專利名稱：酶活性減少的非典型流感嗜血桿菌的p4蛋白突變體的制作方法
發(fā)明的領域本發(fā)明一般涉及免疫原性組合物的領域，更具體是抗中耳炎的免疫原性組合物。
發(fā)明的背景非典型流感嗜血桿菌(NTHi)引起人類疾病，包括成人中的肺炎、中耳炎、鼻竇炎和急性發(fā)熱氣管支氣管炎。此細菌也是兒童和嬰兒中耳炎的常見病原體。由于NTHi感染僅賦予菌株-特異的免疫性，人可被重復感染。事實上，此細菌引起的大部分慢性疾病是兒童的反復耳炎，使治療包括反復接受抗生素或手術以將引流管插入耳中。
現(xiàn)有治療典型流感嗜血桿菌菌株的免疫原性組合物(其特征是一種已知的膠囊)中沒有一種對治療NTHi有用。因此，進行大量研究以發(fā)現(xiàn)用于防止NTHi引起感染的成分。在研究防止人中耳炎發(fā)生的候選成分中，稱為NTHi蛋白4(P4；以前稱為“外膜蛋白e”)的細菌脂蛋白被鑒定為所需成分，因為它能在人中引發(fā)針對細菌的殺菌抗體。發(fā)現(xiàn)P4引發(fā)殺菌抗體，與抗其它NTHi外膜蛋白的抗體協(xié)同作用。因此，此蛋白可結(jié)合其它外膜蛋白使用以誘導更有效的殺菌反應。
編碼P4的hel基因在流感嗜血桿菌菌株內(nèi)和之間抗原性保守。參見例如美國專利號5,780,601；5,955,580和5,601,831及歐洲專利號EP 0 606 921和EP 0 462210，它們納入本文供參考。hel基因序列(SEQ ID NO1)和編碼的274個氨基酸的前蛋白序列(SEQ ID NO2)獲得自NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號M68502并鑒定于Green，B.A.，等，1991 Infec.Immun.，59(9)3191-3198。NTHi的成熟P4是長度為254個氨基酸的脂化蛋白(SEQ ID NO3)，由SEQ ID NO1的核苷酸209-970編碼。274個氨基酸的未加工前P4蛋白具有20個氨基酸的信號肽，特定作為脂肪酸?；稽c(SEQ ID NO2，氨基酸1-20)，此蛋白由SEQ ID NO1的核苷酸149-970編碼，核苷酸149-208編碼信號或前導肽。
原來認為嗜血桿菌中P4蛋白的功能是氯高鐵血紅素轉(zhuǎn)運(Reidl，J.，和J.J.Mekalanos.1996 J.Exp.Med.，183621-629.5)。然而，后來發(fā)現(xiàn)P4蛋白是外膜酶，即細菌酸性磷酸酶(Reilly，T.J.等，1999 J.Bacteriol.，1816797-805)。最近此領域的工作顯示實驗室對于P4蛋白的真正功能持不同觀點(Kemmer，G.等，2001 J.Bacteriol.，1833974-3981；Reidl，J.等，2000 Mol.Microbiol.，351573-81；Reilly，T.，和A.Smith，1999 Prot.Exp.Purif.，17401-409；Reilly，T.J.等，1999.J.Bacteriol.，1816797-805；Reilly，T.J.等，2001 FEBSLett.，49419-23)。
鑒定P4為酶蛋白產(chǎn)生對于其用作人免疫原性組合物成分的潛在關心。此蛋白是酶活性且未完全確定其體內(nèi)底物。當野生型P4施用給人時沒有已知的有害效果，一般認為在用于待施用給人的免疫原性組合物上，非酶活性蛋白或活性減少的蛋白優(yōu)于酶活性蛋白。酶活性蛋白不優(yōu)選用作免疫原性成分，因為除了誘導抗體，其酶活性可能在被免疫的人中引起意想不到的、不需要的反應。
上述文獻和專利描述的P4蛋白片段或變體“突變體”P4序列的特征不在于免疫原性組合物的最重要的性質(zhì)即免疫原性。沒有提供關于突變對免疫原性效果的信息。更沒有提供影響酶活性的變化對潛在免疫原性有任何效果的征兆。因此，先有技術未提供任何指導用于選擇產(chǎn)生免疫原性組合物成分的P4蛋白的突變體。
本領域繼續(xù)需要包含NTHi P4變異蛋白的治療和預防性組合物，此變異蛋白酶活性減少且免疫性相當于野生型蛋白，安全用于人中的免疫原性組合物。
發(fā)明的概述一方面，與野生型P4蛋白相比發(fā)明提供P4變異(突變)蛋白的酶活性減少且誘導野生型P4蛋白的抗體和/或具有抗NTHi的殺菌活性。此變異蛋白用于在被免疫人中誘導抗NTHi的保護性免疫反應。
另一方面，發(fā)明提供免疫原性組合物，包含本文所述NTHi P4變異蛋白、藥學上可接受載體和任選的佐劑。此組合物可含有另外的抗原性蛋白或肽并用于誘導抗NTHi的保護性免疫反應。
又一方面，發(fā)明提供分離或重組核苷酸分子，包括編碼本發(fā)明P4變體的核酸序列。發(fā)明也涉及載體，如質(zhì)粒、重組病毒等，所含這些分子在指導宿主細胞中變體表達的序列調(diào)節(jié)控制下。
另外一方面，發(fā)明提供包含載體的宿主細胞，載體含本文所述核苷酸分子。
另一方面，發(fā)明包括通過施用變異蛋白或含它的組合物在人中誘導抗NTHi的免疫反應的方法。
又一方面，發(fā)明包括宿主細胞重組表達P4變異蛋白的方法，宿主細胞用含這些分子的載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導。
另外一方面，發(fā)明包括使用P4變異蛋白作為另一種抗原的載體，其中另一種抗原可以是蛋白、多肽、肽、多糖、寡糖、糖類、脂多糖、脂寡糖或脂糖。變異P4蛋白與野生型P4蛋白相比酶活性減少，但不一定誘導野生型P4蛋白的抗體或具有抗NTHi的殺菌活性，以P4變異載體蛋白在SEQ ID NO3的氨基酸位置122沒有苯丙氨酸為條件。
發(fā)明的這些和其它方面對閱讀下列發(fā)明詳述的本領域技術人員是顯而易見的。
發(fā)明的詳述本發(fā)明通過提供非酶活性的P4變異蛋白滿足本領域的需求，此蛋白誘導野生型P4蛋白的抗體和/或具有抗NTHi的殺菌活性。含這類P4變異蛋白、編碼它們的核酸分子的組合物及使用這些蛋白和核酸分子的方法提供誘導人中對NTHi免疫性的新方法。
A.本發(fā)明的變異P4蛋白變異P4蛋白定義為突變P4蛋白，具有很低水平的P4酶活性或不能檢測的P4酶活性。當用作免疫原性組合物的成分時，這些變異P4蛋白保持所需野生型P4蛋白的免疫原性性質(zhì)。這些性質(zhì)包括引發(fā)抗野生型P4的ELISA反應性抗體和/或抗NTHi的殺菌活性。當用作載體蛋白時，變異P4蛋白不需保持野生型P4蛋白的免疫原性性質(zhì)。
由于不知道防御NTHi的臨床相關性，如果突變體發(fā)ELISA效價和/或殺菌效價相當于野生型重組脂蛋白P4(rLP4)，突變P4取代免疫原性組合物中的野生型P4才能成功。這種變異P4蛋白是用于預防NTHi感染的免疫原性組合物的所需成分。如本文所用，術語“變異P4蛋白”或“突變P4蛋白”指在氨基酸殘基上攜帶特定突變的蛋白或脂蛋白，它顯著地減少野生型P4酶活性且仍保持蛋白在人中誘導對NTHi免疫反應的能力。
“免疫反應”或“免疫性”是在本文中交換使用的術語，指誘導體液(即B細胞)和/或細胞(即T細胞)反應?？蛇m當評估體液免疫反應，這是根據(jù)本發(fā)明P4蛋白變體導入宿主，測量在免疫動物血清中存在的P4抗原-特異抗體。在下面的一個示范實施方案中，免疫反應通過酶聯(lián)免疫吸收測定(ELISA)免疫動物的血清來評估。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)測定能用于測量來自淋巴細胞的T細胞反應，淋巴細胞分離自免疫動物的脾。
本發(fā)明的變異P4蛋白優(yōu)選是脂蛋白，即它在氨基末端包含修飾的半胱氨酸，經(jīng)硫醚連接脂肪酰化甘油且一個脂肪酸連接其末端氨基。在本發(fā)明P4變異蛋白的一個實施方案中，前導肽是流感嗜血桿菌的野生型P4前導肽，即SEQ ID NO2的氨基酸1到20。然而，其它用于細菌細胞中特定脂肪?；稽c的肽可融合P4變異蛋白，取代野生型序列以提供脂蛋白。其它前導肽的例子包括來自流感嗜血桿菌的P6蛋白、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)的OspA蛋白的前導肽和來自革蘭氏陽性菌脂信號肽的前導肽。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，P4變異蛋白用作載體蛋白，它可優(yōu)選為非脂質(zhì)化，即它的表達沒有前導肽。例如，它缺乏SEQ ID NO2的氨基酸1到20的前導肽或它與缺乏脂肪?；稽c的前導肽融合。
在此說明書中，確定特定突變時氨基酸殘基的鑒定是與野生型P4的加工、成熟脂質(zhì)化氨基酸序列即SEQ ID NO3對應的殘基號。
本發(fā)明涉及NTHi的P4變異蛋白，與野生型P4蛋白相比酶活性減少且誘導野生型P4蛋白的抗體和/或具有抗NTHi的殺菌活性，其中P4變異蛋白具有的突變選自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基39的突變，它在野生型P4蛋白中是谷氨酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基48的突變，它在野生型P4蛋白中是苯丙氨酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64的突變，它在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基161的突變，它在野生型P4蛋白中是賴氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基218的突變，它在野生型P4蛋白中是天冬酰胺；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基35和37的突變，它們在野生型P4蛋白中是丙氨酸，其中突變不是谷氨酸、谷氨酰胺或蘇氨酸；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64和66的突變，它們在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(h)一個或多個突變(a)-(g)的組合。
具體地，本發(fā)明特定P4變異蛋白的首個實施方案是在SEQID NO3的氨基酸殘基39含突變的蛋白，在野生型P4蛋白中是谷氨酰胺。在一個實施方案中，P4變異蛋白包含在SEQ ID NO3的氨基酸位置39的谷氨酸。另外，P4變異蛋白包含在SEQ ID NO3的氨基酸位置39的天冬氨酸或天冬酰胺。
本發(fā)明P4變異蛋白的第二個實施方案包含在氨基酸殘基號48的突變，它在野生型P4蛋白中是苯丙氨酸。P4變異蛋白中的氨基酸殘基最好是半胱氨酸。Cys殘基在位置48取代Phe殘基是非保守性變化，可能預期會破壞蛋白結(jié)構(gòu)。然而，此P4變異蛋白具有所需抗原和免疫原性性質(zhì)。此P4變異蛋白也缺乏在大腸桿菌中補充hemA突變的能力。參見Reilly，T.J.等，2001 FEBS Lett.，49419-23，它全部納入本文供參考。另外，P4變異蛋白在SEQ ID NO3的氨基酸位置48包含絲氨酸或其它具有不帶電極性基團的氨基酸，如甘氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。
本發(fā)明P4變異蛋白的第三個實施方案包含在SEQ ID NO3的氨基酸殘基位置64的突變，它在野生型P4蛋白中是天冬氨酸。在一個實施方案中，P4變異蛋白包含在殘基64的天冬酰胺或谷氨酸。另外，P4變異蛋白包含在SEQ ID NO3的氨基酸位置64的丙氨酸。
本發(fā)明P4變異蛋白的第四個實施方案包含在SEQ ID NO3的氨基酸殘基位置161的突變，它在野生型P4蛋白中是賴氨酸。在一個實施方案中，P4變異蛋白包含在殘基161的精氨酸。
本發(fā)明P4變異蛋白的第五個實施方案包含在SEQ ID NO3的氨基酸殘基位置218的突變，它在野生型P4蛋白中是天冬酰胺。在一個實施方案中，P4變異蛋白包含在殘基218的谷氨酰胺。另外，P4變異蛋白包含在SEQ ID NO3的氨基酸位置218的天冬氨酸或谷氨酸。
本發(fā)明P4變異蛋白的第六個實施方案包含在SEQ ID NO3的氨基酸殘基位置35和37的突變，它們在野生型P4蛋白中是丙氨酸。在一個實施方案中，P4變異蛋白包含在殘基35和37的天冬酰胺。P4變異蛋白在SEQ ID NO3的氨基酸殘基位置35和37不包含谷氨酸、谷氨酰胺或蘇氨酸。
本發(fā)明P4變異蛋白的第七個實施方案包含在SEQ ID NO3的氨基酸殘基位置64和66的突變，它們在野生型P4蛋白中是天冬氨酸。在一個實施方案中，P4變異蛋白包含在殘基64和66的丙氨酸。另外，P4變異蛋白包含在SEQ ID NO3的氨基酸位置64和66的天冬酰胺或谷氨酸。
發(fā)明者確定P4變異蛋白中酶活性去除或減少對于是否保存抗野生型P4的免疫原沒有遵循明顯模式。一些P4序列中的突變?nèi)コ驕p少酶活性，但也產(chǎn)生不能引發(fā)高ELISA效價或高殺菌效價的突變蛋白。發(fā)明者在下面例子中研究和鑒定的多種P4變異蛋白中觀察到酶活性和免疫原性間、高ELISA效價和高殺菌效價間及保守性變化對抗原結(jié)構(gòu)的作用的可預測性間缺乏相關性。
例如，初次嘗試在已知DD基序(兩個相鄰或附近的天冬氨酸殘基)進行去除P4蛋白中的酶活性，DD基序為細菌酸性磷酸酶所共有(Thaller，M.C.等，1998.Prot.Sci.，71647-52)，即SEQ ID NO3的氨基酸殘基64和66及SEQ ID NO3的氨基酸位置184和185。當評估酶活性的P4變異蛋白包含兩個丙氨酸取代位置64和66兩個天冬氨酸的雙重突變體或兩個丙氨酸取代位置184和185兩個天冬氨酸的雙重突變體時，兩者都是酶失活的。
