專利名稱：免疫佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫佐劑。
背景技術(shù)：
結(jié)核菌素很久以來(lái)一直被用作檢測(cè)結(jié)核菌感染史的試劑，或是作為牛結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)BCG(以下稱為BCG)給藥后的轉(zhuǎn)陽(yáng)檢查用試劑。有報(bào)告證實(shí)，如果使用結(jié)核菌素中的蛋白成分經(jīng)硫酸銨沉淀法精制后所得到的精制結(jié)核菌素，即使將其對(duì)人體反復(fù)給藥，在結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)中雖然多少總會(huì)顯示出一些增強(qiáng)效應(yīng)(Singh，D.etal.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.2001，Sep 15；164(6)962-4)，但卻不至于發(fā)生過激的皮膚炎癥反應(yīng)，是極為安全的。
本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，將已經(jīng)固體化或微粒化的腫瘤組織與至少一種細(xì)胞因子或與細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑一起進(jìn)行體內(nèi)給藥，就能夠有效地誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)(PCT/JP00/00692)。在這同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，將精制結(jié)核菌素作為常規(guī)免疫佐劑在保持可溶狀態(tài)下一起給藥，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更為強(qiáng)烈的針對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)(PCT/JP00/0692)。故此，結(jié)核菌素的成分也可以用作免疫佐劑，但缺點(diǎn)是由于結(jié)核菌素成分為可溶性物質(zhì)，所以它會(huì)擴(kuò)散而從給藥部位迅速消失。
另外有報(bào)告指出，結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)培養(yǎng)過濾液中的成分在溶解狀態(tài)下只有微弱的佐劑活性，但通過與聚苯乙烯鍵合可以激活T細(xì)胞反應(yīng)(Wilkinson，K.A.，et al.，J.Immunol.Methods，2351-9，2000)。就是說，如果將溶解狀態(tài)下的佐劑固定在不溶性佐劑載體上，那么它就不會(huì)快速擴(kuò)散消失，顯示出強(qiáng)的佐劑活性。當(dāng)然，由于此固定化物中的聚苯乙烯微粒雖然被抗原提呈細(xì)胞吞噬，但是在細(xì)胞內(nèi)不分解而還繼續(xù)留在體內(nèi)，所以成為機(jī)體所不希望的塑料。
作為解決上述問題的辦法，上述文獻(xiàn)中也引用了使細(xì)菌的培養(yǎng)過濾液中的成分與生物降解性合成高分子的微粒鍵合的方法(Vordermeier，H.M.，et al.，Vaccine，13，1576-1582，1995；Ertl，H.C.，et al.，Vaccine，14，879-885，1996；Jones D.H.，et al.，J.Biotechnology，44，29-36，1996；Venkataprasad，N.，et al.，Vaccine，17，1814-1819，1999)。但是，文中所記載的合成高分子聚(DL-丙交酯-共乙交酯)(PLG)分解時(shí)產(chǎn)生乳酸，造成分解部位環(huán)境酸化，也是機(jī)體所不希望發(fā)生的情況。
