀步驟獲得白細胞部分，然后將細胞分層加入到Ficoll-Paque(Amersham Biosciences)中，在室溫2500rpm下進行密度梯度離心，這樣從外周血中分離到中性粒細胞。在低滲裂解殘余的紅細胞后，將中性粒細胞重懸于同樣體積的RPMI 1640(Invitrogen Inc.)、M199(Invitrogen Inc.)和2％FCS(HyClone)中。
化學趨化檢測將濃度范圍從0.5到10μg/ml的抗C5aR MAb6C12、7F3和12D4加入到中性粒細胞(1×107/ml)中。然后將細胞放入到帶有3.0μm孔徑的聚碳酸酯膜的24孔插入物(Coming Inc.，NY)的上室，并在室溫下孵育10分鐘。然后將插入物放置到含有例如C5a(0.1到100nM)和IL-8(1.12ng/ml到11.2ng/ml)的人中性粒細胞化學引誘物的下室。然后在37℃孵育中性粒細胞30分鐘。流式細胞儀定量通過膜遷移到下室的中性粒細胞數(shù)目。
5.競爭性抑制檢測將50μg/ml的抗C5aR MAb加入到濃度范圍從1到100μM被稱為“PEPI”的C5aR N-末端的合成生成的肽(Biosource；Eldridge)中。然后加入C5a受體轉染的并重懸于1％牛血清白蛋白(BSA；GibcoBRL)(1×107/ml)的鼠L1.2細胞使得總體積為100μl。將細胞在4℃孵育30分鐘并用0.1％BSA洗滌一次。將熒光素結合的綿羊抗鼠IgG，F(xiàn)(ab’)2(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.)用作為第二抗體(1∶200)并在4℃孵育15分鐘，隨后是用0.1％BSA的附加的洗滌步驟。將細胞重懸于0.1％BSA中并用流式細胞儀分析。
6.ELISA檢測按免疫學通用方案(Unit 2.1)(Edited by J.F.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.B.Margulies，E.M.Shevach and W.Strober)，John Wiley and Sons，NewYork所描述的進行ELISA。簡要的，用1Tg/ml蛋白PBS溶液在37℃包被96孔平底ELISA板(Maxisorp；Nunc)1個小時，然后用BSA在4℃阻斷過夜。然后洗滌板，和抗體孵育、洗滌及和過氧化物酶結合的綿羊抗鼠IgG抗體孵育。所使用的底物是TMB底物試劑(PharMingen)。
實施例1MAb的生成和流式細胞檢測將表達高水平C5aR的轉染體[8]用于接種鼠，然后通過流式細胞儀鑒別十種與C5aR轉染的L1.2細胞特異反應，但不與CX3CR1(V28)或CXCR2轉染的L1.2細胞特異性反應的MAb。這十種MAb被稱為12D4、10G1、5H11、6C12、10D4、5F3、7F3、8D6、11B9和1D12。
圖1是一組直方圖，顯示了MAb 7F3與C5aR轉染體(L1.2 C5aR)和人中性粒細胞反應，但不與CX3CR1轉染的細胞(L1.2 V28)或CXCR2轉染的細胞(L1.2 CXCR2)反應。這些MAb 7F3結果是鑒別的十種抗體的代表。
實施例2對C5a與C5aR轉染的細胞的結合的抑制測試了MAb抑制125I-標記的C5a與C5aR轉染體的結合的能力。圖2顯示MAb 7F3完全抑制了125I-標記的C5a與轉染體的結合，并且這種抑制要強于用400nM C5a所獲得的抑制。這說明MAb 7F3能完全阻斷C5a與C5aR的結合。MAb 6C12和12D4也顯示了對125I-標記的C5a與C5aR轉染體的結合的根本性抑制。圖3顯示了MAb 7F3對C5a與C5aR的結合的劑量依賴性抑制。
實施例3MAb 7F3對人C5a介導的C5aR轉染體遷移的抑制利用C5aR轉染的L1.2細胞如上描述的進行化學趨化試驗。圖4顯示7F3、6C12和12D4完全地或根本性抑制了C5a對C5aR-L1.2細胞的化學趨化作用。圖5顯示mAb 7F3對C5a對C5aR-L1.2細胞的化學趨化作用的劑量依賴性抑制。
實施例4MAb 7F3對人C5a介導的中性粒細胞遷移的抑制在1xPBS(GibcoBRL)中透析抗C5aR MAb，以及將5μg/ml透析的和非透析的7F3 MAb都加入到中性粒細胞(1×107/ml)中。包括有陰性對照(無Ab加入，和加入1×PBS)。然后將細胞放入到帶有3.0μm孔徑的聚碳酸酯膜的24孔插入物(Corning Inc.，NY)的上室，并在室溫下孵育10分鐘。然后將插入物放置到含有人中性粒細胞化學引誘物C5a(0.1到100nM)的下室。然后在37℃孵育中性粒細胞30分鐘。流式細胞儀(FACSCalibur；BD Biosciences)定量通過膜遷移到下室的中性粒細胞數(shù)目。
