專利名稱：將核酸和/或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)至腸黏膜的方法及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本研究與細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)以及基因治療領(lǐng)域相關(guān)；總的來說，本發(fā)明是通過基因修飾的正常微生物群將異源核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)至生物體內(nèi)。特別是本發(fā)明涉及將異源核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)至腸黏膜的制劑和有關(guān)方法，是利用基因修飾的微生物直接輸送轉(zhuǎn)化異源核酸，或是輸送至少表達(dá)一種異源核酸的基因修飾的微生物。本發(fā)明所用微生物包括細(xì)菌、細(xì)菌融合體及酵母菌。所用異源核酸可以編碼免疫保護(hù)性抗原決定簇(抗原)或其它基因治療成分。
參考文獻(xiàn) 參考了本申請內(nèi)以圓括號所標(biāo)示的各種出版物或?qū)＠墨I(xiàn)，以說明本發(fā)明所屬領(lǐng)域的目前發(fā)展?fàn)顩r。我們通過參考這些出版物或?qū)＠墨I(xiàn)的每一部分而使之成為一體，所引用的全部科學(xué)出版文獻(xiàn)均列于文中或本說明之末。
背景技術(shù)：
疾病通常是由有缺陷的或者受損傷的基因或者暴露于傳染性病原而引起。由缺陷基因引起的疾病例子包括各種不同形式的癌癥，例如結(jié)腸和肺癌、血友病或低密度脂蛋白(LDL)受體缺乏癥。感染性疾病通常是由致病微生物引起，致病微生物包括細(xì)菌、真菌、寄生蟲、病毒以及某些情況下的感染性缺陷蛋白質(zhì)即prions。
現(xiàn)代基因治療技術(shù)具有很大的潛力，無論是對這些由缺陷基因引起的疾病還是由傳染性病原引起的疾病都能提供強(qiáng)有效的治療和/或預(yù)防方法?；蛑委熁蚧蛱娲委煱ㄌ峁┮环N含有異源核酸的宿主，該異源核酸用來替代缺陷基因或者是編碼產(chǎn)生源自傳染性病原或腫瘤的免疫保護(hù)性抗原決定簇。在以后的應(yīng)用實例中，編碼免疫保護(hù)性抗原決定簇的異源核酸可以被用來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，或者在基因轉(zhuǎn)輸媒介(載體)表面表達(dá)和/或從基因傳輸媒介分泌出去。
導(dǎo)入異源核酸的載體包括病毒性和非病毒性載體。盡管病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)被認(rèn)為是把基因轉(zhuǎn)至細(xì)胞的最有效的媒介，但是由于它具有激發(fā)炎癥反應(yīng)或?qū)@些轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的免疫反應(yīng)的危險，其應(yīng)用還是受到限制。Forbes，S.J.，綜述文獻(xiàn)胃腸疾病和肝臟疾病中的基因治療，Aliment Pharmacol.Ther.11823-826(1997).病毒載體的例子包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體以及腺病毒相關(guān)病毒載體。與其它病毒載體相比，腺病毒載體有以下優(yōu)點它們能夠感染較寬范圍的細(xì)胞，而不象逆轉(zhuǎn)錄病毒載體那樣局限于正在復(fù)制的細(xì)胞。但是腺病毒載體可以激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，因此如果機(jī)體生命未受到威脅，初始劑量或重復(fù)強(qiáng)化誘導(dǎo)很少起作用。見Forbes，S.J.，supra。
也可以使用同各種轉(zhuǎn)染劑配制在一起的質(zhì)粒來完成異源核酸的轉(zhuǎn)導(dǎo)。最基本的轉(zhuǎn)染劑是鹽溶液，將鹽溶液中的質(zhì)粒DNA注射進(jìn)入肌肉，并且已經(jīng)證實它被轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入肌肉細(xì)胞。其它的例子包括脂質(zhì)體、PEG與各種聚合體。但是，目前通用的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)模式和免疫接種技術(shù)在很大程度上依賴于肌肉、皮膚、靜脈、腹膜以及其它身體部位的注射。
免疫治療劑和預(yù)防疫苗是最有希望的疾病預(yù)防領(lǐng)域之一。免疫治療劑通常被認(rèn)為是有助于抑制和殺死病原體或腫瘤的合成制劑，并且是在疾病發(fā)生之后給予機(jī)體。預(yù)防疫苗是用來防止腫瘤感染的，并且在疾病發(fā)生之前給予機(jī)體。然而，免疫治療劑和預(yù)防疫苗二者都必須被制成能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的制劑，才能發(fā)揮作用。
人體至少存在兩個免疫系統(tǒng)“外周”或“全身”免疫系統(tǒng)與“黏膜”免疫系統(tǒng)(Ogra等.，1994)；這兩系統(tǒng)獨立但同時發(fā)揮作用，且可能通過特定的淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)器而相互作用，產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。決定哪一免疫系統(tǒng)首先發(fā)生反應(yīng)的因素就是個體后天獲得和通過各種淋巴組織處理病理性抗原的方式。
依靠淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞通過血液、組織與淋巴腺持續(xù)運(yùn)動才能產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)(Anderson與Shaw，1996)。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移到脾與淋巴結(jié)等二級淋巴器官以及所謂Peyer’s斑的特異化黏膜組織來抗擊分別通過血液、淋巴腺以及黏膜而入侵的周圍環(huán)境中的抗原。抗原在什么地方以及被哪些細(xì)胞提呈給這些中繼(中間)淋巴腺細(xì)胞極大地影響免疫反應(yīng)的結(jié)果—激活T細(xì)胞或B細(xì)胞轉(zhuǎn)化成特異性抗體形成細(xì)胞及其后的記憶反應(yīng)與效應(yīng)淋巴細(xì)胞。
淋巴腺內(nèi)的抗原被濾過、捕獲、處理與提呈，此時淋巴腺不注意淋巴結(jié)內(nèi)固有的抗原提呈細(xì)胞；由淋巴結(jié)進(jìn)行的這種抗原提呈主要產(chǎn)生“外周”免疫、適當(dāng)?shù)腂細(xì)胞轉(zhuǎn)化成特異性的IgG或IgM抗體。血液中的抗原在脾內(nèi)特定的血液/組織界面處被提呈，這也主要激發(fā)“外周”免疫；然而，由于脾臟同時含有抗原提呈細(xì)胞與來自其它各種組織的活化T-細(xì)胞與B-細(xì)胞，這樣兩系統(tǒng)間的對話就有可能誘發(fā)外周免疫或黏膜免疫或者同時產(chǎn)生兩種免疫反應(yīng)。腸腔器官(如呼吸道與胃腸道)內(nèi)腔中的抗原被稱作“M”細(xì)胞的特異性內(nèi)皮細(xì)胞完整吞噬(非破壞性吞噬)，并且跨細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Peyer’s斑內(nèi)的淋巴細(xì)胞，在這里發(fā)生的抗原提呈反應(yīng)主要激發(fā)“黏膜”免疫反應(yīng)，并且釋放特異性IgA抗體到黏膜分泌物中去。
鼻腔、喉嚨、肺以及腸腔中的腔隙是與外界相連通的，這樣就將這些組織暴露在環(huán)境中有毒或致病的危險因素之下。呼吸道、胃腸道以及泌尿生殖道的黏膜表面是由一層覆蓋有黏液的上皮細(xì)胞組成，通過墊圈樣的細(xì)胞間緊密連接將細(xì)胞與細(xì)胞連接在一起，這樣就起到了保護(hù)作用。面對富含微生物的環(huán)境，黏膜表面提供了一個細(xì)胞屏障，這是病原體與宿主之間的第一個接觸界面，因而它們在預(yù)防感染性疾病方面是至關(guān)重要的。
雖然作用相似，但是體內(nèi)不同黏膜表面的上皮襯層具有很大的不同。復(fù)層鱗狀上皮襯在口腔、咽、食道、尿道與陰道黏膜表面，而胃腸道的黏膜表面是由單層簡單的上皮細(xì)胞排列而就。這些黏膜表面總面積超過了400m2。在腸道內(nèi)，小腸和大腸的上皮細(xì)胞裝備良好，足以面對這樣一個富含病原體的外部環(huán)境。盡管這一廣大的細(xì)胞屏障由纖細(xì)的單層細(xì)胞組成，這些細(xì)胞活躍地從事食物消化以及營養(yǎng)成分吸收工作，但是它通常能夠排除潛在性的有害與抗原性物質(zhì)。
在腸道黏膜上皮襯層中，有少量的淋巴組織構(gòu)成系統(tǒng)的黏膜淋巴濾泡-相關(guān)上皮(FAE)組織。盡管大分子物質(zhì)和微生物不能通過襯于腸道的上皮組織入侵，但是在象位于腸道的Peyer’s斑這樣的黏膜誘導(dǎo)點中，淋巴FAE包含微褶皺或M細(xì)胞，微褶皺或M細(xì)胞可以轉(zhuǎn)運(yùn)抗原及微生物以進(jìn)行抗原攝?。籑細(xì)胞存在于簡單上皮內(nèi)的情形僅僅見于有組織的淋巴濾泡。因而在富含M細(xì)胞的FAE位點內(nèi)，存在特化上皮與抗原提呈細(xì)胞及淋巴細(xì)胞之間高度進(jìn)化了的協(xié)同作用。通過活躍的跨上皮細(xì)胞小泡轉(zhuǎn)運(yùn)，M細(xì)胞把來自內(nèi)腔的大分子物質(zhì)、顆粒以及微生物經(jīng)由其細(xì)胞質(zhì)直接轉(zhuǎn)運(yùn)到上皮內(nèi)的黏膜淋巴濾泡和機(jī)體有組織的黏膜淋巴組織，該淋巴組織能夠處理抗原并且激發(fā)能夠引起分泌免疫的黏膜免疫反應(yīng)，分泌性免疫反應(yīng)使得腸道和肺黏膜表面浸浴在保護(hù)性抗體之中。
所以M細(xì)胞提供了用以進(jìn)行小泡轉(zhuǎn)運(yùn)的局部、功能性通道。M細(xì)胞位于淋巴濾泡(FAE)的上方，通過及時將外源性物質(zhì)和微生物暴露于吞噬細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞，從而減少了經(jīng)由上皮屏障轉(zhuǎn)運(yùn)這些物質(zhì)的固有危險。M細(xì)胞朝向內(nèi)腔的頂部表面不同于周圍的其它細(xì)胞它們?nèi)狈Φ湫偷乃罹?，而有不定的微絨毛或具有龐大微絨毛內(nèi)吞區(qū)域的微褶皺。M細(xì)胞的基部內(nèi)陷形成了自身獨一無二的特征，這是上皮內(nèi)的“口袋”或空間，它們既縮短了跨細(xì)胞囊泡從細(xì)胞頂部到基側(cè)部所必須通過的距離，同時又為B細(xì)胞和CD4T細(xì)胞之類的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及樹枝狀細(xì)胞的聚集提供了入塢位點。M細(xì)胞也有延伸到潛在淋巴組織的基本的推移活動，它們在這里與淋巴細(xì)胞或/和抗原提呈細(xì)胞直接接觸，這好象是對M細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)后的細(xì)胞提呈發(fā)揮作用。
胃腸外免疫是疫苗接種的最常用途徑。它通常引起外周急性免疫反應(yīng)，產(chǎn)生保護(hù)性IgM/IgG抗體與細(xì)胞介導(dǎo)的外周免疫反應(yīng)。急性反應(yīng)很快就會減輕消退，但是它留下了被稱為“記憶”細(xì)胞的崗哨，這類崗哨細(xì)胞時刻保持警覺，一旦真正的病原體返回入侵機(jī)體，它們就會釋放作為防護(hù)者的全部力量。盡管它們很有效，但是經(jīng)過注射接種的疫苗最初繞過了黏膜，通常不能刺激黏膜淋巴組織產(chǎn)生保護(hù)性IgA抗體，因而不能激發(fā)黏膜免疫反應(yīng)。
這樣就出現(xiàn)了一個問題，因為許多經(jīng)由全身循環(huán)傳播擴(kuò)散的危險物質(zhì)，最初是通過鼻、口及其它開口器官進(jìn)入身體，越過黏膜感染機(jī)體。因此，它們所遇到的第一道防衛(wèi)結(jié)構(gòu)就是那些襯于氣道、消化道與生殖道內(nèi)的黏膜，這些黏膜組成了體內(nèi)最大的病原體-屏障。抗擊這些致病物的保護(hù)作用需要一種這樣的疫苗，它不僅誘導(dǎo)外周免疫反應(yīng)，而且能誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)。如上所述，當(dāng)黏膜免疫反應(yīng)發(fā)動時，它就產(chǎn)生迅速進(jìn)入這些通道腔內(nèi)的IgA抗體，抑制它們發(fā)現(xiàn)的任何病原體；有效的黏膜免疫反應(yīng)也激活全身性反應(yīng)，此時循環(huán)的免疫系統(tǒng)細(xì)胞幫助消滅遠(yuǎn)處的入侵者。
“標(biāo)準(zhǔn)預(yù)”疫苗接種的另一個并發(fā)癥是傳統(tǒng)的疫苗有這樣一個危險疫苗微生物不知何故會反跳獲得生命力，引發(fā)它們本欲預(yù)防的疾病。
因為有這種并發(fā)癥，人們正在尋求用以替代傳統(tǒng)疫苗接種方式的其它途徑來進(jìn)行免疫。其中一種方法就是應(yīng)用DNA疫苗，此時給予一種攜帶著來自病原生物體的一個DNA片段的質(zhì)粒，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗擊各種病原體的保護(hù)反應(yīng)，這些病原微生物包括B型肝炎病毒、單純皰疹病毒、HIV、瘧疾與流感病毒。
目前正在研究開發(fā)的DNA疫苗也帶來一些問題。首先疫苗的轉(zhuǎn)導(dǎo)十分復(fù)雜，需要將基因或cDNA與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體融合成一體，然后轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)牡鞍缀铣缮矬w(例如，大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母或者其它細(xì)菌、酵母菌、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞)中去，生產(chǎn)獲得感興趣基因的多重拷貝。然后分離DNA并使之進(jìn)入另一表達(dá)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主體內(nèi)，此時在內(nèi)源性或外源性啟動子的控制下恰當(dāng)?shù)剡M(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄和翻譯；使用多重表達(dá)載體(包括，但不局限于噬菌體、粘粒、病毒以及質(zhì)粒載體)是十分昂貴的，難于制備且很難接種給藥。而且，為有效地將疫苗導(dǎo)入宿主體內(nèi)，需要共同注入病毒元件，這就帶來了輸進(jìn)有活力的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒群系的危險。
誘導(dǎo)免疫防護(hù)反應(yīng)的另一種途徑是接種亞單位疫苗制劑，該制劑主要是由從病原體基因分離的具有抗原性的蛋白質(zhì)組成。這些蛋白質(zhì)自身無法引起感染，但是可以誘導(dǎo)產(chǎn)生全身性的而不是黏膜局部的抗體與CTL，而且生產(chǎn)、純化和保存這些疫苗均十分昂貴。
與傳統(tǒng)的疫苗接種方式有關(guān)的另一個問題是疫苗在人類宿主體內(nèi)的生理學(xué)變化可能會引發(fā)新的疾病。新出現(xiàn)的病原體可能對抗體具有抗性，或(通過基因重組而使其)對抗宿主防御反應(yīng)的能力更加強(qiáng)大。就如已經(jīng)充分證實的流感病毒那樣，重組事件或者缺乏與病原體的接觸均會引起人群相應(yīng)免疫性的缺乏；就流感病毒而言，重組事件提高了感染速度，新出現(xiàn)的病原體有時會引發(fā)全國流行。
因此，盡管在疾病預(yù)防與免疫接種方面取得了很大的進(jìn)展，但是新的及重新出現(xiàn)的感染性疾病正在打亂這一平衡狀態(tài)而利于寄生物的生存；全身性免疫固然很重要，但是仍需要繼續(xù)開發(fā)黏膜疫苗以有效的抗擊這些新的疾病威脅。為此，目前正在發(fā)展口服疫苗；它們能夠較好地同時激發(fā)“黏膜”和“外周”免疫，比普遍使用的胃腸外轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)具有更高的效價比、且更為方便。目前正在開發(fā)的口服疫苗有傾向集中在發(fā)展和使用改良的致病生物體，如沙門氏菌屬，作為口服免疫的抗原載體(Stocker，美國專利號4,837,151，沙門氏菌幾個菌株的營養(yǎng)缺陷型變種；Clements等，美國專利號5,079,165，沙門氏菌的無毒力菌株；Charles等，美國專利號5,547,664，活的減毒沙門氏菌)。即使這些病原體已經(jīng)被減毒，但它們?nèi)匀痪哂锌赡芑謴?fù)其致病性而對宿主動物造成危害的危險。
考慮到胃腸外接種疫苗、尤其是涉及DNA或亞單位疫苗時的固有問題，本發(fā)明人正在研究開發(fā)新穎的制劑，以及應(yīng)用非致病性乳酸菌(LAB)作為生產(chǎn)和轉(zhuǎn)導(dǎo)治療性分子(如，抗原)的活載體的方法?？傮w來說，LAB尤其是乳酸桿菌種所具有的某些特性使得它們成為用于口服免疫接種的最具有吸引力的侯選者。這些特性包括佐劑活性、黏膜黏附特性、低的自身免疫原性，且被認(rèn)為是安全的(GRAS)。它們已經(jīng)出現(xiàn)在腸道內(nèi)生菌群中，且在商業(yè)上被用來生產(chǎn)酸奶酪、營養(yǎng)乳和其它食品及其益生的應(yīng)用。人們應(yīng)用食用LAB已經(jīng)有很長時間了，且通常認(rèn)為它們是安全的，這代表著它們用作治療性載體的潛在重要優(yōu)勢。本發(fā)明人目前正在研究，LAB用作活疫苗載體的一個特別重組體是乳酸桿菌。乳酸桿菌種在哺乳動物胃腸道內(nèi)普遍存在，并且能夠定向地黏附于黏膜受體，這使得它們成為用作疫苗載體的非常有用的生物體，這樣接種的宿主可以對抗寬范圍的病原體。
就普通意義上的乳酸菌而言，已經(jīng)有幾個程序用以產(chǎn)生LAB轉(zhuǎn)化子。Leer等人(WO095/35389)介紹了一種將核酸注入微生物的方法，包括象乳酸桿菌與Bifidobacterium之類的微生物；Leer等人的方法是以在轉(zhuǎn)化過程開始之前進(jìn)行有限自分解為基礎(chǔ)。已經(jīng)公開發(fā)表的PCT申請PCT/NL96/00409揭示了篩選非致病性細(xì)菌黏附于特異性黏膜受體的能力的方法，特別是篩選乳酸桿菌與Bifidobacterium屬LAB；同時也揭示了一種表達(dá)載體，它由一個表達(dá)啟動子序列，一種核酸序列和容許核糖體識別與翻譯性能的序列組成。這一參考文獻(xiàn)表明乳酸桿菌的不同種系可以被轉(zhuǎn)化，以表達(dá)包括致病性細(xì)菌蛋白在內(nèi)的的異源基因產(chǎn)物。
此外，已經(jīng)應(yīng)用口服重組L.lactis誘發(fā)了對所表達(dá)抗原的局部IgA和/或血清IgG抗體反應(yīng)。Wells等，Mol.Microbiol.81155-1162，1993。另外，Casas等人(美國專利號6,100,388)研究表明可以用異源DNA轉(zhuǎn)化L.reuteri，在細(xì)胞表面表達(dá)外源性蛋白質(zhì)或?qū)⒅置?；而EP 1084709A1揭示L.plantarum同樣可以被轉(zhuǎn)化，在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面表達(dá)抗原片段。相關(guān)文獻(xiàn)參見U.S.Pat.Nos.5,149,532及6,100,388。
所有這些參考文獻(xiàn)均表明在接種疫苗時可以使用某些種屬的細(xì)菌。但是他們所介紹的方法都很費(fèi)時、昂貴、效率低。另外，就目前所使用的方法而言，對于用來轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原的每一特異性種屬可能需要不同的表達(dá)系統(tǒng)。通常需要研制開發(fā)適當(dāng)?shù)膯幼?、增?qiáng)子以及可選擇性標(biāo)志等；可能需要進(jìn)行幾種不同的轉(zhuǎn)化來確定可行系統(tǒng)，以保證體內(nèi)和體外適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平；所有這些程序均需增加很多時間與經(jīng)費(fèi)?，F(xiàn)在所需要的就是在經(jīng)濟(jì)可行的、安全可靠的食物級微生物中，用一個人們已知的、經(jīng)濟(jì)可行的表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)異源蛋白質(zhì)成分，從而達(dá)到疾病預(yù)防和治療的目的。
發(fā)明概要 本發(fā)明一般適用于應(yīng)用遺傳改良的微生物進(jìn)行體內(nèi)異源核酸的轉(zhuǎn)導(dǎo)。特別是，本發(fā)明包括進(jìn)行異源核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)的制劑及相關(guān)方法，應(yīng)用遺傳改良微生物直接轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化異源核酸，或者是遺傳改良微生物表達(dá)至少一種異源核酸。本發(fā)明中的遺傳改良微生物包括細(xì)菌、細(xì)菌融合體與酵母菌。異源核酸可以編碼適于基因治療應(yīng)用的免疫保護(hù)性抗原決定簇(抗原)或其它蛋白質(zhì)，基因治療包括基因替代和/或基因增加。
本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種免疫原性制劑(或免疫原性組合物)(immunogenic composition)，它是由至少表達(dá)一種異源核酸的遺傳改良微生物組成。這種遺傳改良微生物包括，但不局限于細(xì)菌、細(xì)菌融合體、酵母菌以及酵母-細(xì)菌融合體。異源核酸可以編碼免疫保護(hù)性抗原決定簇(抗原)，后者是疾病預(yù)防性或治療性或者兼具這兩種功能。
本發(fā)明的又一個實施方案中，抗原被表達(dá)在遺傳改良微生物表面。