如上所述，就腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域而言，人們希望得到的是固體狀、具有生物降解性且沒有上述所不希望發(fā)生的作用的佐劑。而就現(xiàn)有技術(shù)而言，如果先使含有復(fù)雜多樣的腫瘤抗原的腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞在同型動(dòng)物個(gè)體體內(nèi)進(jìn)行物理變性、然后再將免疫佐劑向該變性組織中給藥的情況下，還沒有一種免疫佐劑能夠有效地激發(fā)針對(duì)存活的該腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，結(jié)核菌素在溶解狀態(tài)下只具有微弱的佐劑活性，但即使反復(fù)對(duì)人體給藥也還是極為安全的。本發(fā)明的課題是希望提供采用結(jié)核菌素且能夠在避免發(fā)生機(jī)體所不希望的狀態(tài)的同時(shí)有效地發(fā)揮強(qiáng)佐劑活性的免疫佐劑。
本發(fā)明者們?yōu)榱私鉀Q上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌素經(jīng)制成緩釋型制劑就可以得到高的佐劑活性。同時(shí)本發(fā)明者們還發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核菌素緩釋化的同時(shí)，白蛋白與肝素混合后經(jīng)凝聚形成沉淀時(shí)，結(jié)核菌素蛋白被包埋到此沉淀中形成不溶性微粒，而且將此不溶性微粒與抗原以及可溶性的精制結(jié)核菌素一起體內(nèi)給藥時(shí)有很強(qiáng)的防癌作用，而對(duì)熱變性后的體內(nèi)腫瘤組織用藥可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)。本發(fā)明就是以這些發(fā)現(xiàn)為依據(jù)完成的。
換而言之，本發(fā)明可以提供免疫佐劑，提供含有下列物質(zhì)(a)可溶性蛋白(除了結(jié)核菌素中所含可溶性蛋白以外)；以及(b)粘多糖經(jīng)凝聚形成的沉淀，還有與該沉淀一起沉淀出來(lái)的(c)結(jié)核菌素中所含可溶性蛋白的免疫佐劑。
本發(fā)明優(yōu)選的是，成分(a)的可溶性蛋白為白蛋白、成分(b)的粘多糖為肝素的上述免疫佐劑；沉淀物通過蛋白分子間交聯(lián)劑而交聯(lián)的上述免疫佐劑；以及上述成分(c)為結(jié)核菌素中所含可溶性蛋白與具有抗原性的可溶性蛋白的組合的上述免疫佐劑；具有抗原性的該可溶性蛋白為腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞成分和/或腫瘤抗原多肽的上述免疫佐劑。
從其他方面來(lái)說，本發(fā)明可以提供免疫佐劑，此免疫佐劑包含(c)結(jié)核菌素中所含可溶性蛋白和(d)不溶性蛋白分子，且由于上述成分(c)和(d)通過蛋白分子間交聯(lián)劑交聯(lián)而呈不溶性微粒狀。本發(fā)明優(yōu)選不溶性蛋白分子為膠原蛋白的上述免疫佐劑。
再?gòu)牧硪环矫鎭?lái)說，本發(fā)明還可以提供，通過與抗原混合后再對(duì)包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)給藥來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)該抗原的全身性免疫反應(yīng)的上述免疫佐劑；該抗原為腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞成分和/或腫瘤抗原多肽的上述免疫佐劑。
本發(fā)明還可以提供含有上述免疫佐劑的腫瘤疫苗。本發(fā)明優(yōu)選的有，通過對(duì)物理方法變性后的腫瘤組織內(nèi)給藥來(lái)誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)的上述腫瘤疫苗；物理方法為選自微波照射、射頻凝固法、冷凍凝固法、電刀加熱法、熱水注入、醇注入、栓塞法、放射線照射、激光照射和超聲波破壞中的方法的上述腫瘤疫苗；通過在體外與免疫活性細(xì)胞混合后給藥從而在體內(nèi)激發(fā)免疫反應(yīng)的上述腫瘤疫苗；免疫活性細(xì)胞為選自樹突細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中的細(xì)胞的上述腫瘤疫苗；通過先在體外與免疫活性細(xì)胞以及抗原混合后再來(lái)給藥的上述腫瘤疫苗。