然而，當這些蛋白用于免疫小鼠時，產(chǎn)生的抗血清顯示抗野生型P4的低ELISA效價。這是由于抗體識別抗原表位的變化，因為抗血清有抗同源蛋白的高效價。相反，當評估這些抗血清的殺菌活性時，兩種突變蛋白的抗血清都顯示對D64A、D66A突變體的高殺菌活性水平和對D184A、D185A突變體的低殺菌活性水平。因此，D64A、D66A突變體是包含于免疫原性組合物的有用成分，而D184A、D185A突變體不是。另一種建議突變體在位置64由高度保守的Glu殘基取代Asp殘基，產(chǎn)生的P4變體(D64E)引發(fā)抗野生型P4的高ELISA效價，盡管它抗NTHi的殺菌效價低。下面例子中顯示其它的建議突變P4蛋白，它們不滿足P4變異蛋白用作本發(fā)明免疫原性組合物成分的標準。
用于本發(fā)明的其它有用的P4變異蛋白包括全長、成熟的254個氨基酸脂蛋白，有上面提供的一個或多個特定突變，或者含上述誘變殘基的多肽或其片段且蛋白、多肽或片段，保持減少的酶活性、ELISA和/或其衍生的全長P4變體的殺菌(BC)活性。
這些P4變異蛋白的免疫活性、酶失活片段一般包含至少約25個P4變異蛋白的相鄰氨基酸，含上述誘變位點。P4變異蛋白片段更典型地包含至少約100個相鄰氨基酸。另一種P4變異蛋白的片段包含至少約150個相鄰氨基酸。另外一個P4變異蛋白的實施方案包含至少長約200個相鄰氨基酸。
如果P4變異蛋白片段在受試者中誘導對NTHi的保護性免疫反應，它用于下述方法。片段包括截短P4蛋白的羧基末端區(qū)域。例如，在約殘基200截短的P4變異蛋白(即它包含SEQ ID NO3的氨基酸1-200)是所需片段。類似地，在約殘基210、221或232截短的P4變異蛋白是所需片段?？蛇x擇本發(fā)明非酶活性、免疫活性P4變體的其它片段。前述片段也包能含一個或多個上述特定突變。
其它合適的P4變異蛋白可包括其中一個或多個氨基酸殘基含取代基團的蛋白。另一種合適的P4變異蛋白中多肽與另外的化合物融合，如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)。另外一種合適的P4變異蛋白中其它氨基酸與多肽融合，如前導肽或分泌序列或用于提高P4變異蛋白的免疫原性的序列。P4變異蛋白的其它修飾包括上述在P4的N末端缺失信號或前導序列，即由SEQ ID NO1的核苷酸148-208編碼，和/或缺失不影響免疫原性的其它區(qū)域。類似地，本文所述P4變異蛋白的修飾包括用另外的信號或前導序列取代信號或前導序列。參見例如美國專利號5,780,601，納入本文供參考。
另一個合適的P4變異蛋白的例子中任選氨基酸(如-Gly-Ser-)或其它氨基酸或化學化合物間隔可包括在肽末端，用于將蛋白連接一起或連接到載體。例如，有用的P4變異蛋白可包括與載體蛋白偶聯(lián)的一種或多種上述P4變異蛋白。另外，有用的P4變異蛋白可存在于含多種P4變異蛋白的融合蛋白，P4變異蛋白任選與載體蛋白偶聯(lián)。對于這些實施方案，載體蛋白最好是能提高所選P4變異蛋白免疫原性的蛋白或其它分子。這種載體可以是同樣具有輔佐效果的較大分子。示范的常規(guī)蛋白載體不限于包括大腸桿菌DnaK蛋白、半乳糖激酶(galK，它催化細菌中半乳糖代謝的第一步)、泛素、α-交配因子、β-半乳糖苷酶和流感NS-1蛋白。類毒素(即編碼天然產(chǎn)生毒素的序列，有足夠的修飾去除其毒性)如白喉類毒素和破傷風類毒素、它們各自的毒素和這些蛋白的任何突變形式如CRM197(白喉毒素的非毒性形式，參見美國專利號5,614,382)也能用作載體。其它載體包括假單胞菌的外毒素A、大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素和輪狀病毒顆粒(包括輪狀病毒和VP6顆粒)。另外，可使用載體蛋白或其它免疫原性蛋白的片段或抗原表位。例如，半抗原可偶聯(lián)細菌毒素的T細胞抗原表位。參見美國專利號5,785,973。類似地，可使用多種細菌熱激蛋白如分枝桿菌hsp-70。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是另一種有用載體。本領域技術人員能容易地選擇適當載體用于此部分。融合蛋白可通過偶聯(lián)蛋白質(zhì)物質(zhì)的標準技術來形成。融合可表達自融合的基因構(gòu)建物，基因構(gòu)建物由下述重組DNA技術制備。
本文所述其它合適的P4變異蛋白能通過修飾不同于特定示范的P4變異蛋白或肽，修飾不恢復酶活性、不減少免疫原性或組合這些特性。例如，可進行保守性氨基酸變化，盡管它們改變P4變異蛋白的一級結(jié)構(gòu)，但通常不改變其功能。
在進行這些變化時，可考慮氨基酸的親水指數(shù)。本領域一般理解親水氨基酸指數(shù)在賦予活性生物功能中對多肽的重要性(Kyte&Doolittle，1982)。已知某些氨基酸能取代具類似親水指數(shù)或分數(shù)的其它氨基酸且仍產(chǎn)生有相似生物活性的多肽。各氨基酸在其疏水性和電荷特征基礎上賦予親水指數(shù)。這些指數(shù)是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
認為氨基酸殘基的相對親水特征決定所得多肽的二級和三級結(jié)構(gòu)，進而確定多肽與其它分子的相互作用，如酶、底物、受體、抗體、抗原等。本領域已知氨基酸能被具類似親水指數(shù)的另一種氨基酸取代且仍獲得功能相等的多肽。在這種變化中，氨基酸取代的親水指數(shù)優(yōu)選在+/-2內(nèi)，特別優(yōu)選+/-1內(nèi)，甚至更特別優(yōu)選+/-0.5內(nèi)。
取代類似氨基酸也能在疏水性基礎上進行，特別是其中產(chǎn)生的生物功能相等多肽或肽用于免疫實施方案。納入本文作為參考的美國專利號4,554,101陳述了多肽的最大局部平均疏水性，這由其相鄰氨基酸的疏水性控制，與其免疫原性和抗原性相關，即多肽的生物性質(zhì)。
如美國專利號4,554,101所詳述，下列疏水性值賦予氨基酸殘基精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；蘇氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。據(jù)說氨基酸能被具類似疏水性值的另一種氨基酸取代且仍獲得功能相等的多肽，特別是免疫相當?shù)亩嚯摹Ｔ谶@種變化中，氨基酸取代的疏水性值優(yōu)選在+/-2內(nèi)，特別優(yōu)選+/-1內(nèi)，甚至更特別優(yōu)選+/-0.5內(nèi)。
如上所概括，氨基酸取代一般以氨基酸側(cè)鏈取代基的相對類似性為基礎，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等?？紤]到上述不同特征的示范取代對本領域技術人員熟知且包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
此外，通常不改變P4變異蛋白一級序列的修飾包括體內(nèi)或體外化學衍生多肽，如乙?；⒓谆螋然?。同樣包括作為本發(fā)明P4變異蛋白的是由糖基化修飾的蛋白，如在合成和加工中或在進一步加工步驟中通過修飾多肽的糖基化模式產(chǎn)生的蛋白；或通過將多肽暴露于影響糖基化的酶，如哺乳動物糖基化酶或去糖基化酶。同樣包括作為P4變異蛋白的是上面鑒定的誘變序列，具有磷酸化氨基酸殘基如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸。
同樣包括作為P4變異蛋白的是以上已修飾的序列，用普通分子生物技術修飾以改進它們對蛋白降解的抗性或最優(yōu)化溶解性質(zhì)。這些P4變異蛋白包括的蛋白含除了天然產(chǎn)生L-氨基酸的殘基，如D-氨基酸或非天然產(chǎn)生的合成氨基酸?？纱嬖谟诒景l(fā)明P4變異蛋白的已知修飾不限于是酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共價附著黃素、共價附著血紅素部分、共價附著核苷酸或核苷酸衍生物、共價附著脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物、共價附著磷脂酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、形成共價交聯(lián)、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲?；?、γ-羧化、GPI-錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解加工、異戊烯化、外消旋、硒化(selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)移-RNA介導的氨基酸加入蛋白如精氨酰化和泛素化。
B.編碼P4變異蛋白的核酸分子本發(fā)明的另一方面包括分離、合成或重組核酸分子和編碼上述P4變異蛋白的序列，具有針對突變的特定位點或P4蛋白的片段(片段可進一步包含一個或多個這些突變)。
分離的核苷酸分子包括編碼P4變異蛋白的核酸序列，可優(yōu)選在指導宿主細胞中P4變體表達的調(diào)節(jié)序列的控制下。如本文所述，這種核酸分子能用于體外表達P4變異蛋白或在人中體內(nèi)表達P4變異蛋白。
如本文所用，術語“分離的核苷酸分子或序列”指沒有污染其它生物成分的核酸區(qū)段或片段，其它生物成分可與其自然環(huán)境中的分子或序列相關。例如，本發(fā)明分離核苷酸分子或序列的一個實施方案是從天然產(chǎn)生狀態(tài)中其側(cè)翼序列分離的序列，例如從通常與片段相鄰的序列取出的DNA片段，如與天然產(chǎn)生基因組中片段相鄰的序列。此外，改編本發(fā)明的核苷酸序列和分子以編碼本發(fā)明的P4變異蛋白。因此，術語“分離的核苷酸分子或序列”也應用于大體純化自其它成分的核酸序列或分子，其它成分在細胞中天然伴隨著未誘變的核酸，例如RNA或DNA或蛋白。本發(fā)明的分離核苷酸分子或序列也包括由其它常規(guī)方法制備的序列和分子，如重組方法、合成方法例如誘變、或這些方法的組合。構(gòu)建本發(fā)明的核苷酸序列或分子不應僅限于本文所示的特定核苷酸序列，而應包括與本文所示的核苷酸序列共享同源性(即有序列同一性)的任何和所有核苷酸序列。
當指核酸或其片段時，術語“大體同源”或“大體相似”表示當適當核苷酸插入或缺失與另外核酸(或其互補鏈)最佳排列時，核苷酸序列同一性為至少約70％的核苷酸堿基，由任何熟知的序列同一性算法測量，如GCG版本6.1中的程序Fasta。如本文所用，術語“同源”指兩個聚合分子間的序列相似性，如兩個核酸分子，如兩個DNA分子或兩個RNA分子，或兩個多肽分子間。當兩個分子的核苷酸或氨基酸位置都被相同單體核苷酸或氨基酸占據(jù)時，例如如果兩個DNA分子各自的位置被腺嘌呤占據(jù)，則它們在此位置同源。兩種序列間的同源性是匹配或同源位置數(shù)量的直接功能，例如如果兩種化合物序列的一半(如10亞基長度聚合物中的5個位置)位置同源，則兩種序列是50％同源。如果90％位置如10個中的9個匹配或同源，兩種序列共享90％的同源性。通過例子，DNA序列3’ATTGCC5’和3’TATGCG5’共享50％的同源性。如本文所用，術語“大體同源”指DNA或RNA與所需核酸約70％同源，更優(yōu)選約80％同源且最優(yōu)選約90％同源。
發(fā)明也涉及分離的核苷酸分子，所含核酸序列與編碼NTHi的P4變異蛋白的核酸序列至少70％、80％或90％同源，P4變異蛋白與野生型P4蛋白相比酶活性減少且誘導野生型P4蛋白的抗體和/或具有抗NTHi的殺菌活性，其中P4變異蛋白具有的突變選自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基39的突變，它在野生型P4蛋白中是谷氨酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基48的突變，它在野生型P4蛋白中是苯丙氨酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64的突變，它在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基161的突變，它在野生型P4蛋白中是賴氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基218的突變，它在野生型P4蛋白中是天冬酰胺；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基35和37的突變，它們在野生型P4蛋白中是丙氨酸，其中突變不是谷氨酸、谷氨酰胺或蘇氨酸；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64和66的突變，它們在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(h)一個或多個突變(a)-(g)的組合，其中核酸序列編碼至少一種(a)-(g)突變。
此外，由于遺傳密碼的簡并性，本文所述編碼P4突變氨基酸殘基的任何三核苷酸密碼子在發(fā)明的范圍內(nèi)。
其中如本文所述，P4變異蛋白和/或編碼它們的DNA序列或者用于本文所述核酸分子或組合物的其它序列通過它們與鑒定序列的百分比同源性或同一性來確定，用于計算百分比同源性或百分比同一性的算法包括下列Smith-Waterman算法(J.F.Collins等，1988，Comput.Appl.Biosci.，467-72；J.F.Collins等，《分子序列比較和排列》(Molecular Sequence Comparison andAlignment)(M.J.Bishop等主編)，《實踐方法系列核酸和蛋白序列分析XVIII》(Practical Approach SeriesNucleic Acid and Protein Sequence AnalysisXVIII)，IRL PressOxford，England，UK(1987)417頁)、BLAST和FASTA程序(E.G.Shpaer等，1996，Genomics，38179-191)。這些參考文獻納入本文供參考。