本發(fā)明的再一個實施方案中，抗原同時被分泌與表達(dá)在遺傳改良微生物表面。當(dāng)表達(dá)本發(fā)明的遺傳改良微生物的抗原與腸黏膜中免疫細(xì)胞接觸時，就激發(fā)針對抗原的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明再一個實施方案是，本發(fā)明提供了把DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)至哺乳動物細(xì)胞的制劑和相關(guān)方法，這是利用來自自然界生物體或者來自人體“微生物”群體的細(xì)菌和酵母菌進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的。本發(fā)明還證實了，可以通過口服攝取把攜帶著DNA載體，如具有哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒，的改良微生物細(xì)菌培養(yǎng)物引入至腸道。
當(dāng)把本發(fā)明的制劑經(jīng)過口服給予機(jī)體時，其靶細(xì)胞就是腸道細(xì)胞，例如，M-細(xì)胞、K-細(xì)胞以及其它任何襯于機(jī)體腸道的細(xì)胞或者是上皮細(xì)胞層下面的細(xì)胞，但是并不僅限于腸細(xì)胞。本發(fā)明的一個實施方案，遺傳改良微生物攜帶有一個與可誘導(dǎo)啟動子聯(lián)合發(fā)揮作用的自溶解基因，該可誘導(dǎo)啟動子可以被如下因素誘導(dǎo)，例如pH降低、乳糖、溫度、厭氧性環(huán)境或其它任何合適的誘導(dǎo)物或誘導(dǎo)條件。當(dāng)自溶解蛋白對細(xì)菌細(xì)胞發(fā)揮作用時，細(xì)菌細(xì)胞可能在胃腸道內(nèi)破裂并且釋放質(zhì)粒，這最好發(fā)生在腸腔內(nèi)。質(zhì)粒最好是一種高拷貝的質(zhì)粒，例如，基于pUC18的質(zhì)?；颉疤油觥辟|(zhì)粒。
本發(fā)明又一個實施方案為，可以以原生質(zhì)體的形式供應(yīng)本發(fā)明的遺傳改良微生物機(jī)體，例如沒有細(xì)胞壁的細(xì)菌細(xì)胞。在原生質(zhì)體沿胃腸道向下運(yùn)行時，周圍的低滲環(huán)境會在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生較大的滲透壓，致使細(xì)胞突然破裂并且釋放質(zhì)粒。
本發(fā)明還有一個實施方案，本發(fā)明的遺傳改良微生物可以在攝取之前用裂解病毒進(jìn)行處理，這些裂解病毒包括但不局限于噬菌體，例如φadh、φLC3、mv4、M13、T4、φ29、Cp-1、Cp-7和Cp-9噬菌體。在微生物細(xì)胞沿著胃腸道向下運(yùn)行時，噬菌體可以開始它們的細(xì)胞溶解周期，溶解微生物細(xì)胞釋放質(zhì)粒。
由于細(xì)菌體積小、所釋放的DNA量很大，體內(nèi)的腸道細(xì)胞就將DNA攝入細(xì)胞內(nèi)并且表達(dá)蛋白質(zhì)。腸道細(xì)胞之所以能夠攝入DNA，是因為有質(zhì)粒的聯(lián)合作用，例如與細(xì)胞膜碎片聯(lián)合，后者就象脂質(zhì)體在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中起到DNA載體的作用一樣而發(fā)揮載體的作用。腸道細(xì)胞也可以通過細(xì)胞內(nèi)吞或胞飲作用攝取裸露的DNA。
而且，因為腸道細(xì)胞中的M-細(xì)胞通常參與大分子物質(zhì)的小泡轉(zhuǎn)運(yùn)，所以細(xì)菌所釋放的DNA可以被M-攝取。因為M-細(xì)胞定位于淋巴濾泡相關(guān)上皮組織(FAE)中，后者含有大量的免疫細(xì)胞例如B細(xì)胞與T細(xì)胞，所以能夠產(chǎn)生所預(yù)期的針對質(zhì)粒所表達(dá)蛋白質(zhì)的黏膜和/或外周免疫反應(yīng)。就轉(zhuǎn)導(dǎo)治療性基因而言，如轉(zhuǎn)導(dǎo)胰島素、干擾素、生長激素、因子VIII和因子IX以及其它任何治療性目的蛋白，M-細(xì)胞口袋可以發(fā)揮作為治療性分泌蛋白質(zhì)進(jìn)入血流的通路作用。再一方面，DNA的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域可以通過基因工程進(jìn)行設(shè)計，并且可以拼接到容許蛋白質(zhì)分泌的信號序列肽的下游，從而使該蛋白質(zhì)能被細(xì)胞分泌。
本發(fā)明的遺傳改良微生物有機(jī)體可以被制備為多種形式，例如干粉的形式，攝取之前需要重新配制或者被裝在膠囊中，或者被混入食物如牛奶、酸奶酪、冰淇淋。
附圖簡要說明

圖1顯示的是表達(dá)在酵母菌細(xì)胞表面的綠色(未成熟)熒光蛋白(GFP)，已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明的規(guī)則對酵母菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。
圖2是以圖解的形式說明用流感病毒疫苗口服接種的老鼠與對照組的血清學(xué)結(jié)果，該流感病毒疫苗使用了GPD質(zhì)粒。
圖3也是以圖解的形式說明用GPD質(zhì)粒的流感病毒疫苗皮下接種老鼠與對照組的血清學(xué)結(jié)果。
圖4圖示的是用GPD質(zhì)粒的輪狀病毒VP7疫苗口服接種老鼠與對照組的血清學(xué)結(jié)果。
圖5表明用GPD質(zhì)粒的輪狀病毒VP7疫苗皮下接種老鼠與對照組的血清學(xué)結(jié)果。
圖6是以圖解的形式說明用pYD質(zhì)粒的流感病毒疫苗口服接種老鼠與對照組的血清學(xué)結(jié)果。
圖7也是以圖解的形式說明用pYD質(zhì)粒的流感病毒疫苗皮下接種老鼠與對照組的血清學(xué)結(jié)果。
圖8表明用pYD質(zhì)粒的輪狀病毒VP7疫苗口服接種老鼠與對照組的血清學(xué)結(jié)果。
圖9表明用pYD質(zhì)粒的輪狀病毒VP7疫苗皮下接種老鼠與對照組的血清學(xué)結(jié)果。
圖10則是用圖解的形式來說明用pYD質(zhì)粒的流感病毒疫苗經(jīng)鼻腔內(nèi)接種老鼠與對照組的血清學(xué)結(jié)果。
定義 與本發(fā)明中生物學(xué)分子相關(guān)的各種術(shù)語均有詳細(xì)的技術(shù)說明與要求；在提出本發(fā)明之前，首先闡明下文中將要用到的術(shù)語的定義，對理解全文是很有幫助的。
“抗原”或“抗原性片段”，“免疫保護(hù)性抗原決定簇”或“抗原決定簇”是指能夠在受試對象(如，動物或哺乳動物)體內(nèi)引起細(xì)胞或體液免疫的完整蛋白質(zhì)或肽類或者是其中部分成份，他們也必須與由相應(yīng)蛋白免疫的動物所產(chǎn)生的抗體發(fā)生反應(yīng)。而且，在這里所用于說明本發(fā)明的術(shù)語“抗原”、“抗原性片段”或“抗原決定簇”包括對與抗體發(fā)生特異性交互反應(yīng)起決定性作用的任何分子?？乖曰蚩乖瓫Q定簇的決定因素通常是由具有化學(xué)活性的表面分子(如，氨基酸或糖側(cè)鏈)集團(tuán)組成，并且具有特異性的三維空間結(jié)構(gòu)特征以及特異性的電荷特征。可用于本發(fā)明的抗原或抗原決定簇的范例包括，但不局限于病毒、細(xì)菌、原生動物、微生物性以及腫瘤抗原。
“抗原性或治療性元件”可以包括，例如抗原性或治療性DNA、cDNA、RNA以及反義多聚核酸序列。
“編碼序列”或“編碼區(qū)域”是指具有在序列表達(dá)產(chǎn)生基因產(chǎn)物時所必需的序列信息的核酸分子。
與哺乳動物體“兼容”是指協(xié)調(diào)的、共同生存的能力，例如還可以被用于沒有免疫學(xué)反應(yīng)的輸血和器官移植。
術(shù)語“接觸”用于細(xì)胞時，是說明通過微生物轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介把抗原或治療性基因、蛋白或反義序列、和/或附屬元件轉(zhuǎn)導(dǎo)至靶細(xì)胞的過程，或者直接把它們放置于靶細(xì)胞附近的過程。
“治療劑的轉(zhuǎn)導(dǎo)”可以通過許多不同的方式進(jìn)行說明解釋。比如使用口服轉(zhuǎn)導(dǎo)方式，是說給予藥丸配方，或者給予按著允許口服或類似途徑給藥而設(shè)計的制劑。這樣的方法為那些精通發(fā)藥技術(shù)的人們所熟知，但是更為可取的制劑包括如下藥學(xué)配方，由抗原性或治療性基因、蛋白質(zhì)或可以與微生物轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介(如，乳酸桿菌、酵母菌等)聯(lián)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的反義多聚核苷酸序列等組成。這樣的制劑中，基因可以以如下形式存在DNA片段、質(zhì)粒、粘粒或能夠在細(xì)胞(尤其是LAB-大腸桿菌融合體細(xì)胞)中表達(dá)目的蛋白質(zhì)的重組載體等形式。可以根據(jù)藥理學(xué)上能夠接受的酸乳等級，將這些制劑設(shè)計為體內(nèi)給藥方式。
“表達(dá)盒”術(shù)語是指至少包含一個編碼序列的核苷酸序列，該編碼序列必須同時伴有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始和終止的序列元件。一個表達(dá)盒可能含有附加序列，包括但不局限于如下元件啟動子、加強(qiáng)子以及參與轉(zhuǎn)錄后或翻譯后加工處理過程的序列。
核酸結(jié)構(gòu)的“異源”區(qū)域是在一個大分子中的核酸分子的可以明確確認(rèn)的一個(或多個)核酸分子片段，在自然界中尚未發(fā)現(xiàn)它與此大分子有關(guān)聯(lián)。因而當(dāng)異源區(qū)域編碼哺乳動物的基因時，該基因通常被DNA側(cè)面包繞，此DNA在源生物基因組中不會包圍該哺乳動物基因組的DNA。另一個例子中，異源區(qū)域就是在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)的包含編碼序列的一個結(jié)構(gòu)(比如cDNA，其中基因組編碼序列包含內(nèi)含子或具有不同于天然基因的密碼子的合成序列)。根據(jù)這里的定義，等位基因的變異或自然發(fā)生的基因突變事件并不產(chǎn)生DNA的異源區(qū)。就蛋白質(zhì)而言，“異源”可以被理解為這樣一種蛋白質(zhì)，其中至少有一部分在給定宿主細(xì)胞染色體DNA中不被正常編碼。異源蛋白質(zhì)的范例包括由細(xì)菌與真核微生物產(chǎn)生的雜交或融合蛋白、由原核宿主產(chǎn)生的真核蛋白以及類似蛋白質(zhì)。
“異源核酸”是一種從不同于其產(chǎn)生種屬的其它屬種所獲得的DNA、cDNA或任何形式的RNA多聚核苷酸序列或其雜交形式，以及構(gòu)成多肽、肽片段的氨基酸序列，或蛋白質(zhì)。異源核酸序列也可以包括源于同一種屬的意欲被取代或增加的核酸序列以及內(nèi)生性核酸序列。這在包括基因替代在內(nèi)的基因治療應(yīng)用方面特別有用。
這里所使用的“免疫原性制劑”(immunogenic composition)術(shù)語是本發(fā)明的一個實施方案，它提供了一種以便于誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方式接觸動物的抗原。免疫反應(yīng)可以是體液免疫或細(xì)胞免疫或者同時發(fā)生，免疫原或其一個片段或亞單位。典型的抗原包括但不局限于腫瘤抗原、病毒抗原、寄生蟲抗原、真菌抗原和細(xì)菌抗原。例如可被編碼的細(xì)菌性抗原包括但不能因此而局限于下列抗原分枝桿菌屬麻風(fēng)抗原，分枝桿菌屬肺結(jié)核抗原，斑疹傷寒桿菌抗原，衣原體抗原，Coxiella抗原，瘧疾孢子體與裂殖子蛋白(例如，來自瘧原蟲berghei孢子體的周孢子體蛋白)，白喉類毒素，破傷風(fēng)類毒素，梭菌抗原，利什曼蟲抗原，沙門氏菌屬抗原，大腸桿菌抗原，李斯特菌抗原，包柔氏螺旋體菌抗原(包括OspA和OspB抗原)，F(xiàn)ranciscella抗原，耶爾森氏菌屬抗原，分枝桿菌屬africanum抗原，分枝桿菌屬細(xì)胞內(nèi)抗原，分枝桿菌屬avium抗原，志賀氏菌抗原，淋球菌抗原，葡萄球菌、Helicobacter、peudomona、密螺旋體抗原，血吸蟲(裂體蟲)抗原，絲蟲屬抗原，百日咳抗原，葡萄球菌抗原，炭疽毒素、百日咳毒素、梭菌屬，血友病菌抗原，沙門氏菌屬，鏈球菌抗原(包括生膿原S.的M蛋白及肺炎球菌抗原，如鏈球菌肺炎抗原)。
可被編碼的病毒性抗原可以包括但不能因此而局限于下列抗原腮腺炎病毒抗原，甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒、HBV抗原，狂犬病抗原，腦灰質(zhì)炎病毒抗原，裂谷熱病毒抗原，登革熱病毒抗原，麻疹病毒抗原，輪狀病毒抗原，人類免疫缺陷病毒(HIV)抗原(包括gag、pol與env蛋白以及HIV env的gp120和gp160)，呼吸合胞體病毒(RSV)抗原，皰疹病毒抗原，副流感病毒抗原，風(fēng)疹病毒抗原，蛇毒抗原，人類腫瘤抗原，Vibrio霍亂抗原，以及來自HCV、HAV、HPV、TB、皰疹、風(fēng)疹、流行性感冒、腮腺炎、小兒麻痹癥(急性脊髓灰白質(zhì)炎)、輪狀病毒、瘧原蟲表面糖蛋白、細(xì)小病毒、EB病毒、痘病毒、狂犬病病毒、肺炎等的抗原，象CEA之類的癌抗原和其它相似的抗原性片段。
“乳酸菌”或“LAB”通常是指發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸作為終末產(chǎn)物的一個革蘭氏陽性細(xì)菌家族。乳酸菌生長在口腔與消化道，被用來制造發(fā)酵食品如朝鮮泡菜、酸奶酪等。眾所周知，它們能夠產(chǎn)生各種抗菌化合物如有機(jī)酸、過氧化氫、聯(lián)乙醯與細(xì)菌素，它們利用碳水化合物作為能源物質(zhì)產(chǎn)生乳酸和抑制有害細(xì)菌生長的抗菌物質(zhì)，因而對維持腸內(nèi)健康狀態(tài)發(fā)揮重要的作用。乳酸菌包括鏈球菌、腸球菌、乳酸球菌、乳酸桿菌和Bifidobacterium等菌屬。這些乳酸-產(chǎn)生細(xì)菌的典型范例包括嗜熱鏈球菌、乳酸腸球菌、durans腸球菌、乳酸球菌、乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、保加利亞乳酸桿菌、嗜熱乳酸桿菌、酪蛋白乳酸桿菌以及plantarum乳酸桿菌。
“乳酸桿菌”是指乳酸桿菌種的具有下列細(xì)菌學(xué)特征的乳酸細(xì)菌革蘭氏陽性、桿棒狀、無活動力、過氧化氫酶陰性、兼性厭氧、最適生長溫度為30°--40°C、15℃ 時不生長以及形成DL-乳酸。
這里所使用的“微生物”包括，細(xì)菌、酵母菌、細(xì)菌-細(xì)菌融合體與細(xì)菌-酵母菌融合體。
術(shù)語“改良”通常是指通過基本或基礎(chǔ)的變化而使給定的生物體或系統(tǒng)呈現(xiàn)出新的傾向性、新的結(jié)構(gòu)或新的終末形式的過程。一個方面，“改良的微生物體”是指已經(jīng)用編碼抗原性或治療性多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)換過的微生物體，因而“改良微生物”在其表面表達(dá)或/和分泌抗原性或治療性多肽。
術(shù)語“核酸結(jié)構(gòu)”或“DNA結(jié)構(gòu)”有時被用來指代編碼序列或者是與適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列聯(lián)合發(fā)揮作用并且被插入到載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化的序列。這一術(shù)語可以同術(shù)語“轉(zhuǎn)化DNA”交替使用。這樣的核酸結(jié)構(gòu)可以包括一個興趣基因產(chǎn)物的編碼序列，連同一個選擇性標(biāo)志基因和/或一個報告基因?！癉NA結(jié)構(gòu)”也用來代指異源區(qū)域，特別是指為進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化組建而成的區(qū)域。
“運(yùn)作上相聯(lián)系”或“運(yùn)作插入”意思是表達(dá)編碼序列所必需的調(diào)節(jié)序列被安置在核酸分子中相對于編碼序列的適當(dāng)位置，以使編碼序列能夠表達(dá)。這一定義有時也被用指在表達(dá)載體中排列其它轉(zhuǎn)錄控制元件(如，增強(qiáng)子)。
“質(zhì)粒”或“質(zhì)粒載體”是一種能夠通過轉(zhuǎn)化而被引進(jìn)或轉(zhuǎn)染到細(xì)菌或酵母菌細(xì)胞中去的環(huán)狀DNA分子，質(zhì)粒就可以在細(xì)胞內(nèi)自動復(fù)制。質(zhì)粒載體通常包含一個為宿主自身固有的或非宿主自有的RNA聚合酶所識別的啟動子序列、一個運(yùn)作上與啟動子序列相聯(lián)系的異源核酸以及一個通過與外因子感應(yīng)而提高拷貝數(shù)量的復(fù)制原點組成，其中啟動子控制著目的基因的表達(dá)。質(zhì)粒復(fù)制原點是很重要的，因為它們決定質(zhì)?？截悢?shù)量進(jìn)而影響質(zhì)粒產(chǎn)量。能夠以高拷貝數(shù)量進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)?？梢源蟠筇岣吖潭ㄈ萘颗囵B(yǎng)基上的質(zhì)粒產(chǎn)量(Suzuki等，Genetic Analysis，p.404，(1989)。包含在質(zhì)粒載體中的啟動子序列，控制著目的基因的表達(dá)，可以是能夠在特定宿主中驅(qū)動基因表達(dá)的任何啟動子序列，例如，可以使用能夠被來自T7，T3，SP6以及其它類似的LacZ等的RNA聚合酶所識別的啟動子序列?？捎糜诖四康牡膯幼影ǖ痪窒抻谙铝行蛄衛(wèi)ac、tip、tac、gal、ara以及P.sub.L啟動子等，當(dāng)使用埃希氏菌屬大腸桿菌時，只要達(dá)到上述目的即可使用(Fitzwater等.，Embo J.73289-3297(1988)；Uhlin等，Mol.Gen.Genet.165167-179(1979))。此外，質(zhì)粒載體可以含有抗藥基因用作選擇性標(biāo)志。
“多聚核苷酸”通常是指任何多聚核糖核酸或多聚脫氧核糖核酸，可以是未加修飾的RNA或DNA，也可以是修飾的RNA或DNA?！岸嗑酆塑账帷保瑢捂溑c雙鏈DNA或RNA沒有限制，包括DNA或RNA，它們是單鏈區(qū)域和雙鏈區(qū)域的混合物以及由上述混合物形成的雜交分子。多聚核苷酸也包括含有一個或更多修飾堿基的多種DNA或RNA以及為了穩(wěn)定性或其它原因而將主鏈骨架修飾的多種DNA或RNA?！靶揎棄A基”包括，例如，tritylated堿基與稀有堿基(如，次黃嘌呤核苷)。DNA與RNA都經(jīng)過了許許多多的修飾，因而“多聚核苷酸”擁有象在自然界中發(fā)現(xiàn)的那樣典型的經(jīng)過化學(xué)修飾、酶學(xué)修飾或代謝修飾過的多聚核苷酸形式，以及具有病毒和細(xì)胞特征的DNA和RNA化學(xué)形式?！岸嗑酆塑账帷币矒碛邢鄬Χ痰亩嗑酆塑账幔ǔＪ侵腹押塑账?。
“多肽”是指任何由兩個或更多氨基酸通過肽鍵或經(jīng)過修飾的肽鍵(如，肽等排體)相互連接而成的肽或蛋白質(zhì)。“多肽”既指短鏈又指長鏈，短鏈通常是指肽、寡肽或寡聚物，而長鏈常指蛋白質(zhì)。多肽可以包括氨基酸而不是基因編碼的氨基酸?！岸嚯摹卑ń?jīng)過修飾了的氨基酸序列，這種修飾是由自然過程(如，翻譯后加工處理過程)或者經(jīng)過化學(xué)修飾技術(shù)來完成的，后者在工業(yè)工藝中為人們所熟知。在基本課本與更為詳細(xì)的專論，以及大部頭的研究專著中均對這些修飾做了詳細(xì)解釋。
修飾可以發(fā)生在多肽的任何位置，包括肽鏈骨架、氨基酸側(cè)鏈與氨基末端或羧基末端。在給定多肽中，如果同一類型的修飾可生在幾個位點或相同或不同水平，則會更為人們所賞識。一種給定的多肽也可以含有多種類型的修飾；多肽可因為泛醌化而產(chǎn)生分枝，它們可以是有分枝或無分枝的循環(huán)。循環(huán)的、分枝化的以及分枝循環(huán)的多肽可以是由于翻譯后自然加工處理過程所致，也可以是由合成方式所引起。
術(shù)語“啟動子”、“啟動子區(qū)域”或“啟動子序列”通常是指基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，它們可以在編碼區(qū)的5’或3’旁、或者在編碼區(qū)內(nèi)或者在內(nèi)含子中。典型的啟動子是一個能夠與細(xì)胞內(nèi)RNA聚合酶結(jié)合并且發(fā)動下游(3’方向)編碼序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)域。典型的5’啟動子序列3’末端緊鄰轉(zhuǎn)錄啟始位點，并且其5’端向上游方向延伸，包含起始可以探測到的、高于本底水平的轉(zhuǎn)錄所需要的最小數(shù)量的堿基或元件。啟動子序列內(nèi)部是一個轉(zhuǎn)錄啟始位點(用核酸酶S1可以地定位)以及與RNA聚合酶結(jié)合的蛋白結(jié)合區(qū)域(一致序列)。
術(shù)語“報告基因”是指編碼可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法直接或間接地探測得到其產(chǎn)物的基因。
“酵母”通常是指釀酒酵母、貝克酵母菌種的一個酵母菌株，是一種可以以單倍體或雙倍體形式生存的單細(xì)胞微生物，通過子細(xì)胞發(fā)芽的方式來進(jìn)行繁殖。由于釀酒基因組的遺傳操縱簡便，這就使得它在以了解真核細(xì)胞基本生物學(xué)現(xiàn)象為目的的研究中具有極高的應(yīng)用價值。酵母基因組已經(jīng)被全部測序，并且擁有大量關(guān)于這一生物體的生物學(xué)、遺傳學(xué)與分子生物學(xué)的可獲得信息。此外，它是在酵母菌中表達(dá)可構(gòu)建和可誘導(dǎo)的異源蛋白質(zhì)的經(jīng)濟(jì)可行并為人們所熟知的、獨具特色的工具，這就使得酵母菌成為表達(dá)和純化宿主的治療性重組蛋白質(zhì)的有用工具。此外，酵母菌被廣泛地應(yīng)用于人們?nèi)粘ＯM(fèi)的烘焙食品、維生素以及酒精飲料發(fā)酵的制造業(yè)中，這就是被食品與藥品管理局(FDA)冠以“通常被認(rèn)為是人們消費(fèi)安全的”(GRAS)稱號的慈善酵母菌的原因。
除了廣泛地應(yīng)用于食品和飲料制造業(yè)，酵母菌還是寄居在人類體內(nèi)的自然微生物中的一部分。已經(jīng)從健康個體口腔與直腸黏膜表面分離出了釀酒酵母菌株(見Xu，J.，C.M.Boyd，Livingston，W.Meyer，J.F.Madden，and T.G.Mitchell.1999.定居于婦女體內(nèi)的致病性酵母菌種類與基因型的差別及相似性.JClin.Microbiol.373835-3843.)。