圖6顯示了比較于兩個陰性對照，MAb 7F3(無論透析的或未透析的)的加入造成了中性粒細胞遷移的抑制。
實施例5MAb 7F3、6C12和12D4對人C5a介導的中性粒細胞遷移的抑制將三種5μg/ml的抗C5aR MAb 7F3、6C12和12D4加入到中性粒細胞(1×107/ml)中。包括有陰性對照(無Ab加入，和加入1×PBS)。然后將細胞放入到帶有3.0μm孔徑的聚碳酸酯膜的24孔插入物(ComingInc.，NY)的上室，并在室溫下孵育10分鐘。然后將插入物放置到含有人中性粒細胞化學引誘物C5a(1.12到1120ng/ml)的下室。然后在37℃孵育中性粒細胞30分鐘。流式細胞儀(FACSCalibur；BD Biosciences)定量通過膜遷移到下室的中性粒細胞數(shù)目。
圖7的結果顯示比較于兩種陰性對照，所有的三種MAb表現(xiàn)出對中性粒細胞朝向C5a遷移的抑制。特別是，7F3 MAb表現(xiàn)出最有效的抑制，造成中性粒細胞遷移數(shù)目比背景水平減少了140倍。
實施例6MAb 7F3、6C12和12D4對人IL-8介導的中性粒細胞遷移的抑制將三種5μg/ml的抗C5aR MAb 7F3、6C12和12D4；以及7F3的透析樣品加入到中性粒細胞(1×107/ml)中，并放置于24孔插入物的上室中。也包括有陰性對照(無Ab加入，和加入1×PBS)。在室溫下孵育10分鐘后。然后將插入物放置到含有IL-8(1.12到1120ng/ml)的下室中，IL-8是一種與中性粒細胞表面上所表達的CXCR1和CXCR2受體結合的人中性粒細胞化學引誘物。然后在37℃孵育中性粒細胞30分鐘。流式細胞儀(FACSCalibur；BD Biosciences)定量通過膜遷移到下室的中性粒細胞數(shù)目。
圖8(a)果顯示所有的三種MAb表現(xiàn)出對中性粒細胞朝向IL-8遷移的抑制。7F3 MAb(透析的和為透析的)都是最有效的抑制劑，造成了中性粒細胞遷移數(shù)目減少了5倍。
也測定了MAB 7F3抑制其他中性粒細胞化學引誘物，特別是CXCR1和CXCR2配體的能力。表1顯示在中性粒細胞化學趨化檢測中，對中性粒細胞遷移向大量的中性粒細胞化學引誘物，特別是CXCR1和CXCR2配體的真實抑制。
表1化學引誘物(112ng/ml) ％抑制C5a 98IL-8 81GCP-2 91ENA-7883實施例7C5aRN末端肽(9-29)對MAb 7F3、6C12和12D4與C5aR轉染體結合的競爭性抑制。
通過用熒光素(FITC)結合的綿羊抗鼠IgG染色測定MAb 7F3、6C12和12D4與C5aR轉染細胞的結合。然后根據(jù)上述的方法測定C5aR N末端肽(9-29)抑制這種結合的能力。該C5aR N末端肽(9-29)具有序列PDYGHYDDKDTLDLNTPVDKT以及在此被稱為“PEPI”。
圖9(a)顯示增加濃度的PEPI沒有抑制三種抗C5aR MAb的熒光染色。甚至在100TM濃度的PEPI，熒光染色仍是穩(wěn)定的。
圖9(b)顯示了PEPI(50TM濃度)不能抑制MAb 7F3對純化的中性粒細胞的FACS染色。
實施例8MAb 7F3、6C12和12D4與C5aRN末端肽(9-29)(“PEPI”)及OPG的反應性按上述的進行ELISA檢測測定MAb 7F3、6C12、12D4和PEPI及OPG的反應性。OPG是TNF受體超家族的一個成員，它特異性地結合于它的配體TNFSF11/OPGL。更特異的，OPG是成骨細胞分泌的誘餌受體，它作用為對骨吸收的負性調(diào)節(jié)子將1μg/ml濃度的MAb 7F3、6C12和12D4作為純化蛋白用于ELISA。將MAb 9C1(特異于OPG)和MAb 11B9(識別PEPI)用作為陽性對照。以未稀釋的組織培養(yǎng)上清的形式使用這些對照MAb。
圖10顯示MAb 7F3、6C12和12D4和PEPI無反應，MAb 7F3和OPG有弱的交叉反應。
實施例9抗C5aR MAb 7F3、6C12和12D4的序列測定從表達抗體的雜交瘤細胞中提取的RNA中測定抗C5aR抗體7F3、6C12和12D4的核苷酸序列。為了確定用于擴增重鏈和輕鏈可變區(qū)的引物，通過Biogen Inc.測定三種抗體的可變區(qū)的蛋白序列，并用鼠單克隆抗體同型試劑盒-IsoStrip(Roche Cat.No.1 493 027)測定抗體的同型。因此，5’框架1引物來自Biogen Inc.蛋白序列，而3’引物是根據(jù)于抗體的同型。
每種抗C5aR抗體的同型如下6C12輕鏈 Kappa6C12重鏈 IgG37F3 輕鏈 Kappa7F3 重鏈 IgG2a12D4輕鏈 Kappa12D4重鏈 IgG3
