專利名稱：含吸因子Ⅷ的穩(wěn)定藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的含有因子VIII的穩(wěn)定藥物組合物。
背景技術(shù)：
因子VIII是眾所周知的血漿蛋白，它是血液凝結(jié)過程所必要的，因此用于治療血友病。
幾種形式的因子VIII已經(jīng)或者正在試圖用作治療血友病的活性成分。它們包括人因子VIII(象HumateP、MonoclateP、Imunate或HemofilM中的活性成分)、重組人因子VIII(象PCT專利申請(qǐng)WO 91/09122中公開的r-VIII SQ(ReFacto的活性成分)或Kogenate或Recombinate中的活性成分)、豬因子VIII(它是美國(guó)Ipsen，Inc.公司銷售的產(chǎn)品HyateC的活性成分)、或重組豬因子VIII(如改進(jìn)的無B-域形式的豬因子VIII，象專利申請(qǐng)WO01/68109中公開的“POL1212”或者該申請(qǐng)中序列為SEQ.ID.NO.38的蛋白)。
對(duì)于生產(chǎn)因子VIII藥物組合物的制藥工業(yè)而言，制劑的穩(wěn)定性一直是一個(gè)問題。
白蛋白常常用于穩(wěn)定這些制劑。但是，除了要達(dá)到的穩(wěn)定效果以外，白蛋白存在價(jià)格昂貴的缺陷，而且有攜帶朊病毒之類的感染物的風(fēng)險(xiǎn)。基于這些原因，近年來制藥工業(yè)一直在尋求在因子VIII藥物組合物中用其他穩(wěn)定劑替代白蛋白。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員已經(jīng)熟知一些穩(wěn)定的無白蛋白的藥物組合物。例如●美國(guó)專利5,565,427教導(dǎo)一種有因子VIIIC活性的穩(wěn)定的無白蛋白的溶液，它含有因子VIIIC、氨基酸或其鹽或同系物以及去污劑(象聚山梨醇酯80或Tween80)或有機(jī)聚合物(象聚乙二醇)。
●美國(guó)專利5,605,884涉及一種含有因子VIII和高離子強(qiáng)度介質(zhì)的穩(wěn)定的因子VIII組合物，所述介質(zhì)優(yōu)選由含有作為緩沖離子的氯化鈉、氯化鈣和組氨酸的混合物的水溶液組成。
●美國(guó)專利5,763,401和5,874,408都公開了穩(wěn)定的無白蛋白的重組因子VIII組合物，它含有重組因子VIII、甘氨酸、組氨酸、蔗糖、氯化鈉和氯化鈣。
●美國(guó)專利5,962,650教導(dǎo)了一種穩(wěn)定的無白蛋白的重組因子VIII組合物，它由具有降低的氧濃度的水溶液組成，該水溶液含有重組因子VIII、鈣鹽(如氯化鈣)和優(yōu)選地抗氧化劑、非離子性表面活性劑、氯化鈉或氯化鉀、氨基酸以及單糖或二糖。
●美國(guó)專利5,972,885涉及一種用于皮下、肌內(nèi)或皮內(nèi)施用的藥物制劑，它含有高濃度的(至少1000IU/ml)重組因子VIII和優(yōu)選地一種或多種(尤其是)選自下述的物質(zhì)氯化鈉或氯化鉀、氯化鈣、非離子性表面活性劑(如泊洛沙姆)、單糖或二糖(優(yōu)選蔗糖)和抗氧化劑(如檸檬酸)。
● PCT專利申請(qǐng)WO89/09784公開了一種生產(chǎn)熱穩(wěn)定的因子VIII濃縮物的方法，它包括將含有所述的因子VIII和三(羥甲基)甲基胺、檸檬酸三鈉、氯化鈉、蔗糖和氯化鈣的緩沖液進(jìn)行凝膠過濾，然后將得到的濃縮物凍干。這樣生產(chǎn)的因子VIII能夠耐受高達(dá)80℃的溫度最長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)。
●PCT專利申請(qǐng)WO94/07510公開了一種用非離子性表面活性劑(如泊洛沙姆，象聚山梨醇酯80)穩(wěn)定化的因子VIII組合物。該組合物還可以含有(尤其是)下述物質(zhì)中的一種或者多種氯化鈉或氯化鉀、氯化鈣、氨基酸、單糖或二糖如蔗糖。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)在，本申請(qǐng)人意外地發(fā)現(xiàn)，通過冷凍干燥含有下述組分且不含有氨基酸的溶液可以得到一種固體藥物組合物(a)因子VIII；
(b)表面活性劑；(c)氯化鈣；(d)蔗糖；(e)氯化鈉；(f)檸檬酸三鈉；和(g)無氨基酸的緩沖液；所述的藥物組合物在冷凍干燥以前和與注射用水重配以后的pH為6～8，并顯示出時(shí)間穩(wěn)定性。
本申請(qǐng)中的因子VIII是指人因子VIII、重組人因子VIII、豬因子VIII、重組豬因子VIII或更一般地任何能夠用來替換它們的其他重組因子VIII。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物所含的因子VIII選自豬因子VIII或重組豬因子VIII。更優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物所含的因子VIII是重組豬因子VIII，特別是象專利申請(qǐng)WO01/68109所公開的修飾的無B-域形式的豬因子VIII，即具有下述氨基酸序列SEQ.ID.NO.1的修飾的豬因子VIIISEQ.ID.NO.1Met Gln Leu Glu Leu Ser Thr Cys Val Phe Leu Cys Leu Leu Pro Leu1 5 10 15Gly Phe Ser Ala Ile Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser20 25 30Trp Asp Tyr Arg Gln Ser Glu Leu Leu Arg Glu Leu His Val Asp Thr35 40 45Arg Phe Pro Ala Thr Ala Pro Gly Ala Leu Pro Leu Gly Pro Ser Val50 55 60Leu Tyr Lys Lys Thr Val Phe Val Glu Phe Thr Asp Gln Leu Phe Ser65 70 75 80Val Ala Arg Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile85 90 95Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Val Thr Leu Lys Asn Met Ala100 105 110Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Phe Trp Lys Ser115 120 125Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Glu Asp His Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu130 135 140