另外，本發(fā)明還提供包括將上述免疫佐劑對(duì)包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物給藥的步驟的全身性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)方法；包括將上述腫瘤疫苗對(duì)經(jīng)物理方法變性的腫瘤組織內(nèi)給藥的步驟的腫瘤的治療方法；包括將上述腫瘤疫苗對(duì)經(jīng)物理方法變性的腫瘤組織內(nèi)給藥的步驟的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)的方法；以及先將上述腫瘤疫苗和免疫活性細(xì)胞在體外混合然后再對(duì)包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)給藥從而刺激體內(nèi)免疫反應(yīng)的方法。
附圖簡(jiǎn)要說明

圖1是顯示本發(fā)明的腫瘤疫苗產(chǎn)生的肝癌增殖抑制效果的圖。虛線表示累積存活率(空白對(duì)照組)，實(shí)線表示累積存活率(微?；Y(jié)核菌素疫苗給藥組)，細(xì)密虛線為陽(yáng)性對(duì)照組。
圖2是顯示對(duì)微波凝固后的腫瘤組織內(nèi)給藥的本發(fā)明腫瘤疫苗產(chǎn)生的防腫瘤復(fù)發(fā)效果圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的免疫佐劑的特征是含有下列物質(zhì)a)可溶性蛋白(除了結(jié)核菌素中所含的可溶性蛋白以外)；以及b)粘多糖(但它是和上述(a)的可溶性蛋白經(jīng)凝聚會(huì)形成沉淀的粘多糖)經(jīng)凝聚形成的沉淀，還含有與該沉淀一起沉淀出來(lái)的c)結(jié)核菌素中所含可溶性蛋白。
作為上述(a)可溶性蛋白和(b)粘多糖的組合，只要是兩者在本領(lǐng)域公知的條件下經(jīng)凝聚可以形成沉淀的均可，沒有特別的限制。關(guān)于凝聚，如美國(guó)專利第5,759,582號(hào)說明書中記載了其詳細(xì)的技術(shù)說明，但此處對(duì)這個(gè)用語(yǔ)的解釋不作任何意義上的限制，而必須作最為廣義的理解?？梢詢?yōu)選(a)可溶性蛋白為白蛋白而(b)粘多糖為肝素，但(a)可溶性蛋白和(b)粘多糖的組合并不僅限于上述組合。結(jié)核菌素中所含可溶性蛋白可以使用如精制結(jié)核菌素的總蛋白，除此以外也可以使用按常規(guī)方法由結(jié)核菌素配制而成的可溶性蛋白的全部或其中一部分。通過攪拌上述3種成分，成分(a)和成分(b)凝聚形成沉淀，同時(shí)成分(c)被該沉淀包埋后一起沉淀下來(lái)形成沉淀物。
(c)結(jié)核菌素中所含可溶性蛋白與(a)可溶性蛋白的比例沒有特別的限制，只要是可以讓(a)可溶性蛋白和(b)粘多糖發(fā)生凝聚的范圍，任何比例都可以。舉例來(lái)說，如果可溶性蛋白用pH值為2.5的2.5％人血清白蛋白溶液的話，則粘多糖用大約5mg/ml的市售肝素溶液，在600μl粘多糖中添加2.5μg結(jié)核菌素的可溶性蛋白并使之溶解，然后一邊攪拌此混合物一邊滴入上述人血清白蛋白溶液使其容量比不斷變?yōu)?/1.75、1/1.5、1/1.25、1/1，使其通過凝聚形成微粒。將此混懸液進(jìn)行離心，定量測(cè)定其上清液的蛋白質(zhì)含量，優(yōu)選使混合后的蛋白質(zhì)幾乎全部被包埋至微粒中的容量比。當(dāng)然，成分(a)到(c)的比例或凝聚的條件等都可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員作適當(dāng)選擇。得到的沉淀中所含微粒的粒徑一般在1μm以下，但并不局限于一定的大小。
得到的沉淀以微粒狀沉淀為優(yōu)選，可以直接用來(lái)作為免疫佐劑使用，但也可以根據(jù)需要用蒸餾水清洗沉淀。另外為了使沉淀穩(wěn)定，也可以通過蛋白分子間交聯(lián)劑使其形成交聯(lián)，從而形成不溶性微粒。蛋白交聯(lián)劑的種類沒有特別的限制，可以按照常規(guī)的方法使用常規(guī)的交聯(lián)劑。比如，將1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺制成20mg/ml的水溶液，用旋渦混合器一邊混合一邊加入使其最終濃度達(dá)0.8～1.5mg/ml，然后室溫下靜置15分鐘，這時(shí)沉淀中的蛋白質(zhì)分子間就形成了十分穩(wěn)定的交聯(lián)。當(dāng)然交聯(lián)的形成并不僅限于上述特定條件或特定蛋白分子間交聯(lián)劑。按上述方法得到的免疫佐劑優(yōu)選經(jīng)過交聯(lián)處理的免疫佐劑，它即使用水清洗也不溶解，適合用作本發(fā)明的免疫佐劑。