如本文所述，兩種DNA描述為“可操作連接”是指單鏈或雙鏈DNA包括這兩個DNA中的每一個且兩個在DNA內(nèi)的排列方式使至少一種DNA序列能發(fā)揮生理作用，由此它對另一種具有特征。
為用于生成本發(fā)明P4變異蛋白或施用它在細胞中體內(nèi)生成，編碼序列的各P4變異蛋白和必需的調(diào)節(jié)序列優(yōu)選存在于單獨的病毒或非病毒重組載體(包括傳遞核酸分子到細胞中的非病毒方法)。另外，兩種或多種這些編碼P4變異蛋白的雙份拷貝或編碼本發(fā)明多種不同P4變異蛋白的核酸序列可包含于多順反子轉(zhuǎn)錄物，即設計用于表達多種基因產(chǎn)物的單分子。
如本文所述，術語“載體”指來源于病毒或非病毒的DNA分子，如設計用于編碼外源或異源核酸序列的細菌屬。因此，此術語包括常規(guī)細菌質(zhì)粒。這種質(zhì)粒或載體可包括來自病毒或噬菌體的質(zhì)粒序列。這種載體包括染色體載體、附加型載體和來源于病毒的載體，如來源于細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件和病毒的載體。載體也能來源于它們的組合，如來源于質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件、粘粒和噬菌粒。術語也包括將基因從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞的非復制型病毒。術語也應包括促進核酸轉(zhuǎn)移到細胞的非質(zhì)粒和非病毒化合物，例如聚賴氨酸化合物等。
發(fā)明的核酸分子包括非病毒載體和根據(jù)本發(fā)明將編碼P4變異蛋白的序列傳遞到宿主細胞的方法。多種非病毒載體在本領域已知且可包括但不限于質(zhì)粒、細菌載體、噬菌體載體、“裸露”DNA和與陽離子脂質(zhì)或聚合物縮合的DNA。
細菌載體的例子包括但不限于來源于卡介菌(BCG)、沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌和李斯特菌的序列。合適的質(zhì)粒載體包括例如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pK37、pKC101、pAC105、pVA51、pKH47、pUB110、pMB9、pBR325、Col E1、pSC101、pBR313、pML21、RSF2124、pCR1、RP4、pBAD18和pBR328。
合適誘導型大腸桿菌表達載體的例子包括pTrc(Amann等.，1988Gene，69301-315)、阿拉伯糖表達載體(如pBAD18，Guzman等，1995J.Bacteriol.，1774121-4130)和pETIId(Studier等.，1990 Methods inEnzymology，18560-890)。來自pTrc載體的靶基因表達取決于來自雜合trp-lac融合啟動子的宿主RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。來自pETIId載體的靶基因表達取決于來自T7gn10-lac融合啟動子的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄由共表達的病毒RNA聚合酶T7 gn 1介導。此病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS I 74(DE3)提供，來自lacUV 5啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下攜帶T7 gn 1基因的居留原噬菌體。pBAD系統(tǒng)取決于受araC基因調(diào)節(jié)的誘導型阿拉伯糖啟動子。該啟動子在阿拉伯糖存在時被誘導。
示范載體是單鏈或雙鏈噬菌體載體。例如，合適的克隆載體包括但不限于載體如噬菌體λ載體系統(tǒng)、λgt11、μ gt μ WES.tB、Charon 4、λgt-WES-λB、Charon28、Charon 4A、λgt-1-λBC、λgt-1-λB、M13mp7、M13mp8或M13mp9。
在另一個實施方案中，表達載體是酵母表達載體。在酵母如釀酒酵母中表達的載體例子包括pYepSec 1(Baldari等.，1987)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982)、pJRY88(Schultz等.，1987)和pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。
另外，使用桿狀病毒表達載體?？捎糜谠谂囵B(yǎng)昆蟲細胞(如Sf9或Sf21細胞)中表達蛋白的桿狀病毒載體包括pAC系列(Smith等.，1983)和pVL系列(Lucklow和Summers，1989)。
在另外一個實施方案中，哺乳動物表達載體用于在哺乳動物細胞中表達。哺乳動物表達載體的例子包括pCDM8(Seed，1987)和pMT2PC(Kaufman等.，1987)。當用于哺乳動物細胞時，表達載體的控制功能通常由病毒調(diào)節(jié)元件提供。
一類重組載體是重組單鏈或雙鏈RNA或DNA病毒載體。本領域已知多種病毒載體系統(tǒng)。這種載體的例子包括但不限于重組腺病毒載體、以單純皰疹病毒(HSV)為基礎的載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、雜合腺病毒/AAV載體、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒、重組痘病毒載體、重組痘苗病毒載體、SV-40載體、昆蟲病毒如桿狀病毒等，構(gòu)建它們用于攜帶或表達所選感興趣的核酸組合物。
能使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括EP 0 415 731；國際專利出版號WO 90/07936；WO94/03622；WO 93/25698和WO 93/25234；美國專利號5,219,740；國際專利出版號WO 93/11230和WO 93/10218；Vile和Hart，1993 Cancer Res.533860-3864；Vile和Hart，1993 Cancer Res.53962-967；Ram等.，1993 Cancer Res.5383-88；Takamiya等.，1992 J.Neurosci.Res.33493-503；Baba等.，1993 J.Neurosurg.79729-735；美國專利號4,777,127；GB專利號2,200,651和EP 0 345 242所述。合適的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的例子包括國際專利出版號WO 91/02805所述。
以甲病毒為基礎的載體也可用作編碼P4變異蛋白的核酸分子。這種載體能構(gòu)建自多種甲病毒，包括例如辛德比斯病毒載體、塞姆利基森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、羅斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532)。這種載體系統(tǒng)的代表例子包括美國專利號5,091,309；5,217,879和5,185,440；國際專利出版號WO 92/10578；WO 94/21792；WO 95/27069；WO 95/27044和WO 95/07994所述。
腺病毒載體的例子包括Berkner，1988 Biotechniques 6616-627；Rosenfeld等.，1991 Science 252431-434；國際專利出版號WO 93/19191；Kolls等.，1994PNAS 91215-219；Kass-Eisler等.，1993 PNAS 9011498-11502；Guzman等.，1993Circulation 882838-2848；Guzman等.，1993 Cir.Res.731202-1207；Zabner等.，1993 Cell 75207-216；Li等.，1993 Hum.Gene Ther.4403-409；Cailaud等.，1993 Eur.J.Neurosci.51287-1291；Vincent等.，1993 Nat.Genet.5130-134；Jaffe等.，1992 Nat.Genet.1372-378和Levrero等.，1991 Gene 101195-202所述。示范腺病毒載體包括國際專利出版號WO 94/12649；WO 93/03769；WO94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655所述。其它腺病毒載體包括來源于黑猩猩腺病毒的載體，如美國專利號6,083,716所述。
另一個病毒載體以細小病毒為基礎，如腺伴隨病毒(AAV)。代表例子包括國際專利出版號WO 93/09239；Samulski等.，1989 J.Virol.633822-3828；Mendelson等.，1988 Virol.166154-165和Flotte等.，1993 PNAS 9010613-10617所述AAV載體。其它特別理想的AAV載體包括以AAV1為基礎的；參見2000年5月18日發(fā)表的國際專利出版號WO 00/28061。其它理想AAV載體包括假型載體，即含有由AAV 5’ITRS、轉(zhuǎn)基因和AAV 3’ITRs組成的小基因，它們包裝于對AAV ITRs異源的AAV血清型的衣殼中。生成這種假型AAV載體的方法詳細描述于國際專利出版號WO 01/83692。
在一個實施方案中，發(fā)明的核酸分子是“裸露”DNA，它可結(jié)合的聚合物包括傳統(tǒng)聚合物和非傳統(tǒng)聚合物如含環(huán)式糊精的聚合物和保護性、活性非縮合聚合物。“裸露”DNA和與陽離子脂質(zhì)或聚合物縮合的DNA一般用化學方法傳遞給細胞。一些化學方法在本領域已知用于細胞傳遞且包括使用脂質(zhì)、聚合物或與DNA復合的蛋白質(zhì)，任選相同縮合入顆粒并傳遞給細胞。另一種非病毒化學方法包括使用陽離子縮合DNA，隨后置于脂質(zhì)體并根據(jù)本發(fā)明使用。參見C.Henry，2001 Chemicaland Engineering News，79(48)35-41。
核酸分子作為“裸露”DNA直接導入細胞(美國專利號5,580,859)或制成有試劑的組合物，試劑促進免疫，如布比卡因和其它局部麻醉劑(美國專利號6,127,170)。
以上所有病毒和非病毒載體的成分可容易地選自本領域已知材料和且獲得自制藥工業(yè)。不認為選擇載體成分和調(diào)節(jié)序列是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明編碼P4變異蛋白的各核酸序列優(yōu)選在調(diào)節(jié)序列的控制下，調(diào)節(jié)序列指導哺乳動物細胞中各核酸序列產(chǎn)物的復制和產(chǎn)生。術語“啟動子/調(diào)節(jié)序列”指表達核酸所需的DNA序列可操作連接于啟動子/調(diào)節(jié)序列。在一些情況中，啟動子/調(diào)節(jié)序列可以組織特異方式發(fā)揮功能。例如，啟動子/調(diào)節(jié)序列僅能驅(qū)動在特定組織類型的細胞中表達。在一些情況中，此序列可以是核心啟動子序列，在其它情況中，此序列也可包括增強子序列和以組織特異方式表達所需的其它調(diào)節(jié)元件。
編碼本發(fā)明P4變異蛋白的核酸分子和/或重組載體進一步優(yōu)選包括調(diào)節(jié)序列。例如，這種調(diào)節(jié)序列包括驅(qū)動P4變異蛋白表達的啟動子。啟動子/調(diào)節(jié)序列優(yōu)選位于編碼序列的5’末端，從而它驅(qū)動細胞中P4變異蛋白的表達。
合適的啟動子可容易地選自組成型啟動子、誘導型啟動子、組織-特異啟動子和其它。非特異活性且在編碼本發(fā)明P4變異蛋白的核酸分子中使用的組成型啟動子的例子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子(任選有RSV增強子)、巨細胞病毒(CMV)啟動子(任選有CMV增強子)(參見例如Boshart等.，Cell，41521-530(1985))、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子和EF1α啟動子(Invitrogen)。
由外源提供化合物調(diào)節(jié)的誘導型啟動子包括但不限于阿拉伯糖啟動子、鋅-誘導型綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(Dex)-誘導型小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統(tǒng)(WO 98/10088)、蛻皮激素昆蟲啟動子(No等，1996Proc.Natl.Acad.Sci.USA，933346-3351)、四環(huán)素-阻抑系統(tǒng)(Gossen等，1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895547-5551)、四環(huán)素-誘導系統(tǒng)(Gossen等，1995Science，2681766-1769，也參見Harvey等，1998 Curr.Opin.Chem.Biol.，2512-518)、RU486-誘導系統(tǒng)(Wang等，1997 Nat.Biotech.，15239-243和Wang等，1997 Gene Ther.，4432-441)和雷帕霉素-誘導系統(tǒng)(Magari等，1997J.Clin.Invest.，1002865-2872)。