與條件致病性微生物酵母菌種不同，例如白色假絲酵母菌可以引起免疫功能受損患者發(fā)生致命性感染，釀酒酵母寄居菌極少與這種破壞健康的效應(yīng)有關(guān)聯(lián)。另外，已經(jīng)證明如果把活的酵母菌給予健康個體與動物模型并不能引起酵母菌定居與致病性(見Maejima，K.，K.Shimoda，C.Morita，T.Fujiwara和T.Kitamura.1980.給小鼠和獼猴口服及靜脈注射釀酒酵母菌MC16后細(xì)菌的定居與致病性，Jpn.J Med.Sci.Biol.33271-276。參見Pecquet，S.，D.Guillaumin，C.Tancrede，and A.Andremont.1991.釀酒酵母菌在人類志愿者腸道中的排除動力學(xué)及其在無菌小鼠體內(nèi)對微生物移植的抵抗效應(yīng)，Appl.Environ.Microbiol.573049-3051)。依據(jù)本發(fā)明的原則，適于應(yīng)用的無限制性酵母菌屬的例子包括下組酵母菌釀酒酵母菌、S.exiquus、S.telluris、S.dairensis、S.servazzii、S.unisporus以及S.kluyveri。
“選擇性標(biāo)志基因”這一術(shù)語是指編碼一種產(chǎn)物的基因，該產(chǎn)物在得到表達(dá)時則賦予被轉(zhuǎn)化細(xì)胞一種可被選擇的表現(xiàn)型，如抗生素抗性。
關(guān)于“有效治療量”，“有效治療量”是指多聚核苷酸、反義多聚核苷酸或蛋白質(zhì)或者它們的片段的計量，當(dāng)將該計量的上述物質(zhì)同細(xì)菌融合體載體一起給予生物體時，它們能夠在生物體內(nèi)有效產(chǎn)生預(yù)期效應(yīng)(如，提高或降低M-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng))。
“轉(zhuǎn)錄與翻譯”控制序列是DNA調(diào)節(jié)序列，例如啟動子、增強(qiáng)子、多聚腺苷化信號、終止子以及宿主細(xì)胞內(nèi)為表達(dá)編碼序列而提供的類似元件。
將包括DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)在內(nèi)的治療性配方轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞(如，大腸桿菌細(xì)胞)的許多方法已經(jīng)為該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。當(dāng)把外源性或異源DNA或基因引導(dǎo)入細(xì)胞時，該細(xì)胞即被這樣的DNA“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)化DNA可以整合入細(xì)胞基因組，也可以不整合。例如，在原核生物、細(xì)菌和酵母菌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化DNA可以維持在游離元件(如，質(zhì)粒)上也可以被結(jié)合在宿主DNA特異性的限制位點。在這里所使用的“轉(zhuǎn)化”是用來說明用病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，如腺病毒、AAV、逆轉(zhuǎn)錄病毒或質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)基因轉(zhuǎn)換方法，將DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞的過程。這里所使用的“轉(zhuǎn)染”是用來說明使用非病毒介導(dǎo)的方式，這些方法包括磷酸鈣-或-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電擊孔法、玻璃發(fā)射打靶法及其它類似的方法將基因元件傳輸和導(dǎo)入細(xì)胞的過程。這些方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，根據(jù)本次公開的資料，精確的制劑與實施操作方法就更為明顯了。
“載體”就是象質(zhì)粒、噬菌體或者粘粒這樣的復(fù)制子，另外一個核酸片段可以被插入進(jìn)去并使該片段得以復(fù)制或表達(dá)。
發(fā)明詳述 身體不同部位的微生物濃度變化很大。例如，口腔黏膜與牙齒表面具有很高濃度的細(xì)菌，它們同唾液及咀嚼的食物一起由此進(jìn)入食道、然后到達(dá)胃中，食物在胃中與胃液混合呈流質(zhì)狀。胃液的酸性能夠有效地破壞與其接觸的大部分細(xì)菌。食物在胃內(nèi)停留大約4小時左右，就被逐漸釋放進(jìn)入小腸；小腸的近端部分也因為從胃內(nèi)進(jìn)入的酸而呈酸性；此外，分泌進(jìn)入小腸近端部分的膽汁酸也破壞細(xì)菌，這樣就使得此處的細(xì)菌水平相對的低。由于酸性下降、膽汁酸被沖淡稀釋，小腸末端部分的細(xì)菌水平就升高了。數(shù)米長的小腸內(nèi)布滿了密度很高的微絨毛，這些微絨毛極大地提高了黏膜的固有表面積，結(jié)果是如果我們把小腸鋪開來的話，它就會覆蓋一個網(wǎng)球場的面積。巨大的表面積使得食物分解以及其后的營養(yǎng)成分吸收能夠有效進(jìn)行，營養(yǎng)成分是通過黏膜被吸收進(jìn)入血流的。大部分的系統(tǒng)免疫組織與小腸有關(guān)系，且可以在黏膜上皮細(xì)胞之下直接發(fā)現(xiàn)它們。
乳酸菌(“LAB”)與酵母菌具有的某些特性使得它們成為把DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)至腸道細(xì)胞的最具有吸引力的侯選者。它們已經(jīng)出現(xiàn)在腸道內(nèi)生微生物群中，并且在商業(yè)上被用來生產(chǎn)酸奶酪、營養(yǎng)乳和其它食品及其前生命期的應(yīng)用，它們通常被認(rèn)為是安全(GRAS)的。它們也具有黏膜黏附特性，且自身免疫原性低。LAB和酵母菌在哺乳動物胃腸道內(nèi)普遍存在，并且能夠定向地黏附于黏膜受體，這使得它們成為把DNA和抗原轉(zhuǎn)導(dǎo)至腸細(xì)胞內(nèi)的非常有用的載體生物。
也可以在胃內(nèi)和小腸的近端部分發(fā)現(xiàn)LAB，是因為LAB的耐算性相對較好；這使得它們成為把DNA和抗原通過胃轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入腸的一個理想載體。有5個主要的乳酸桿菌屬，包括鏈球菌、腸球菌、乳酸球菌、乳酸桿菌和Bifidobacterium。這些乳酸-產(chǎn)生細(xì)菌的典型例子包括嗜熱鏈球菌、faecalis腸球菌、durans腸球菌、lactis乳酸球菌、lactis乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、bulgaricus乳酸桿菌、嗜熱乳酸桿菌、casei乳酸桿菌、plantarum乳酸桿菌、L.gasseri、L.jenseni、L.crispatus、L.paracasei、L.rhamnosus、L.agilis、L.salivarius、L.pseudoplantarum、L.buchneri以及L.reuteri。例如，rhamnosus乳酸桿菌GG(ATCC 53103)或者更為簡單地稱為乳酸桿菌GG或LGG是從健康人類的腸道菌群中分離出來的前生命期株。乳酸桿菌對健康人類的益生效應(yīng)已經(jīng)被廣泛地研究，并且在科學(xué)期刊中有文獻(xiàn)證明。依據(jù)本發(fā)明的一個方面，所有這些種和屬的細(xì)菌都可被用作DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。
大腸桿菌是自然生長在哺乳動物腸道內(nèi)的又一菌種。例如，coli K-細(xì)胞生產(chǎn)制造機(jī)體血液凝固所需要的維生素K。由于大腸桿菌細(xì)菌已經(jīng)被廣泛地研究，是現(xiàn)代基因工程中廣為應(yīng)用的菌種，所以改良和操縱大腸桿菌的方法與技術(shù)已為業(yè)內(nèi)人士所周知。正因如此，依據(jù)本發(fā)明的一個方面，改良的大腸桿菌也可以被用作將DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)至腸細(xì)胞的載體。
酵母菌是通常發(fā)現(xiàn)于食物中的真核細(xì)胞的真菌，因此經(jīng)常定居在人類的部分腸道。象Saccharomyces種這樣的酵母菌通常被認(rèn)為是安全的，因此根據(jù)本發(fā)明的規(guī)范，它們是可用的理想侯選者。Saccharomyces菌種包括如下種類S.exiquus、S.telluris、S.dairensis、S.servazzii、S.unisporus、S.cerevisiae與S.kluyveri。釀酒酵母菌株為現(xiàn)代面包師所用的酵母，且已經(jīng)在傳統(tǒng)的酵母粉中發(fā)現(xiàn)S.kluyveri，因此按照本發(fā)明的規(guī)范，這些菌種理想地適合于修飾改良。
為了這次公開的目的，所有在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的自然發(fā)生的細(xì)菌或酵母菌都被稱為“微生物”。
依據(jù)本發(fā)明的一個方面，包括細(xì)菌(如，LAB、coli)和酵母菌的微生物都可以用、包含哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)、能表達(dá)興趣蛋白質(zhì)的質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明的一個實施方案中，所用細(xì)菌是嗜酸乳酸桿菌；而在另一個實施方案中，所用微生物是酵母菌。這樣就可以將改良微生物的培養(yǎng)物通過口服攝取給予動物或人類。在微生物沿著胃腸道運(yùn)行過程中，微生物細(xì)胞被觸發(fā)而引起細(xì)胞溶解，并且在腸道內(nèi)釋放質(zhì)粒。通過給予加大量的微生物，同時使用高拷貝的質(zhì)粒，這樣質(zhì)粒DNA就可以被腸道細(xì)胞攝取并被在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
應(yīng)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌已為本領(lǐng)域內(nèi)所熟知，在這里不需要進(jìn)一步的解釋?？梢詰?yīng)用Leer等人描述的方法，以有限的自分解方式對LAB進(jìn)行轉(zhuǎn)化，我們通過參考該文獻(xiàn)(WO095/35389)全文而使之呈為一體。根據(jù)下列文獻(xiàn)中所公開的方法和技術(shù)，也可以對各種興趣LAB進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這些文獻(xiàn)在這里被呈為一體，就象在這里全面提出一樣。已經(jīng)公開發(fā)表的PCT申請PCT/NL96/00409揭示了篩選非致病性細(xì)菌黏附于特異性黏膜受體的能力的方法，特別是篩選乳酸桿菌與Bifidobacterium屬LAB；同時也揭示了一種載體，它由一個表達(dá)啟動子序列(一種核酸序列)和容許核糖體識別與翻譯性能的序列組成。這一參考文獻(xiàn)表明乳酸桿菌的不同種系可以被轉(zhuǎn)化，以致表達(dá)包括致病性細(xì)菌蛋白的異源基因產(chǎn)物。PCT/NL95/00135說明了一種用于乳酸桿菌的多拷貝載體，它所包含的5’非翻譯核酸序列至少組成了核糖體識別與RNA穩(wěn)定所需要的最小序列，緊隨該序列之后的是翻譯起始密碼子。而且，已經(jīng)應(yīng)用口服重組體L.lactis來誘導(dǎo)針對表達(dá)抗原反應(yīng)的局部IgA和/或血清IgG抗體(Wells等人，Antonie van Leeuwenhoek 199670317-330)。此外，Casas等人在U.S.Patent No.6,100,388中說明可以應(yīng)用異源DNA轉(zhuǎn)化L.reuteri，并且可以在細(xì)胞表面表達(dá)外源性蛋白質(zhì)或者將其分泌；而EP1084709 A1揭示plantarum乳酸桿菌也可以被轉(zhuǎn)化，在細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞表面表達(dá)抗原片段。
酵母菌的轉(zhuǎn)化方法也已為本領(lǐng)域所熟知。例如，2002年10月25日歸檔的懸而未決的美國專利申請系列號10/280,769中附加了詳細(xì)的資料。再見ChristineGuthrie和Gerald Fink編著的《酵母菌遺傳學(xué)、分子與細(xì)胞生物學(xué)的指導(dǎo)》(2002)。這是酶學(xué)系列叢書中關(guān)于方法學(xué)的兩本。350卷和351卷，Academic Press出版，通過參考其全部而在這里呈為一體。
除了上述參考文獻(xiàn)所揭示的載體以外，適合于LAB的其它質(zhì)粒包括，例如pFXL03、pWV01、pGKV210及pVA838。來自乳酸桿菌和乳酸球菌的某些質(zhì)粒也可以從DSMZ、Braunschweig和Germany獲得。其它的都在專著中進(jìn)行了說明。例如，適合于酪蛋白乳酸桿菌的質(zhì)粒載體在許多文獻(xiàn)中都又說明，包括Maassen C.等人的“口服疾病預(yù)防策略的手段表達(dá)破傷風(fēng)毒素片段C的酪蛋白乳酸桿菌重組體疫苗接種或多發(fā)性硬化癥中口服耐量感應(yīng)的髓磷脂蛋白”Vaccine 17(17)2117-28(1999)。此外，適合于Lactobacillus plantarum和Lactococcus lactis的質(zhì)粒載體在Geoffrey M.等人“應(yīng)用綠色熒光蛋白標(biāo)記乳酸菌以開發(fā)活疫苗載體”(Applied and Environmental Microbiology 66(1)383(2000))有說明解釋；Piard J.等人在“各種乳酸菌錨定鏈球菌生膿原M6蛋白的細(xì)胞壁”Journal ofBacteriology179(9)3068-72(1997)中對適于lactis乳酸球菌、酵素乳酸桿菌與sake乳酸桿菌的質(zhì)粒載體進(jìn)行了說明。有些質(zhì)粒載體適合于寬范圍的乳酸桿菌種，如pPSC20和pPSC22，在Cocconcelli P.等人的文章“單鏈DNA質(zhì)粒、載體結(jié)構(gòu)和嗜熱硬脂桿菌α-淀粉酶在乳酸桿菌內(nèi)的克隆”Res Microbiol 142(6)643-52(1991)中都得到了說明。也可以應(yīng)用穿梭載體，它們是能夠在乳酸桿菌和大腸桿菌兩種細(xì)菌內(nèi)表達(dá)的質(zhì)粒；大腸桿菌/LAB穿梭載體在Maassen C.等人.，Vaccine，同上，中得到說明。因為操縱大腸桿菌的方法和技術(shù)很具特色，穿梭載體具有方便大腸桿菌基因改良及其后乳酸桿菌轉(zhuǎn)化工作的優(yōu)勢。大腸桿菌E的載體和質(zhì)粒已經(jīng)為人們所熟知，并且具有豐富的可得資源，包括商業(yè)性資源。
質(zhì)粒可以包含選擇性標(biāo)志基因或者包含報告基因，它們使確定哪些細(xì)菌含有預(yù)期質(zhì)粒DNA的工作更為容易?？赡艿倪x擇性標(biāo)志基因是抗生素抗性基因，如卡拉霉素抗性基因，、四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因或者是酶突變或酶缺陷，這種酶突變或缺陷能夠影響細(xì)菌代謝或合成某些營養(yǎng)成分的能力。β-半乳糖基因和編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因?qū)儆趫蟾婊虻睦?。相反，如果質(zhì)粒沒有包含選擇性標(biāo)志基因或報告基因，則質(zhì)粒DNA需要用多種方法如使用質(zhì)粒DNA作探針的斑點印跡技術(shù)，才能被探測得到。
如果想應(yīng)用的話，也可以使用在LAB和大腸桿菌細(xì)菌中進(jìn)行原核表達(dá)的啟動子，這些啟動子在專著中均有說明解釋。例如，已為人們研究透徹的plantarum乳酸桿菌和lactis乳酸球菌兩種細(xì)菌的、并且已被證明對其它LAB中的表達(dá)也很有用的一種啟動子就是來自lactis乳酸球菌的尼生素可誘導(dǎo)的nisA啟動子(deRuyter P.等，“食品級尼生素誘導(dǎo)lactis乳酸桿菌的控制表達(dá)系統(tǒng)”Applied andEnvironmental Microbiology.623662-67(1996))。Kleerebezem M.，“乳酸菌的控制基因表達(dá)系統(tǒng)乳酸球菌，Leuconostoc和Lactobacillus spp可轉(zhuǎn)化的尼生素誘導(dǎo)表達(dá)盒”Applied and Environmental Microbiology 63(11)4581-84(1997)。L.plantarum ldhL啟動子也被成功地應(yīng)用于L.plantarum。L.casei表達(dá)系統(tǒng)的啟動子包括來自L.casei的組成性乳酸脫氫酶啟動子與來自L.amylovorus的可調(diào)控淀粉酶啟動子(Maassen，等，Vaccine 17(17)2117-28(1999))。乳酸球菌啟動子P59已經(jīng)被應(yīng)用在各種lactis乳酸球菌和乳酸桿菌細(xì)菌中(Piard J.等，“各種乳酸菌錨定鏈球菌生膿原M6蛋白的細(xì)胞壁”Journal of Bacteriology 179(9)3068-72(1997))。此外，質(zhì)?？梢院芯c編碼抗原序列聯(lián)合運(yùn)作的多重啟動子。
本發(fā)明的一個實施方案中，DNA結(jié)構(gòu)可以是一個質(zhì)粒，它至少編碼一個適當(dāng)?shù)念A(yù)期細(xì)菌宿主的復(fù)制原點、一個可選擇性標(biāo)志基因和/或一個報告基因、一個啟動子，該啟動子與編碼抗原或治療性元件的異源核苷酸序列聯(lián)合發(fā)揮作用，而被編碼的抗原或治療性元件融合到表面結(jié)合或分泌信號序列。該結(jié)構(gòu)也可以包含其它適當(dāng)?shù)脑?，例如轉(zhuǎn)錄起始序列、錨定或分泌信號序列和轉(zhuǎn)錄終止序列。
用于LAB的質(zhì)?？梢园ㄉ鲜鑫墨I(xiàn)中所揭示的已經(jīng)存在的LAB質(zhì)粒的修飾改良。特別是通過重組體DNA技術(shù)，對質(zhì)粒載體進(jìn)行修飾使其包含一個真核表達(dá)增強(qiáng)子和啟動子，例如CMV啟動子、RSV啟動子、泛素啟動子、肌動蛋白啟動子或其它能夠在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)的任何合適的啟動子。這種修飾也可以包括引入啟動子的5’非翻譯區(qū)域，例如用以加強(qiáng)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的CMV啟動子的內(nèi)含子A。而且，組成多聚腺苷酸(poly A)尾和多聚腺苷化信號的3’非翻譯區(qū)也可被包括在質(zhì)粒中，目的是正確地加工處理質(zhì)粒所表達(dá)的mRNA分子。在不需要在LAB中表達(dá)蛋白質(zhì)的某些情況下，可以把除了復(fù)制原點序列和選擇性標(biāo)志之外的原核表達(dá)系統(tǒng)剔除。
這樣就可以應(yīng)用真核表達(dá)的改良質(zhì)粒來表達(dá)任何興趣蛋白質(zhì)；這些蛋白質(zhì)的例子包括報告蛋白質(zhì)(例如，綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)、熒光素酶、堿性磷酸酯酶、CAT等)、治療性蛋白質(zhì)(例如，胰島素、生長激素、干擾素、促紅細(xì)胞生成素、filgastrim、細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素、人類白蛋白、activase、維生素合成或乳糖消化酶(乳糖分解酶)、VIII因子和IX因子、完整抗體、抗體片段、抗生素、激素、信息素以及象降鈣素之類的其它小分子)。為提高機(jī)體對免疫原性蛋白質(zhì)的免疫原反應(yīng)，抗原可以與白細(xì)胞介素-2共表達(dá)，二者在分離的載體內(nèi)或者在同一個載體不同表達(dá)盒內(nèi)，或者通過雙順反子表達(dá)的IRES序列。例如見，Chow Y.H.等，(1997)“應(yīng)用乙型肝炎表面抗原和白細(xì)胞介素-2共表達(dá)質(zhì)粒改進(jìn)乙型肝炎病毒DNA疫苗”，J.Virology，Vol.71，No.1，169-178。
為把所翻譯的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外環(huán)境中去，可以將適當(dāng)?shù)姆置谛盘柡喜⒌侥康亩嚯闹腥ァ＿@些信號可以是多肽內(nèi)生性的，或者是異源信號。因而，可以應(yīng)用分泌信號來使終末蛋白質(zhì)的傳輸更容易進(jìn)行。分泌肽的編碼序列與蛋白質(zhì)編碼序列的5’末端聯(lián)合發(fā)揮作用，這一雜交核酸分子被嵌入到選定質(zhì)粒中去，該質(zhì)粒是為將來在所選宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白表達(dá)而設(shè)計的。被特異性設(shè)計為表達(dá)和分泌外源性蛋白質(zhì)的質(zhì)?？梢詮脑S多商業(yè)途徑購買得到，例如可以從Invitrogen公司買到pSecTag2載體。因為腸道細(xì)胞是有極性的，所以也可以應(yīng)用適當(dāng)?shù)捻敳堪邢蚧蚧鶄?cè)部靶向的信號序列。
此外，也可以應(yīng)用重組DNA技術(shù)對質(zhì)粒載體進(jìn)行改良修飾，以包含一個病毒復(fù)制原點，如源自Epstein-Barr病毒的oriP/EBNA-1蛋白。Huertas D.等，“源自游離基因oriP-EBNAI-YACs的人類CFTR基因在鼠細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)”HumanMolecular Genetics，2000，Vol.9，No.4，617-629。具備了病毒復(fù)制原點，質(zhì)粒就可以在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)以穩(wěn)定的游離基因形式存在，這是因為它與內(nèi)源性DNA一起復(fù)制并且通過粘著于宿主染色體而分離。這樣就使得質(zhì)粒能夠生存較長的時間，從而使特定的蛋白質(zhì)長時間表達(dá)。