本發(fā)明其他方面的優(yōu)選還有，將具有抗原性的可溶性蛋白和結(jié)核菌素中所含可溶性蛋白進(jìn)行混合后，用此混合物代替上述(c)，采取與上述操作同樣的方法來(lái)得到沉淀物，就可以制備得到含有具抗原性的可溶性蛋白和具佐劑活性的結(jié)核菌素可溶性蛋白的免疫佐劑。
另外，本發(fā)明還可以提供含有經(jīng)蛋白分子間交聯(lián)劑交聯(lián)的結(jié)核菌素中所含可溶性蛋白以及不溶性蛋白分子的不溶性微粒狀免疫佐劑。不溶性蛋白分子可以使用具生物降解性的不溶性蛋白分子。比如，可以使用膠原蛋白，但也不是僅限于此，只要是可在機(jī)體內(nèi)分解，任何不溶性蛋白分子均可。蛋白分子間交聯(lián)劑的種類沒有特別的限制，按照常規(guī)的方法使用本領(lǐng)域公知的交聯(lián)劑即可。比如，可以使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺等。微粒的粒徑一般優(yōu)選1μm以下，但并沒有特定的大小限制。
本發(fā)明的免疫佐劑可以用作普通的免疫佐劑。將其單純與抗原混合后對(duì)人體或動(dòng)物體內(nèi)給藥，可以誘導(dǎo)對(duì)該抗原的全身性免疫反應(yīng)。如果該抗原為腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞成分和/或腫瘤抗原多肽的情況下，就可以用作為腫瘤疫苗。例如，將從患者體內(nèi)分離出來(lái)并固定化的癌細(xì)胞與本發(fā)明的免疫佐劑混合后對(duì)患者皮內(nèi)注射給藥，這時(shí)患者體內(nèi)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)該癌細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)。當(dāng)然本發(fā)明的免疫佐劑的使用方法并不僅限于上述這些內(nèi)容，只要是常規(guī)使用免疫佐劑的情況下的任何方法均可。
另外，通過物理方法使患者體內(nèi)的腫瘤組織變性，然后將本發(fā)明的免疫佐劑對(duì)此組織內(nèi)給藥，以此也可以誘導(dǎo)針對(duì)患者體內(nèi)依然存活的腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤組織的物理變性的方法沒有特別的限制，可以采用如微波照射、射頻凝固法、冷凍凝固法、電刀加熱、熱水注入、醇注入、栓塞法、放射線照射、激光照射、超聲波破壞等方法。當(dāng)然也并不僅限于這些方法，只要是可以誘導(dǎo)腫瘤組織內(nèi)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，任何方法都可以。也可以將2種以上物理方法適當(dāng)組合在一起使用。
例如，通過對(duì)腫瘤組織進(jìn)行微波照射，使其加熱凝固，再將本發(fā)明的免疫佐劑對(duì)此凝固組織內(nèi)給藥，就可以誘導(dǎo)發(fā)生針對(duì)該腫瘤組織內(nèi)部或其周邊依然存活的腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)。同時(shí)也優(yōu)選在本發(fā)明的免疫佐劑給藥的同時(shí)進(jìn)行結(jié)核菌素溶液給藥。當(dāng)然本發(fā)明的免疫佐劑的給藥方法并不僅限于上述方式，只要是可以使本發(fā)明的免疫佐劑與變性腫瘤組織中所含腫瘤抗原一起被攝取至聚集到該變性腫瘤組織中的抗原提呈細(xì)胞、或者形成本發(fā)明的免疫佐劑能夠直接刺激到抗原提呈細(xì)胞的環(huán)境，任何方法均可采用。
另外，可以先將本發(fā)明的免疫佐劑與免疫活性細(xì)胞在體外混合后再對(duì)患者體內(nèi)給藥，從而激發(fā)體內(nèi)免疫反應(yīng)。此免疫活性細(xì)胞可以優(yōu)選使用樹突細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和/或自然殺傷細(xì)胞等，但并不僅限于這些。