其它可用于本文的誘導型啟動子類型由特定生理狀態(tài)調(diào)節(jié)，如溫度或急性期或僅在復制細胞中。有用的組織特異啟動子包括來自編碼骨骼β-肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈2A、肌營養(yǎng)不良蛋白、肌肉肌酸激酶的基因的啟動子，以及活性高于天然產(chǎn)生啟動子的合成肌肉啟動子(參見Li等.，1999 Nat.Biotech.，17241-245)。組織特異啟動子的例子已知用于肝(白蛋白，Miyatake等.1997J.Virol.，715124-32；乙肝病毒核心啟動子，Sandig等.，1996 GeneTher.，31002-9；α-胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等.，1996 Hum.GeneTher.，71503-14)、骨(骨鈣蛋白，Stein等.，1997 Mol.Biol.Rep.，24185-96；骨涎蛋白，Chen等.，1996 J.Bone Miner.Res.，11654-64)、淋巴細胞(CD2，Hansal等.，1988 J.Immunol.，1611063-8；免疫球蛋白重鏈；T細胞受體α鏈)、神經(jīng)元(神經(jīng)元-特異性烯醇酶(NSE)啟動子，Andersen等.1993 Cell.Mol.Neurobiol.，13503-15；神經(jīng)絲輕鏈基因，Piccioli等.，1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，885611-5；神經(jīng)元-特異性vgf基因，Piccioli等.，1995 Neuron，15373-84)。參見例如國際專利出版號WO 00/55335的另外已知啟動子列表，這些啟動子用于本文。
用于包含于本發(fā)明核酸序列、分子或載體的另外調(diào)節(jié)序列包括但不限于增強子序列、聚腺苷酸化信號、剪接供體序列和剪接受體序列、分別位于待翻譯多肽開始和末端的轉(zhuǎn)錄起始和終止位點、用于轉(zhuǎn)錄區(qū)翻譯的核糖體結(jié)合位點、抗原決表位標簽、核定位序列、IRES元件、戈德堡-霍格內(nèi)“TATA”元件、限制性酶切割位點、可選擇標記等。增強子序列包括例如72bp的SV40 DNA串聯(lián)重復或逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復或LTRs等并用于增加轉(zhuǎn)錄效率。常規(guī)選擇啟動子和其它共同載體元件且有許多這類序列可用于設計本發(fā)明中有用的核苷酸分子和載體。參見例如Sambrook等.，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning.A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989)和其引用的參考文獻，例如3.18-3.26和16.17-16.27頁以及Ausubel等.，《最新分子生物學實驗指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley&Sons，New York(1989)。本領域技術人員可容易地從這些已知調(diào)節(jié)序列中選擇以制備本發(fā)明的分子。選擇這類調(diào)節(jié)序列不是本發(fā)明的限制。
C.產(chǎn)生本發(fā)明P4變異蛋白和核苷酸分子的方法制備或合成本文所示核苷酸序列和P4變異蛋白以及含本發(fā)明核苷酸分子或P4變異蛋白的組合物在使用現(xiàn)有材料的本領域普通技術人員的能力范圍內(nèi)。合成方法不是本發(fā)明的限制。下面的例子詳述了本發(fā)明編碼P4變異蛋白的序列合成的較佳實施方案。
本發(fā)明的P4變異蛋白和核苷酸分子和序列可通過化學合成方法、重組遺傳工程方法、定點誘變和這些方法的組合產(chǎn)生。
例如，本發(fā)明的核苷酸序列/P4變異蛋白可采用已知化學合成技術來常規(guī)制備，例如固相化學合成，如Merrifield，1963 J.Amer.Chem.Soc.，852149-2154；J.Stuart和J.Young，固相肽合成》(Solid Phase PeptideSynthesis)，Pierce Chemical Company，Rockford，IL(1984)；Matteucci等.，1981J.Am.Chem.Soc.，1033185；Alvarado-Urbina等.，1980 Science，214270和Sinha，N.D.等.，1984 Nucl.Acids Res.，134539所述。也參見例如《蛋白質(zhì)-結(jié)構(gòu)和分子性質(zhì)》(PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES)，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993；Wold，F(xiàn).，“翻譯后蛋白修飾觀點和前景”(Posttranslational Protein ModificationsPerspectives and Prospects)，1-12頁，《翻譯后共價修飾蛋白》(POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS)，B.C.Johnson主編，Academic Press，New York，1983；Seifter等.，1990 Meth.Enzymol.，182626-646和Rattan等.，1992 Ann.N.Y.Acad.Sci.，66348-62。
另外，重組構(gòu)建本發(fā)明組合物可用常規(guī)分子生物技術、定點誘變、遺傳工程或聚合酶鏈式反應，如用本文提供的信息在宿主微生物中用任選的其它免疫原和任選的載體蛋白克隆和表達編碼P4變異蛋白的核苷酸分子，(參見例如Sambrook等.，《分子克隆實驗室手冊》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory.NewYork(1989)；Ausubel等.，《最新分子生物學實驗指南》，John Wiley&Sons，NewYork(1997))。P4變異蛋白和任選的免疫原的編碼序列能合成制備(W.P.C.Stemmer等，Gene，16449(1995))。另外，編碼P4野生型蛋白的DNA可如納入本文供參考的美國專利號5,780,601所述分離自流感嗜血桿菌并誘變。
一般，重組DNA技術包括通過合成獲得或如上所述分離編碼P4變異蛋白的DNA序列，并將其導入表達它的適當載體/宿主細胞表達系統(tǒng)。所述將DNA插入表達載體的任何方法可用于將啟動子和其它調(diào)節(jié)控制元件連接入所選重組載體的特定位點。本發(fā)明的重組P4變異蛋白可作為脂質(zhì)化或非脂質(zhì)化蛋白產(chǎn)生，分別使用P4前導肽編碼序列或無前導肽序列(或前導肽序列沒有上面討論的特定脂肪酸乙?；?。
多種宿主細胞載體系統(tǒng)能用于表達本發(fā)明的P4變異蛋白。用合成核酸分子克隆和表達本發(fā)明P4變異蛋白和其它組合物的系統(tǒng)包括使用重組技術中熟知的不同微生物和細胞。宿主細胞可選自任何生物體，包括原核(如細菌)細胞和真核細胞，包含哺乳動物、昆蟲細胞、酵母細胞。用于本發(fā)明不同方法和組合物的細胞優(yōu)選是細菌細胞。
合適的細菌細胞包括例如大腸桿菌、桿菌和鏈霉菌的不同菌株。酵母細胞如酵母屬和畢赤酵母屬、昆蟲細胞如Sf9和Sf21也是用于生產(chǎn)目的的有用宿主細胞。哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、NIH3T3、PER C6、NSO、VERO或COS細胞也是合適的宿主細胞。
載體可選自上述一種病毒載體或非病毒載體，但必須與所用宿主細胞相容。重組DNA載體可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染(取決于載體/宿主細胞系統(tǒng))導入適當宿主細胞(細菌、病毒、酵母、哺乳動物細胞等)。宿主-載體系統(tǒng)包括但不限于用噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細菌；微生物如含酵母載體的酵母；用病毒(如牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳動物細胞系統(tǒng)和用病毒(如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)。
選擇其它合適的宿主細胞和用于轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、擴增、篩選、產(chǎn)物生成和純化的方法能由本領域技術人員參考已知技術來完成。參見例如Gething和Sambrook，1981 Nature，293620-625。
通常，宿主細胞在培養(yǎng)條件下維持一段足表達的時間。培養(yǎng)條件在本領域熟知且包括離子組成和濃度、溫度、pH等。一般，轉(zhuǎn)染細胞在培養(yǎng)基中維持于培養(yǎng)條件下。不同細胞類型的合適培養(yǎng)基在本領域熟知。在一個較佳實施方案中，溫度從約20℃到約50℃，更優(yōu)選從約30℃到約40℃，甚至更優(yōu)選約37℃。
pH優(yōu)選從約6.0的值到約8.0的值，更優(yōu)選從約6.8的值到約7.8的值，最優(yōu)選約7.4。滲量濃度優(yōu)選從約200毫摩爾滲透壓每升(mosm/L)到約400mosm/L，更優(yōu)選從約290mosm/L到約310mosm/L。轉(zhuǎn)染和表達編碼蛋白所需的其它生物條件在本領域熟知。
重組P4變異蛋白從宿主細胞或其膜或培養(yǎng)這些細胞的培養(yǎng)基中回收或收集?；厥瞻ǚ蛛x和純化重組P4變異蛋白。多肽的分離和純化技術在本領域熟知且包括過程如沉淀、過濾、層析、電泳等。
當通過常規(guī)重組方法產(chǎn)生時，本發(fā)明的P4變異蛋白可通過常規(guī)方法從細胞或其培養(yǎng)基分離和純化，包括層析(如離子交換、親和和大小柱層析)、離心、溶解度差異或通過任何其它純化蛋白的標準技術。存在一些技術用于從原核細胞純化異源蛋白。參見美國專利號4,518,526；4,599,197和4,734,362。然而，產(chǎn)生的純化制品應大體上沒有可能對人有害的宿主毒素。特別是當表達于革蘭氏陰性菌宿主細胞如大腸桿菌時，純化肽或蛋白應大體上沒有內(nèi)毒素污染。參見例如Sambrook等.，《分子克隆 實驗室手冊》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork(1989)。
用于發(fā)明方法和組合物的P4變異蛋白不限于本文所列任何特定示范過程的產(chǎn)物。事實上，制備蛋白可通過上面所引用的方法或本說明書其它地方所引用的方法。分離和產(chǎn)生用于這類用途的重組或合成蛋白組合物在本領域技術范圍內(nèi)。所得組合物能制成有任意數(shù)量的任選免疫原的免疫原性組合物并通過體內(nèi)測定篩選功效，如下面例子所述的BC測定。另外，如上所述制備的蛋白和/或核苷酸分子可用于診斷測定。
D.本發(fā)明的免疫原性組合物本發(fā)明的P4變異蛋白和編碼它們的核酸分子可用于多種免疫原性組合物以誘導抗非典型流感嗜血桿菌的保護性免疫反應。這種免疫原性組合物能用于防止或減少對急性中耳炎和NTHi引起的其它疾病的敏感性。免疫原性組合物通常用于免疫兒童或成人抗中耳炎或它們可用于有感染中耳炎危險的兒童(例如有耳感染史的兒童)。
這些NTHi的變異P4蛋白也適合包含于抗多種典型流感嗜血桿菌菌株的免疫原性組合物，如流感嗜血桿菌b型，因為編碼P4蛋白的hel基因在流感嗜血桿菌菌株內(nèi)和之間抗原性保守。
這種免疫原性組合物可制成單價和多價疫苗。除了編碼P4變異蛋白的核酸分子或蛋白本身之外，這類組合物包含另一抗原或表達其它抗原的核苷酸分子。這些用于本發(fā)明免疫原性組合物的另外抗原包括其它抗原的B或T細胞抗原表位。這些與本發(fā)明P4變異蛋白共施用的“其它抗原”包括但不限于流感嗜血桿菌的其它抗原，如流感嗜血桿菌的其它外膜蛋白(或有其抗原表位的肽或蛋白)。這類流感嗜血桿菌的外膜蛋白包括15,000-道爾頓肽聚糖相關外膜脂蛋白(PAL)和15,000-道爾頓的嗜血桿菌脂蛋白PCP(Deich，R.A.等.1988 J.Bacteriol.170(2)489-498)。“其它”抗原也可包括流感嗜血桿菌的寡-或多糖莢膜成分，如多核糖基磷酸核醣醇(PRP)或者流感嗜血桿菌或其它微生物的脂多糖、脂寡糖或脂糖成分?？砂诒景l(fā)明免疫原性組合物的另外“其它”抗原包括其它微生物(如有被囊或無被囊的細菌、病毒、真菌和寄生蟲)。例如，中耳炎中包括的其它微生物的抗原如肺炎鏈球菌(包括但不限于一種或多種已知肺炎鏈球菌多肽、脂多糖-蛋白綴合物和多糖-蛋白綴合物，包括但不限于現(xiàn)有的23價肺炎球菌莢膜多糖疫苗和7價肺炎球菌多糖-蛋白綴合物疫苗)、化膿鏈球菌A組、金黃色葡萄球菌、呼吸合胞病毒和卡他募拉菌(Moraxella catarrhalis)(包括但不限于UspA1、UspA2、B1、C/D、E和74kDa蛋白)可包含于本發(fā)明的免疫原性組合物。