本發(fā)明的一個實施方案，就如上面所述，可以通過用溶菌酶處理細(xì)菌而制備原生質(zhì)體而得到改良微生物，就象在下面要討論的范例I中例證的那樣。原生質(zhì)體培養(yǎng)物就可以通過口服攝??；在原生質(zhì)體通過胃并進(jìn)入腸道內(nèi)的過程中，滲透壓和/或膽汁鹽觸發(fā)原生質(zhì)體突然破裂并釋放質(zhì)粒DNA。為提高原生質(zhì)體經(jīng)受住胃內(nèi)的胃酸作用的機(jī)會，必須應(yīng)用各種載體與緩沖物對原生質(zhì)體進(jìn)行配方設(shè)計，保護(hù)它在胃內(nèi)免受胃酸的侵蝕。例如，經(jīng)常用在抗酸劑中的NaHCO3可以被用作設(shè)計原生質(zhì)體的緩沖劑，此時原生質(zhì)體被設(shè)計為可用于口服的等滲溶液中。其它的例子包括將原生質(zhì)體配制在凝膠體中，如瓊脂糖凝膠、白明膠等。
又一個實施方案，細(xì)菌溶解是通過細(xì)菌培養(yǎng)物與噬菌體一起感染而發(fā)生的。噬菌體的例子包括，但不局限于φadh、φLC3、mv4、M13、T4、φ29、Cp-1、Cp-7與Cp-9。在攝取細(xì)菌培養(yǎng)物之前，細(xì)菌細(xì)胞必須為足夠數(shù)量的噬菌體感染。由于在細(xì)菌感染與細(xì)菌溶解之間有一個時間滯后差，這就有了足夠的時間讓細(xì)菌細(xì)胞在溶解發(fā)生之前向下運(yùn)行進(jìn)入腸道。可選擇的另一種方法是，噬菌體在首次感染數(shù)小時或數(shù)天之后才被引入。在這后一種實施方案中，細(xì)菌培養(yǎng)物的首次感染是允許細(xì)菌移植于腸道，并且大量增殖；然后在給予第一培養(yǎng)物數(shù)小時或數(shù)天之后給予被噬菌體感染的第二種細(xì)菌培養(yǎng)物；當(dāng)噬菌體在腸道內(nèi)溶解細(xì)胞時，噬菌體顆粒可以進(jìn)一步感染腸黏膜中的細(xì)菌細(xì)胞，這就極大地提高了腸道內(nèi)的質(zhì)粒DNA。
本發(fā)明的再一個實施方案，可以通過基因工程設(shè)計改變LAB，使它能夠在可誘導(dǎo)的啟動子控制下表達(dá)自體溶解基因。通過使用可誘導(dǎo)的啟動子，自體溶解基因就可以在適當(dāng)?shù)臅r間、在胃腸道內(nèi)適當(dāng)?shù)奈恢帽挥|發(fā)、表達(dá)，進(jìn)一步溶解細(xì)菌細(xì)胞。自體溶解基因的例子包括，但不局限于AcmA(Buist G.等，(1997)“通過誘導(dǎo)自身的主要自溶素AcmA過度形成而引起的lactis乳酸球菌自身溶解”Appl.Environ.Microbiol，632722-2728)、holin與細(xì)胞溶解酶(Henrich B.等，(1995)“乳酸球菌gasseri噬菌體φadh自溶基因的一級結(jié)構(gòu)和泛函分析”J.Bacteriology，Vol.177，No.3，723-732)，通過參考文獻(xiàn)而使它們在這里呈為一體。
在機(jī)體腸道內(nèi)發(fā)生細(xì)菌自溶解更為可取，這樣就會使得腸道細(xì)胞可以攝取質(zhì)粒。用于自溶解基因的可誘導(dǎo)啟動子的例子包括，但不局限于pH可誘導(dǎo)啟動子，這在頒布給Kullen等人的U.S.Patent No.6,242,194中有詳細(xì)說明，也在這里通過參考文獻(xiàn)而使之呈為一體，就象在這里完全提出的一樣；乳糖可誘導(dǎo)啟動子，例如，用于大腸桿菌質(zhì)粒的啟動子(如，源自Stratagene的pBluescript)或乳酸桿菌的內(nèi)生性乳糖啟動子；厭氧生長期誘導(dǎo)的啟動子，例如醇脫氫酶啟動子(adhE)，這在AristarkhovA等人的“埃希氏大腸桿菌體內(nèi)產(chǎn)生醇脫氫酶的adhE轉(zhuǎn)錄抄本的翻譯需要核糖核酸酶III的分裂”J.Bacteriology，Vol.178，No.14，4327-4332。就乳糖而言，誘導(dǎo)自溶解基因需要在攝取細(xì)菌培養(yǎng)物之后攝入乳糖，如給予牛奶或酸奶酪；可以在攝取細(xì)菌培養(yǎng)物數(shù)小時甚至數(shù)天之后再給予乳糖，以使LAB重組體于腸道內(nèi)進(jìn)一步在數(shù)量上增殖。在adhE啟動子存在的情況下，該啟動子在腸道內(nèi)被誘導(dǎo)是由于腸道內(nèi)的厭氧條件所致。
自溶解基因和可誘導(dǎo)啟動子，二者一起被稱為表達(dá)盒，可能是在用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒的一部分。另一方面，自溶解基因表達(dá)盒可能更適合于整合進(jìn)入所使用的LAB染色體DNA中?？梢酝ㄟ^自溶解基因表達(dá)盒兩側(cè)的側(cè)翼DNA序列來完成進(jìn)入染色體的整合，表達(dá)盒兩側(cè)的側(cè)翼DNA序列與染色體內(nèi)靶序列是同源的。由側(cè)翼DNA序列和自溶解基因組成的整個結(jié)構(gòu)就可以被用來轉(zhuǎn)化微生物。通過同源重組，自溶解基因就可以整合進(jìn)入LAB的基因組(染色體組)。通過同源重組修飾改良細(xì)菌種屬的上述方法，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于大腸桿菌細(xì)胞，并且同樣可以被應(yīng)用于LAB。
編碼抗原或治療性元件以及表面結(jié)合啟動子區(qū)域的核苷酸序列，可以用多種方法進(jìn)行準(zhǔn)備。可以從任何自然資源中分離獲得這些序列，或者利用已經(jīng)為人們所熟知的DNA合成技術(shù)通過人工合成而獲得這些序列。這些序列就可以被整合進(jìn)入質(zhì)粒，然后利用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所選定的細(xì)菌宿主。最近，分子生物學(xué)在重組體蛋白質(zhì)生產(chǎn)方面的進(jìn)展使得在微生物體外表面表達(dá)蛋白質(zhì)成為可能，這是利用一種被稱為“細(xì)胞表面展示”的技術(shù)來完成的。編碼表面結(jié)合啟動子區(qū)域的序列需要與抗原序列融合，這樣就使得改良的乳酸桿菌生物體能夠在自身表面表達(dá)抗原。這種表面結(jié)合啟動子區(qū)域的例子是那些用在PCT/NL96/00135所說明的結(jié)構(gòu)中的區(qū)域，以及Dieye Y.等在“乳酸菌蛋白靶向系統(tǒng)的設(shè)計”中所說明的那些區(qū)域，Journal of Bacteriology，183(14)；4157-66(2001)。
被研究的首批表面表達(dá)系統(tǒng)之一是George P.Smith在20世紀(jì)80年代中期開發(fā)的，他能夠表達(dá)與絲狀噬菌體pIII融合的肽或小分子蛋白質(zhì)(見Smith G.P.，Science，2281315-1317，1985)。從那時開始，人們已經(jīng)研究了微生物體內(nèi)表達(dá)和分泌異源蛋白質(zhì)的各種系統(tǒng)，以開發(fā)新的、比較好的細(xì)胞表面展示與分泌系統(tǒng)，可以通過該系統(tǒng)將興趣蛋白質(zhì)表達(dá)在微生物機(jī)體表面或?qū)⑵浞置?。目前，發(fā)明人正在利用內(nèi)生性表面蛋白作為表面錨定主體，研究細(xì)菌和酵母菌在細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)蛋白質(zhì)和多肽方面的應(yīng)用。
細(xì)菌，特別是象大腸桿菌這樣的革蘭氏陰性細(xì)菌，具有獨特且復(fù)雜的細(xì)胞包膜結(jié)構(gòu)，它可能是由內(nèi)層細(xì)胞膜、外周細(xì)胞質(zhì)與外層細(xì)胞膜組成；因此，要想把外源性蛋白質(zhì)有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面，需要一個表面錨定主體。所以為了表達(dá)外源性肽或蛋白質(zhì)，適當(dāng)?shù)募?xì)菌表面蛋白質(zhì)必需與外源性興趣蛋白質(zhì)在基因水平上融合，并且所表達(dá)的融合蛋白必須通過內(nèi)層細(xì)胞膜和外層細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)菌表面，并被錨定在細(xì)菌表面。
考慮到這些因素，一個表面錨定主體需要具有幾個關(guān)鍵性特征。首先，要被用作錨定主體的表面蛋白需要具有一個足夠的分泌信號序列基序來支持外源性蛋白質(zhì)通過細(xì)胞內(nèi)層細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)；第二，也需要一個將外源性蛋白質(zhì)錨定到細(xì)胞表面的靶信號；此外，完整的融合主體不僅需要具有調(diào)節(jié)提供各種大小的外源性蛋白質(zhì)或肽類的能力，而且要具有能夠大量地表達(dá)這些物質(zhì)的能力。
已經(jīng)被研究開發(fā)的細(xì)胞表面展示系統(tǒng)基本上有三組C-末端融合、N-末端融合與夾心融合(三明治融合)。首先，如果天然的表面蛋白在其N-末端內(nèi)具有一個不連續(xù)的定位信號，則可以使用一個C-末端融合基序把外源性肽融合到那一功能性部分的C-末端；例如，在大腸桿菌中開發(fā)的Lpp-OmpA基序就是利用C-末端融合系統(tǒng)(見Georgiou G.等人，Protein Eng.，9239-247，1996)。第二，已經(jīng)開發(fā)了一個N-末端融合基序，它含有一個C-末端分類信號將外源性蛋白質(zhì)導(dǎo)航到細(xì)胞壁；已經(jīng)開發(fā)N-末端融合基序的細(xì)菌范例包括金黃色葡萄球菌蛋白A(見Gunneriusson等，J.Bacteriol.，1781341-1346，1996)、金黃色葡萄球菌fibronectin結(jié)合蛋白B(見Strauss A.等，Mol.Microbiol.，21491-500，1996)以及鏈球菌生膿原絲狀M蛋白(見Pozzi G.等，Infect.Immun.，601902-1907，1992.)。但是，如果表面蛋白不含有這樣的錨定區(qū)域，則需要裝配整個結(jié)構(gòu)；為此開發(fā)了夾心-融合系統(tǒng)，外源性興趣蛋白質(zhì)被插入到表面蛋白主體；使用這一系統(tǒng)的幾個例子包括大腸桿菌PhoE(見Agterberg M.等，Gene，8837-45，1990)、FimH(見Pallesen L.等，Microbiology，‘1412839-2848，1995)以及PapA(見Steidler L.等，J.Bacteriol.，1757639-7643，1993)。利用這些機(jī)制，掌握該領(lǐng)域普通技術(shù)的人們就能夠修飾改良給定細(xì)菌(如，鏈球菌和乳酸球菌)的特定表達(dá)系統(tǒng)從而達(dá)到本發(fā)明的目的，也就是表達(dá)、分泌和/或細(xì)胞表面展示各種抗原性和/或治療性元件。
為了把所翻譯的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外環(huán)境中去，可以將適當(dāng)?shù)姆置谛盘栒系侥康亩嚯闹?；這些信號可以是多肽內(nèi)生性的，也可以是異源信號。因此可以使用分泌信號而使終末蛋白質(zhì)的傳遞更為容易。分泌肽的編碼序列與蛋白質(zhì)編碼序列的5’末端聯(lián)合運(yùn)作，這一雜交的核酸分子被插入到所選擇的適合于在所選宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)粒中?？梢詮脑S多商業(yè)途徑得到質(zhì)粒，特別是為表達(dá)和分泌外源性蛋白質(zhì)而設(shè)計的質(zhì)粒。例如，如果想應(yīng)用大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)和分泌蛋白質(zhì)，通常使用的質(zhì)粒包括pTrcPPA(Pharmacia)、pPROK-C和pKK233-2(Clontech)以及pNH8a、pNH16a、pcDNAII和pAX(Stratagene)或其它質(zhì)粒。其它的分泌信號系統(tǒng)是Dieye Y.等人在“乳酸菌蛋白靶系統(tǒng)的設(shè)計”Journal ofBacteriology183(14)；4157-66(2001)中解釋說明的那些系統(tǒng)，例如，來自鏈球菌致熱原的M6前蛋白；以及Ravn P.等人在“TnINuc的研究進(jìn)展及其在分離Lactis乳酸球菌的新穎分泌信號中的應(yīng)用”Gene242347-356(2000)中提出的那些系統(tǒng)，如被信號肽酶I或信號肽酶II所識別的SP13、SP10、SP307與SP310。
因而，本發(fā)明在一個方面實施方案了在宿主生物體內(nèi)生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的方法，通過宿主的分泌途徑加工處理蛋白質(zhì)。分泌是通過用包含一個DNA結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒對宿主生物體(如，大腸桿菌)進(jìn)行轉(zhuǎn)化而實現(xiàn)的，該DNA結(jié)構(gòu)含有與編碼分泌信號肽的DNA序列聯(lián)合運(yùn)作的轉(zhuǎn)錄啟動子，比如BAR1 C-末端區(qū)域的那一部分，或者能夠?qū)Ш疆愒吹鞍踪|(zhì)或多肽輸出的金黃色葡萄球菌蛋白A。
已經(jīng)說明的、應(yīng)用在大腸桿菌中的其它各種分泌系統(tǒng)的例子包括美國專利號4,336,336(1979年1月12日歸檔)，歐洲專利申請發(fā)表號184,169(1986年6月11日發(fā)表)、177,343(1986年4月9日發(fā)表)以及121,352(1984年10月10日發(fā)表)，Oka T.等(1985)、Gray G.L.等(1985)、Ghrayeb J.等(1984)與Silhavy T.等(1983)。這些系統(tǒng)大部分是應(yīng)用如下發(fā)現(xiàn)某些細(xì)菌蛋白質(zhì)在正常情況下被細(xì)胞輸出到非細(xì)胞質(zhì)區(qū)域，而一個出現(xiàn)在這些細(xì)菌蛋白氨基NH2-末端上的短(15-30)的氨基酸序列，對以相似的方法將異源蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到非細(xì)胞質(zhì)區(qū)域是非常有用的。這些短的氨基酸序列通常被稱為“信號序列”，因為它們發(fā)出信號將蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)到非細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，這樣的非細(xì)胞質(zhì)區(qū)域包括內(nèi)層細(xì)胞膜、周質(zhì)間隙、細(xì)胞壁和外層細(xì)胞膜。在剛剛早于或者在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞質(zhì)的過程中，信號序列去除的典型方式是通過某點上肽切割，這樣就將成熟的蛋白質(zhì)留在了預(yù)期的非細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。信號序列點特異性的去除，在這里也指信號序列精確的加工處理過程，如果希望正確的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到預(yù)期的非細(xì)胞質(zhì)區(qū)域，這是一首選的事情。
因此，本發(fā)明在這方面同通過與大腸桿菌細(xì)菌融合而被改良的嗜熱鏈球菌或lactis乳酸球菌生物體有關(guān)，所使用的大腸桿菌包含一個編碼異源核酸的質(zhì)粒，該異源核酸與能夠在改良的宿主細(xì)菌體內(nèi)驅(qū)動基因元件表達(dá)的啟動子聯(lián)合發(fā)揮作用。依據(jù)本發(fā)明的一個獨特實施方案，異源核酸是編碼抗原的多聚核苷酸序列，該抗原可以被分泌或者出現(xiàn)在細(xì)菌的細(xì)胞表面；無論是哪種情況，編碼異源核酸的質(zhì)粒都將包含適當(dāng)?shù)姆置诨蝈^定序列信息，而這些信息是分泌或向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)與表達(dá)所必需的。據(jù)此，在融合體內(nèi)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或肽片段構(gòu)成了能夠在與機(jī)體的免疫相關(guān)細(xì)胞接觸時誘發(fā)免疫反應(yīng)的抗原。
在蛋白質(zhì)被分泌時，預(yù)期的相關(guān)免疫細(xì)胞是分泌IgA抗體的細(xì)胞，但是也很有可能出現(xiàn)下面的情況分泌的抗原性片段被Peyer’s斑內(nèi)的M細(xì)胞吞噬，抗原性蛋白質(zhì)或片段在這種情況下可能與M細(xì)胞口袋內(nèi)的各種成分接觸，包括CTL、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹枝狀細(xì)胞，因此誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或抗原性片段被錨定并呈現(xiàn)在融合體細(xì)胞表面時，抗原性片段可以直接與M細(xì)胞表面細(xì)胞膜接觸，因而直接與M細(xì)胞的各種成分相互作用，直接誘發(fā)黏膜免疫反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個獨特實施方案，異源核酸是編碼治療性蛋白質(zhì)或肽片段的多聚核苷酸序列，這些蛋白質(zhì)或肽片段或者被分泌或者被展示在細(xì)菌細(xì)胞表面。無論是哪種情況，編碼異源基因元件的質(zhì)粒都將包含適當(dāng)?shù)姆置诨蝈^定序列信息，而這些序列信息是分泌或向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)與表達(dá)所需要的。根據(jù)這一實施方案，融合體內(nèi)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或肽片段組成了治療劑，這樣在異源核酸得以表達(dá)時它就產(chǎn)生減輕和/或糾正疾病狀態(tài)所必需的蛋白質(zhì)或蛋白片段。特別是，異源核酸編碼一種能夠被分泌到呼吸道內(nèi)腔中去的蛋白質(zhì)例如胰島素，這就是為什么當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被分泌時它能夠被吸收并且減輕、糾正疾病狀態(tài)，如糖尿病。
根據(jù)上面的簡要論述，依據(jù)本發(fā)明的規(guī)范，也可以應(yīng)用由細(xì)菌-細(xì)菌組成的融合體?？梢詫⒕哂羞m當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)的幾種不同的細(xì)菌與非致病性鏈球菌或乳酸球菌細(xì)菌融合而產(chǎn)生預(yù)期的改良LAB生物體。本發(fā)明中可取的一方面，鏈球菌或乳酸球菌細(xì)菌與大腸埃希氏菌(coli)融合；通常用于分子克隆技術(shù)的幾種不同的coli菌種是HB101、C600、DH1、DH10B、DH5、α5與β10。優(yōu)先選擇上述菌種，是因為可以很容易地得到它們生產(chǎn)和表達(dá)異源核酸所需要的表達(dá)系統(tǒng)，這些表達(dá)系統(tǒng)都已經(jīng)被詳細(xì)地說明并且可以通過商業(yè)渠道獲得。
本發(fā)明中，一個菌種的細(xì)菌與不同菌種的細(xì)菌相融合。具有已經(jīng)報道的表達(dá)系統(tǒng)的兩個獨特菌種是嗜酸乳酸球菌和枯草桿菌。Cocconcelli PS.等，“單鏈DNA質(zhì)粒、載體結(jié)構(gòu)和嗜熱硬脂桿菌α-淀粉酶在乳酸桿菌內(nèi)的克隆”Research inMicrobiolog；y 142(6)643-52(1991)和Kleerebezem M.等“乳酸菌的控制基因表達(dá)系統(tǒng)乳酸球菌、Leuconostoc以及spp.乳酸桿菌可轉(zhuǎn)化的尼生素誘導(dǎo)表達(dá)盒”Applied and Environmental Microbiology63(11)4581-84(1997)。
一個方面，本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)含有一個DNA結(jié)構(gòu)，至少由一個編碼目的抗原或治療性基因的核酸序列組成，它發(fā)揮作用時與可以指導(dǎo)細(xì)菌宿主體內(nèi)異源序列表達(dá)的啟動子相關(guān)聯(lián)。編碼抗原性或治療性片段的多聚核苷酸可能包含編碼成熟多肽或其一個片段的編碼序列，該序列獨自發(fā)揮作用，或者是在閱讀框內(nèi)編碼成熟多肽或其一個片段的編碼序列與其它編碼序列共同作用，如編碼復(fù)制原點、錨定點、引導(dǎo)或分泌序列、前蛋白(或副蛋白)或其它融合肽片段的序列。比如，可以編碼標(biāo)志序列，后者使得我們更容易選擇融合多肽。多聚核苷酸也可以包含非編碼5’與3’序列，如轉(zhuǎn)錄的非翻譯序列、拼接與多聚腺苷化信號、核糖體結(jié)合位點以及穩(wěn)定mRNA的序列。
另一方面，LAB(如嗜熱或lactis菌種)與大腸桿菌融合，該融合方法可以使嗜熱或lactis細(xì)菌表達(dá)由大腸桿菌相關(guān)DNA編碼的抗原性或治療性蛋白質(zhì)或多肽。更有價值的是，抗原性多肽可以被表達(dá)在LAB-大腸桿菌融合體表面，而治療性蛋白質(zhì)則可以被分泌。因而，含有編碼錨定、分泌、引導(dǎo)氨基酸序列的附加多聚核苷酸序列或增加體內(nèi)產(chǎn)物穩(wěn)定性的附加序列通常是很有利的，。這樣所產(chǎn)生的由多肽片段構(gòu)成的蛋白質(zhì)要么被表達(dá)在LAB-大腸桿菌融合體細(xì)胞表面、要么被分泌，并由此引起免疫或者治療反應(yīng)。
典型的多肽片段包括，例如編碼能夠被機(jī)體的各種免疫起動細(xì)胞特別是M細(xì)胞、IgA和IgG細(xì)胞所識別的抗原決定簇的那些片段，它們在動物體內(nèi)尤其在人類體內(nèi)具有抗原性或免疫原性。特定序列或片段的不同變異體也構(gòu)成了本發(fā)明的一部分；首選的變異體是那些將其保守氨基酸替換者；其它可選擇的片段包括具有生物學(xué)活性的治療性片段，它們調(diào)節(jié)生物學(xué)活性，包括相似的或者加強(qiáng)的活性、降低不需要的活性。這些多肽片段保留抗原或治療劑的生物學(xué)活性，包括抗原性活性。