利用Trizol試劑(Invitrogen，Cat.No.15596-018)從雜交瘤細胞分離到總RNA。按生產(chǎn)商所描述的分離RNA。簡要的，將近5×106細胞裂解于1ml Trizol試劑中。用200T1氯仿清除細胞碎片并離心。取出含有RNA的水溶液層并用250T1異丙醇沉淀RNA。
利用AMV逆轉錄酶(Promega Cat.No.M5101)用總RNA(2Tg)制備cDNA。然后利用下面的引物用cDNA作為模板擴增編碼可變區(qū)的序列6C12輕鏈可變區(qū)引物mIgkapFR1 5′GATGTTTTGATGACCCAAACTCC(SEQ ID NO2)mIgkapcon3′ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG(SEQ ID NO3)6C12重鏈可變區(qū)引物mIgVh2 5′SAGGTCCAGCTGCARCAGTC(SEQ ID NO4)FR1 VhIIA家族mIgG3con3′TGGGCATGAAGAACCTGG(SEQ ID NO5)鉸鏈區(qū)7F3輕鏈可變區(qū)引物mIgkapFR1 5′GATGTTTTGATGACCCAAACTCC(SEQ ID NO6)mIgkapcon3′ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG(SEQID NO7)7F3重鏈可變區(qū)引物mIgVh2 5′SAGGTCCAGCTGCARCAGTC(SEQ ID NO8)FR1 VhIIA家族mIgG2acon3′TTTGCATGGAGGACAGGG(SEQ ID NO9)12D4輕鏈可變區(qū)引物mIgkapFR1 5′GATGTTTTGATGACCCAAACTCC(SEQ ID NO10)mIgkapcon3′ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG(SEQ ID NO11)12D4重鏈可變區(qū)引物mIgVh1 5′CAGGTGCAGCTGAAGSAGTC(SEQ ID NO12)FR1 VhIB家族mIgG3con3’TGGGCATGAAGAACCTGG(SEQ ID NO13)鉸鏈區(qū)用高保真的Pfu聚合酶(Promega Cat.No.M7741)進行聚合酶鏈反應(PCR)，退火溫度60℃，以及在72℃延伸引物3分鐘。將所得到的近700bp的PCR片段克隆進pGEM-Teasy(Promega Cat.No.A1360)中。分離單個克隆并用商品化的測序工具測序。
在此所提供的結果序列如下6C12輕鏈可變區(qū)(DNA)序列 SEQ ID NO146C12輕鏈可變區(qū)(蛋白)序列 SEQ ID NO156C12重鏈可變區(qū)(DNA)序列 SEQ ID NO166C12重鏈可變區(qū)(蛋白)序列 SEQ ID NO177F3輕鏈可變區(qū)(DNA)序列 SEQ ID NO187F3輕鏈可變區(qū)(蛋白)序列 SEQ ID NO197F3重鏈可變區(qū)(DNA)序列 SEQ ID NO207F3重鏈可變區(qū)(蛋白)序列 SEQ ID NO2112D4輕鏈可變區(qū)(DNA)序列 SEQ ID NO2212D4輕鏈可變區(qū)(蛋白)序列 SEQ ID NO2312D4重鏈可變區(qū)(DNA)序列 SEQ ID NO2412D4重鏈可變區(qū)(蛋白)序列 SEQ ID NO25實施例10對MAb 7F3、6C12和12D4的DNA和蛋白序列的一致性及相似性的分析。
利用MacVector 6.5.3比較三種抗C5aR抗體(7F3、6C12和12D4)的DNA及蛋白序列。將ClustalW(1.4)多比對程序用于該分析。
(i)輕鏈可變區(qū)DNA序列的分析圖11顯示了7F3、6C12和12D4的輕鏈可變區(qū)DNA序列的比對。
ClustalW(1.4)多序列比對分析得到了以下結果3 Sequences Aligned.Alignment Score＝6612Gaps Inserted＝0 Conserved Identities＝315