1.在免疫原性組合物中使用P4變異蛋白P4變異蛋白最好制成免疫原性組合物以誘導保護性免疫反應。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物在藥學上可接受載體中包含一種或多種上述P4變異蛋白。這種制劑包括P4變異蛋白，結(jié)合藥學上可接受載體如無菌水或無菌等滲鹽水。如本文所用，術語“藥學上可接受載體”指包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等，與施用給人相容。適當載體對于本領域技術人員是顯然的且大部分取決于施用途徑。
制劑包括但不限于懸浮液、溶液、油或水載體中的乳劑、糊和可移植的緩釋或可生物降解制劑。這種制劑可進一步包括一種或多種另外組分，包括但不限于懸浮、穩(wěn)定或分散劑。在腸胃外施用制劑的一個實施方案中，活性組分以干燥(即粉末或顆粒)形式提供以與合適的載體(如無菌無熱原的水)重建，然后腸胃外施用重建組合物。其它有用的腸胃外施用制劑包括的活性組分以微晶形式、脂質(zhì)體制劑、或作為可生物降解聚合物系統(tǒng)的成分。用于緩釋或移植的組合物可包括藥學上可接受聚合或疏水物質(zhì)如乳劑、離子交換樹脂、微溶聚合物或微溶鹽。
可存在于本發(fā)明蛋白免疫原性組合物的另外成分是佐劑、防腐劑、化學穩(wěn)定劑或其它抗原性蛋白。通常，優(yōu)化穩(wěn)定劑、佐劑和防腐劑以確定在目標人或動物中功效最佳的制劑。合適的示范防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸酯、乙基香蘭素、甘油、苯酚和對氯苯酚?？墒褂玫暮线m穩(wěn)定組分包括例如酪蛋白氨基酸、蔗糖、明膠、酚紅、N-Z胺、二磷酸一鉀、乳糖、乳白蛋白水解物和奶粉。
常規(guī)佐劑用于增強免疫反應。這類佐劑包括MPLTM(3-O-脫?；瘑瘟柞Ｖ珹；Corixa，Hamilton，MT)，描述于納入本文供參考的美國專利號4,912,094。
同樣適合用作佐劑的是氨烷基磷酸葡糖胺化合物(AGP)或其衍生物或類似物，它們獲得自Corixa(Hamilton，MT)且描述于納入本文供參考的美國專利號6,113,918。這種AGP是2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰氨基]乙基2-脫氧-4-O-膦酰-3-O-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷?；?2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰氨基-b-D-吡喃葡糖苷，也稱為529(以前稱為RC529)。此529佐劑制成含水形式或穩(wěn)定乳劑。
其它佐劑包括礦物油和水乳劑、鋁鹽(明礬)如氫氧化鋁，磷酸鋁等、Amphigen、Avridine、L121/鯊烯、D-丙交酯-聚交酯/糖苷、Pluronic多元醇、胞壁酰二肽、滅活包特菌、皂苷如Quil A或StimulonTMQS-21(Antigenics，F(xiàn)ramingham，MA)，描述于納入本文供參考的美國專利號5,057,540、以及由此產(chǎn)生的顆粒如ISCOMS(免疫刺激復合體)、結(jié)核分枝桿菌、細菌脂多糖、合成多核苷酸如含CpG基序的寡核苷酸(美國專利號6,207,646，納入本文供參考)、霍亂毒素(以野生型或突變形式，例如其中氨基酸位置29的谷氨酸被另一種氨基酸取代，優(yōu)選組氨酸，根據(jù)納入本文供參考的國際專利出版號WO 00/18434)、百日咳毒素(PT)或大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LT)，特定是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129；參見例如納入本文供參考的國際專利出版號WO 93/13302和WO 92/19265。多種細胞因子和淋巴因子適合用作佐劑。這種佐劑是粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，它具有納入本文供參考的美國專利號5,078,996所述核苷酸序列。含GM-CSF的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌并保存于美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，登錄號39900。細胞因子白介素-12(IL-12)是另一種佐劑，描述于納入本文供參考的美國專利號5,723,127。其它細胞因子或淋巴因子顯示具有免疫調(diào)節(jié)活性，包括但不限于白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18、干擾素-α、β和γ、粒細胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子α和β，它們適合用作佐劑。
其它合適的佐劑包括但不限于表面活性物質(zhì)(如十六烷基胺、十八烷基胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、二甲基-二十八烷基溴化銨)、甲氧基十六烷基甘油和甘油；Pluronic多元醇聚胺，如吡喃、硫酸葡聚糖脂、聚IC、carbopol；肽，如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、吞噬作用激素；油乳劑；礦物凝膠，如磷酸鋁等以及免疫刺激復合體。免疫原也可摻入脂質(zhì)體或綴合于多糖、脂多糖和/或其它用于疫苗制劑的聚合物。
如上所述，另外的免疫原性成分可包括一種或多種上述另外抗原。為與其它外膜蛋白抗原表位結(jié)合施用，P4變異蛋白能在與其它抗原的混合物中單獨存在或它可作為綴合物或融合蛋白存在，融合蛋白包括其它流感嗜血桿菌或非典型流感嗜血桿菌抗原的多種外膜蛋白決定簇或多種抗原決定簇。例如，流感嗜血桿菌PAL和PCP或來源于它們的任何蛋白、肽或抗原表位能施用作為與本發(fā)明P4變異蛋白的混合物或作為綴合物或融合物。
在用本發(fā)明單獨或所述不同組合的P4變異蛋白制成免疫原性組合物中，免疫原調(diào)節(jié)到合適濃度并用任何合適的佐劑制成。在一些較佳實施方案中，制備發(fā)明的蛋白免疫原性組合物以施用給人受試者，例如以液體、粉劑、氣霧劑、片劑、膠囊、腸溶片劑或膠囊或者栓劑形式。
2.含核酸分子的免疫原性組合物本發(fā)明的另一個免疫原性組合物的實施方案包括編碼本發(fā)明P4變異蛋白的核酸分子和藥學上可接受載體。編碼P4變異蛋白的核酸序列用于抗NTHi的免疫原性組合物，可存在于合適的藥學或生理上可接受載體，如等滲鹽溶液。適當?shù)妮d體對本領域技術人員是顯然的且大部分取決于施用途徑。
另外，免疫原性組合物由多核苷酸分子組成，最好包含任選的多核苷酸促進劑或“協(xié)同劑”(coagent)，如局部麻醉劑、肽、含陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)、脂質(zhì)體或脂顆粒、聚陽離子如聚賴氨酸、分支的三維聚陽離子如樹狀聚體、碳水化合物、陽離子兩親物、去垢劑、芐銨表面活性劑、或另一種促進多核苷酸轉(zhuǎn)移到細胞的化合物。用于本發(fā)明的這種促進劑或協(xié)同劑的非唯一例子描述于美國專利號5,593,972；5,703,055；5,739,118；5,837,533；1996年4月4日發(fā)表的國際專利出版號WO 96/10038和1994年8月8日發(fā)表的國際專利出版號WO94/16737，它們各自納入本文供參考。
更優(yōu)選局部麻醉劑的存在量與核酸分子形成一個或多個復合體。當局部麻醉劑混合本發(fā)明核酸分子或質(zhì)粒時，它形成多種小復合體或包裝DNA的顆粒且是均勻的。因此，在本發(fā)明免疫原性組合物的一個實施方案中，通過混合局部麻醉劑和至少一個本發(fā)明質(zhì)粒來形成復合體。
另外，在本發(fā)明組合物的另一個實施方案中，如果所有質(zhì)粒要以單推注施用，局部麻醉劑可與各質(zhì)粒單獨預混合，然后單獨的混合物結(jié)合于單個組合物以確保所需質(zhì)粒的比例在單個免疫原性組合物中存在。另外，局部麻醉劑和各質(zhì)?？蓡为毣旌喜为毷┯靡垣@得所需比例。以后，術語“復合體”或“一個或多個復合體”或“幾個復合體”用于定義此免疫原性組合物的實施方案，當然該術語包括一個或多個復合體，各復合體含P4變異蛋白編碼質(zhì)粒的混合物或分開形成的復合體混合物，其中各復合體僅包含一類質(zhì)?；蛘咭粋€復合體或一種復合體混合物，其中各復合體含一種多順反子DNA。
復合體直徑優(yōu)選在約50到約150nm間。當促進劑用作局部麻醉劑時，優(yōu)選布比卡因，其量優(yōu)選從約0.1重量百分比到約1.0重量百分比，以多核苷酸組合物的總重量為基礎。也參見國際專利出版號WO99/21591，它納入本文供參考且教授了摻入芐銨表面活性劑作為協(xié)同劑，優(yōu)選施用量在約0.001-0.03重量％間。根據(jù)本發(fā)明，局部麻醉劑的存在量與所述核酸分子的比例為0.01-2.5％w/v局部麻醉劑相對1-10μg/ml核酸。另一個這種范圍是0.05-1.25％w/v局部麻醉劑相對100μg/ml到1ml/ml核酸。
在此多核苷酸免疫過程中，發(fā)明的變異P4蛋白在體內(nèi)瞬時基礎上表達；無遺傳物質(zhì)插入或整合入宿主的染色體。此過程與基因治療有區(qū)別，其目標是將感興趣的遺傳物質(zhì)插入或整合入染色體。測定用于確認通過免疫施用的多核苷酸不在宿主中引起表型轉(zhuǎn)變(美國專利號6,168,918)。
免疫原性組合物也可包含其它添加物，適用于所選組合物的施用模式。發(fā)明組合物也可包括凍干的多核苷酸，它能與其它藥學上可接受賦形劑一起使用，用于開發(fā)粉劑、液體或懸浮劑型。參見例如《Remington藥學的科學和實踐》(TheScience and Practice of Pharmacy)，第2卷，第19版(1995)，如第95章氣霧劑；國際專利出版號WO 99/45966，其教授的內(nèi)容納入本文供參考。如果需要，可結(jié)合或調(diào)整這些組合物的施用途徑。
如上所述，這些含核酸分子的免疫原性組合物可包括編碼一種或多種上述“另外”抗原的核酸序列。例如，編碼單獨抗原的單獨核苷酸分子可混合含編碼P4變異蛋白序列的核苷酸分子。另外，編碼P4變異蛋白的序列能融合DNA序列，序列編碼一種或多種其它流感嗜血桿菌的抗原或其它細菌、病毒、寄生蟲或真菌的抗原，以產(chǎn)生遺傳融合(享有共同的肽骨架)的多價抗原。
這些含核酸分子的免疫原性組合物能包含添加物，添加物適合經(jīng)任何常規(guī)施用途徑來施用。在一些較佳實施方案中，制備發(fā)明的免疫原性組合物以施用給人受試者，例如以液體、粉劑、氣霧劑、片劑、膠囊、腸溶片劑或膠囊或者栓劑形式。
3.含重組病毒的免疫原性組合物在本發(fā)明的另一方面，免疫原性組合物可包含能表達P4變異蛋白(和/或任何另外的免疫原)的重組病毒。合適的非致病病毒可改造以攜帶本發(fā)明核酸分子進入宿主細胞，它們包括痘病毒如牛痘病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、金絲雀痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。對于施用，病毒優(yōu)選是非復制病毒，如缺失E1的腺病毒，典型用于基因治療。作為例子，參見美國專利號5,698,202所述重組復制缺陷型腺病毒。一些這種非致病病毒常用于人基因治療并作為其它疫苗劑的載體，為本領域技術人員已知且可選擇。
攜帶本發(fā)明編碼P4變異蛋白的核酸序列的非復制病毒優(yōu)選懸浮于生物相容溶液或藥學上可接受傳遞載體。合適的載體是無菌鹽水。其它含水和非水等滲無菌注射溶液及含水和非水無菌懸浮液已知是藥學上可接受載體且對本領域技術人員熟知，它們可用于此目的。
此類發(fā)明的免疫原性組合物可任選制成包含其它成分，包括例如上述的佐劑、穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、防腐劑。這種成分對疫苗領域的技術人員熟知。
另一個根據(jù)本發(fā)明適用于免疫原性組合物的實施方案是使用滅活的免疫原性組合物，如培養(yǎng)生長大量表達所需P4變異蛋白的重組病毒以提供必需量的相關抗原并通過常規(guī)方法滅活。表達不同抗原表位的滅活病毒的混合物可用于制成“多價”免疫原性組合物，如納入本文供參考的美國專利號5,780,601所述。此免疫原性組合物也應包含上述合適的佐劑，用于增強對抗原的免疫反應。
4.含共生細菌的免疫原性組合物在本發(fā)明的另外一方面，編碼P4變異蛋白的本發(fā)明的合成核酸分子(包括任何融合蛋白和/或另外抗原)能摻入非致病微生物中。當所得微生物施用給人宿主時，體內(nèi)表達和增殖本發(fā)明的表達組合物以誘導特定抗體形成。例如，非致病共生細菌能用于攜帶本發(fā)明的P4變異蛋白編碼分子且用于施用給病人，它可通過使用常規(guī)方法制備并選自已知的非致病微生物。可用于體內(nèi)外源傳遞本發(fā)明核酸分子給病人的共生細菌包括但不限于多種鏈球菌菌株如戈氏鏈球菌(S.gordonii)，或大腸桿菌、桿菌、鏈霉菌和酵母菌株。
如上所述，本發(fā)明的免疫原性組合物不受選擇常規(guī)、生理上可接受載體、佐劑或其它成分的限制，它們用于上述藥物制品類型。從上述成分制備這些藥學上可接受組合物在本領域技術范圍內(nèi)，這些組合物具有適當pH等滲性、穩(wěn)定性和其它常規(guī)特征。
E.使用方法上述免疫原性組合物可用于在人中誘導抗非典型流感嗜血桿菌的免疫反應的方法。在此方法的一個實施方案中，有效量的上述P4變異蛋白免疫原性組合物施用給病人。組合物中P4蛋白、表達P4變體的核酸分子或表達P4變體的重組病毒的量有效引發(fā)抗NTHi的免疫反應。免疫反應優(yōu)選對NTHi感染起保護作用。