Asp Asp Lys Val Leu Pro Gly Lys Ser Gln Thr Tyr Val Trp Gln Val145 150 155 160Leu Lys Glu Asn Gly Pro Thr Ala Ser Asp Pro Pro Cys Leu Thr Tyr165 170 175Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu180 185 190Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Thr Arg Glu Arg195 200 205Thr Gln Asn Leu His Glu Phe Val Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu210 215 220Gly Lys Ser Trp His Ser Ala Arg Asn Asp Ser Trp Thr Arg Ala Met225 230 235 240Asp Pro Ala Pro Ala Arg Ala Gln Pro Ala Met His Thr Val Asn Gly245 250 255Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Lys Lys Ser260 265 270Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Ser Pro Glu Val His Ser275 280 285Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg His His Arg Gln Ala290 295 300Ser Leu Glu Ile Ser Pro Leu Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Phe Leu305 310 315 320Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His His325 330 335His Gly Gly Met Glu Ala His Val Arg Val Glu Ser Cys Ala Glu Glu340 345 350Pro Gln Leu Arg Arg Lys Ala Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Asp Asn355 360 365Leu Tyr Asp Ser Asp Met Asp Val Val Arg Leu Asp Gly Asp Asp Val370 375 380Ser Pro Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr385 390 395 400Trp Val His Tyr Ile Ser Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro405 410 415Ala Val Pro Ser Pro Ser Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Leu Tyr Leu Asn420 425 430Ser Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Ala Arg Phe Val435 440 445Ala Tyr Thr Asp Val Thr Phe Lys Thr Arg Lys Ala Ile Pro Tyr Glu450 455 460Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu465 470 475 480Leu Ile Ile Phe Lys Asn Lys Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495His Gly Ile Thr Asp Val Ser Ala Leu His Pro Gly Arg Leu Leu Lys500 505 510Gly Trp Lys His Leu Lys Asp Met Pro Ile Leu Pro Gly Glu Thr Phe515 520 525Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp530 535 540Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Ile Asn Leu Glu Lys545 550 555 560Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu565 570 575Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Met Met Ser Asp Lys Arg Asn Val580 585 590Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Gln Ser Trp Tyr Leu Ala Glu595 600 605Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Asp Gly Leu Gln Pro Gln Asp610 615 620Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val625 630 635 640Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp645 650 655Tyr Ile Leu Ser Val Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe660 665 670Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr675 680 685Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro690 695 700Gly Leu Trp Val Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Leu Arg Asn Arg Gly705 710 715 720Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Tyr Ser Cys Asp Arg Asp Ile Gly Asp725 730 735Tyr Tyr Asp Asn Thr Tyr Glu Asp Ile Pro Gly Phe Leu Leu Ser Gly740 745 750Lys Asn Val Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ala Gln Asn Ser Arg Pro Pro755 760 765Ser Ala Ser Ala Pro Lys Pro Pro Val Leu Arg Arg His Gln Arg Asp770 775 780Ile Ser Leu Pro Thr Phe Gln Pro Glu Glu Asp Lys Met Asp Tyr Asp785 790 795 800Asp Ile Phe Ser Thr Glu Thr Lys Gly Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Gly805 810 815Glu Asp Glu Asn Gln Asp Pro Arg Ser Phe Gln Lys Arg Thr Arg His820 825 830
Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Glu835 840 845Ser Pro Arg Ala Leu Arg Asn Arg Ala Gln Asn Gly Glu Val Pro Arg850 855 860Phe Lys Lys Val Val Phe Arg Glu Phe Ala Asp Gly Ser Phe Thr Gln865 870 875 880Pro Ser Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Lys His Leu Gly Leu Leu Gly Pro885 890 895Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Lys Asn900 905 910Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Pro915 920 925Asp Asp Gln Glu Gln Gly Ala Glu Pro Arg His Asn Phe Val Gln Pro930 935 940Asn Glu Thr Arg Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro945 950 955 960Thr Glu Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val965 970 975Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile980 985 990Cys Arg Ala Asn Thr Leu Asn Ala Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val99510001005Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp101010151020Tyr Phe Thr Glu Asn Val Glu Arg Asn Cys Arg A1a Pro Cys His Leu1025 103010351040Gln Met Glu Asp Pro Thr Leu Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile104510501055Asn Gly Tyr Val Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asn106010651070Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile107510801085His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Ser Val Arg Lys Lys Glu109010951100Glu Tyr Lys Met Ala Val Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr1105 111011151120Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Val Gly Ile Trp Arg Ile Glu Cys Leu112511301135Ile Gly Glu His Leu Gln Ala Gly Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Tyr114011451150Ser Lys Glu Cys Gln Ala Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly Arg Ile Arg115511601165Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys117011751180
Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys1185 119011951200Asp Pro His Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile120512101215His Gly Ile Met Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr122012251230Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Arg Asn Trp Gln123512401245Ser Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn125012551260Val Asp Ala Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Val1265 127012751280Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr128512901295Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro130013051310Leu Gly Met Gln Asn Lys Ala Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr Ala Ser131513201325Ser His Leu Ser Asn Ile Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Gln Ala Arg133013351340Leu His Leu Gln Gly Arg Thr Asn Ala Trp Arg Pro Arg Val Ser Ser1345 135013551360Ala Glu Glu Trp Leu Gln Val Asp Leu Gln Lys Thr Val Lys Val Thr136513701375Gly Ile Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Ser Ser Met Tyr Val138013851390Lys Glu Phe Leu Val Ser Ser Ser Gln Asp Gly Arg Arg Trp Thr Leu139514001405Phe Leu Gln Asp Gly His Thr Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser141014151420Ser Thr Pro Val Val Asn Ala Leu Asp Pro Pro Leu Phe Thr Arg Tyr1425 143014351440Leu Arg Ile His Pro Thr Ser Trp Ala Gln His Ile Ala Leu Arg Leu144514501455Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr14601465
優(yōu)選地，所述的表面活性劑是非離子性表面活性劑。非離子性表面活性劑優(yōu)選包括聚山梨醇酯和嵌段共聚物象泊洛沙姆(即聚氧乙烯/聚氧丙烯的共聚物)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選變體，表面活性劑是聚山梨醇酯。更優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物所含的聚山梨醇酯具有20～100個(gè)、優(yōu)選約80個(gè)單體單元的平均聚合度，例如可以是聚山梨醇酯80。該聚山梨醇酯還優(yōu)選是植物來源的。
優(yōu)選地，所述的無氨基酸的緩沖液是三(羥甲基)甲基胺(以后簡(jiǎn)稱“tris”)。