Pairwise Alignment ModeSlowPairwise Alignment ParametersOpen Gap Penalty＝10.0 Extend Gap Penalty＝5.0Multiple Alignment ParametersOpen Gap Penalty＝10.0 Extend Gap Penalty＝5.0Delay Divergent＝40％ TransitionsWeightedProcessing time0.4 seconds1.7F3 Vk vs.6c12 VkAligned Length＝336 Gaps＝0Identities＝320(95％)2.7F3 Vk vs.12d4 VkAligned Length＝336 Gaps＝0Identities＝320(95％)3.6c12 Vk vs.12d4 VkAligned Length＝336 Gaps＝0Identities＝326(97％)(ii)重鏈可變區(qū)DNA序列的分析圖12顯示了7F3、6C12和12D4的重鏈可變區(qū)DNA序列的比對。
ClustalW(1.4)多序列比對分析得到了以下結果3 Sequences Aligned.Alignment Score＝5346Gaps Inserted＝3 Conserved Identities＝200Pairwise Alignment ModeSlowPairwise Alignment ParametersOpen Gap Penalty＝10.0 Extend Gap Penalty＝5.0Multiple Alignment ParametersOpen Gap Penalty＝10.0 Extend Gap Penalty＝5.0
Delay Divergent＝40％ TransitionsWeightedProcessing time0.5 seconds1.7F3 Vh vs.6c12 VhAligned Length＝363 Gaps＝0Identities＝333(91％)2.7F3 Vh vs.12d4 VhAligned Length＝363 Gaps＝3Identities＝210(57％)3.6c12 Vh vs.12d4 VhAligned Length＝363 Gaps＝3Identities＝210(57％)(iii)輕鏈可變區(qū)蛋白序列的分析圖13顯示了7F3、6C12和12D4的輕鏈可變區(qū)蛋白序列的比對。
ClustalW(1.4)多序列比對分析得到了以下結果3 Sequences Aligned. Alignment Score＝1902Gaps Inserted＝0Conserved Identities＝99Pairwise Alignment ModeSlowPairwise Alignment ParametersOpen Gap Penalty＝10.0 Extend Gap Penalty＝0.1Similarity MatrixblosumMultiple Alignment ParametersOpen Gap Penalty＝10.0 Extend Gap Penalty＝0.1Delay Divergent＝40％ Gap Distance＝8Similarity MatrixblosumProcessing time0.1 seconds1.7F3 Vk vs.6c12 Vk
Aligned Length＝112Gaps＝0Identities＝102(91％) Similarities＝5(4％)2.7F3 Vk vs.12d4 VkAligned Length＝112Gaps＝0Identities＝103(91％) Similarities＝4(3％)3.6c12 Vk vs.12d4 VkAligned Length＝112Gaps＝0Identities＝104(92％) Similarities＝4(3％)(iv)重鏈可變區(qū)蛋白序列的分析圖14顯示了7F3、6C12和12D4的重鏈可變區(qū)蛋白序列的比對。
ClustalW(1.4)多序列比對分析得到了以下結果3 Sequences Aligned. Alignment Score＝1432Gaps Inserted＝2 Conserved Identities＝51Pairwise Alignment ModeSlowPairwise Alignment ParametersOpen Gap Penalty＝10.0 Extend Gap Penalty＝0.1Similarity MatrixblosumMultiple Alignment ParametersOpen Gap Penalty＝10.0 Extend Gap Penalty＝0.1Delay Divergent＝40％ Gap Distance＝8Similarity MatrixblosumProcessing time0.1 seconds1.7F3 Vh vs.6c12 VhAligned Length＝121Gaps＝0Identities＝107(88％) Similarities＝6(4％)2.7F3 Vh vs.12d4 Vh