本發(fā)明獨特的一方面是，它與包含一種或多種抗原性或治療性多聚核苷酸的大腸桿菌起源的載體以及宿主嗜熱鏈球菌或lactis乳酸球菌細(xì)胞有關(guān)，宿主嗜熱鏈球菌或lactis乳酸球菌細(xì)胞是通過與大腸桿菌細(xì)胞載體融合由遺傳工程設(shè)計生產(chǎn)的，本發(fā)明還與由宿主LAB-大腸桿菌融合體細(xì)胞編碼的抗原性或治療性多肽的生產(chǎn)與表達(dá)有關(guān)。具有適當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)的合適的大腸桿菌細(xì)胞可以通過多種商業(yè)渠道購買得到或者由遺傳工程設(shè)計生產(chǎn)而得，并且與本發(fā)明的抗原性或治療性多聚核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)或表達(dá)系統(tǒng)的一部分合成一體。
將多聚核苷酸引進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞可以通過許多標(biāo)準(zhǔn)實驗室操作手冊(如Davis等，分子生物學(xué)的基本方法(1986)以及Sambrook等，分子克隆法實驗室手冊，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))中所介紹的方法來完成，例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、DEAF-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、顯微注射法、脂質(zhì)陽離子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、轉(zhuǎn)換、擦痕裝載法、彈道導(dǎo)入或感染。用以與大腸桿菌細(xì)胞融合并且在體內(nèi)生產(chǎn)抗原性和治療性蛋白質(zhì)和/或多肽的合適的LAB宿主代表性范例包括嗜熱鏈球菌或lactis乳酸球菌以及乳酸桿菌細(xì)胞如acidophilus、brevis、casei、delbrueckii、fermentum或plantarum。
更為獨特的是本發(fā)明所使用的重組大腸桿菌載體，已經(jīng)被以正向或反向插入了由DNA、cDNA或RNA序列組成的抗原性或/和治療性結(jié)構(gòu)。所插入的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步組成調(diào)節(jié)序列，比如包括與遺傳序列關(guān)聯(lián)運(yùn)作的啟動子，這一方面更有實用價值。很大數(shù)量的合適的質(zhì)粒和啟動子為業(yè)內(nèi)人士所熟知，和/或如下所述，并且可以從商業(yè)渠道獲得。
因此本發(fā)明還體現(xiàn)一個方面，DNA結(jié)構(gòu)可以是一個質(zhì)粒，它至少編碼一個適當(dāng)?shù)念A(yù)期細(xì)菌宿主的復(fù)制原點、一個可選擇性標(biāo)志基因和/或一個報告基因、一個啟動子，該啟動子與編碼抗原或治療性元件的異源核苷酸序列關(guān)聯(lián)運(yùn)作，而被編碼的抗原或治療性元件融合到表面結(jié)合啟動子或錨定點區(qū)域。該結(jié)構(gòu)也可以包含其它適當(dāng)?shù)脑甾D(zhuǎn)錄起始序列、分泌信號序列和轉(zhuǎn)錄終止序列。根據(jù)它們在宿主細(xì)菌體內(nèi)復(fù)制的能力而生產(chǎn)或制造質(zhì)粒。當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)來自大腸桿菌時，啟動子與核苷酸序列可以被克隆進(jìn)入其中的質(zhì)粒載體包括，例如pUC18、pUC19、pBR322及pBluescript。適合于LAB的適當(dāng)質(zhì)粒包括，例如pFXL03，pWV01，pGKV210和pVA838。來自乳酸桿菌和乳酸球菌的某些質(zhì)粒可以從DSMZ，Braunschweig，Germany處購的。其它的質(zhì)粒在專著中都有說明。例如，適合于酪蛋白乳酸桿菌的質(zhì)粒載體在許多文獻(xiàn)中都又說明，包括Maassen C.等人的“口服疾病預(yù)防策略的手段表達(dá)破傷風(fēng)毒素片段C的酪蛋白乳酸桿菌重組體疫苗接種或多發(fā)性硬化癥中口服耐量感應(yīng)的髓磷脂蛋白”Vaccine 17(17)2117-28(1999)。此外，適合于Lactobacillus plantarum和Lactococcus lactis的質(zhì)粒載體在Geoffrey M.等人“識別正在開發(fā)的活疫苗載體乳酸菌種的綠色熒光蛋白的應(yīng)用”(Applied andEnvironmental Microbiology 66(1)383(2000))有說明解釋；Piard J.等人在“各種乳酸菌錨定鏈球菌生膿原M6蛋白的細(xì)胞壁”Journal of Bacteriology179(9)3068-72(1997)中對適于lactis乳酸球菌、酵素乳酸桿菌與sake乳酸桿菌的質(zhì)粒載體進(jìn)行了說明。有些質(zhì)粒載體適合于寬范圍的乳酸桿菌種，如pPSC20和pPSC22，在Cocconcelli P.等人的文章“單鏈DNA質(zhì)粒、載體結(jié)構(gòu)和嗜熱硬脂桿菌α-淀粉酶在乳酸桿菌內(nèi)的克隆”Research in Microbiolog；y142(6)643-52(1991)中都得到了說明。也可以應(yīng)用穿梭載體，它們是能夠在用以產(chǎn)生融合體的雙親細(xì)菌中表達(dá)的質(zhì)粒；這種情況下，適當(dāng)?shù)拇┧筝d體要含有來自兩個融合菌種的復(fù)制原點；適用于LAB的適當(dāng)穿梭載體包括pFXL03、pWV01、pGKV210、pVA838和pNZ123。此外，大腸桿菌/LAB穿梭載體在Maassen C.等人.，Vaccine，同上和Bringel等人的“來自乳酸桿菌plantarum CCM 1904的pLP1質(zhì)粒在乳酸桿菌中的特性、克隆、加工與分布及其在穿梭載體構(gòu)建中的應(yīng)用”Plasmid，22(3)193-202(1989)中得到說明。
質(zhì)粒可以包含選擇性標(biāo)志基因或報告基因，它們使我們更容易確定那些細(xì)菌包含有預(yù)期質(zhì)粒DNA?？赡艿倪x擇性標(biāo)志基因是抗生素抗性標(biāo)志，如卡拉霉素抗性基因，、四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因；β-半乳糖苷酶基因和編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因就是報告基因的例子。相反，如果質(zhì)粒沒有包含選擇性標(biāo)志或報告基因，則質(zhì)粒DNA只能以不同的方法檢測，如使用質(zhì)粒DNA作為探針的斑點印跡法。
需要根據(jù)宿主細(xì)菌及要表達(dá)的抗原來選擇啟動子?？梢允褂糜诖竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)的啟動子包括λ-PR、PL與Trp以及T3、T7、gpt、SP6和lacZ啟動子或乳糖操縱子。文獻(xiàn)中已經(jīng)說明了各種乳酸桿菌和乳酸球菌細(xì)菌的啟動子。例如，已為人們研究透徹的plantarum乳酸桿菌和lactis乳酸球菌兩種細(xì)菌的、并且已被證明對其它LAB中的表達(dá)也有用的一種啟動子就是來自lactis乳酸球菌的尼生素可誘導(dǎo)的nisA啟動子(參見deRuyter P.等人的.，“食品級尼生素誘導(dǎo)嗜酸乳酸桿菌的控制表達(dá)系統(tǒng)”Applied and Environmental Microbiology.623662-67(1996)；Kleerebezem M.，“乳酸菌的控制基因表達(dá)系統(tǒng)乳酸球菌，Leuconostoc和Lactobacillus spp可轉(zhuǎn)化的尼生素誘導(dǎo)表達(dá)盒”Applied and EnvironmentalMicrobiology63(11)4581-84(1997))。L.plantarum ldhL啟動子也被成功地應(yīng)用于L.plantarum。L.casei表達(dá)系統(tǒng)的啟動子包括來自L.casei的結(jié)構(gòu)性乳酸脫氫酶啟動子與來自L.amylovorus的可調(diào)控淀粉酶啟動子(Maassen，等，Vaccine17(17)2117-28(1999))。乳酸球菌啟動子P59已經(jīng)被應(yīng)用在各種lactis乳酸球菌和乳酸桿菌細(xì)菌中(Piard J.等，“各種乳酸菌錨定鏈球菌生膿原M6蛋白的細(xì)胞壁”Journalof Bacteriology 179(9)3068-72(1997))。此外，質(zhì)粒可以含有均與編碼抗原序列聯(lián)合運(yùn)作的多重啟動子序列。這樣載體中的每一個啟動子都與用來制造該融合體的雙親細(xì)菌中的至少一個相兼容，并且如上所述，質(zhì)?？梢园ǘ嘀貜?fù)制原點，如來自每一雙親細(xì)菌種的復(fù)制原點。
在抗原性多肽要被表達(dá)時，通常情況下，如果能使多肽產(chǎn)生并被展示于細(xì)胞表面，這種情況是首選的。最近，分子生物學(xué)在重組體蛋白質(zhì)產(chǎn)物方面的進(jìn)展使得在微生物體外表面表達(dá)蛋白質(zhì)成為可能，這是利用一種被稱為“細(xì)胞表面展示”的技術(shù)來完成的。編碼表面結(jié)合啟動子區(qū)域的序列需要與抗原序列融合，這樣就使得改良的乳酸桿菌生物體能夠在自身表面表達(dá)抗原。這種表面結(jié)合啟動子區(qū)域的例子是那些用在PCT/NL96/00135所說明的結(jié)構(gòu)中的區(qū)域，以及Dieye Y.等在“乳酸菌蛋白靶向系統(tǒng)的設(shè)計”中所說明的那些區(qū)域，Journal of Bacteriology，183(14)；4157-66(2001)。
釀酒酵母菌是一種被認(rèn)為與人類表達(dá)系統(tǒng)兼容的酵母，因為它具有與人類表達(dá)系統(tǒng)如此的相似性，如細(xì)胞周期、染色體結(jié)構(gòu)和RNA拼接。本發(fā)明人已經(jīng)選定方向來研究一種利用該酵母的表達(dá)系統(tǒng)，由于該酵母菌具有進(jìn)行翻譯后修飾的能力，例如，對所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)進(jìn)行乙酰化作用、磷酸化作用以及糖基化作用修飾，它們的作用方式與哺乳動物細(xì)胞的作用方式相當(dāng)相似。因此，人們希望利用釀酒酵母菌作為在動物體內(nèi)表達(dá)外源性蛋白質(zhì)的宿主，產(chǎn)生與其自然形式更為接近的基因產(chǎn)物，就象動物細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)一樣。因為就其培養(yǎng)方式而言，釀酒酵母菌與其它的酵母和細(xì)菌具有很多相似之處，關(guān)于其它微生物的應(yīng)用知識以及用來操縱它們的微生物學(xué)方法和DNA重組技術(shù)，都可以很容易地被用來在使用釀酒酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)生產(chǎn)外源性蛋白質(zhì)。
已經(jīng)在釀酒酵母在內(nèi)的酵母內(nèi)生產(chǎn)出了各種蛋白質(zhì)，尤其是被用作藥物的那些蛋白質(zhì)，其安全性已經(jīng)被廣泛認(rèn)識(Marten & Seo，第7章，生產(chǎn)rDNA的表達(dá)系統(tǒng)和程序，Hatch等編著，ACS Symp.Ser.，477(1991))。來自酵母菌的生產(chǎn)和分泌預(yù)期蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌載體質(zhì)粒包含有一個轉(zhuǎn)錄啟動序列(啟動子)、編碼分泌信號肽的DNA、編碼目的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄終止子，如果有必要的話，還可以含有一個報告基因。如果想要使蛋白質(zhì)或肽片段被展示在酵母融合體的細(xì)胞表面，蛋白質(zhì)或肽片段的編碼序列就必須分別在5′和3′末端同分泌信號序列和合適的錨定序列融合。
這類載體的轉(zhuǎn)錄啟動序列(啟動子)，已被應(yīng)用者有GAPDH、MF.α-1啟動子或PGK(Loison等，Korean Patent Laid-open Publication Nos.88-7727 and88-700234；Bio/Technol.，6，72(1988))、GAPDH、雜交因子-α.(MF.α.-1)、PH05(Meyhack等，Korean Patent Laid-open Publication Nos.86-381 and 87-6185；工業(yè)微生物的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)，Hershberger等人編著，American Society ofMicrobiology出版，pp.311-312(1989))以及GAL啟動子序列(Johnston，Microbiol.Rev.，51，458-476(1987))，例如，在培養(yǎng)介質(zhì)中由半乳糖誘導(dǎo)而成的GAL1。
關(guān)于分泌信號，目前用于異源性蛋白質(zhì)分泌的來自酵母菌的分泌信號肽包括轉(zhuǎn)化酶信號肽(U.S.Pat.No.5,010,003)、酸性磷酸酯酶信號肽(U.S.Pat.No.5,013,652)、雜交因子-α.的prepro引導(dǎo)肽(ppL)(U.S.Pat.No.4,588,684)。在這些各種各樣的分泌信號肽中，ppL的應(yīng)用最為廣泛。就細(xì)胞壁錨定序列而言，可以被融合(與酵母菌分泌信號相關(guān)聯(lián))到抗原上以實現(xiàn)在細(xì)胞壁上的細(xì)胞表面展示的各種序列包括Gas1p的羧基末端部分(編碼最后252個氨基酸的序列)或Yap3p的羧基末端部分(編碼最后35個氨基酸的序列)。詳細(xì)資料請參閱de Sampaio G.等，“釀酒酵母菌中GPI錨定點的組成必作用細(xì)胞壁靶向”MolecularMicrobiology34(2)247-56(1999)；也可參見Van Der Vaart等“發(fā)揮異源蛋白質(zhì)細(xì)胞表面表達(dá)錨定點作用的釀酒酵母菌細(xì)胞壁蛋白的比較”Applied andEnvironmental Microbiology63(2)615-620(1997)。
因此，本發(fā)明的一個獨特實施方案是，它同通過與大腸桿菌細(xì)菌融合而被改良的酵母菌生物體有關(guān)，所使用的大腸桿菌包含一個編碼異源基因元件的質(zhì)粒，該異源基因元件與能夠在改良的宿主酵母菌體內(nèi)驅(qū)動基因元件表達(dá)的啟動子聯(lián)合發(fā)揮作用。可以使用能夠被RNA聚合酶II所利用的各種啟動子，這些啟動子是可以誘導(dǎo)的例如GAL、GAL10、PH05及相似者，或者它們是組成性的例如ADH1、TPI、PGK及類似者。而且，可以被使用的各種載體包括，但不局限于PBM150、PYEP51、PLGSD5、YEP62、PAAH5及類似物；此外，編碼異源基因元件的質(zhì)粒也可以包含選擇性標(biāo)記，例如URA3、LEU2、HIS3、TRPI及其類似物。
根據(jù)這一獨特實施方案，異源基因元件是編碼抗原的多聚核苷酸序列，所產(chǎn)生的抗原或者被分泌，或者被展示在細(xì)菌的細(xì)胞表面。無論是哪種情況，編碼異源基因元件的質(zhì)粒都將包含分泌或向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)與表達(dá)所需要的適當(dāng)?shù)姆置诨蝈^定序列信息。據(jù)此，在融合體內(nèi)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或肽片段構(gòu)成了能夠在與機(jī)體的免疫相關(guān)細(xì)胞接觸時誘發(fā)免疫反應(yīng)的抗原。
根據(jù)本發(fā)明的另一個獨特實施方案，異源基因元件是編碼治療性蛋白質(zhì)或肽片段的多聚核苷酸序列，這些蛋白質(zhì)或肽片段或者被分泌或者被顯示在細(xì)菌細(xì)胞表面。無論是哪種情況，編碼異源基因元件的質(zhì)粒都將包含分泌或向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)與表達(dá)所需要的適當(dāng)?shù)姆置诨蝈^定序列信息。根據(jù)這一實施方案，融合體內(nèi)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或肽片段組成了治療劑，這樣在異源核酸得以表達(dá)時它就產(chǎn)生減輕和/或糾正疾病狀態(tài)所必需的蛋白質(zhì)或蛋白片段。特別是，異源基因元件編碼一種能夠被分泌到腸道黏膜內(nèi)腔中去的蛋白質(zhì)例如胰島素，這就是為什么當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被分泌時它能夠被吸收并且減輕、糾正疾病狀態(tài)，如糖尿病。
本發(fā)明的一個實施方案，重組LAB、融合體及酵母菌可以被導(dǎo)航至M-細(xì)胞，例如與腸黏膜內(nèi)Peyer’s有關(guān)的那些M-細(xì)胞。在黏膜上皮襯層中，有少量的淋巴組織構(gòu)成系統(tǒng)的黏膜淋巴濾泡-相關(guān)上皮(FAE)組織。盡管大分子物質(zhì)和微生物不能通過襯于腸道黏膜的上皮組織入侵，但是在象位于腸道內(nèi)的Peyer’s斑這樣的黏膜誘導(dǎo)點中，淋巴FAE包含微褶皺或M細(xì)胞，微褶皺或M細(xì)胞可以轉(zhuǎn)運(yùn)抗原及微生物以進(jìn)行抗原攝??；簡單上皮內(nèi)的M細(xì)胞僅僅發(fā)生于機(jī)體系統(tǒng)的淋巴濾泡。因而在富含M細(xì)胞的FAE位點內(nèi)，存在著專化上皮與抗原提呈細(xì)胞及淋巴細(xì)胞之間的高度進(jìn)化(強(qiáng)化)了的協(xié)作(協(xié)同作用)。通過活躍的跨上皮細(xì)胞的小泡轉(zhuǎn)運(yùn)，M細(xì)胞把來自內(nèi)腔的大分子物質(zhì)、顆粒以及微生物經(jīng)由其細(xì)胞質(zhì)直接轉(zhuǎn)運(yùn)到上皮內(nèi)的黏膜淋巴濾泡和機(jī)體的系統(tǒng)黏膜淋巴組織，該淋巴組織能夠處理抗原并且激發(fā)能夠引起分泌免疫的黏膜免疫反應(yīng)，分泌性免疫反應(yīng)使得腸道黏膜和肺臟黏膜表面浸浴在保護(hù)性抗體之中。所以，這些淋巴組織也是抗原、細(xì)胞、抗體以及存在于淋巴系統(tǒng)內(nèi)、最后出現(xiàn)在血液中的其它任何蛋白質(zhì)進(jìn)入機(jī)體循環(huán)的通路。
所以M細(xì)胞提供了上皮屏障內(nèi)用以進(jìn)行小泡轉(zhuǎn)運(yùn)的局部、功能性通道(口穴)。M細(xì)胞直接局限于淋巴濾泡(FAE)位點，通過及時將這些物質(zhì)暴露于吞噬細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞，從而減少了通過上皮屏障轉(zhuǎn)運(yùn)外源性物質(zhì)和微生物的固有危險。M細(xì)胞朝向內(nèi)腔的頂部表面不同于周圍的其它細(xì)胞它們?nèi)狈Φ湫偷乃罹?，而有不定的微絨毛，或擁有有龐大微絨毛內(nèi)吞區(qū)域的微褶皺。M細(xì)胞的基部內(nèi)陷形成了自身特征，這是上皮內(nèi)的“口袋”或空間，它們既縮短了跨細(xì)胞囊泡從細(xì)胞頂部到基側(cè)部所必須通過的距離，同時又為B細(xì)胞和CD4T細(xì)胞之類的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及樹枝狀細(xì)胞的聚集提供了入塢位點。M細(xì)胞也有延伸到潛在淋巴組織的基本的推移活動，它們在這里與淋巴細(xì)胞或/和抗原提呈細(xì)胞直接接觸，這好象是對M細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)后的抗原提呈起到一定的作用。
M細(xì)胞以幾種不同的跨細(xì)胞方式參與如下過程外源性物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿管、囊泡以及位于M細(xì)胞頂部胞漿中的大的多囊泡體中去，及其后通過細(xì)胞外分泌作用將這些物質(zhì)釋放到口袋中去的過程。粘附性病毒與高分子物質(zhì)是通過粘附性細(xì)胞內(nèi)吞作用而被攝取的，這種細(xì)胞內(nèi)吞作用是由籠合包被的凹陷與囊泡進(jìn)行的；而非黏附性物質(zhì)的攝取是經(jīng)過液相細(xì)胞內(nèi)吞作用完成的，液相細(xì)胞內(nèi)吞作用的囊泡是以包被或非包被的形式存在。大的黏附性顆粒與細(xì)菌觸發(fā)吞噬作用，這包括細(xì)胞處理過程的延伸以及膜下肌動蛋白網(wǎng)的重組。
M細(xì)胞引導(dǎo)完整的大分子物質(zhì)由屏障一邊向另一邊轉(zhuǎn)運(yùn)的能力包括膜性小泡的定向運(yùn)動。盡管這種轉(zhuǎn)運(yùn)在M細(xì)胞中的分子機(jī)制尚未明確，但是我們可以有把握地推測M細(xì)胞介導(dǎo)的膜性轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于極化上皮細(xì)胞所具有的特征即極化的組織結(jié)構(gòu)和信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)來完成的?？缟掀ば∨蒉D(zhuǎn)運(yùn)是內(nèi)吞物質(zhì)的主要途徑，這使得M細(xì)胞在上皮細(xì)胞中獨具特色。研究表明在M細(xì)胞頂部表面形成的內(nèi)吞小泡首先將其內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到頂部細(xì)胞漿中的內(nèi)涵體，內(nèi)涵體酸化其內(nèi)含物且包含有蛋白酶。
B細(xì)胞是M細(xì)胞口袋中的主要成分之一，口袋中的B細(xì)胞表達(dá)IgM而不表達(dá)IgG或IgA，提示存在記憶B細(xì)胞或/和原始B細(xì)胞在此發(fā)生分化。記憶表現(xiàn)型的存在提示口袋中的細(xì)胞自身就已經(jīng)為重新暴露于入侵抗原做好了準(zhǔn)備；研究表明轉(zhuǎn)移到M細(xì)胞口袋中去的B淋巴母細(xì)胞可以反復(fù)暴露于抗原，延伸擴(kuò)展免疫反應(yīng)并且使之多樣化。但是緊鄰在FAE下面中，也會存在大量的其它B淋巴母細(xì)胞、輔助T細(xì)胞以及抗原提呈細(xì)胞，這就足以觸發(fā)免疫反應(yīng)的發(fā)生。