還優(yōu)選地，所述的藥物組合物在冷凍干燥以前和與注射用水重配以后的pH為6.5～7.5，更優(yōu)選約7.0。
優(yōu)選地，本發(fā)明的固體組合物是可以通過冷凍干燥含有下述組分且不含有氨基酸的溶液得到的固體組合物(a)50～10,000國(guó)際單位/ml的人或重組人因子VIII，或50～10,000豬單位/ml的豬或重組豬因子VIII；(b)從高于臨界膠束濃度至1％v/v的表面活性劑；(c)0.5～10mM的氯化鈣；(d)5～50mM的蔗糖；(e)0.15～0.5M的氯化鈉；(f)1～50mM的檸檬酸三鈉；和(g)1～50mM的無氨基酸的緩沖液。
為了以因子VIII的國(guó)際單位評(píng)價(jià)活性，將待測(cè)產(chǎn)物相對(duì)于濃縮物標(biāo)準(zhǔn)(Concentrate Standard)進(jìn)行分析，所述標(biāo)準(zhǔn)例如英國(guó)標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 95/608(NIBSC代表National Institute of Biological Standards and Control)。
因子VIII的豬單位(porcine unit)是指英國(guó)NIBSC推行的英國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)單位。為了以豬因子VIII單位評(píng)價(jià)活性，將待測(cè)產(chǎn)物與英國(guó)國(guó)家豬標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 86/514相對(duì)照進(jìn)行分析。關(guān)于重組豬因子VIII，應(yīng)當(dāng)理解重組豬因子VIII的1單位活性與豬因子VIII的1單位活性相當(dāng)。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的固體組合物是可以通過冷凍干燥具有至少一項(xiàng)下述特征、不含有氨基酸的溶液得到的固體組合物●100～5,000國(guó)際單位/ml人或重組人因子VIII，或100～5,000豬單位/ml豬或重組豬因子VIII；●0.002％至0.04％v/v表面活性劑；●1～5mM氯化鈣；●5～25mM蔗糖；●0.2～0.4M氯化鈉；●1～20mM檸檬酸三鈉；或●1～20mM無氨基酸的緩沖液。
甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明的固體組合物是可以通過冷凍干燥具有至少一項(xiàng)下述特征、不含有氨基酸的溶液得到的固體組合物●人或重組人因子VIII 200～2,000國(guó)際單位/ml(優(yōu)選約1,000國(guó)際單位/ml)，或豬或重組豬因子VIII 200～2,000豬單位/ml(優(yōu)選約1,000豬單位/ml)；●表面活性劑0.002％至0.02％v/v(優(yōu)選約0.01％v/v)；●氯化鈣1～3mM(優(yōu)選約2mM)；●蔗糖5～15mM(優(yōu)選約11.7mM)；●氯化鈉0.25～0.35M(優(yōu)選約0.3M)；●檸檬酸三鈉1～20mM(優(yōu)選約10mM)；或●無氨基酸的緩沖液的濃度范圍為5～15mM(優(yōu)選約10mM)。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)方法(無菌條件等)，通過冷凍干燥含有上面(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)所述的適當(dāng)量的組分的溶液可以制備出本發(fā)明的固體因子VIII組合物。
可以測(cè)定該組合物在經(jīng)過一段時(shí)間后的穩(wěn)定性，例如，通過下面的“分析方法”部分所公開的方法，或本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為合適的任何其他方法。
按照下面的“分析方法”部分所公開的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，如果經(jīng)過一段時(shí)間后維持了初始因子VIII活性的70％～130％(優(yōu)選80％～120％)，則認(rèn)為本發(fā)明的組合物在這段時(shí)間內(nèi)是穩(wěn)定的。
優(yōu)選地，當(dāng)保存在2～8℃時(shí)，本發(fā)明的固體組合物至少在6或12個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的。更優(yōu)選地，當(dāng)保存在30～32℃時(shí)，它們至少在6或12個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的。
本發(fā)明的固體因子VIII組合物可以用任選含有氯化鈉的無菌水稀釋，得到的液體藥物組合物可以直接注射到需要的病人體內(nèi)。此得到的液體藥物組合物，以及可以通過用任選含有氯化鈉的無菌水稀釋本發(fā)明的固體因子VIII組合物得到的液體藥物組合物，也是本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括通過給需要的病人施用本發(fā)明的液體組合物治療血友病的方法。本發(fā)明的液體組合物的預(yù)期給藥方式優(yōu)選為靜脈給藥。要施用的本發(fā)明組合物的劑量可以由治療醫(yī)生或獸醫(yī)考慮每位病人的疾病嚴(yán)重程度來確定。
術(shù)語“約”是指圍繞所考慮的值的區(qū)間。在本專利申請(qǐng)中使用的“約X”是指從X減去10％的X至X加上10％的X的區(qū)間，優(yōu)選X-5％X～X+5％X的區(qū)間。
除非進(jìn)行不同的定義，這里使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語的含義都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解相同。類似地，這里提到的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他文件都并入作為參考。
下面的實(shí)施例用來舉例解釋上述內(nèi)容，在任何情況下都不能認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1制備在0.5ml無菌水中含有下述組分的溶液

混合物在滅菌的小瓶中冷凍干燥，然后封口。測(cè)試得到的固體組合物，測(cè)試因子VIII活性的結(jié)果表明，它在2～8℃時(shí)能穩(wěn)定至少18個(gè)月，在30～32℃時(shí)能穩(wěn)定至少6個(gè)月。經(jīng)過大小排阻HPLC(SEC HPLC)分析沒有發(fā)現(xiàn)形成高分子量組分，經(jīng)過SDS PAGE分析也沒發(fā)現(xiàn)碎片。
在給病人注射之前，得到的凍干混合物典型地與1.0ml無菌水重配。
實(shí)施例2制備在1.0ml無菌水中含有下述組分的溶液

混合物在滅菌的小瓶中冷凍干燥，然后封口。
在給病人注射之前，得到的凍干混合物典型地與2.0ml無菌水重配。
實(shí)施例3制備在0.5ml無菌水中含有下述組分的溶液

混合物在滅菌的小瓶中冷凍干燥，然后封口。
在給病人注射之前，得到的凍干混合物典型地與1.0ml無菌水重配。