Aligned Length＝121 Gaps＝2Identities＝52(42％) Similarities＝25(20％)3.6c12 Vh vs.12d4 VhAligned Length＝121 Gaps＝2Identities＝54(44％) Similarities＝25(20％)本領域人員了解，只要不脫離于廣泛描述的本發(fā)明的精神或范圍，可以如特殊實施方案所示的對本發(fā)明進行無數(shù)的變更和/或修改。因此，本實施方案的所有部分只被認為是作為舉例說明而不是限制性的。
參考文獻1.Gerard，C.and N.P.Gerard，C5A anaphylatoxin and its seventransmembrane-segment receptor.Annual Review of Immunology，1994.12p.775-808.
2.Murdoch，C.and A.Finn，Chemokine receptors and their role ininflammation and infectious diseases.Blood，2000.95(10)p.3032-43.
3.Watanabe，H.，et al.，Analysis of C5a receptorby monoclonal antibody.Journal of Immunological Methods，1995.185(1)p.19-29.
4.Pellas，T.C.，et al.，Novel C5a receptor antagonists regulate neutrophilfunctions in vitro and in vivo.Journal of Immunology，1998.160(11)p.5616-21.
5.Konteatis，Z.D.，et al.，Development of C5a receptor antagonists.Differential loss of functional responses.Journal of Immunology，1994.153(9)p.4200-5.
6.Kaneko，Y.，et al.，Antagonistic peptides against human anaphylatoxinC5a.Immunology，1995.86(1)p.149-54.
7.Morgan，E.L.，et al.，Anti-C5a receptor antibodies.Characterization ofneutralizing antibodies specific for a peptide，C5aR-(9-29)，derived from thepredicted amino-terminal sequence of the human C5a receptor.Journal ofImmunology，1993.151(1)p.377-88.
8.Campbell，J.J.，et al.，Biology of chemokine and classicalchemoattractant receptorsdifferential requirements for adhesion-triggeringversus chemotactic responses in lymphoid cells.J Cell Biol，1996.134(1)p.255-66.
9.Heath，H.，et al.，Chemokine receptor usage by human eosinophils.Theimportance of CCR3 demonstrated using an antagonistic monoclonalantibody.J Clin Invest，1997.99(2)p.178-84.
10.Ponath，P.D.，et al.，Molecular cloning and characterization of a humaneotaxin receptor expressed selectively on eosinophils[see comments].J ExpMed，1996.183(6)p.2437-48.
11.Ponath，P.D.，et al.，Cloning of the human eosinophil chemoattractant，eotaxin.Expression，receptor binding，and functional properties suggest amechanism for the selective recruitment of eosinophils.J Clin Invest，1996.97(3)p.604-12.