本發(fā)明免疫原性組合物的施用途徑包括但不限于腸胃外施用、腹膜內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、肌肉內(nèi)施用、皮下施用、皮內(nèi)施用、口服施用、局部施用、鼻內(nèi)施用、肺內(nèi)施用、直腸施用、陰道施用等。所有這種途徑適合這些組合物的施用。選擇合適途徑取決于所用免疫原性組合物性質(zhì)和病人年齡、重量、性別及總的健康狀況和免疫原性組合物中存在的抗原和參與醫(yī)師的類似因素。
一般，選擇用于本發(fā)明免疫原性組合物的適當“有效量”或劑量也以所用特定免疫原性組合物以及受試者的生理狀況為基礎，尤其包括被免疫受試者的總的健康狀況和重量。這種選擇和上調(diào)或下調(diào)有效劑量在本領域技術范圍內(nèi)。誘導免疫反應優(yōu)選是保護性反應或在病人中產(chǎn)生外源效果而沒有顯著副作用所需的活性成分量的變化取決于所用藥物組合物和佐劑的任選存在(用于含蛋白的組合物)。
在一個實施方案中，對于含蛋白成分的組合物如上述P4變異蛋白或融合蛋白，各劑量在約1μg到約20mg蛋白免疫原每mL無菌溶液間。其它劑量范圍也可由本領域技術人員考慮。起始劑量后可任選在需要的地方反復加強。
在另一個實施方案中，DNA和載體組合物中核苷酸分子的量可由本領域技術人員選擇和調(diào)節(jié)。在一個實施方案中，各劑量在約50μg到約1mg免疫原編碼核酸如DNA質(zhì)粒每mL無菌溶液間。
對于含本發(fā)明編碼P4變異蛋白的核酸分子的重組病毒，優(yōu)選復制缺陷型病毒，“有效量”是施用途徑中有效的重組病毒的量，用于轉(zhuǎn)染所需受試者的細胞并提供足夠的所選基因的表達水平以提供有益即保護性免疫。能監(jiān)控免疫水平以確定對于加強的需要。然而，當然本領域技術人員可改變這種劑量，這取決于重組病毒的同一性和免疫原的組成(即存在重組病毒傳遞給宿主的另外P4變異蛋白或“其它”抗原)。
攜帶核酸序列的共生細菌的量一般范圍在約103到約1012個細胞/kg間，核酸序列表達待傳遞給病人的P4變異蛋白。這些劑量可由本領域技術人員改變，這取決于所用細菌和活細菌傳遞給宿主的另外P4變異蛋白或“其它”抗原。
F.使用P4變異蛋白作為載體蛋白除了用作主要免疫原之外，P4變異蛋白可用作載體蛋白來賦予或增強其它抗原的免疫原性，其中其它抗原可以是蛋白、多肽、肽、多糖、寡糖、糖、脂多糖、脂寡糖或脂糖。變異P4蛋白與野生型P4蛋白相比酶活性減少，但不一定需要誘導野生型P4蛋白的抗體或具有抗NTHi的殺菌活性，但須是P4變異載體蛋白在SEQID NO3的氨基酸位置122沒有苯丙氨酸。例如，P4變異蛋白通過常規(guī)方法化學綴合多糖或脂多糖或表達為與另一種蛋白的融合蛋白。
G.診斷測定本發(fā)明的P4變異蛋白和核酸分子任選結(jié)合可檢測標記或能檢測免疫復合體的形成或DNA雜交，也可用作測定中的抗原，用于在不同組織和體液中檢測非典型流感嗜血桿菌，如血液、脊髓液、痰等。這些測定和測定模式是常規(guī)的且與使用野生型P4試劑所述模式相同，如美國專利號5,780,601所述。
例如，本發(fā)明的P4變異蛋白可用作放射性免疫測定、ELISA測定、“三明治”測定、沉淀反應、凝膠擴散沉淀反應、免疫擴散測定、凝集測定、熒光免疫測定、蛋白A免疫測定和免疫電泳測定中的試劑。本發(fā)明的P4變異蛋白任選結(jié)合可檢測標記。
本發(fā)明編碼P4變異蛋白的核酸分子和與其雜交的任何核苷酸序列也能用作核酸雜交測定中的探針，以檢測病人的不同組織和體液中的非典型流感嗜血桿菌。合適的雜交測定包括但不限于DNA印跡、RNA印跡和菌落印跡。雜交嚴謹性可取決于測定要求而變化。
合適的可檢測標記包括但不限于蛋白或小化學分子，它能單獨作用或結(jié)合其它分子或蛋白來提供直接或間接可檢測的信號。例如，可檢測標記可以是熒光標記、發(fā)光標記、放射性標記或化學發(fā)光標記。標記也可以是與底物相互作用的酶以產(chǎn)生可檢測信號。參見例如《熒光探針和研究化學只手冊》(Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals)，第6版，R.P.Haugland，MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR(1996)；美國專利號4,542,104和美國專利號5,272,257。其它標記包括綠色熒光蛋白和藍色熒光蛋白。用于核酸分子的合適標記可以是DNA序列，編碼lux基因、β-內(nèi)酰胺酶、半乳糖苷酶如β-半乳糖苷酶(lacZ)、堿性磷酸酶、胸苷激酶、綠色熒光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、熒光素酶或葡糖酸酶(gluconase)。
常規(guī)使用的任何數(shù)量的其它標記系統(tǒng)適合于結(jié)合本發(fā)明的P4變異蛋白和/或編碼P4變異蛋白的核酸序列。技術人員理解選擇和/或執(zhí)行標記系統(tǒng)僅包括途徑實驗。
實施例提供以下例子以闡明本發(fā)明代表性P4變異蛋白的產(chǎn)生和活性。這里所示例子顯示編碼P4變異蛋白的分離核苷酸分子的構(gòu)建、宿主細胞中的重組表達和由此純化。在靈敏的比色測定中分析純化蛋白的酶活性。蛋白也用于和野生型rLP4一起免疫Swiss-Webster小鼠且分析所得抗血清用于抗野生型rLP4的總IgG抗體及抗NTHi的殺菌活性。這些例子證明確定缺乏酶活性而保持野生型免疫原性且引起功能抗體的P4突變體不是繁瑣的事。如下所述構(gòu)建的突變P4蛋白中有3種具有所需免疫性質(zhì)，即引起抗野生型P4的高ELISA效價和抗NTHi的高殺菌抗體水平。本領域技術人員理解盡管以下例子概括了特定試劑和條件，這些試劑和條件不是對本發(fā)明的限制。
實施例1定點誘變P4基因細菌酸性磷酸酶被很好地研究了幾年，在其底物特異性、細胞定位等的基礎上分成多個種類(Thaller，M.C.等，1998.Prot.Sci.，71647-52.9)。具多種細菌酸性磷酸酶間高保守氨基酸的區(qū)域被鑒定為定點誘變的可能區(qū)域以去除或減少酶活性，且通過進行保守性變化來維持三級結(jié)構(gòu)。
合成引物用于引入BsmB1位點和下述所需突變后，在野生型P4上進行定點誘變。用BsmB1消化和再連接產(chǎn)生所需突變P4序列，伴隨著失去BsmB1位點。這些脂質(zhì)化的突變蛋白在大腸桿菌BLR宿主細胞中表達，通過對用于純化脂質(zhì)化的野生型rLP4的標準過程稍微修改來純化。
特別是在野生型P4蛋白中的2個天冬氨酸殘基對酸性磷酸酶活性關鍵的信息基礎上構(gòu)建雙天冬氨酸定點突變。構(gòu)建名為P4-351的突變體，其中在SEQ ID NO3的位置Asp64和Asp66的氨基酸殘基變?yōu)锳la64和Ala66A。構(gòu)建名為P4-D184A、D185A的另外突變體，其中SEQ ID NO3的野生型Asp184和Asp185突變?yōu)锳la184和Ala185。在其它突變體中，定點誘變SEQ ID NO3的氨基酸殘基35和37產(chǎn)生四種蛋白，丙氨酸殘基變?yōu)楣劝彼?A35G，A37G)、蘇氨酸(A35T，A37T)、天冬酰胺(A35D，A37D)或谷氨酰胺(A35Q，A37Q)。構(gòu)建這些突變體以確定另外區(qū)域中除了Asp到Ala的變化是否會使蛋白分子構(gòu)象破壞更少并因此抗野生型P4的免疫原性更好。
另外，進行下列P4蛋白中的單突變以產(chǎn)生P4變異蛋白N218Q、K161R、D64E、Y122F、D64N、D64E和Q39E。此外，位置48的Phe殘基變?yōu)镃ys殘基。選擇此殘基用于誘變，選擇是以它在推定氯高鐵血紅素結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的位置為基礎。
產(chǎn)生多種表達的突變蛋白，如表1所鑒定。
表1.突變體P4變異蛋白和突變
除了F48C和D64A，D66A的所有定點突變體來源于質(zhì)粒pLP339、pBAD18Cam表達載體，在阿拉伯糖啟動子控制下含野生型非典型流感嗜血桿菌(NTHi)P4基因(Green，B.A.，等1991 Infect.Immun.，593191-3198)。突變蛋白D64A，D66A和F48c來源于質(zhì)粒pHel3(Reilly等，1999，上面引用)。
大部分定點突變蛋白用QuickChange誘變試劑盒(Stratagene)根據(jù)廠商說明的構(gòu)建。用于構(gòu)建P4突變的引物列于下表2。本文所用寡核苷酸引物(除了上面引用的Reilly等，1999中所用的)在PerSeptive生物系統(tǒng)寡核苷酸合成儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)上用β-氰乙基亞磷酰胺化學來合成。
表2.定點誘變hel基因所用的引物
BsmBI無縫克隆用于產(chǎn)生一些P4突變體。P4基因部分通過聚合酶鏈反應(PCR)(PE2400熱循環(huán)儀，Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)從質(zhì)粒pLP339擴增。首先，含BsmBI位點和所需突變的引物與適當載體引物配對并用于擴增P4基因部分。另外，第二個含BsmBI位點的引物與適當載體引物配對并用于擴增剩余P4基因部分。連接各P4基因部分且克隆入pCR2.1-TOPO中(Invitrogen)。
由于插入物的存在通過PCR篩選轉(zhuǎn)化體并通過序列分析確認。正確克隆用BsmBI和SacI或SphI(New England Biolabs提供的限制性酶)限制性消化，插入物在低熔點瓊脂糖凝膠上純化。凝膠純化片段在BsmBI位點無縫連接一起。
除了F48C基因，克隆入pCR2.1-TOPO中的誘變P4基因亞克隆入pBAD18Cam(Invitrogen)中以用SacI-SphI位點表達突變P4蛋白。F48C序列用NheI-SacI位點亞克隆入pBAD18Cam中。
實施例2脂質(zhì)化重組突變P4蛋白的表達含這些突變P4蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株BLR中且所有突變P4蛋白在其中重組表達?？寺⊥ㄟ^測序P4基因來確認。含適當質(zhì)粒的BLR過夜培養(yǎng)物生長于Hy-Soy培養(yǎng)基，用含0.05％葡萄糖和30μg/ml氯霉素的NaPO4緩沖，37℃通氣。含相同培養(yǎng)基但減去葡萄糖的燒瓶用1∶20稀釋的過夜培養(yǎng)物接種并在37℃通氣培養(yǎng)，直到OD600達到約2.0。然后細菌用0.5％阿拉伯糖誘導且連續(xù)培養(yǎng)3小時。細菌細胞通過10,000xg 4℃離心30分鐘來收集，細胞沉淀用PBS洗1X。再沉淀細胞并在-20℃冷凍保存。用12％膠通過SDS-PAGE分析總細胞裂解物檢查P4蛋白的表達。
實施例3脂質(zhì)化重組P4和突變體的純化然后P4突變蛋白如下純化大腸桿菌細胞懸浮于低滲緩沖液(10mMHEPES-NaOH，pH7.4、1mM Na2EDTA)并在高壓下(約18,000psi)細胞懸浮液通過微流化器來裂解。在Beckman 45Ti轉(zhuǎn)子中以300,000xg 10℃超離心1小時后獲得膜。內(nèi)膜和外膜蛋白分別用10mM HEPES-NaOH，pH7.4、1mM MgCl2中的1％(w/v)TritonX-100和50mM Tris-HCl，pH8、5mM Na2EDTA中的1％(w/v)兩性洗滌劑3-12連續(xù)提取來差異溶解。兩性洗滌劑3-12提取物溶解rLP4或突變蛋白。
感興趣的蛋白通過在串聯(lián)離子交換柱(DEAE&SP-瓊脂糖)上分級分離來純化。rLP4蛋白在0-0.2M鹽梯度中從SP-瓊脂糖洗脫，2個峰命名為形式1和形式2。通過在10mM磷酸鈉，pH7.1、150mM NaCl、1％兩性洗滌劑3-12的緩沖液中緩慢冷凍，接著透析入Tris-EDTA-兩性洗滌劑3-12-緩沖液，pH8中，形式2轉(zhuǎn)變成形式1。轉(zhuǎn)化的形式1進一步在SP-瓊脂糖柱上純化。rLP4突變體用與野生型蛋白相同的方法純化，除了突變減少蛋白的pl。在這些情況中，提取后，緩沖液變?yōu)?0mMHEPES-NaOH，pH7.4、1mM Na2EDTA、1％(w/v)兩性洗滌劑3-12，然后進行串聯(lián)柱步驟。此緩沖液也用于從SP-瓊脂糖柱洗脫。大部分rLP4突變體洗脫于單個蛋白峰。根據(jù)廠商說明書(Pierce)用二金雞寧酸測定法來測定蛋白。
實施例4磷酸酶活性的測定然后在靈敏的流動相測定中檢測純化P4突變蛋白的酶活性。通過上面引用的Reilly等，1999所述基本比色測定測量rLP4的磷酸單酯酶活性，與野生型rLP4相比較。加入1％(w/v)Triton X100到測定緩沖液提高rLP4的活性。通過比較410nm處吸光度和p-硝基酚標準曲線。一單位的酶活性定義為在37℃將1μmol底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物每分鐘所需的活性的量確定產(chǎn)生的p-硝基酚的nmol量。比活性定義為每1mg蛋白的酶單位數(shù)。結(jié)果也表示為％野生型活性。結(jié)果示于表3。
表3.rLP4突變體的比活性(pNPP測定)
a/與野生型rLP4相比的活性百分比b/檢測極限下c/無數(shù)據(jù)在選擇用于細菌酸性磷酸酶間保守性的P4特定殘基中進行的每個變化幾乎完全去除P4酶活性，除了Y122F突變。在剩余的測試突變體中，只有Q39E突變體保持＞1％的野生型活性(3.3％)，而雙重突變體沒有可檢測活性。