分析方法顯色試驗(yàn)通過改良的顯色試驗(yàn)(Technochrom FVIIIC試劑盒，Technoclone)確定因子VIII活性。由因子IX產(chǎn)生激活的因子X受到因子VIII的刺激，其中因子VIII是反應(yīng)的輔因子。激活的因子X催化從顯色底物釋放對(duì)硝基苯胺。在405 nm光度測(cè)量確定釋放出的對(duì)硝基苯胺的量，該試驗(yàn)得出產(chǎn)生的對(duì)硝基苯胺的量與FVIII含量之間的線性關(guān)系。
SEC HPLC在使用TosoHaas TSK G3000 SWXL、0.78×30cm預(yù)填充柱、帶有熒光檢測(cè)儀(Waters LC Module 1 plus)的HPLC設(shè)備上進(jìn)行凝膠過濾，測(cè)定可溶性的高分子量組分和碎片。激發(fā)波長(zhǎng)280nm，發(fā)射波長(zhǎng)340nm。通過峰面積的積分評(píng)價(jià)結(jié)果。
SDS PAGE試驗(yàn)使用SDS PAGE(使用平板電泳系統(tǒng)(Multiphor II LKB)和預(yù)制的7.5％凝膠(EXCELGEL SDS，Pharmacia)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳)測(cè)定FVIII因子的任何分解產(chǎn)物。通過考馬斯藍(lán)染色使蛋白帶可見。
穩(wěn)定性試驗(yàn)在于選定的溫度(它可以是約+4℃或+31℃)保存的相同組合物樣品上，通過在不同的時(shí)間進(jìn)行上述的試驗(yàn)分析穩(wěn)定性。一旦其因子VIII活性降低超過30％，該組合物就被認(rèn)為已經(jīng)失去其穩(wěn)定性。
序列表<110>科學(xué)研究和應(yīng)用咨詢公司<120>含有因子VIII的穩(wěn)定藥物組合物<130>44284.WO01/JMD<150>GB 0207092.8<151>2003-03-26<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1467<212>PRT<213>豬(Porcine)<400>1Met Gln Leu Glu Leu Ser Thr Cys Val Phe Leu Cys Leu Leu Pro Leu1 5 10 15Gly Phe Ser Ala Ile Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser20 25 30Trp Asp Tyr Arg Gln Ser Glu Leu Leu Arg Glu Leu His Val Asp Thr35 40 45Arg Phe Pro Ala Thr Ala Pro Gly Ala Leu Pro Leu Gly Pro Ser Val50 55 60Leu Tyr Lys Lys Thr Val Phe Val Glu Phe Thr Asp Gln Leu Phe Ser65 70 75 80Val Ala Arg Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile85 90 95Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Val Thr Leu Lys Asn Met Ala100 105 110Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Phe Trp Lys Ser115 120 125Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Glu Asp His Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu130 135 140Asp Asp Lys Val Leu Pro Gly Lys Ser Gln Thr Tyr Val Trp Gln Val145 150 155 160
Leu Lys Glu Asn Gly Pro Thr Ala Ser Asp Pro Pro Cys Leu Thr Tyr165 170 175Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu180 185 190Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Thr Arg Glu Arg195 200 205Thr Gln Asn Leu His Glu Phe Val Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu210 215 220Gly Lys Ser Trp His Ser Ala Arg Asn Asp Ser Trp Thr Arg Ala Met225 230 235 240Asp Pro Ala Pro Ala Arg Ala Gln Pro Ala Met His Thr Val Asn Gly245 250 255Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Lys Lys Ser260 265 270Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Ser Pro Glu Val His Ser275 280 285Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg His His Arg Gln Ala290 295 300Ser Leu Glu Ile Ser Pro Leu Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Phe Leu305 310 315 320Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His His325 330 335His Gly Gly Met Glu Ala His Val Arg Val Glu Ser Cys Ala Glu Glu340 345 350Pro Gln Leu Arg Arg Lys Ala Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Asp Asn355 360 365Leu Tyr Asp Ser Asp Met Asp Val Val Arg Leu Asp Gly Asp Asp Val370 375 380Ser Pro Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr385 390 395 400Trp Val His Tyr Ile Ser Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415Ala Val Pro Ser Pro Ser Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Leu Tyr Leu Asn420 425 430Ser Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Ala Arg Phe Val435 440 445Ala Tyr Thr Asp Val Thr Phe Lys Thr Arg Lys Ala Ile Pro Tyr Glu450 455 460Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu465 470 475 