序列表<110>G2治療有限公司<120>抗C5aR抗體及其應用<130>501129<150>USSN 60/350,961<151>2002-01-25<160>34<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>350<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Asn Ser Phe Asn Tyr Thr Thr Pro Asp Tyr Gly His Tyr Asp Asp1 5 10 15Lys Asp Thr Leu Asp Leu Asn Thr Pro Val Asp Lys Thr Ser Asn Thr20 25 30Leu Arg Val Pro Asp Ile Leu Ala Leu Val Ile Phe Ala Val Val Phe35 40 45Leu Val Gly Val Leu Gly Asn Ala Leu Val Val Trp Val Thr Ala Phe50 55 60
Glu Ala Lys Arg Thr Ile Asn Ala Ile Trp Phe Leu Asn Leu Ala Val65 70 75 80Ala Asp Phe Leu Ser Cys Leu Ala Leu Pro Ile Leu Phe Thr Ser Ile85 90 95Val Gln His His His Trp Pro Phe Gly Gly Ala Ala Cys Ser Ile Leu100 105 110Pro Ser Leu Ile Leu Leu Asn Met Tyr Ala Ser Ile Leu Leu Leu Ala115 120 125Thr Ile Ser Ala Asp Arg Phe Leu Leu Val Phe Lys Pro Ile Trp Cys130 135 140Gln Asn Phe Arg Gly Ala Gly Leu Ala Trp Ile Ala Cys Ala Val Ala145 150 155 160Trp Gly Leu Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Ser Phe Leu Tyr Arg Val165 170 175Val Arg Glu Glu Tyr Phe Pro Pro Lys Val Leu Cys Gly Val Asp Tyr180 185 190Ser His Asp Lys Arg Arg Glu Arg Ala Val Ala Ile Val Arg Leu Val195 200 205Leu Gly Phe Leu Trp Pro Leu Leu Thr Leu Thr Ile Cys Tyr Thr Phe210 215 220Ile Leu Leu Arg Thr Trp Ser Arg Arg Ala Thr Arg Ser Thr Lys Thr225 230 235 240Leu Lys Val Val Val Ala Val Val Ala Ser Phe Phe Ile Phe Trp Leu245 250 255Pro Tyr Gln Val Thr Gly Ile Met Met Ser Phe Leu Glu Pro Ser Ser260 265 270Pro Thr Phe Leu Leu Leu Asn Lys Leu Asp Ser Leu Cys Val Ser Phe275 280 285Ala Tyr Ile Asn Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Val Val Ala Gly
290 295 300Gln Gly Phe Gln Gly Arg Leu Arg Lys Ser Leu Pro Ser Leu Leu Arg305 310 315 320Asn Val Leu Thr Glu Glu Ser Val Val Arg Glu Ser Lys Ser Phe Thr325 330 335Arg Ser Thr Val Asp Thr Met Ala Gln Lys Thr Gln Ala Val340 345 350<210>2<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR primer<400>2gatgttttga tgacccaaac tcc 23<210>3<211>25<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR primer<400>3acactcattc ctgttgaagc tcttg25<210>4<211>20<212>DNA
<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR primer<400>4saggtccagc tgcarcagtc 20<210>5<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR primer<400>5tgggcatgaa gaacctgg18<210>6<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<220>