穿越M細(xì)胞的腔內(nèi)抗原被直接轉(zhuǎn)運(yùn)到抗原處理細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞，緊接著遷移到定位于黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)中的潛在淋巴濾泡中抗原特異性淋巴細(xì)胞，MALT誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)一步增殖分化；因而，抗原與微生物通過M細(xì)胞的過程是黏膜免疫反應(yīng)發(fā)生過程中至關(guān)重要的一步。該過程引起產(chǎn)生IgA的B細(xì)胞增殖分化，其中部分IgA-形成B細(xì)胞運(yùn)動到脈管系統(tǒng)然后返回到黏膜表面，有效地激發(fā)了特異性的黏膜免疫反應(yīng)。
黏膜免疫系統(tǒng)是由功能專一化的局部誘導(dǎo)位點(系統(tǒng)的黏膜相關(guān)淋巴組織，或O-MALT)和分布廣泛的效應(yīng)位點(彌漫性黏膜相關(guān)淋巴組織，或D-MALT)組成的，上皮屏障隔把它們均同黏膜表面抗原隔開。誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)的第一步就是將抗原轉(zhuǎn)運(yùn)通過上皮屏障。在誘導(dǎo)位點中處理和提呈抗原之后，定向IgA的抗原特異性B淋巴母細(xì)胞局部增殖分化并通過血流遷移到局部和遠(yuǎn)處的黏膜及分泌腺組織；它們在這里主要分化成產(chǎn)生IgA聚合體的漿細(xì)胞，漿細(xì)胞是D-MALT的重要組分，并且通過受體介導(dǎo)的跨細(xì)胞作用轉(zhuǎn)運(yùn)通過上皮細(xì)胞進(jìn)入腺體與黏膜分泌物中去 所以，黏膜免疫反應(yīng)構(gòu)成了機(jī)體防御經(jīng)黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)的病原體(如流行性感冒病毒)的第一道防線，并且對長期保護(hù)作用也是非常重要的。機(jī)體對抗病原體的黏膜防御包括兩類先天屏障，即黏液、上皮組織以及先天性免疫機(jī)制之類的先天性屏障，以及適應(yīng)性宿主免疫反應(yīng)，后者在黏膜表面主要是由CD4+T細(xì)胞、分泌性免疫球蛋白A(S-IgA)以及抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)組成。在健康的環(huán)境中，M細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)以及由此引起的抗菌性S-IgA的分泌，都限制了黏膜疾病的強(qiáng)度與持續(xù)時間，并能防止再感染。
通過將改良微生物導(dǎo)航至腸道襯層，就使得來自真核質(zhì)粒的抗原性蛋白質(zhì)表達(dá)并被提呈給M-口袋內(nèi)的免疫細(xì)胞。任何治療性蛋白質(zhì)，如胰島素、生長激素、干擾素等，都可以以相似的方式被表達(dá)并通過M-口袋分泌進(jìn)入淋巴組織，進(jìn)而進(jìn)入血液循環(huán)。盡管M-細(xì)胞是首選的靶向細(xì)胞，但是質(zhì)粒DNA也可以被轉(zhuǎn)導(dǎo)至腸道內(nèi)的其它細(xì)胞，例如K-細(xì)胞和其它的快速分裂細(xì)胞。事實上，人們已經(jīng)證實因子VIII和因子IX的表達(dá)，例如在快速分離的上皮細(xì)胞內(nèi)首先在基側(cè)部方向(例如，遠(yuǎn)離內(nèi)腔并朝向底層的毛細(xì)血管和淋巴腺)分泌因子VIII和因子IX。因此人們可以預(yù)測，在M-細(xì)胞、K-細(xì)胞和其它腸道細(xì)胞內(nèi)的分泌性治療蛋白質(zhì)的表達(dá)會引起這些蛋白質(zhì)出現(xiàn)在血流和循環(huán)中。見Lozier JN，“作為血友病基因治療靶子的腸道上皮細(xì)胞”Hum Gene Ther(1997)Aug 10；8(12)1481-90。為了進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)向基側(cè)部分泌的靶向作用，可以使用靶向信號序列，例如，來自皰疹性口炎病毒糖類蛋白G的基側(cè)部特異性11氨基酸信號序列。Thomas與Roth，“來自皰疹性口炎病毒的糖類蛋白G細(xì)胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)的基側(cè)部靶向信號一級結(jié)構(gòu)序列與細(xì)胞內(nèi)多種靶向主體相似，但有不同的靶向活性”J.Biol.Chem.，Vol.269，No.22，15732-15739(1994). 另一方面，某些蛋白質(zhì)(例如，尼生素)被優(yōu)先分泌到管腔內(nèi)，這在自然情況下僅僅發(fā)生在乳酸桿菌表達(dá)的細(xì)菌素；這種情況下可以應(yīng)用頂部表面特異性的信號序列。例如，來自Thy-1的glycosylphosphatidylinositol(GPI)附加序列可以與興趣蛋白質(zhì)融合，以將特定的蛋白質(zhì)導(dǎo)航至腸道黏膜細(xì)胞頂層。例如，已經(jīng)證實GPI附加序列可以在培養(yǎng)物中引起極化腸道Caca-2細(xì)胞內(nèi)所表達(dá)的蛋白質(zhì)向頂部方向的轉(zhuǎn)運(yùn)高于基側(cè)部方向轉(zhuǎn)運(yùn)2.5倍。見Soole K.等，“極化的腎臟MDCK細(xì)胞和腸道Caco-2細(xì)胞內(nèi)所表達(dá)的glycosylphosphatidylinositol錨定細(xì)菌蛋白的上皮分類”Journal of Cell Science，108，369-377(1995)，通過參考文獻(xiàn)而使之在此呈為一體。
M-細(xì)胞的靶向作用可以用多種方法來完成，包括使用與M-細(xì)胞表面復(fù)合物結(jié)合的復(fù)合物。這樣的復(fù)合物包括多肽(例如，M-細(xì)胞受體或表面抗原)、碳水化合物和glycoconjugates。M-細(xì)胞靶向作用可能包含與M-細(xì)胞特異結(jié)合的復(fù)合物，以及特異地結(jié)合到與M-細(xì)胞相關(guān)的組織細(xì)胞的復(fù)合物，例如腸道黏膜的上皮細(xì)胞。
與M-細(xì)胞結(jié)合的復(fù)合物的一個實例是由打靶M-細(xì)胞的細(xì)菌和病毒所產(chǎn)生的黏附素，例如耶爾森氏菌種和沙門氏菌typhi種。(Clark M.A.等，“M-細(xì)胞表面β1 integrin的表達(dá)及侵襲素介導(dǎo)的耶爾森氏菌假結(jié)核向鼠Peyer’s斑內(nèi)M-細(xì)胞的靶向作用”Infect Immun.661237-43(1998)；Baumler A.等，“l(fā)pf fimbrial操縱子介導(dǎo)的Samonella typhirium與鼠Peyer’s斑的黏附作用”Proc.Natl.Acad.Sci.USA93279-83(1996).這樣的細(xì)菌性與病毒性黏附素是介導(dǎo)M-細(xì)胞結(jié)合的蛋白質(zhì)。呼腸孤病毒的δ-1蛋白也已經(jīng)被用來打靶M-細(xì)胞。Wu Y.等，“M-細(xì)胞靶向的DNA疫苗”Proc.Natl Acad.Sci.USA 98(16)9318-23(2001)。
特異性地結(jié)合到M細(xì)胞的另一種復(fù)合物是植物血凝素。攜帶脂質(zhì)體到M細(xì)胞的植物血凝素的M細(xì)胞靶向作用，可以使用各種類型的植物血凝素，在U.S.Patent No.6,060,082中均作了說明，在這里通過參考文獻(xiàn)而使之呈為一體。
特異性結(jié)合到M細(xì)胞表面蛋白質(zhì)如受體或表面抗原的抗體，也可以被用來打靶M細(xì)胞?？梢杂枚喾N已經(jīng)為業(yè)內(nèi)人士所熟知的方法生產(chǎn)針對這樣的表面蛋白的抗體，使用完整的興趣蛋白質(zhì)(蛋白前體或加工后的蛋白質(zhì))或蛋白質(zhì)的一部分。此外，也可以應(yīng)用靶向M-細(xì)胞的呼腸孤病毒δ蛋白。Wu Y.等，“M-細(xì)胞靶向的DNA疫苗”Proc.Natl Acad.Sci.USA98(16)9318-23(2001)。
上面所說的M細(xì)胞靶向復(fù)合物可以被整合進(jìn)入改良微生物的細(xì)胞壁中；這可以通過把M細(xì)胞靶向復(fù)合物添加到正在重建細(xì)胞壁的原生質(zhì)體來實現(xiàn)。首先是，將M細(xì)胞靶向復(fù)合物與被設(shè)計作為細(xì)胞膜錨定點的脂質(zhì)結(jié)合。這樣的功能化脂質(zhì)可以從Avanti Polar Lipids，Inc.(Alabaster，AL)購買得到。
另一種方法，質(zhì)粒可以編碼一種M細(xì)胞靶向多肽。一個實施方案是，包含要表達(dá)的抗原或治療性蛋白質(zhì)編碼序列的質(zhì)粒也含有M細(xì)胞靶向多肽的序列；此時，M細(xì)胞靶向多肽序列可以被附加到抗原序列上去。也可選擇的方法是，M細(xì)胞靶向多肽序列可以由DNA片段來編碼，此DNA片段是經(jīng)過同源重組產(chǎn)生并且被整合到微生物的基因組中，這與上面所述的把自溶解基因整合到染色組中的方法相似。
下面的實例是說明根據(jù)本發(fā)明開展工作所要用到的方法和制劑。這些實例僅僅是為了說明問題，而不要認(rèn)為是限制本發(fā)明的適用范疇。雖然這些實例可能是用最為首選的嗜酸乳酸桿菌種來說明的，但是根據(jù)本發(fā)明的規(guī)范，其它的乳酸桿菌種、LAB與大腸桿菌也是適用的。
在這次公開的資料中提到但沒進(jìn)行詳細(xì)說明的有關(guān)微生物學(xué)、分子生物學(xué)以及細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，均已經(jīng)在科學(xué)文獻(xiàn)中有了詳細(xì)的報道。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員力所能及的。
實施例一 嗜酸乳酸桿菌原生質(zhì)體的形成 乳酸桿菌細(xì)胞在MRS肉湯(Difco)、37℃環(huán)境中培養(yǎng)3小時至過夜。然后將細(xì)胞在2000xg條件下離心30分鐘，用含有溶菌酶(20μg/ml)的高滲溶液(0.01MTris氫氯化物[pH 7.5]，0.3-0.5M甘露醇)沖洗細(xì)胞并使之重新懸浮，室溫環(huán)境中孵育5-15分鐘。在適當(dāng)?shù)脑偕橘|(zhì)或者是與合適的載體(如，酸奶酪)混合，或者是配有蔗糖與適當(dāng)緩沖劑的高滲溶液中，所形成的原生質(zhì)體逐漸覆蓋于平皿上。必須將原生質(zhì)體維持在含有蔗糖而不含甘露醇的高滲溶液中，直至再生出細(xì)胞壁，以防止?jié)B透壓所引起的自溶解。
實施例二 具有可誘導(dǎo)自溶基因的乳酸桿菌種的產(chǎn)生 含有自溶解基因的表達(dá)盒可能與乳糖啟動子關(guān)聯(lián)運(yùn)作；自溶解基因的例子就象上面所公開的那樣，包括AcmA、holin或細(xì)胞溶解酶；乳糖啟動子的例子有細(xì)菌Plac啟動子或pH依賴啟動子。關(guān)于Plac啟動子，例如，它可以通過在源自Stratagene克隆系統(tǒng)的pBluescript內(nèi)克隆自溶解基因而獲得。
來自乳酸桿菌染色體DNA的靶DNA序列，例如，可以通過產(chǎn)生源自乳酸桿菌生物體的基因文庫而獲得。可以通過適當(dāng)?shù)南拗泼覆⑶也迦胍欢〝?shù)量的源自乳酸桿菌文庫的基因克隆，使攜帶有自溶解基因表達(dá)盒的pBluescript線性化。最好選擇所要使用的克隆包含有參與某些營養(yǎng)物質(zhì)或氨基酸(如，色氨酸、酪氨酸等)代謝途徑的一些生化酶，并且pBluescript的插入破壞特定代謝途徑中的特定的生化酶。
這樣就可以利用上面所討論的轉(zhuǎn)化規(guī)程中的任一方案，使所產(chǎn)生的改良染色體DNA克隆返過來轉(zhuǎn)化進(jìn)入乳酸桿菌。當(dāng)這一改良染色體DNA克隆存在于細(xì)胞時，它可以與內(nèi)源性染色體DNA發(fā)生同源重組，結(jié)果使自溶解基因整合進(jìn)入乳酸桿菌基因組?？梢酝ㄟ^pBluescript質(zhì)粒所賦予的抗生素抗性，或者伴有在某些營養(yǎng)成分中細(xì)胞生長能力的缺失來選擇突變種，細(xì)胞生長能力的缺失是由于這些營養(yǎng)成分的代謝途徑已經(jīng)被打亂而中斷。我們應(yīng)該注意到，突變?nèi)樗釛U菌具有能夠驅(qū)動自溶解基因表達(dá)的Plac啟動子，應(yīng)該在無乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)與繁殖這種突變異體。這種突變?nèi)樗釛U菌可以被很容易地培養(yǎng)在含有葡萄糖的介質(zhì)中。
除了自溶解基因之外，可以將任何數(shù)量的基因引進(jìn)并且整合到乳酸桿菌基因組，以產(chǎn)生特定目的的突變體。
實施例三 攜帶GFP表達(dá)盒細(xì)菌的M-細(xì)胞靶向作用體外模型 最初為了檢測重組體LAB打靶M-細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒DNA的能力，可以使用擁有不同分化M-細(xì)胞的腸道細(xì)胞體外模型，正如Kerneis S.等人說明的那樣“人類腸道Peyer’s斑淋巴細(xì)胞向轉(zhuǎn)輸細(xì)菌的M-細(xì)胞的轉(zhuǎn)化”Science，277(5328)949(1997)，在此通過參考文獻(xiàn)而使其呈為一體。簡要的說，通過Peyer’s斑淋巴細(xì)胞與不同分化的人類腸道細(xì)胞系Caco-2.3x 105 Caco-2細(xì)胞共同培養(yǎng)而建立的濾泡相關(guān)上皮(FAE)和M-細(xì)胞，最初可以在6.5mm過濾器(3 micrometer pore Transwellfilters，COSTAR，Cambridge，MA)的較低面過夜培養(yǎng)。然后將過濾器轉(zhuǎn)移至Transwell裝置，使上皮細(xì)胞朝向孔板的較低室。上皮細(xì)胞就可以被培養(yǎng)至其完全分化(14天)。可以從PPs of BALB/c小鼠分離淋巴細(xì)胞，通過FACS對淋巴細(xì)胞進(jìn)行分離與分類，所使用的抗體是針對鼠B220(CD45)的單克隆抗體和針對鼠CD3T細(xì)胞的單克隆抗體。分離之后，將淋巴細(xì)胞(106)加至朝向Caco-2細(xì)胞基側(cè)部一邊的上層室。培養(yǎng)兩天以后，淋巴細(xì)胞最有可能已經(jīng)積聚在上皮內(nèi)口袋內(nèi)，該上皮內(nèi)口袋與在體內(nèi)觀察到的M-細(xì)胞口袋相似；Caco-2細(xì)胞最有可能已經(jīng)被轉(zhuǎn)化成具有M-細(xì)胞表現(xiàn)型的細(xì)胞。因此，可以應(yīng)用這一體外模型進(jìn)行實驗，評價將重組體LAB導(dǎo)航至M-細(xì)胞的條件。
應(yīng)用這一體外模型，把按照范例I所準(zhǔn)備的原生質(zhì)體培養(yǎng)物，或者是把如上所述的具有靶向復(fù)合物的重組體LAB與M-細(xì)胞一起在體外孵育。原生質(zhì)體或重組體LAB就可以攜帶具備CMV啟動子的質(zhì)粒，該啟動子與GFP聯(lián)合運(yùn)作?？梢允褂脽晒怙@微鏡監(jiān)測M-細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)。
還可選用的另一種方法就是利用分泌性堿性磷酸酯酶作為報告基因，例如，可以從市場購買得到的Clontech Laboratories(Palo Alto，CA)生產(chǎn)的pSEAP2-Basic載體?？梢岳弥圃焐烫峁┑姆椒ㄒ?guī)程，從培養(yǎng)基中化驗分析分泌性堿性磷酸酯酶。而且，可以通過修飾pSEAP2載體，使得靶信號肽序列既可用于堿性磷酸酯酶的頂部靶向，也可用于堿性磷酸酯酶的基側(cè)部靶向。這樣就可以依據(jù)靶分泌是頂部方向還是10基側(cè)部方向，在Transwell的上層室或下層室中分析堿性磷酸酯酶的活性。
可以理解的是，特定的實驗并未被限制于應(yīng)用報告基因，也可以使用其它任何興趣蛋白質(zhì)的ELISA方法或免疫組織化學(xué)的方法來確定DNA是否引入M-細(xì)胞。
然而在另一個例子中，提高數(shù)量的具有GFP基因的質(zhì)粒DNA也可以與體外M-細(xì)胞模型共同孵育，分析M-細(xì)胞對裸露質(zhì)粒DNA的攝取情況。此外，重組體LAB或原生質(zhì)體的溶解產(chǎn)物也可以與體外模型共同孵育，分析使用GFP的質(zhì)粒DNA的攝取情況。
實施例四 分泌性堿性磷酸酯酶的體外分析 根據(jù)關(guān)于M-細(xì)胞攝取DNA所需要的細(xì)菌、原生質(zhì)體或DNA的濃度數(shù)據(jù)，就可以象所說明的那樣精確地計算出所需原生質(zhì)體或重組體LAB的適當(dāng)濃度，然后將它們通過口服攝取的方式給予動物或人類。如果要使用分泌性堿性磷酸酯酶，則需要采集動物或人類的血清，應(yīng)用Clontech’s Great EscAPETM SEAPChemiluminescence Detection試劑盒(Cat.#K2041-1)及其操作規(guī)程分析動物或人類血清的SEAP活性，通過參考文獻(xiàn)將該試劑盒的資料在這里呈為一體。Clontech’spSEAP-2載體所表達(dá)的SEAP酶是熱穩(wěn)定的。這樣，要確定與內(nèi)源性堿性磷酸酯酶活性相反的SEAP活性水平，就要求在加入化學(xué)發(fā)光酶底物之前通過將標(biāo)本在65℃加熱30分鐘而滅活內(nèi)源性堿性磷酸酯酶。
可使用的另一種方法是，如果預(yù)期蛋白質(zhì)是胰島素，則可以將具有適當(dāng)胰島素表達(dá)盒的重組體LAB給予適當(dāng)?shù)奶悄虿游锬Ｐ突蚪o予糖尿病患者。這樣就可以依據(jù)動物或人類血流中的葡萄糖與胰島素水平來監(jiān)測治療效果，而檢測血流中葡萄糖和胰島素水平的方法已為業(yè)內(nèi)人士所熟知。
如果預(yù)期的蛋白質(zhì)是一種抗原，則可以采集動物或人類的血清樣本，分析與被引入的抗原發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的抗體。
實施例五 高拷貝質(zhì)粒 為了提高質(zhì)粒DNA實際上進(jìn)入上皮襯層中細(xì)胞的機(jī)會，首選的方法應(yīng)該是使用高拷貝的質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化細(xì)菌。高拷貝質(zhì)粒的例子包括具有突變復(fù)制原點的質(zhì)粒，例如pUC 18載體，其阻遏物與復(fù)制原點的結(jié)合更松弛?？梢栽贚AB質(zhì)粒載體的復(fù)制原點上制造相似的突變異，以提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)量?？梢詰?yīng)用已為人們所熟知的PCR反應(yīng)技術(shù)產(chǎn)生的隨機(jī)突變來引起這種突變異?？梢栽O(shè)計側(cè)翼包圍復(fù)制原點的引物，然后使用象Taq聚合酶這樣的非校對性聚合酶，最好在含錳緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，而不用鎂緩沖液。這樣，變異的PCR片段就可以取代原來的復(fù)制原點，并且被轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌。然后可以應(yīng)用高選擇性壓力(例如，培養(yǎng)介質(zhì)中的高抗生素)來選擇高拷貝的LAB質(zhì)粒。
可以選擇的另一種方法是使用“逃跑”質(zhì)粒，提高高拷貝質(zhì)粒的數(shù)量。“逃跑”質(zhì)粒是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)與開發(fā)生產(chǎn)的一類最通用質(zhì)粒中的一部分。它們是以IncFII質(zhì)粒RI為基礎(chǔ)，其中有一個反義RNA(CopA RNA)序列消極地控制著速率限制復(fù)制的蛋白質(zhì)的形成。質(zhì)粒的拷貝數(shù)量是由CopA RNA形成速率與RepAmRNA形成速率之間的平衡來決定的；后者形成速率略有提高就會極大地消減CopA RNA的形成速率，這是由于會聚性轉(zhuǎn)錄所致，會聚性轉(zhuǎn)錄引起(逃跑復(fù)制)拷貝數(shù)量控制的全部喪失，結(jié)果引起大量的DNA擴(kuò)增，質(zhì)粒的拷貝數(shù)量可以達(dá)到每個基因組中存在1000拷貝。因為這一擴(kuò)增發(fā)生在蛋白質(zhì)合成時，所以由所克隆基因編碼的蛋白質(zhì)也能夠被擴(kuò)增，并且可占總蛋白量的10-50％。見Nordstrom K與Uhlin BE的“逃跑復(fù)制質(zhì)粒細(xì)菌體內(nèi)產(chǎn)生大量克隆基因所編碼蛋白質(zhì)的工具”Biotechnology(NY)1992 Jun；10(6)661-6。
目前可以獲得的“逃跑”質(zhì)粒，可以被修飾以載有適合于哺乳動物表達(dá)的表達(dá)盒。根據(jù)上面所介紹的方法，就可以利用非致病性大腸桿菌細(xì)胞、并將細(xì)胞溶解，把改良的“逃跑”質(zhì)粒傳輸?shù)轿改c道中來。也可以為DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)中所使用的乳酸桿菌和乳酸球菌設(shè)計開發(fā)“逃跑”質(zhì)粒。
實施例六 改良乳酸球菌生物體的生產(chǎn)細(xì)菌的選擇和質(zhì)粒DNA的克隆 可以通過乳酸球菌與包含重組體質(zhì)粒的第二細(xì)菌融合，形成改良的乳酸球菌生物體。在本實例中，lactis乳酸球菌(ATCC#7962)與大腸桿菌HB101(ATCC#33694)發(fā)生融合。