480Leu Ile Ile Phe Lys Asn Lys Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro485 490 495His Gly Ile Thr Asp Val Ser Ala Leu His Pro Gly Arg Leu Leu Lys500 505 510Gly Trp Lys His Leu Lys Asp Met Pro Ile Leu Pro Gly Glu Thr Phe515 520 525Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp530 535 540Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Ile Asn Leu Glu Lys545 550 555 560Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu565 570 575Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Met Met Ser Asp Lys Arg Asn Val580 585 590Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Gln Ser Trp Tyr Leu Ala Glu595 600 605Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Asp Gly Leu Gln Pro Gln Asp610 615 620Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val625 630 635 640Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Val Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe660 665 670Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr675 680 685Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro690 695 700Gly Leu Trp Val Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Leu Arg Asn Arg Gly705 710 715 720Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Tyr Ser Cys Asp Arg Asp Ile Gly Asp725 730 735Tyr Tyr Asp Asn Thr Tyr Glu Asp Ile Pro Gly Phe Leu Leu Ser Gly740 745 750Lys Asn Val Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ala Gln Asn Ser Arg Pro Pro755 760 765Ser Ala Ser Ala Pro Lys Pro Pro Val Leu Arg Arg His Gln Arg Asp770 775 780Ile Ser Leu Pro Thr Phe Gln Pro Glu Glu Asp Lys Met Asp Tyr Asp785 790 795 800Asp Ile Phe Ser Thr Glu Thr Lys Gly Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Gly805 810 815Glu Asp Glu Asn Gln Asp Pro Arg Ser Phe Gln Lys Arg Thr Arg His820 825 830Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Glu835 840 845Ser Pro Arg Ala Leu Arg Asn Arg Ala Gln Asn Gly Glu Val Pro Arg850 855 860Phe Lys Lys Val Val Phe Arg Glu Phe Ala Asp Gly Ser Phe Thr Gln865 870 875 880Pro Ser Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Lys His Leu Gly Leu Leu Gly Pro885 890 895Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Lys Asn
900 905 910Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Pro915 920 925Asp Asp Gln Glu Gln Gly Ala Glu Pro Arg His Asn Phe Val Gln Pro930 935 940Asn Glu Thr Arg Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro945 950 955 960Thr Glu Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val965 970 975Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile980 985 990Cys Arg Ala Asn Thr Leu Asn Ala Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val995 1000 1005Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser1010 1015 1020Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Val Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys1025 1030 1035His Leu Gln Met Glu Asp Pro Thr Leu Lys Glu Asn Tyr Arg Phe1040 1045 1050His Ala Ile Asn Gly Tyr Val Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val1055 1060 1065Met Ala Gln Asn Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly1070 1075 1080Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe1085 1090 1095Ser Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Val Tyr Asn Leu1100 1105 1110Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Val1115 1120 1125Gly Ile Trp Arg Ile Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu Gln Ala1130 1135 1140