另外，本發(fā)明還可以提供含有上述免疫佐劑作為有效成分的疫苗。此疫苗給藥的時(shí)候，也可以同時(shí)與免疫活性細(xì)胞混合使用。還可以與作為抗原的腫瘤組織和/或腫瘤細(xì)胞混合后使用，這樣得到的疫苗給患此腫瘤的患者使用可以治療腫瘤。
實(shí)施例以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明的范圍并不僅限于以下這些實(shí)施例。在本實(shí)施例中，有時(shí)將制備的本發(fā)明的免疫佐劑稱為微?；Y(jié)核菌素(或其他類似用語(yǔ))。
例1本發(fā)明的腫瘤疫苗的肝癌增殖抑制效果A.材料和方法1.免疫佐劑的制備1)25％人血清白蛋白溶液(HAS，Baxter Albumac，Bacter)用無(wú)菌水稀釋至2.5％，用4N的HCl調(diào)至pH2.5。
2)預(yù)先將此2.5％人血清白蛋白溶液與肝素溶液(ノボ·ヘパリン注1000，1000單位/ml，約7.69mg/ml以下，安萬(wàn)特醫(yī)藥株式會(huì)社)以各種比例混合，確定肝素溶液的最恰當(dāng)?shù)幕旌媳壤?。所謂最恰當(dāng)?shù)幕旌媳壤?，就是最開始用一定的混合比例制成微粒，以2500rpm(1300g)的速度進(jìn)行15分鐘離心，再用蛋白質(zhì)分析試劑盒1(日本BioRadLaboratories，東京)定量其上清液的蛋白質(zhì)含量，如果混合后的蛋白質(zhì)有99.9％以上被包埋入微粒，那么這時(shí)就是最恰當(dāng)?shù)幕旌媳壤?br> 3)將結(jié)核菌素(日本BCG制造株式會(huì)社，一般診斷用精制結(jié)核菌素(PPD)1人份，標(biāo)準(zhǔn)品0.25μg當(dāng)量)混懸于注射用肝素溶液中，一邊用旋渦混合器攪和，一邊按事先確定好的比例滴入2.5％的人血清白蛋白溶液。
4)以4300rpm(1300g)的速度進(jìn)行15分鐘的離心，用無(wú)菌蒸餾水清洗2次，再混懸于無(wú)菌蒸餾水中。
5)將1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺溶液(EDC，Sigma公司，溶于水中成為濃度為20mg/ml的溶液)一邊用旋渦混合器攪拌一邊添加，使其最終濃度變成0.8～1.5mg/ml，然后在室溫下靜置15分鐘。
6)以4300rpm(1300g)的速度進(jìn)行15分鐘的離心，用無(wú)菌蒸餾水清洗6次，再混懸于無(wú)菌生理鹽水中使其達(dá)到必要的濃度。這就制成了微?；Y(jié)核菌素混懸液。
2.腫瘤疫苗的小鼠肝癌增殖抑制效果的測(cè)定1)在直徑10cm的塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)肝癌細(xì)胞Hepa 1-6直至鋪展，用3％的多聚甲醛溶液在室溫下使其固定2小時(shí)。含鈣、鎂的Dulbecco磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS(+))充分清洗，再用70％的乙醇進(jìn)行清洗滅菌，然后再用PBS(+)充分清洗。
2)按照每個(gè)培養(yǎng)皿10ml的量加入DMEM培養(yǎng)基，在37℃下溫孵2天。
3)用PBS(+)充分清洗后，按照每個(gè)培養(yǎng)皿3ml的量加入聚L-賴氨酸溶液(25μg/ml)，溫孵2小時(shí)。
4)用PBS(+)充分清洗后，用細(xì)胞刮將全部固定細(xì)胞刮下收集起來(lái)，混懸于PBS(+)中。
5)將相當(dāng)于4個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞量的200μl放入Eppendrof管中，再添加結(jié)核菌素溶液100μl(0.25μg/100μl PBS(+))，溫孵2小時(shí)。
6)添加微?；Y(jié)核菌素混懸液150μl(所含結(jié)核菌素濃度為3μg/ml)，再添加50μl的PBS(+)。于是得到微?；Y(jié)核菌素疫苗。與此同時(shí)，用5KE/ml的OK432(中外制藥，ピシバニ一ル5KE)代替微?；Y(jié)核菌素和PBS(+)，用PBS(+)使其稀釋10倍至200μl，將其加入Eppendrof管中，由此得到陽(yáng)性對(duì)照組用疫苗。