大腸桿菌HB101含有一個編碼GFPuv的重組體質(zhì)粒pSYG3，GFPuv是為細(xì)菌表達(dá)而經(jīng)過最優(yōu)化設(shè)計的一種GFP突變異體(Crameri A.等，“經(jīng)DNAshuffling(洗牌)法分子演變改良綠色熒光蛋白”Nat.Biotechnol.14315-19(1996))。GFPuv已經(jīng)被最優(yōu)化設(shè)計，它在受到UV光線(360-400nm)激發(fā)時產(chǎn)生最大的熒光性；并且可以利用如下引物從pBAD-GFPuv(Clontech，Palo Alto，CA)對其進(jìn)行擴(kuò)增CAT GCA TGC CAT GGC TAG CAA AGG AGA AGA AC以及CCG GGT ACCGAG CTC GAA TTC(SEQ.ID.NO 1)(Geoffroy M.等人，“識別正在開發(fā)的活疫苗載體乳酸菌種的綠色熒光蛋白的應(yīng)用”(應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)66(1)383-91(2000)). 由pUC19構(gòu)建PSYG3，PSYG3含有源自pBR322的復(fù)制原點、卡那霉素抗性基因和一個同編碼GFPuv核酸序列聯(lián)合運(yùn)作的T7啟動子序列，其中GFPuv與表面結(jié)合啟動子區(qū)域融合。表面結(jié)合啟動子區(qū)域可以是來自乳酸球菌Usp45蛋白前體的信號肽的編碼序列，與源自鏈球菌生膿原的M6蛋白前體的細(xì)胞壁錨定點區(qū)域的序列，同時還有必需的轉(zhuǎn)錄終止子，其中細(xì)胞壁錨定點區(qū)域。信號肽序列是從GFPuv序列起始向上游方向延伸，而細(xì)胞壁錨定點區(qū)域是從GFPuv序列開始向下游方向延伸。詳細(xì)資料請參閱Deite Y.等人，“乳酸菌蛋白靶向系統(tǒng)的設(shè)計”Journal of Bacteriology183(14)4157-66(2001)。質(zhì)粒的克隆、用質(zhì)粒對大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化、以及選擇包含質(zhì)粒的克隆等都可以用掌握本領(lǐng)域普通技術(shù)的人員所熟知的程序來完成，具體程序參見以下文獻(xiàn)Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》，第三版(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York)(2001)以及Ausubel等人的，《分子生物學(xué)通用規(guī)程》(Wiley，New York)(2001)。
質(zhì)粒也可以包含其它的DNA序列，例如與表面結(jié)合啟動子區(qū)域及T7啟動子聯(lián)合發(fā)生作用的呼腸孤病毒的σ1蛋白的編碼序列，正如以上所說明的那樣。這類蛋白的表達(dá)可以完成M-靶向作用。
埃希氏大腸桿菌與乳酸球菌原生質(zhì)體的形成 兩細(xì)菌種的原生質(zhì)體都可以通過下列方法形成。lactis乳酸球菌要在MRS培養(yǎng)基(Difco)、26℃環(huán)境中生長到指數(shù)生長期，而擁有pSYG3的大腸桿菌HB 101要在LB培養(yǎng)基、37℃環(huán)境中培養(yǎng)到指數(shù)生長期之后。然后將氯霉素加到大腸桿菌培養(yǎng)物中，選擇性地增殖pSYG3 16小時。將培養(yǎng)物在2000xg離心30分鐘，用含有溶菌酶(20ug/ml)的高滲溶液(0.01 M Tris氫氯化物[pH 7.5]，0.3-0.5M甘露醇)沖洗所產(chǎn)生的細(xì)胞顆粒，并且用該溶液使之重新懸浮起來，在室溫條件下孵育5-15分鐘。把所產(chǎn)生的部分原生質(zhì)體用適當(dāng)?shù)脑偕囵B(yǎng)基(MRS或LB)輕輕地覆蓋在平皿上，觀測到菌落形成確保原生質(zhì)體能夠再生形成細(xì)胞壁。原生質(zhì)體必須保持在含有蔗糖而不含甘露醇的高滲溶液中，直到它們再生了細(xì)胞壁以防止?jié)B透壓引起的細(xì)菌細(xì)胞溶解。
大腸桿菌與lactis乳酸球菌原生質(zhì)體的融合 要融合原生質(zhì)體，把保持在上述高滲溶液中的大腸桿菌原生質(zhì)體1×109-10×1010添加到0.5-1ml保養(yǎng)在同一高滲溶液的L.lactis原生質(zhì)體1×109-10×109中。向混合物中加入0.5ml-1.5ml的20％-70％PVA或PEG，輕輕搖動溶液使之充分混勻。混合物在室溫條件下孵育1-30分鐘，用相差顯微鏡監(jiān)測原生質(zhì)體的聚集與融合。當(dāng)細(xì)胞生長到達(dá)指數(shù)生長期時，用上述高滲溶液將原生質(zhì)體沖洗3次，并且用3-7ml此溶液稀釋。取少量所形成的溶液(0.5-2ml)覆蓋在含有卡那霉素的MRS瓊脂上，26C孵育。
MRS瓊脂適用于L.lactis和改良L.lactis在基本培養(yǎng)基上復(fù)制，和/或用對抗LAB的抗血清進(jìn)行ELISA試驗。LAB的種鑒定也可在西紅柿瓊脂平皿上進(jìn)行，用卡那霉素選擇包含pSYG3的細(xì)菌。這樣所產(chǎn)生的微生物菌落就是擁有pSYG3的改良嗜酸乳酸菌的融合體。還可選用的方法是，由于GFP也是一種報告基因，可以根據(jù)紫外線照射下的綠色熒光來選擇含有pSYG3菌落。
實施例七 改良乳酸球菌生物體的表現(xiàn)型特征鑒定 需要進(jìn)行各種試驗才能證實是否已經(jīng)產(chǎn)生了預(yù)期的改良乳酸桿菌生物體。單個的菌落必須是1)取自上述選擇性培養(yǎng)平皿；2)在MRS肉湯中培養(yǎng)；3)移植于含有卡那霉素的MRS瓊脂上。步驟1-3要重復(fù)5次，以獲得純化的群體。
確定改良乳酸桿菌生物體生理特性的試驗，要根據(jù)API ZYM和API 20A生化試驗系統(tǒng)中的操作程序來進(jìn)行。雙親細(xì)菌的特性已經(jīng)由Holt等人在《Bergey’s細(xì)菌鑒定手冊》第九版(Williams & Wilkins，Baltimore，MD)(1994)中提出，它是對所要說明和培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行鑒定的綜合性指導(dǎo)手冊。
根據(jù)上述選擇性要求，改良的乳酸球菌生物體應(yīng)該具備與乳酸球菌種相應(yīng)的表現(xiàn)型。因而改良細(xì)菌細(xì)胞應(yīng)該是球形、革蘭氏染色陽性，在液體培養(yǎng)基中細(xì)胞成對或以短鏈的形式出現(xiàn)，需要合成培養(yǎng)基才能生長，代謝應(yīng)是發(fā)酵性、且產(chǎn)生L(+)-乳酸、而不產(chǎn)生氣體，而且細(xì)菌應(yīng)是過氧化氫酶陰性、氧化酶陰性的。
改良的乳酸球菌生物體不應(yīng)該具有與埃希氏菌種相應(yīng)的表現(xiàn)型。上面對乳酸桿菌進(jìn)行的某些試驗也說明改良的乳酸桿菌生物體不是埃希氏菌，因為埃希氏菌細(xì)胞還原硝酸鹽、革蘭氏染色陰性、過氧化氫酶陽性。
實施例八 改良乳酸球菌生物體的基因型特征鑒定 應(yīng)用斑點印跡技術(shù)來確定改良的乳酸球菌生物體是否具有預(yù)期的基因型。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序提取染色體DNA，見Saito與Miura。按照Sambrook《分子克隆實驗室手冊》中說明的方法準(zhǔn)備質(zhì)粒DNA、進(jìn)行Southern雜交。
將源自雙親細(xì)菌的染色體DNA和質(zhì)粒DNA用作探針。如果用大腸桿菌染色體DNA來探測lactis乳酸球菌的染色體DNA或者以L.lactis染色體DNA為探針探測大腸桿菌染色體DNA，則會看到很低的同源性。相反，L.lactis和大腸桿菌的染色體DNA探針與改良乳酸球菌染色體DNA共享50％或更大的同源性，因為融合體應(yīng)該含有來自雙親細(xì)菌的染色體DNA。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也應(yīng)該意識到這種情況的重要性如果雙親細(xì)菌更為緊密的相關(guān)，因此它們具有高度同源的染色體DNA，正如本發(fā)明的某些實施方案中可能發(fā)生的情況那樣；發(fā)生在雙親細(xì)菌染色體DNA間的雜交程度與發(fā)生在親代與融合體染色體DNA間的雜交程度之間的差異就比本范例中所述的變化小許多。在這種情況下，我們更可以依靠Southern雜交鑒定質(zhì)粒DNA，從而來說明融合體基因型的特征。
實施例九 確定抗原在改良乳酸球菌生物體Ex Vivo表達(dá)的實驗分析GFP熒光的探測 根據(jù)已知的程序，可以用幾種不同的方法來檢測GFP熒光在改良乳酸球菌生物體內(nèi)的表達(dá)。如上文所述，可以在UV照射下給改良乳酸球菌生物體的培養(yǎng)平皿進(jìn)行照相，從而鑒別表達(dá)GFP的菌落。此外，可以利用表面熒光顯微鏡來觀察懸浮于PBS中的改良乳酸球菌細(xì)胞內(nèi)的GFP產(chǎn)物，可以使用合適的膠片拍攝觀察結(jié)果。最后，還可以通過制備改良乳酸球菌細(xì)胞的溶解產(chǎn)物、并使用熒光計分析其熒光性，來檢測GFP的表達(dá)。
對總蛋白抽提物和細(xì)胞碎片進(jìn)行Western斑點印跡分析定位GFP的表達(dá) 對總蛋白抽提物和細(xì)胞的各種碎片進(jìn)行Western斑點印跡分析，來檢測GFPuv的表達(dá)，表明GFP正被導(dǎo)航至細(xì)胞膜。根據(jù)人們早已熟知的程序準(zhǔn)備總蛋白抽提物，這些程序在多種文獻(xiàn)中提出，如Ausubel等人的《通用分子生物學(xué)規(guī)程》。細(xì)胞碎片的準(zhǔn)備要根據(jù)Piard，J.-C.等人在.“各種乳酸菌錨定鏈球菌生膿原M6蛋白的細(xì)胞壁”中提出的方法進(jìn)行。簡要地說就是，將2nil指數(shù)期培養(yǎng)物在4C、4,300g條件下微量離心5分鐘。所產(chǎn)生的細(xì)胞顆粒與上層清液被分離開來且被濃縮。用三氯乙酸(TCA)把上清液中的蛋白質(zhì)沉淀下來。將細(xì)胞顆粒重新懸浮在TES中，用溶菌酶處理，把所產(chǎn)生的原生質(zhì)體低速離心沉淀。上清液中就包含著由細(xì)胞壁釋放的、并且可以被TCA沉淀的蛋白質(zhì)。那么，我們就可以應(yīng)用Dieye Y.等人在“乳酸菌靶向蛋白系統(tǒng)的設(shè)計”Journal of Bacteriology 183(14)4157-66中提出的方法，把蛋白質(zhì)從原生質(zhì)體顆粒中抽提出來。
這樣就可以使用Western斑點印跡方法來分析總蛋白或細(xì)胞碎片樣本用兔抗GFP抗血清(Invitrogen)作為第一抗體，辣根過氧化物酶共價連接的抗兔抗血清(Sigma)作第二抗體，進(jìn)行檢測。以已知量的重組體GFPuv(Clontech)作為對照標(biāo)準(zhǔn)，可以通過掃描標(biāo)準(zhǔn)品泳道與實驗組泳道的信號來評估Western印跡上的GFPuv含量。Sambrook等人在《分子克隆實驗室手冊》中詳細(xì)說明了Western印跡技術(shù)。
實施例十 HBsAg抗原與IL-2基因的轉(zhuǎn)導(dǎo) HBV表面抗原基因Pre-S2和S可以通過PCR技術(shù)從質(zhì)粒pEco63(ATCC31518)擴(kuò)增獲得；鼠IL-2基因片段可以通過PCR技術(shù)從質(zhì)粒pMUT-1(ATCC37553)獲取。把這兩種基因安置在融合一體的Lac-Z啟動子之下或者安置在位于pUC18中獨立的T7啟動子之下。這些基因也可以在穿梭載體中克隆。僅包含pre-S2/S基因的質(zhì)粒被稱作pPS2S，同時包含pre-S2/S和IL-2兩種基因的質(zhì)粒稱為pPS2S/IL2(Chow et al.J Vir.Jan 1997169-178)。這兩種基因也可以被克隆至另一個穿梭載體，形成融合基因或受獨立啟動子調(diào)控。DNA就被轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5和/或HB 101，質(zhì)粒DNA就在大腸桿菌培養(yǎng)物內(nèi)增殖。按照上述方法將指數(shù)生長期的大腸桿菌制成原生質(zhì)體并且與lactis乳酸球菌融合。融合體將選擇性地生長在LAB MRC培養(yǎng)平皿和西紅柿汁平皿和/或合成培養(yǎng)基平皿中(Broach等，Gene，8(1979)121-133.)。通過卡那霉素以及下述的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物分析來選擇表達(dá)質(zhì)粒。
用AUSZYME(Abbott Lab)單克隆抗體試劑盒來分析融合體肉湯培養(yǎng)基或細(xì)胞沉淀中的HBsAg蛋白。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)被Ten-Brock ground bead高速勻漿器所釋放；用Triton X-100處理、釋放膜結(jié)合蛋白質(zhì)。抗原產(chǎn)物應(yīng)該占細(xì)胞總蛋白的3％。應(yīng)用增殖擴(kuò)散分析(Chow等)和使用抗-IL-2抗體的ELISA(Pharmigen)分析法來測定IL-2的活性。
用1-10×109cfu的LAB，最多可使用三劑對BALB/c和C57b1/6鼠進(jìn)行免疫。從第二天開始通過斷尾取血法采集血清。使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的血清學(xué)分析法和/或本說明中介紹的方法來檢測HbsAg抗體。
實施例十一 以pYD1為基礎(chǔ)的質(zhì)粒的構(gòu)建 pYD1是從Invitrogen購買的半乳糖可誘導(dǎo)的表達(dá)載體，它指導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)在酵母細(xì)胞壁上。興趣抗原VP7、HA和NA是利用表1所列出的引物通過PCR擴(kuò)增而得。所得到的PCR產(chǎn)物被克隆到pYD1的BamHI/EcoRI(VP7)或BamHI/XbaI(NA and HA)位點。
實施例十二 pGPD-DSPLY及其衍生物的構(gòu)建 pGPD-DSPLY是許多蛋白質(zhì)在細(xì)胞壁上組成性表達(dá)的靶向載體。表1列出了構(gòu)建pGPD-DSPLY及其衍生物所使用的PCR引物的名稱與序列。pGPD-DSPLY包含一些序列，這些序列編碼酵母-配對因子的引導(dǎo)序列以及釀酒酵母菌α-凝集素的細(xì)胞壁錨定區(qū)域(C-末端350個氨基酸)。首先，編碼由兩個氨基酸(Gly and Ala)間隔緊隨其后的α-引導(dǎo)肽的序列是利用BamLALPHAfwd和EcoLALPHArev作為引物經(jīng)PCR從酵母菌染色體(strain S288C)擴(kuò)增，并且被克隆進(jìn)入p426GPD的BamHI和EcoRI位點(Mumberg等人，1995，不同遺傳背景下異源蛋白質(zhì)控制表達(dá)的酵母載體，Gene 156119-122)，進(jìn)而構(gòu)建pSecY。然后，編碼α-凝集素細(xì)胞壁錨定區(qū)域的序列是利用寡聚核苷酸Agglfwd和Agglrev作為引物經(jīng)過PCR技術(shù)從酵母染色體DNA(strain S288C)擴(kuò)增，并且被克隆進(jìn)入p426GPD的ClaI/XhoI位點，這樣獲得了pGPDAnch。pGPD-DSPLY是通過將含有α-凝集素序列的EcoRI/XhoI片段亞克隆至pSecY同一位點構(gòu)建而成。
抗原NA、VP7(pNADSPLY，pVP7DSPLY)表面展示的載體是經(jīng)過下面的程序而制備的NA和VP7編碼序列是分別利用引物對NAnewfwd/Nanewrev和VP7newfwd/VP7newrev經(jīng)過PCR技術(shù)從這些基因的克隆拷貝擴(kuò)增而得，并且將α-凝集素的上游序列克隆到pGPDAnch的EcoRI/HindIII位點，得到pNAAnch和pVP7Anch。然后，把源自pNAAnch和pVP7Anch的EcoRI/XhoI片段亞克隆進(jìn)入到pSecY的同一位點分別得到pNADSPLY和pVP7DSPLY。為了證實抗原是否正確定位到細(xì)胞壁上了，pGFPDSPLY是基本按照上面所述的方法構(gòu)建的；GFP編碼序列是使用sgGFPfwd和sgGFPrev作為引物從質(zhì)粒pQB125-fPA(Qbiogene)經(jīng)過PCR擴(kuò)增而得。
構(gòu)建HA表面展示載體pHADSPLY，是通過將PCR-擴(kuò)增的HA序列克隆到pGPDDSPLY的EcoRI/HindIII位點來完成的。由于在HA編碼序列中存在EcoRI位點，使用了一個粘性末端PCR策略(Zheng G.，粘性末端PCR亞克隆的新方法.1998，Biotechniques，25206-208)來使克隆更容易進(jìn)行。首先，使用引物對HAfwd1/Hanewrev和HAfwd2/Hanewrev來進(jìn)行兩個獨立的HA擴(kuò)增反應(yīng)。經(jīng)過DpnI(去除背景質(zhì)粒)和HindIII消化處理之后，把相同摩爾的兩種PCR產(chǎn)物混合、加熱變性，并冷卻至室溫，然后克隆到pGPDDSPLY的EcoRI/HindIII位點。
為了便于抗原的免疫學(xué)檢測，將編碼各種抗原決定基片段(His6和HA)的序列克隆至pNADSPLY的EcoRI位點和pVP7DSPLY載體，該載體把抗原決定基片段定位于抗原編碼序列和細(xì)胞壁錨定序列之間。用于這些構(gòu)建工作的寡聚核苷酸都列在表1中。
實施例十三 乳酸桿菌表面展示載體的準(zhǔn)備 表達(dá)目的抗原的基因被克隆至表面展示載體pSC111AE的SfiI/AscI位點。這種構(gòu)建過程的結(jié)果就是，VP7、HA、NA與GFP被從N-末端融合至淀粉酶基因的分泌信號，以及由C-末端融合到prtp蛋白酶的細(xì)胞壁錨定區(qū)域。融合蛋白質(zhì)的表達(dá)是由具有基本活性的Xyl啟動子驅(qū)動的。表1列出了用于各種抗原PCR擴(kuò)增的寡聚核苷酸序列。
表1.構(gòu)建表面展示表達(dá)載體所需要寡聚核苷酸的SEQ ID NO編號

實施例十四 酵母細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的表達(dá) 基于pYD1的表達(dá) 用pYD1或基于pYD1的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的EBY 100酵母在含有2％葡萄糖的YNB-CAA培養(yǎng)基中，于30℃環(huán)境中過夜培養(yǎng)。通過離心、并將細(xì)胞重新懸浮于含有2％半乳糖到OD600值為0.5～1的YNB-CAA培養(yǎng)基中。將細(xì)胞培養(yǎng)在20～25℃的環(huán)境中，按照適當(dāng)?shù)臅r間間隔收集標(biāo)本，通過免疫熒光染色法來檢測細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的表達(dá)。
基于pGPD-DSPLY的表達(dá)用pGDP-DSPLY或其衍生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化的W303-1A細(xì)胞在不含尿嘧啶的合成培養(yǎng)基中，于30℃環(huán)境中培養(yǎng)至對數(shù)中期。收集細(xì)胞，并根據(jù)下述方法分析蛋白質(zhì)的表達(dá)。
實施例十五 檢測展示于酵母細(xì)胞表面的抗原 通過免疫熒光染色法標(biāo)記完整的細(xì)胞，然后在共聚焦顯微鏡下檢測酵母細(xì)胞表面抗原的表達(dá)。酵母菌的培養(yǎng)至指數(shù)生長期后，加入1/10培養(yǎng)基體積的甲醛以固定培養(yǎng)物，搖動培養(yǎng)物繼續(xù)孵育1小時。用PBS把固定的細(xì)胞沖洗3次，并且在室溫(RT)環(huán)境中同抗-GFP單克隆抗體一起孵育1.5小時；用PBS沖洗后，使用與羅丹明共價連接的第二抗體把細(xì)胞在RT環(huán)境中孵育1小時；用PBS沖洗細(xì)胞，，并將標(biāo)本滴于顯微鏡載玻片上，在共焦顯微鏡下觀察細(xì)胞。就如圖1所示的那樣，GFP被表達(dá)在酵母細(xì)胞表面，以GFP-相關(guān)熒光性的細(xì)胞分布方式來顯示。此外，應(yīng)用免疫熒光檢驗法分析表達(dá)表面展示-GFP的酵母細(xì)胞，也探測到了相似的GFP分布方式。
實施例十六 用重組體酵母菌進(jìn)行動物免疫的程序 用在自身細(xì)胞表面表達(dá)VP7、HA或NA的酵母菌經(jīng)口服、鼻內(nèi)或皮下途徑對6周齡的雌性Balb/c鼠進(jìn)行接種；強(qiáng)化接種是每2周進(jìn)行一次。用表達(dá)表面展示抗原的酵母菌，或用包含空載體的酵母菌對鼠進(jìn)行接種。使用了三種不同的接種方法口服、鼻內(nèi)或皮下接種。每一實驗所使用的老鼠的數(shù)量列在表2中。第一次接種之前與此后的每2周采集一次血液標(biāo)本。8周后將鼠處死，收集氣管、肺及腸道的沖洗液。使用ELISA法檢測血液及組織樣本中的抗原特異性的IgG和IgA抗體。
A.準(zhǔn)備疫苗 半乳糖可誘導(dǎo)的表達(dá)(pYD1)，把表達(dá)病毒抗原VP7、HA或NA的酵母細(xì)胞以及包含空載體的酵母細(xì)胞培養(yǎng)在YNB-CAA培養(yǎng)基上，用2％半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)。組成性表達(dá)(pGPD-DSPLY)，酵母細(xì)胞在不含尿嘧啶的合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對數(shù)中期；在對數(shù)中期收集細(xì)胞，用PBS沖洗細(xì)胞、并用PBS將細(xì)胞懸浮達(dá)到5×109/ml的濃度。
B.疫苗接種口服0.1ml(5×108)/只鼠鼻腔內(nèi) 0.02ml(1×108)/只鼠皮下0.1ml(5×108)+0.1ml佐劑/只鼠(第一次皮下接種使用完全福氏佐劑，強(qiáng)化接種使用不完全福氏佐劑)。第一次接種在0周，強(qiáng)化接種分別在2、4、6周進(jìn)行，每次都使用相同數(shù)量的細(xì)胞。
實施例十七 抗體反應(yīng)的測定 從眼眶采集血液標(biāo)本(～0.1ml)，通過離心分離血清，-20℃保存。將肺和腸道從死動物尸體上剝離，用PBS沖洗。把組織沖洗液收集到Eppendorf試管中，進(jìn)行離心，將上清液保存在-20℃。
用ELISA法檢測標(biāo)本，檢測抗原特異性的抗體存在與否。把病毒抗原VP7、HA或NA包被在96孔板上。封閉非特異性結(jié)合位點之后，用PBS稀釋血清、肺或腸道的沖洗液標(biāo)本并加入每一反應(yīng)孔。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體(抗-IgG或抗-IgA)檢測抗原-抗體復(fù)合物。