這些結(jié)果表明，細菌酸性磷酸酶間保守的P4區(qū)域內(nèi)的電荷和三級結(jié)構(gòu)對于酶功能是關鍵的。當變化在保守的Asp殘基上進行時，即使保守性變化如將Asp殘基變?yōu)镚lu殘基，幾乎完全去除酶活性。
除了Y122F和Q39E突變體，發(fā)明者沒有檢測到僅部分減少酶活性的突變體。實際上所有突變幾乎完全去除酶活性。將F48變?yōu)榘腚装彼峄蚪z氨酸殘基的突變也減少酶活性。
實施例5抗脂質(zhì)化RLP4突變蛋白的抗血清的產(chǎn)生然后測定突變P4蛋白與單克隆抗體(Mabs)的反應性和引起高效價、抗野生型P4的生物活性抗血清的能力。
A.免疫過程雌性Swiss Webster小鼠(6-8周齡)用15μg野生型或突變P4蛋白皮下免疫，蛋白混合鹽水或PBS中的100μgMPLTM佐劑。組合物也包含0.01％硫汞撒作為防腐劑。2次免疫隔4周進行，在第6周進行最后一次放血。第0周和第6周，通過ELSA測定單獨分析血清或血清庫并分析庫的殺菌活性。
B.酶聯(lián)免疫吸附測定(ELSA)抗P4(野生型和突變)抗體如下測量。平板用PBS中稀釋的1μg/ml野生型P4或12μg/ml突變P4涂布。90分鐘/37℃孵育后，平板貯存于4℃直到次日。突變P4涂布的平板用脫脂牛奶封閉。洗滌后，100μl等分血清在PBS/0.05％吐溫20中連續(xù)稀釋到1∶50至1∶5,467,500的終濃度，加入各孔且室溫孵育2小時。洗平板并加入100μl二抗(綴合山羊抗小鼠IgG的堿性磷酸酶，在PBS/0.05％吐溫20中以1∶5,000稀釋)，室溫孵育2小時。
洗滌后，結(jié)合抗體通過底物pNPP(p-磷酸硝基酚)檢測，pNPP以1mg/ml稀釋于二乙醇胺。1小時后，在405nm處讀到黃色，參考為650nm。各反應進行兩次，平均結(jié)果。血清的抗P4效價計算為4-參數(shù)曲線上產(chǎn)生0.1吸光度的血清稀釋。
C.總細胞ELISANTHi菌株P860295在巧克力瓊脂平板上生長6小時并收集到PBS中。細胞懸浮液稀釋到620nm處確定為0.2的OD且75μl分散到NUNCpolysorb平板。平板在37℃干燥過夜并保持于室溫直到使用。它們用PBS/5％脫脂牛奶封閉并洗滌，然后加入100μl稀釋血清(在PBS/0.1％吐溫20/5％脫脂牛奶中連續(xù)稀釋到1∶36,450或1,093,500的終濃度)。1小時/37℃孵育后，洗平板，用100μl二抗(綴合山羊抗小鼠IgG的堿性磷酸酶，在PBS/0.1％吐溫20/5％脫脂牛奶中以1∶5,000稀釋)37℃再孵育1小時。
再次洗平板且通過底物pNPP(p-磷酸硝基酚)檢測結(jié)合抗體，pNPP以1mg/ml稀釋于二乙醇胺。1小時后，在405nm處讀到黃色，參考為650nm。各反應進行兩次，平均結(jié)果。血清的抗總細胞效價計算為4-參數(shù)曲線上產(chǎn)生0.1吸光度的血清稀釋。
表4闡明非酶活性P4突變體的ELISA結(jié)果，突變體是P4-D184A，D185A和P4-D64A，D66A，它們包含非保守性突變。ELISA數(shù)據(jù)證明這些位點參與酶活性并對免疫反應重要。抗這些突變蛋白產(chǎn)生的抗體顯示突變P4蛋白引起抗野生型rLP4的抗體效價顯著低于天然P4或野生型rLP4。
表4.定向抗初始P4突變體的血清的GMT ELISA效價
表5報導了P4突變蛋白(A35G，A37G)、(A35T，A37T)、(A35D，A37D)或(A35Q，A37Q)的ELISA測定結(jié)果。如上所述，編碼這些蛋白的突變基因插入用于rLP4的阿拉伯糖表達載體(pBAD18cam)，在大腸桿菌BLR中表達，純化并用于免疫小鼠。小鼠用5μg適當P4蛋白+MPL在第0和4周免疫。動物在第6周放血。表5的數(shù)據(jù)來自第6周放血的5只小鼠庫。確定各抗血清抗各同源突變P4蛋白和野生型P4的ELISA抗體效價。在表中，ND表示無數(shù)據(jù)。
各突變蛋白引起良好水平的定向抗本身(同源蛋白)抗體。沒有蛋白引起相當水平的抗野生型rLP4抗體。這些結(jié)果減低了突變P4蛋白不是良好免疫原的可能性。它們抗同源蛋白的效價在此模式中脂質(zhì)化P4所預期的正常范圍內(nèi)。
表5.rLP4突變小鼠相對rLP4突變蛋白的ELISA反應
D.殺菌測定殺菌抗體測定是功能測量抗NTHi的抗體且如上面引用的Green等.1991所述進行。簡要地，NTHi菌株P860295在37℃過夜生長于BHI-XV液體培養(yǎng)基。過夜培養(yǎng)物在BHI-XV液體培養(yǎng)基中稀釋到30克萊特的光密度，光密度在Klett-Sumerson光度計中660nm處測量。培養(yǎng)物在37℃過培養(yǎng)直到對數(shù)中期并以1∶15,000稀釋到PCM(約1-2×105cfu/mL)?？筆4小鼠血清在55℃加熱30分鐘以去除補體活性。然后這些血清在磷酸緩沖鹽水中連續(xù)稀釋，鹽水含0.15mM CaCl2和0.5mM MgCl2(PCM)。
吸收抗NTHi P860295的人補體，人補體由羅切斯特大學提供(Green，B.A.等，1990 Infect.Immun.，583272-3278)。在96孔微量滴定板中，結(jié)合30μl PCM、5μl稀釋的小鼠抗血清、10μl稀釋的NTHi和5μl吸收的人補體并在37℃孵育30分鐘。通過加入200μl PCM終止反應。來自各孔的50μl一式兩份鋪在BHI-XV瓊脂上且37℃孵育過夜。計數(shù)菌落以確定殺菌效價(能殺死至少50％細菌的抗血清最高稀釋的倒數(shù)與不含抗體的測定對照相比)。
表6證明抗血清產(chǎn)生抗P4-D184A，D185A和P4-D64A，D66A的BC效價。確定這些效價且顯示它們與rLP4引起的相等，在測定誤差內(nèi)(下表6)。這些突變體的BC效價和ELISA效價間沒有相關性。
表6.抗血清相對突變體和野生型P4的殺菌活性血清a/放血BC效價相對NTHiP860295抗天然P4 后-2° 160抗野生型rLP4 后-2° ＞320抗rLP4-D184A，D185A 后-2° 80抗rLP4-D64A，D66A 后-2° ＞320免疫前庫 免疫前 ＜20抗P860295總細胞 后-3° ＞320免疫前庫 免疫前 ＜20a/來自10只小鼠的血清庫表7報導了免疫小鼠的血清的BC測定結(jié)果，免疫用雙重突變蛋白(A35G，A37G)、(A35T，A37T)、(A35D，A37D)或(A35Q，A37Q)。殺菌抗體效價不與抗野生型P4的ELISA效價相關。例如，rLP4 A35N，A37N突變體不引起抗野生型rLP4的高ELISA效價，但引起抗NTHi的良好殺菌抗體效價。因此，這些突變體中沒有一種被認為是良好的免疫原性或疫苗成分。有趣的是，抗rLP4血清對大部分突變體的反應不很強烈，似乎表明酶活性位點也是免疫顯性的。
表7.抗rLP4和抗P4突變體的血清的ELISA和BC效價
表8報導了脂化質(zhì)蛋白的BC測定結(jié)果，蛋白具有單突變N218Q、K161R、D64E、Y122F、D64N、D64E、F48C和Q39E，它們純化自大腸桿菌BLR細胞，檢測蛋白的酶活性。當?shù)鞍子糜诿庖咝∈髸r，3種突變體似乎結(jié)合了高ELISA效價和高BC效價以及不能檢測的酶活性。這些是F48C、N218Q和Q39E突變(表7和8)。這些突變P4蛋白有抗野生型P4的高ELISA效價，相當于野生型P4，但也有抗NTHi的高殺菌效價。
表8.突變P4蛋白的ELISA和BC效價突變體 IgG效價BC效價相對P860295rLP4-D64N1,921,553* 20rLP4-N218Q 1,475,833** 200rLP4Y122F1,106,822* 40rLP4D64E 988,016*20rLP4-Q39E770,483*320rLP4-F48C687,742** 240rLP4 197,160** 160rLP4-K161R 186,394** 60rLP4-D64A，D66A 60,358**30rLP4-D184A，D185A33,185**30rLP4-A35Q，A37Q 14,331**50rLP4-A35N，A37N 7,121** 200rLP4-A35E，A37E 4,322** 30*來自10只小鼠的集合血清**來自10只小鼠的單獨血清的GMT實施例6P4截短突變體構(gòu)建了在野生型序列的C末端不同點截短的4種P4變異蛋白。截短突變體通過pLP339中hel基因的PCR產(chǎn)生。簡要地，合成與hel基因的5’引發(fā)末端和核糖體結(jié)合位點同源的引物，其5’末端有SphI位點。合成3’引物，將指定截短點后的殘基變?yōu)榻K止密碼子，但引物3’末端處的hel基因同源。第二個引物的5’末端也包含SacI位點。PCR產(chǎn)物克隆入pCR2.1-TOPO中(Invitrogen)且用SphI-SacI消化。純化hel基因片段并連接入用相同酶消化的pBAD18Cam。鑒定陽性克隆并測試表達。所有構(gòu)建表達在大腸桿菌BLR中脂質(zhì)化的截短P4蛋白。
特別產(chǎn)生了P4變異蛋白，它們在殘基200(即它包含SEQ ID NO3的氨基酸1-200)、210、221和232截短。用實施例4所列方案測定各片段的磷酸酶活性。所有4個片段都沒有可檢測的酶活性。
其次，Swiss Webster小鼠遵循實施例5A的方案免疫，除了施用與25μg MPLTM混合的5μg截短P4蛋白。表9闡明了4個截短P4片段的ELISA結(jié)果，與野生型rLP4相比，其中遵循實施例5的方案。代號“rLP4-232”表示重組P4在SEQ ID NO3的氨基酸232截短。ELISA數(shù)據(jù)證明所有4種截短突變體引起有用的效價水平。
表9.Swiss Webster小鼠中P4截短突變體的抗rP4 ELISA效價
接著，遵循實施例5D的方案進行2次殺菌測定。在第一次測定中，在氨基酸210截短的P4蛋白與野生型rLP4和上述多種P4變體相比，其中各制劑包括與100μg MPLTM混合的15μg P4蛋白，除了最后一組，其中僅包括來自前研究的5μg rLP4蛋白作為正對照。表10中殺菌測定數(shù)據(jù)表明在氨基酸210截短的P4蛋白引起的殺菌抗體效價在統(tǒng)計上明顯區(qū)別于背景。在此實驗中，認為80或更高的BC50效價顯著不同于背景(＜20)。所用補體是吸收的人UR8-96。
表10.抗血清相對突變體、截短&野生型P4的殺菌活性
在第二次測定中，在氨基酸200、210、221和232截短的P4蛋白與野生型rLP4和上述多種P4變體相比，其中各制劑包括與25μgMPLTM混合的5μg P4蛋白(次最佳量)，除了最后一組，其中僅包括來自前研究的5μg rLP4蛋白加100μg MPLTM作為正對照。表11中殺菌測定數(shù)據(jù)表明在氨基酸221和232截短的P4蛋白引起的殺菌抗體效價在統(tǒng)計上明顯區(qū)別于背景，即使有低劑量的MPLTM。在此實驗中，認為80或更高的BC50效價顯著不同于第0周。所用補體是吸收的人UR8-97。
表11.抗血清相對突變體、截短和野生型P4的殺菌活性
總之，建議P4突變的結(jié)果表明，來自殺菌活性的ELISA效價分開意味著殺菌活性所需位點不同于酶活性必需的區(qū)域。
本發(fā)明書引用的全部出版物納入本文供參考。盡管發(fā)明參考特定的較佳實施方案來描述，應理解可進行修改而不背離發(fā)明的精神。這種修改屬于所附權(quán)利要求范圍內(nèi)。
序列表<110>惠氏控股有限公司(Wyeth Holdings Corporation)密蘇里州立大學校董(The Curators of the University of Missouri)B.A.格林(Green，Bruce A.)G.W.洛特尼克(Ziotnick，Gary W.)L.D.弗萊徹(Fletcher，Leah D.)A.L.史密斯(Smith，Arnold L.)T.J.雷利(Reilly，Thomas J.)<120>酶活性減少的非典型流感嗜血桿菌的P4蛋白突變體<130>AM100935PCT<150>US 60/364,688<151>2002-03-15<160>29<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1143<212>DNA<213>流感嗜血桿菌(H.influenzae)的hel基因<400>1gaattcttaa aaggaataaa ataatttcta ttataaccgt aggtagttta tttacggtta60ttaatgccat ctatgatgaa aaacactttt caattgaaaa gtgtttttca gaaagactta120ctataccctg aatgaatagg aacataatat gaaaacaacg ttaaaaatga ccgcacttgc180ggctctttct gcttttgttt tagctggctg tggttcacac caaatgaaat cagaagaaca240tgcaaatatg caattacaac aacaagcggt gcttggatta aactggatgc aagattctgg300cgaatataaa gcattagctt atcaagcgta caatgcggca aaagttgcat ttgatcacgc360aaaagtggca aaaggtaaga aaaaagcggt tgtggctgat ttagatgaaa ctatgttaga420caacagccct tatgctggct ggcaagttca aaataacaaa ccattcgatg gtaaagattg480gactcgttgg gtagacgcac gtcaatctcg tgccgttccg ggtgcggtag aatttaataa540