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<400>19Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asn Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser85 90 95Thr Leu Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105 110<210>20<211>363<212>DNA<213>Mus musculus<400>20caggttcagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatt 60tcctgcaagg cttctggcta cgcattcagt aactcctgga tgaactgggt gaagcagagg120cctggaaagg gtcttgagtg gattggacgg atttatcctg gagatggaga tactaagtac180aatgggaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac240atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagattccta300cttattagta cggtaacagc cgttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc360tca 363
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權利要求
1.一種與C5aR的N-末端結構域以外的細胞外環(huán)具有反應性的抗體，其中所述抗體減少或抑制C5a與C5aR的結合。
2.權利要求1的抗體，其中所述抗體與含有C5aR的第二個細胞外環(huán)(殘基175到206)的表位具有反應性。
3.一種抗體，其和MAb 7F3與C5aR的同一個表位具有反應性，其中所述抗體減少或抑制C5a與C5aR的結合。
4.一種抗體，其和MAb 6C12與C5aR的同一個表位具有反應性，其中所述抗體減少或抑制C5a與C5aR的結合。
5.一種抗體，其和MAb 12D4與C5aR的同一個表位具有反應性，其中所述抗體減少或抑制C5a與C5aR的結合。
6.一種與C5aR結合的抗體，其中所述抗體競爭性地抑制MAb7F3與C5aR的結合。
7.一種與C5aR結合的抗體，其中所述抗體競爭性地抑制MAb6C12與C5aR的結合。
8.一種與C5aR結合的抗體，其中所述抗體競爭性地抑制MAb12D4與C5aR的結合。
9.權利要求6到8中任一項的抗體，其中在存在C5aR或含有C5aR的細胞外環(huán)的多肽的條件下通過抗體抗體競爭性檢測測定相對的結合特異性。
10.一種包含與分別由SEQ ID NO19和SEQ ID NO21所示的序列基本相同的輕鏈和/或重鏈序列的抗體，其中所述抗體減少或抑制C5a與C5aR的結合。
11.一種包含至少一個CDR環(huán)序列的抗體，所述CDR環(huán)序列與分別由SEQ ID NO26、SEQ ID NO27或SEQ ID NO28所示的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環(huán)序列基本相同，其中所述抗體減少或抑制C5a與C5aR的結合。
12.權利要求11的抗體，其中所述抗體包含至少兩個與分別由SEQ ID NO26、SEQ ID NO27和SEQ ID NO28所示的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環(huán)序列基本相同的CDR環(huán)序列。
13.權利要求11或12的抗體，其中所述抗體進一步包含至少一個基本上由SEQ ID NO19所示的可變輕鏈序列的24到39、55到61、或94到102位氨基酸殘基所確定的CDR環(huán)序列。
14.權利要求13的抗體，其中所述抗體包含至少兩個基本上由SEQ ID NO19所示的可變輕鏈序列的24到39、55到61、和94到102位氨基酸殘基所確定的CDR環(huán)序列。
15.一種包含與分別由SEQ ID NO15和SEQ ID NO17所示的序列基本相同的輕鏈和/或重鏈序列的抗體，其中所述抗體減少或抑制C5a與C5aR的結合。
16.一種包含至少一個CDR環(huán)序列的抗體，所述CDR環(huán)序列與分別由SEQ ID NO29、SEQ ID NO30或SEQ ID NO31所示的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環(huán)序列基本相同，其中所述抗體減少或抑制C5a與C5aR的結合。
17.權利要求16的抗體，其中所述抗體包含至少兩個與分別由SEQ ID NO29、SEQ ID NO30和SEQ ID NO31所示的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環(huán)序列基本相同的CDR環(huán)序列。
18.權利要求16或17的抗體，其中所述抗體進一步包含至少一個基本上由SEQ ID NO15所示的可變輕鏈序列的24到39、55到61、或94到102位氨基酸殘基所確定的CDR環(huán)序列。
19.權利要求18的抗體，其中所述抗體包含至少兩個基本上由SEQ ID NO15所示的可變輕鏈序列的24到39、55到61、和94到102位氨基酸殘基所確定的CDR環(huán)序列。