7)用此微?；Y(jié)核菌素疫苗，對(duì)肝癌細(xì)胞Hepa 1-6的同型小鼠(C57L/J系，6-9周齡，雄性)9只按照每只50μl皮內(nèi)注射給藥。1周后重復(fù)此操作。空白對(duì)照組的9只小鼠只注射不含鈣鎂Dulbecco磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS(-))。同樣，給陽(yáng)性對(duì)照組注射上述6)中制成的陽(yáng)性對(duì)照組用疫苗。
8)過1周后，右腳皮下注射Hepa 1-6細(xì)胞(1×107個(gè)/0.2ml PBS(-))。
9)在此激發(fā)后，按照上述1)至6)條同樣操作，制成微?；Y(jié)核菌素疫苗(但是，制備此疫苗時(shí)所用的微?；Y(jié)核菌素所含結(jié)核菌素濃度為2μg/ml)，將其給每只小鼠皮內(nèi)注射50μl。空白對(duì)照組的9只小鼠只注射PBS(-)。同樣，給陽(yáng)性對(duì)照組注射按上述6)制成的陽(yáng)性對(duì)照組用疫苗。
10)然后測(cè)定皮下肝癌擴(kuò)大后的小鼠的存活率。
B.結(jié)果結(jié)果如圖1所示。這是空白對(duì)照組、微?；Y(jié)核菌素疫苗給藥組、陽(yáng)性對(duì)照組的Kaplan-Meyer曲線。微粒化結(jié)核菌素疫苗給藥組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異，比空白對(duì)照組的存活率高(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)log-rank test，p＜0.0001)，同時(shí)顯示了比陽(yáng)性對(duì)照組更好的抗腫瘤效果。
例2微?；Y(jié)核菌素對(duì)微波凝固后的腫瘤組織給藥產(chǎn)生的防腫瘤復(fù)發(fā)效果A.材料和方法1.按照例1的第1.條制備微?；Y(jié)核菌素。
2.向C57BL/6小鼠(雌性，1組6只)的右腳皮下注射1×106個(gè)同型肺癌細(xì)胞(Lewis肺癌細(xì)胞株)，到第8日皮下肺癌組織基本上都達(dá)到75mm3的時(shí)候，進(jìn)行戊巴比妥鈉麻醉，切開近肺癌組織的皮膚，由此處向癌組織中插入Microtaze內(nèi)窺鏡檢查用單球電極(E-24N，粒徑2.4mm)。
3.將此電極連接在Microtaze(HSE-8M型，Azwell公司生產(chǎn))上，用10W的功率微波照射3分鐘，使得看上去癌組織完全熱凝固了。
4.縫合傷口，到第10日將結(jié)核菌素溶液(精制結(jié)核菌素25ng溶于25μl生理鹽水中)和混懸好的微粒化結(jié)核菌素(含有精制結(jié)核菌素50ng并混懸于5μl生理鹽水中)注射至癌組織中。到第14日再次重復(fù)以上注射(a組)。對(duì)照組(b組)的小鼠只給以微波照射。同時(shí)設(shè)置不給以微波照射的對(duì)照組(c組)，還有用OK-432(1KE/25μl來(lái)代替微?；Y(jié)核菌素的組(d組)，以及用OK-432(1KE/25μl)來(lái)代替結(jié)核菌素溶液的組(e組)。
5.然后動(dòng)態(tài)測(cè)定復(fù)發(fā)并腫脹起來(lái)的癌組織的大小(mm3)。
B.結(jié)果結(jié)果如圖2所示。各點(diǎn)表示6只小鼠的肺癌組織大小的平均值。肺癌細(xì)胞移植后觀察到第33天時(shí)，發(fā)現(xiàn)與b組、c組相比較，a組的肺癌組織復(fù)發(fā)得到了明顯抑制。尤其是含有微?；Y(jié)核菌素和結(jié)核菌素溶液的a組，6只中沒有1只復(fù)發(fā)，完全得到了抑制，而不含微?；Y(jié)核菌素的d組以及不含結(jié)核菌素溶液的e組在微波照射后，一旦縮小后再次生長(zhǎng)起來(lái)的組織都是小的癌組織，與b組和c組相比癌增殖是得到了抑制，但6只中5只有復(fù)發(fā)(表1)。