下面的表3、4、5及表6表示的是來自每一免疫接種方案的原始數(shù)據(jù)。表3表明應(yīng)用pGPD的酵母菌流感疫苗接種鼠的血清抗體滴度(濃度)。表4表明應(yīng)用pGPD的酵母菌輪狀病毒疫苗接種鼠的血清抗體滴度。表5表示的是應(yīng)用pYD1的酵母菌流感疫苗接種鼠的血清抗體滴度(濃度)。表6表示的是應(yīng)用pYD1的酵母菌輪狀病毒疫苗接種鼠的血清抗體滴度(濃度)。
圖2-10是以圖解的形式說明表3-6所表示的數(shù)據(jù)。就如我們所見到的那樣，與質(zhì)粒對照組比較時，本發(fā)明中的每一免疫原性制劑都成功地誘發(fā)了實驗動物體內(nèi)的免疫反應(yīng)。
表2.每一實驗組中的動物數(shù)量

注ApYD1系統(tǒng)；BpGPD-DSPLY系統(tǒng)表3.使用pGPD的酵母流感疫苗接種鼠的血清抗體滴度


SQ皮下表4.使用pGPD的酵母菌輪狀病毒疫苗接種鼠的血清抗體滴度

N/A意思是未能得到酵母菌流感疫苗的血清抗體滴度表5.使用pYD1的酵母菌流感疫苗接種鼠的血清抗體滴度


SQ皮下表6.使用pYD1的酵母菌輪狀病毒疫苗接種鼠的血清抗體滴度

給藥和輸送 可以將本發(fā)明的改良微生物傳輸?shù)侥c道黏膜，以把抗原和異源核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)給危難之中的動物?？梢杂脧V泛的制藥學(xué)上可以接受的賦形劑配制本發(fā)明中的免疫原性制劑和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)制劑。用于治療目的、制藥學(xué)上可以接受的載體已經(jīng)在制藥學(xué)領(lǐng)域為人們所熟知，并可參見相關(guān)文獻(xiàn)，例如，《雷明頓藥物科學(xué)》(A.P.Gennaro編著；Mack，1985)。一套接種方案由如下步驟組成在1～6天內(nèi)進(jìn)行一次或多次的“初始”接種，緊隨其后的12～24天內(nèi)的一次或多次強(qiáng)化接種，以及在30～36天內(nèi)進(jìn)行一次或多次的選擇性強(qiáng)化接種。單獨一次初始接種，再于該時間期限內(nèi)進(jìn)行一次單獨的強(qiáng)化接種，這在一般情況下是足以達(dá)到目的的。
就其本身而言，可以根據(jù)已知的任何一種方式對改良微生物的培養(yǎng)物進(jìn)行配方設(shè)計，例如，用于動物口服接種的活細(xì)菌形式的配方設(shè)計或配制品、用于益生菌接種的配制品，治療胃腸功能紊亂。配制品也可以是這樣一種形式適合于通過攝取、或經(jīng)由管子或?qū)Ч芙臃N到胃或腸道黏膜的形式。依據(jù)本發(fā)明，改良微生物的培養(yǎng)物可以是一種適合于口服接種的形式，它可以是固體、半固體或液體的形式，這包括但不局限于細(xì)菌的溶液和/或懸浮液。配制品也可以是一種腸溶性包被制劑的形式；合適的膠囊封裝用化合物包括但不局限于聚氨基葡萄糖、麥芽糖糊精、脂質(zhì)、寡聚糖與多聚糖；這種封裝也可以提高細(xì)菌培養(yǎng)物的貨架壽命。此外，如果需要的話，本發(fā)明也可以設(shè)計為并被用作栓劑的形式，用于直腸或陰道接種；氣溶膠或吸入劑用于氣管支氣管內(nèi)接種；以及其它類似的形式。這類配方的配制品為精于制藥學(xué)技術(shù)的人們所熟知。對所用劑量和接種方式都可以進(jìn)行調(diào)整以取得最佳功效，并且依賴于精通醫(yī)學(xué)技術(shù)的人們能夠意識到的因素。
改良微生物的培養(yǎng)物也可以被準(zhǔn)備為粉末的形式，如冰凍干粉，它需要在使用之前重新配制，例如用合適的液體溶解；或者是固體或液體配制品的形式，與固體、半固體或液體食物混合后進(jìn)行接種。它們也可以是發(fā)酵配制制品的形式，例如酸奶酪或干酪。正因如此，改良微生物的培養(yǎng)物可以包含一種或多種制藥學(xué)上可以接受的載體/賦形劑，例如水。改良微生物培養(yǎng)物也可以包含一種或多種佐劑，包括適合于口服接種的免疫佐劑，只要它們與細(xì)菌宿主或酵母菌宿主兼容，并且不妨礙它的預(yù)期免疫原特性；例如，可以使用生理性pH的無菌鹽水或磷酸鹽緩沖液。防腐劑、穩(wěn)定劑、染料甚至調(diào)味劑都可以被用于藥物制品中；例如，可以把苯甲酸鈉、山梨酸以及p-羧基苯酸酯作為防腐劑加入；也可以使用抗氧化劑(硬化防止劑)與懸浮劑。
進(jìn)行接種的首選途徑就是口服攝取細(xì)菌培養(yǎng)物。生物學(xué)制劑的配方設(shè)計最好包括改良微生物的發(fā)酵制品與奶制品，例如，以酸奶酪配制品的形式進(jìn)行口服接種，這樣就可以按日常習(xí)慣攝入酸奶酪而接種。因而在另一個實施方案中，本發(fā)明旨在提供一種新穎的藥物制劑，它包括改良微生物和生物學(xué)上可以接受的載體，如酸奶酪，其中改良微生物能夠編碼治療和/或預(yù)防疾病所需要的有效計量的DNA、cDNA、RNA或蛋白質(zhì)。關(guān)于溶菌酶處理的原生質(zhì)體，在口服攝入之前，也可以把原生質(zhì)體培養(yǎng)物與非毒性的、制藥學(xué)上可以接受的載體物質(zhì)(如，酸奶酪)輕輕地混合。
給予特定病人的改良微生物的有效劑量依賴于多種因素，其中部分因素會因病人不同而不同。一位合格的臨床醫(yī)生應(yīng)該能夠確定要給予患者的抗原性或治療性制劑的有效劑量，以產(chǎn)生恰當(dāng)?shù)拿庖呋蛑委煼磻?yīng)。制劑的劑量依賴于治療類型、接種途徑、抗原或治療劑的性質(zhì)以及引起治療效應(yīng)的合適的吸收速率等。利用LD50動物數(shù)據(jù)以及可以得到的經(jīng)由腸道黏膜攝取和/或吸收的其它信息，臨床醫(yī)生可以根據(jù)給藥途徑來確定個體的最大安全劑量；利用平時的經(jīng)驗，合格的臨床醫(yī)生也能夠在常規(guī)的臨床實踐中把特定的治療性制劑的用量最優(yōu)化設(shè)計。
這里所介紹的用于胃腸道內(nèi)細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞溶解的所有方法，都能夠以相似的方式應(yīng)用于大腸桿菌細(xì)菌，該細(xì)菌也是身體細(xì)菌群落的一個自然組成部分。也可以從腸道黏膜選擇或分離大腸桿菌的非致病性菌種。表達(dá)質(zhì)粒和載體及其在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化在此之前已被清楚闡明，因此上面所介紹的修飾改良也可以通過常規(guī)的重組體技術(shù)來實現(xiàn)。
一旦根據(jù)本發(fā)明的規(guī)則正確地合成了微生物制劑，本發(fā)明的微生物制劑可以被用來有效地誘發(fā)免疫反應(yīng)，并且向一個廣泛的動物腸黏膜提供異源核酸，這些動物包括但不局限于靈長類、山羊、牛、馬、鳥、魚、豬、小鼠、大鼠、貓及狗。
除非是特別的指明，所有表示成分的量與特性的數(shù)據(jù)如分子質(zhì)量、反應(yīng)條件以及在規(guī)范與聲明中所使用的這類指標(biāo)都要這樣理解已經(jīng)用術(shù)語“關(guān)于”在所有情況下都作了修正。相應(yīng)地，除非是指向?qū)α⒚?，在下列?guī)范與附加聲明中所用到的數(shù)字參量都是近似值，這些數(shù)值可以根據(jù)本發(fā)明所尋求的預(yù)期特性而變化。最后，且并非試圖將等價物學(xué)說的應(yīng)用限制于本聲明的范疇，對每一數(shù)字參量都應(yīng)該至少依據(jù)所報道的有意義數(shù)字(有效數(shù)據(jù))的數(shù)值、并且運(yùn)用普通的舍入技巧進(jìn)行解析分析。盡管用以闡明本發(fā)明主要范圍的數(shù)字范圍和參數(shù)是近似值，但是在特定的實例中，我們盡可能地提出精確數(shù)據(jù)。然而，任何數(shù)值都不可避免地含有某些誤差，這可能是由它們各自的實驗測定中產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)偏差所引起。
在描述本發(fā)明的上下文中(特別是在下列聲明中的上下文中)所使用的術(shù)語“a”、“an”、“the”以及相似的指代物，除非在這里不同地指明或者同上下文明顯相抵觸，都必須對其進(jìn)行分析以同時含蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)，。在這里復(fù)述數(shù)值范圍，僅僅是為了在個別提及該范圍內(nèi)每一獨立數(shù)值時提供一個速記方法。除非是在這里不同地指明，每一單獨的數(shù)值都與該規(guī)范說明呈為一體，好象是在這里個別地復(fù)述它一樣。這里所說明的所有方法都可以根據(jù)任何合適的順序進(jìn)行，除非是這里不同地指明或者是明顯地與上下文相矛盾。使用這里所提供的任何與所有的例子，或者使用可效仿性語言(例如，“such as”)僅僅是為了更好地闡明本發(fā)明，而不是對發(fā)明的適用范圍加以限制，否則就予以聲明。本說明中的任何語言都不應(yīng)被這樣理解為暗示任何發(fā)明實施必須的非聲明要素。
對這里所公開的可選擇要素或者發(fā)明的具體實施方案進(jìn)行分類，都不應(yīng)被理解為限制。每一組成員可能被單獨地提及與聲明，或者同組內(nèi)其它成員或這里發(fā)現(xiàn)的其它要素一起被聲明提及?？梢灶A(yù)見得到會有這樣一種情況一個組內(nèi)的一個或多個成員可能被包括在內(nèi)，或者是因為合適的時間和/或?qū)＠麢?quán)限問題而被從組中剔除。當(dāng)發(fā)生這樣的包含或剔除時，此時的說明是包括修正后的組別，以執(zhí)行在附加聲明中使用的所有Markush組別的已成文說明。
在這里說明了本發(fā)明的首選實施方案，包括本發(fā)明人所知道的應(yīng)用本發(fā)明的最好模式。當(dāng)然，該領(lǐng)域普通技術(shù)人員會通過閱讀說明書明白對那些優(yōu)選實施方案的變化。本發(fā)明人希望有經(jīng)驗的技術(shù)人員正確處理這樣的變化，并且希望以其它不同的方式運(yùn)用本發(fā)明，而不僅僅使用本申請?zhí)囟ㄕf明的方法。因此，本發(fā)明包括了所有所附的，法律上適用的權(quán)利要求中限定的發(fā)明主題的全部修飾與等同替換。而且，本發(fā)明包括了在所有可能的變異范圍內(nèi)對上面所說明的因素可作的任何結(jié)合，除非是本申請不同地說明或者明顯地與上下文相抵觸。
而且，大量的專利文獻(xiàn)與公開發(fā)表的文獻(xiàn)作為參考貫穿于本說明書的始末。對上述所引用的每一參考文獻(xiàn)與公開發(fā)表的文獻(xiàn)通過參考其全文而使之獨立地成為一體。
作為結(jié)束語，應(yīng)該理解本申請所公開的發(fā)明實施方案是例證本發(fā)明的法則原理；可采用的其它修正也在本發(fā)明的范圍內(nèi)；因而，通過舉例的方式，而不是通過限制的方式，本發(fā)明可根據(jù)這種原則采用替換性說明。因此，本發(fā)明并不僅僅限制在上述顯示說明的內(nèi)容。
序列表<110>圣必健公司<120>將核酸和/或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)至腸黏膜的方法及其制劑<130>21823.11<160>32<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>1ccgggtaccg agctcgaatt c 21<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>2cgggatccgg tggccagaac tatggactta atatac 36<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>3ccggaattct taatttatcc catcaacgac 30<210>4<211>34
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>4cgggatccgg tggtggtgac acaatattat aggc34<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>寡核苷酸<400>6cgggatccgg tggtggtcat tcaattcaaa ctgg34<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>7ccggaattct tacttgtcaa tggtgaa27<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸<400>8ccggatccat gagatttcct tcaattttta c 31<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>9gcgaattcag cacctctttt atccaaagat acc 33<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>10ccatcgatgg ttctgctagc gccaaaagct c 31<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>11cagctcgagt tagaatagca ggtacgac 28<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>12aattcgacac aatatgtata ggctac 26<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>13cgacacaata tgtataggct ac 22<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>14accaagcttg atgcatattc tgcac 25<210>15<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>寡核苷酸
<400>16accaagcttc ttgtcaatgg tgaatgg 27<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>17cggaattcca gaactatgga cttaatatac 30<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>21<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
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<23>寡核苷酸<400>28aaggcgcgcc atttatccca tcaacgac 28<210>29<211>39
<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>寡核苷酸<400>30aaggcgcgcc gatgcatatt ctgcactgc29<210>31<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>31taggcccagc cggccgccca ttcaattcaa actggaagtc40<210>32<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>32aaggcgcgcc cttgtcaatg gtgaatgg 28
權(quán)利要求
1.一種在動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法包括，向?qū)嶒瀯游锾峁┮环N按口服接種配方設(shè)計的免疫原性制劑，其中所述的免疫原性制劑包括具有表達(dá)載體的微生物體，而所述的表達(dá)載體含有編碼抗原的異源核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，其中所述的微生物體是指酵母菌或細(xì)菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，其中所述的抗原選自腫瘤、細(xì)菌、病毒、寄生蟲與真菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，其中所述的病毒選自流行性感冒、肝炎、HIV和輪狀病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的在動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，其中所述的酵母菌選自釀酒酵母菌、S.exiquus、S.telluris、S.dairensis.、S.servazzii、S.unisporus與S.kluyveri。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的在動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，其中所述的細(xì)菌包括雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、糞腸球菌、durans腸球菌、乳酸乳球菌、乳酸乳桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱乳桿菌、干酪乳桿菌及植物乳桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，其中所述的口服配方制劑選自粉劑、凍干粉劑、液體配制品、半固體的酸乳與干酪。
8.一種動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，包括提供一種按口服接種配方設(shè)計的轉(zhuǎn)化酵母菌，其中所述的酵母菌含有編碼抗原的異源核酸，而抗原被表達(dá)在所用酵母菌表面上。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的在動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，其中所述的酵母菌是指釀酒酵母菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的在動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，其中所述的抗原源自病毒。
11.一種在動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，包括提供一種按口服接種配方設(shè)計的轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌，其中所述的轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌含有編碼來自甲型流行性感冒病毒的免疫保護(hù)性抗原決定簇的異源核酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的在動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，其中所述的免疫保護(hù)性抗原決定簇是流感HA或NA。
13.一種免疫原性制劑，包括具有表達(dá)載體的微生物體口服配方，其中所述的表達(dá)載體含有編碼抗原的異源核酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的免疫原性制劑，其中所述的微生物體是酵母菌或細(xì)菌。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的免疫原性制劑，其中所述的抗原選自腫瘤、細(xì)菌、病毒、寄生蟲和真菌。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的免疫原性制劑，其中所述的病毒選自流感、肝炎、HIV和輪狀病毒。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫原性制劑，其中所述的酵母菌選自釀酒酵母菌、S.exiquus、S.telluris、S.dairensis、S.servazzii、S.unisporus與S.kluyveri。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫原性制劑，其中所述的細(xì)菌包括雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、糞腸球菌、durans腸球菌、乳酸乳球菌、乳酸乳桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱乳桿菌、干酪乳桿菌及植物乳桿菌。
19.根據(jù)權(quán)利要求13免疫原性制劑的組成，口服接種配方選散劑、凍干粉、液體配制品、半固體的酸乳及干酪。
20.一種免疫原性制劑，包括轉(zhuǎn)化酵母菌口服配方，其中所述的酵母菌含有編碼抗原的異源核酸，而抗原被表達(dá)在所用酵母菌表面。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的免疫原性制劑，其中所述的酵母菌是釀酒酵母菌。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的免疫原性制劑，其中所述的抗原源自病毒。
23.一種免疫原性制劑，包括轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌的口服配方，其中所述的轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌含有編碼來自流感A的免疫保護(hù)性抗原決定簇的異源核酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的免疫原性制劑，其中所述的免疫保護(hù)性抗原決定簇是流感病毒HA或NA。
全文摘要
本發(fā)明提供了利用基因修飾的微生物進(jìn)行體內(nèi)異源核酸輸送的方法和制劑，特別是提供了將異源核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)至動物腸道黏膜的制劑和相關(guān)方法。尤其是，利用基因修飾的正常微生物群直接轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化異源核酸，或者是提供至少表達(dá)一種異源核酸的基因修飾的微生物。典型的正常微生物群包括細(xì)菌、細(xì)菌融合體與酵母菌。異源核酸可以編碼免疫保護(hù)性抗原決定簇(抗原)或其它基因治療蛋白。
文檔編號A61K38/19GK1642579SQ03807298
公開日2005年7月20日 申請日期2003年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月31日
發(fā)明者陳巍, 傅曉麗, 雪莉·諾萊尼, 張智清 申請人:圣必健公司