20.一種包含與分別由SEQ ID NO23和SEQ ID NO25所示的序列基本相同的輕鏈和/或重鏈序列的抗體，其中所述抗體減少或抑制C5a與C5aR的結合。
21.一種包含至少一個CDR環(huán)序列的抗體，所述CDR環(huán)序列與分別由SEQ ID NO32、SEQ ID NO33或SEQ ID NO34所示的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環(huán)序列基本相同，其中所述抗體減少或抑制C5a與C5aR的結合。
22.權利要求21的抗體，其中所述抗體包含至少兩個與分別由SEQ ID NO32、SEQ ID NO33和SEQ ID NO34所示的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環(huán)序列基本相同的CDR環(huán)序列。
23.權利要求21或22的抗體，其中所述抗體進一步包含至少一個基本上由SEQ ID NO23所示的可變輕鏈序列的24到39、55到61、或94到102位氨基酸殘基所確定的CDR環(huán)序列。
24.權利要求23的抗體，其中所述抗體包含至少兩個基本上由SEQ ID NO23所示的可變輕鏈序列的24到39、55到61、和94到102位氨基酸殘基所確定的CDR環(huán)序列。
25.權利要求1到24中任一項的抗體，其中所述抗體也抑制由不同于C5a的其他化學引誘物配體引起的中性粒細胞的激活。
26.權利要求1到25中任一項的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體或重組抗體。
27.權利要求1到25中任一項的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
28.權利要求1到27中任一項的抗體，其中所述抗體是IgG2a型或IgG3型抗體。
29.一種單克隆抗體，選自由MAb 7F3、MAb 6C12和MAb12D4組成的組。
30.一種保藏于ECACC、保藏號為00110609的雜交瘤。
31.一種保藏于ECACC、保藏號為02090226的雜交瘤。
32.一種保藏于ECACC、保藏號為02090227的雜交瘤。
33.一種包含權利要求1到29中任一項的抗體和治療劑的綴合物。
34.權利要求33的綴合物，其中所述治療劑為毒素。
35.權利要求33的綴合物，其中所述毒素是假單胞菌外毒素或其衍生物。
36.一種包括權利要求1到29中任一項的抗體和可測定的標記物的綴合物。
37.權利要求36的綴合物，其中所述標記物選自由放射性標記物、熒光標記物、酶標記物和對比劑標記物組成的組。
38.一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼權利要求1到29中任一項的抗體的序列。
39.一種包含權利要求1到29中任一項的抗體及藥用可接受的載體的組合物。
40.一種抑制帶有C5aR的細胞與其配體相互作用的方法，所述方法包括將所述細胞暴露于權利要求1到29中任一項的抗體。
41.一種抑制細胞內(nèi)C5aR活性的方法，所述方法包括將所述細胞暴露于權利要求1到29中任一項的抗體。
42.一種治療目標對象的涉及中性粒細胞遷移的疾病的方法，所述方法包括將權利要求1到29中任一項的抗體施用于所述目標對象。
43.一種診斷目標對象的涉及中性粒細胞遷移的疾病的方法，所述方法包括將得自所述目標對象的樣品與權利要求36或37的綴合物接觸，并檢測所述綴合物和所述樣品之間的免疫特異性結合。
44.權利要求43的方法，其中所述方法利用得自所述目標對象的組織學樣品或組織碎片或體液在體外進行。
45.權利要求43的方法，其中所述方法在體內(nèi)進行。
46.一種診斷目標對象的涉及中性粒細胞遷移的疾病的方法，所述方法包括在能在目標對象內(nèi)形成抗體和呈遞C5aR的細胞之間的復合物的條件下將帶有成像物質(zhì)的權利要求1到19中任一項的抗體施用于所述目標對象，并對該復合物進行成像。
47.權利要求42到46中任一項的方法，其中所述疾病是一種免疫性疾病。
48.一種將治療劑輸送到目標對象的炎癥部位的方法，所述方法包括將權利要求33到35中任一項的綴合物施用于所述目標對象。
49.一種將遺傳物質(zhì)引入到呈遞C5aR的細胞中的方法，所述方法包括將所述細胞和權利要求1到29中任一項的抗體接觸，其中所述抗體附著了或結合了遺傳物質(zhì)。
50.權利要求49的方法，其中所述呈遞C5aR的細胞選自由粒細胞、白細胞例如單核細胞、巨噬細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞、肥大細胞、和包括T細胞在內(nèi)的淋巴細胞、樹突狀細胞、以及非髓系細胞例如內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞所組成的組。
51.一種治療目標對象的涉及中性粒細胞遷移的疾病的方法，所述方法包括將編碼權利要求1到29中任一項的抗體的多核苷酸引入到所述目標對象的細胞中以使得所述抗體在體內(nèi)表達。
全文摘要
本發(fā)明涉及與C5aR結合并可用于診斷和治療方法中的抗體。本發(fā)明的抗體與C5aR的N－末端結構域以外的細胞外環(huán)具有反應性并能夠基本上減少或抑制C5a與C5aR的結合以及中性粒細胞化學引誘物受體激活的功能性結果。
文檔編號A61K39/395GK1642983SQ03806948
公開日2005年7月20日 申請日期2003年1月24日 優(yōu)先權日2002年1月25日
發(fā)明者查爾斯·雷伊·麥凱 申請人:G2治療有限公司