表1肺癌細(xì)胞移植后的復(fù)發(fā)1組6只中發(fā)生肺癌復(fù)發(fā)的小鼠數(shù)量a微波照射+結(jié)核菌素溶液+微?；Y(jié)核菌素 0b微波照射 5c無(wú)微波照射 6d微波照射+OK-432+結(jié)核菌素溶液 5e微波照射+OK-432+微粒化結(jié)核菌素 5
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的免疫佐劑能夠在避免機(jī)體所不希望發(fā)生的狀態(tài)的同時(shí)有效地發(fā)揮強(qiáng)的佐劑活性。
權(quán)利要求
1.免疫佐劑，含有a)可溶性蛋白(除了結(jié)核菌素中所含的可溶性蛋白以外)；和b)粘多糖(但它是和上述(a)的可溶性蛋白凝聚產(chǎn)生沉淀的粘多糖)經(jīng)凝聚形成的沉淀，以及與該沉淀一起沉淀出來(lái)的c)結(jié)核菌素中所含可溶性蛋白。
2.如權(quán)利要求1記載的免疫佐劑，其中成分(a)的可溶性蛋白為白蛋白、成分(b)的粘多糖為肝素。
3.如權(quán)利要求1或2記載的免疫佐劑，其中沉淀物經(jīng)蛋白分子間交聯(lián)劑交聯(lián)。
4.如權(quán)利要求1～3的任何一項(xiàng)記載的免疫佐劑，其中上述成分(c)為結(jié)核菌素所含可溶性蛋白和具抗原性的可溶性蛋白的組合。
5.如權(quán)利要求4記載的免疫佐劑，其中具有抗原性的可溶性蛋白為腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞成分和/或腫瘤抗原多肽。
6.免疫佐劑，含有c)結(jié)核菌素中所含可溶性蛋白；和d)不溶性蛋白分子且上述成分c)和d)通過蛋白分子間交聯(lián)劑交聯(lián)在一起的呈不溶性微粒狀。
7.如權(quán)利要求6記載的免疫佐劑，其中不溶性蛋白分子為膠原蛋白。
8.如權(quán)利要求1～7任何一項(xiàng)記載的免疫佐劑，將其與抗原混合后對(duì)包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物進(jìn)行體內(nèi)給藥，用來(lái)誘導(dǎo)對(duì)該抗原的全身性免疫反應(yīng)。
9.如權(quán)利要求8記載的免疫佐劑，其中該抗原為腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞成分和/或腫瘤抗原多肽。
10.含有如權(quán)利要求1～9任何一項(xiàng)記載的免疫佐劑的腫瘤疫苗。
11.如權(quán)利要求10記載的腫瘤疫苗，將其對(duì)通過物理方法變性后的腫瘤組織內(nèi)進(jìn)行給藥，用來(lái)誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。
12.如權(quán)利要求11記載的腫瘤疫苗，其中物理方法為選自微波照射、射頻凝固法、冷凍凝固法、電刀加熱法、注入熱水、醇注入、栓塞法、放射線照射、激光照射和超聲波破壞的方法。
13.如權(quán)利要求10～12任何一項(xiàng)記載的腫瘤疫苗，將其在體外與免疫活性細(xì)胞混合后再給藥，用來(lái)刺激體內(nèi)免疫反應(yīng)。
14.如權(quán)利要求13記載的腫瘤疫苗，其中免疫活性細(xì)胞為選自樹突細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求13或14記載的腫瘤疫苗，將其在體外進(jìn)一步與抗原混合后再給藥。
全文摘要
本發(fā)明是能夠在避免機(jī)體所不希望發(fā)生的情況的同時(shí)有效地發(fā)揮強(qiáng)大的佐劑活性的免疫佐劑，該免疫佐劑含有(a)可溶性蛋白(除了結(jié)核菌素中所含有的可溶性蛋白以外)、和(b)粘多糖經(jīng)凝聚形成的沉淀，y以及含有與該沉淀一起沉淀出來(lái)的(c)結(jié)核菌素中所含可溶性蛋白。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1646159SQ0380865
公開日2005年7月27日 申請(qǐng)日期2003年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月18日
發(fā)明者大野忠夫, 內(nèi)村英次, 黃嵐, 匡銘 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所, 細(xì)胞醫(yī)藥股份有限公司