Gly Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Tyr Ser Lys Glu Cys Gln Ala1145 1150 1155Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly Arg Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr1160 1165 1170Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu1175 1180 1185His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Asp Pro His1190 1195 1200Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly1205 1210 1215Ile Met Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile1220 1225 1230Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Arg Asn Trp Gln1235 1240 1245Ser Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly1250 1255 1260Asn Val Asp Ala Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro1265 1270 1275Ile Val Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile1280 1285 1290Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser1295 1300 1305Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Gln Asn Lys Ala Ile Ser Asp Ser1310 1315 1320Gln Ile Thr Ala Ser Ser His Leu Ser Asn Ile Phe Ala Thr Trp1325 1330 1335Ser Pro Ser Gln Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Thr Asn Ala1340 1345 1350Trp Arg Pro Arg Val Ser Ser Ala Glu Glu Trp Leu Gln Val Asp1355 1360 1365Leu Gln Lys Thr Val Lys Val Thr Gly Ile Thr Thr Gln Gly Val
1370 1375 1380Lys Ser Leu Leu Ser Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Val Ser1385 1390 1395Ser Ser Gln Asp Gly Arg Arg Trp Thr Leu Phe Leu Gln Asp Gly1400 1405 1410His Thr Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Ser Thr Pro Val1415 1420 1425Val Asn Ala Leu Asp Pro Pro Leu Phe Thr Arg Tyr Leu Arg Ile1430 1435 1440His Pro Thr Ser Trp Ala Gln His Ile Ala Leu Arg Leu Glu Val1445 1450 1455Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr1460 146權(quán)利要求
1.一種固體藥物組合物，它可以通過冷凍干燥含有下述組分、不含有氨基酸的溶液得到(a)因子VIII；(b)表面活性劑；(c)氯化鈣；(d)蔗糖；(e)氯化鈉；(f)檸檬酸三鈉；和(g)無氨基酸的緩沖液；所述組合物在冷凍干燥以前和與注射用水重配以后具有pH6～8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的固體藥物組合物，其特征在于，所述的因子VIII選自豬因子VIII或重組豬因子VIII。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的固體藥物組合物，其特征在于，所述的因子VIII是重組豬因子VIII。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的固體藥物組合物，其特征在于，所述的重組豬因子VIII具有氨基酸序列SEQ.ID.NO.1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)的固體藥物組合物，其特征在于，所述的表面活性劑是聚山梨醇酯。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的固體藥物組合物，其特征在于，所述的表面活性劑是聚山梨醇酯80。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任意一項(xiàng)的固體藥物組合物，其特征在于，所述的無氨基酸的緩沖液是三(羥甲基)甲基胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～7中任意一項(xiàng)的固體藥物組合物，其在冷凍干燥以前和與注射用水重配以后具有pH6.5～7.5。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～8中任意一項(xiàng)的固體藥物組合物，其可以通過冷凍干燥含有下述組分、不含有氨基酸的溶液得到(a)50～10,000國(guó)際單位/ml的人或重組人因子VIII，或50～10,000豬單位/ml的豬或重組豬因子VIII；(b)從高于臨界膠束濃度至1％v/v的表面活性劑；(c)0.5～10mM的氯化鈣；(d)5～50mM的蔗糖；(e)0.15～0.5M的氯化鈉；(f)1～50mM的檸檬酸三鈉；和(g)1～50mM的無氨基酸的緩沖液。
10.一種液體藥物組合物，它可以通過用任選含有氯化鈉的無菌水稀釋權(quán)利要求1～9中任意一項(xiàng)的固體藥物組合物得到。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的含有因子VIII的固體藥物組合物。該組合物不含有氨基酸，含有(a)因子VIII；(b)表面活性劑；(c)氯化鈣；(d)蔗糖；(e)氯化鈉；(f)檸檬酸三鈉；和(g)無氨基酸的緩沖液；其在冷凍干燥以前和與注射用水重配以后具有pH 6～8。本發(fā)明還涉及一種液體藥物組合物，它可以通過用任選含有氯化鈉的無菌水稀釋所述的穩(wěn)定的固體藥物組合物得到。
文檔編號(hào)A61K47/02GK1642570SQ03806991
公開日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2003年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月26日
發(fā)明者M·懷特, P·韋布 申請(qǐng)人:科學(xué)研究和應(yīng)用咨詢公司