ttatgtaaac agccacaacg gtaaagtgtt ctacgtaaca aaccgcaaag acagcactga600aaaatcaggc actatcgatg atatgaaacg cttaggtttc aatggcgtgg aagaatctgc660attttatttg aaaaaagaca aatcagctaa agcggctcgt tttgcagaaa ttgaaaaaca720aggctatgaa atcgtacttt atgtaggtga taacttagat gacttcggta ataccgtata780tggcaaatta aacgctgacc gccgtgcatt cgttgatcaa aaccaaggca aatttggtaa840aactttcatc atgttaccta acgcaaacta cggtggctgg gaaggcggtt tagctgaagg900gtatttcaaa aaagatacac aaggccaaat caaagctcgt ttagatgcag tacaagcttg960ggatggtaaa taattttcca ttaaaaagat cgatttaaat atcgattttg aaaatttaat1020tgaggggcta agctcagttt ttactggctt agctttttca ttttcagtca ctcaagtatc1080atcattacta catctgagtt tgctatgatg ttgcagcttc aaatgatcaa gtagagaatg1140acc 1143<210>2<211>274<212>PRT<213>流感嗜血桿菌(H.influenzae)的hel基因<400>2Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe1 5 10 15Val Leu Ala Gly Cys Gly Ser His Gln Met Lys Ser Glu Glu His Ala20 25 30Asn Met Gln Leu Gln Gln Gln Ala Val Leu Gly Leu Asn Trp Met Gln35 40 45Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Ala Leu Ala Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Ala
50 55 60Lys Val Ala Phe Asp His Ala Lys Val Ala Lys Gly Lys Lys Lys Ala65 70 75 80Val Val Ala Asp Leu Asp Glu Thr Met Leu Asp Asn Ser Pro Tyr Ala85 90 95Gly Trp Gln Val Gln Asn Asn Lys Pro Phe Asp Gly Lys Asp Trp Thr100 105 110Arg Trp Val Asp Ala Arg Gln Ser Arg Ala Val Pro Gly Ala Val Glu115 120 125Phe Asn Asn Tyr Val Asn Ser His Asn Gly Lys Val Phe Tyr Val Thr130 135 140Asn Arg Lys Asp Ser Thr Glu Lys Ser Gly Thr Ile Asp Asp Met Lys145 150 155 160Arg Leu Gly Phe Asn Gly Val Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Leu Lys Lys165 170 175Asp Lys Ser Ala Lys Ala Ala Arg Phe Ala Glu Ile Glu Lys Gln Gly180 185 190Tyr Glu Ile Val Leu Tyr Val Gly Asp Asn Leu Asp Asp Phe Gly Asn195 200 205Thr Val Tyr Gly Lys Leu Asn Ala Asp Arg Arg Ala Phe Val Asp Gln210 215 220Asn Gln Gly Lys Phe Gly Lys Thr Phe Ile Met Leu Pro Asn Ala Asn
225 230 235 240Tyr Gly Gly Trp Glu Gly Gly Leu Ala Glu Gly Tyr Phe Lys Lys Asp245 250 255Thr Gln Gly Gln Ile Lys Ala Arg Leu Asp Ala Val Gln Ala Trp Asp260 265 270Gly Lys<210>3<211>254<212>PRT<213>流感嗜血桿菌(H.influenzae)的hel基因<400>3Cys Gly Ser His Gln Met Lys Ser Glu Glu His Ala Asn Met Gln Leu1 5 10 15Gln Gln Gln Ala Val Leu Gly Leu Asn Trp Met Gln Asp Ser Gly Glu20 25 30Tyr Lys Ala Leu Ala Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Ala Lys Val Ala Phe35 40 45Asp His Ala Lys Val Ala Lys Gly Lys Lys Lys Ala Val Val Ala Asp50 55 60Leu Asp Glu Thr Met Leu Asp Asn Ser Pro Tyr Ala Gly Trp Gln Val65 70 75 80Gln Asn Asn Lys Pro Phe Asp Gly Lys Asp Trp Thr Arg Trp Val Asp85 90 95
Ala Arg Gln Ser Arg Ala Val Pro Gly Ala Val Glu Phe Asn Asn Tyr100 105 110Val Asn Ser His Asn Gly Lys Val Phe Tyr Val Thr Asn Arg Lys Asp115 120 125Ser Thr Glu Lys Ser Gly Thr Ile Asp Asp Met Lys Arg Leu Gly Phe130 135 140Asn Gly Val Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Leu Lys Lys Asp Lys Ser Ala145 150 155 160Lys Ala Ala Arg Phe Ala Glu Ile Glu Lys Gln Gly Tyr Glu Ile Val165 170 175Leu Tyr Val Gly Asp Asn Leu Asp Asp Phe Gly Asn Thr Val Tyr Gly180 185 190Lys Leu Asn Ala Asp Arg Arg Ala Phe Val Asp Gln Asn Gln Gly Lys195 200 205Phe Gly Lys Thr Phe Ile Met Leu Pro Asn Ala Asn Tyr Gly Gly Trp210 215 220Glu Gly Gly Leu Ala Glu Gly Tyr Phe Lys Lys Asp Thr Gln Gly Gln225 230 235 240Ile Lys Ala Arg Leu Asp Ala Val Gln Ala Trp Asp Gly Lys245 250<210>4<211>28
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>4gcaaaagttg catgcgatca cgcaaaag28<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>5cttttgcgtg atcgcatgca acttttgc 28<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>6gcggttgtgg ctgctttagc tgaaactatg ttag 34<210>7<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>7ctaacatagt ttcagctaaa gcagccacaa ccgc 34
<210>8<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>8gcgcgtctct tgcattttat ttgaaaaaag acaaatcagc tagagcggct c 51<210>9<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>9gcgcgtctcg tgcagattct tccacgccat tgaaacc 37<210>10<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>10gcgcgtctct gctgggaagg cggtttagct gaag 34<210>11<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>11gcgcgtctcg cagccaccgt agtttgcttg aggtaacatg atgaaag 47<210>12<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>12gcgcgtctct ggtaagaaaa aagcggttgt ggctaattta gatg44<210>13<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>13gcgcgtctcg taccttttgc cacttttgcg tg 32<210>14<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>14gcgcgtctcg taccttttgc cacttttgcg tg 32<210>15<211>44
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>15gcgcgtctct ggtaagaaaa aagcggttgt ggctgaatta gatg 44<210>16<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>16cgccgtctcg ctgccttcgg taataccgta tatggc 36<210>17<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>17cgccgtctcg gcagctaagt tatcacctac ataaagtacg 40<210>18<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>18cgccgtctct tagaatatca agcgtacaat gcggc35
<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>19ccgcgtctca tctaattctt tatattcgcc agaatcttgc 40<210>20<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>20gcccgtctcc cttaaactat caagcgtaca atgcggc 37<210>21<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>21gcccgtctcc taagttttta tattcgccag aatcttgc 38<210>22<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>22ccgcgtctca ttacaatatc aagcgtacaa tgcggc 36<210>23<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>23gcccgtctcg gtaattgttt atattcgcca gaatcttgc39<210>24<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>24cggcgtctcc attaacttat caagcgtaca atgcggc 37<210>25<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>25cggcgtctcc taatgtttta tattcgccag aatcttgc 38<210>26<211>28
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>26gcattagctt atgaagcgta caatgcgg 28<210>27<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>27ccgcattgta cgcttcataa gctaatgc 28<210>28<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>28cggtaaagtg ttctttgtaa caaaccgc 28<210>29<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>29gcggtttgtt acaaagaaca ctttaccg 28
權(quán)利要求
1.一種非典型流感嗜血桿菌(NTHi)的P4變異蛋白，與野生型P4蛋白相比酶活性減少且誘導野生型P4蛋白的抗體和/或具有抗NTHi的殺菌活性，其特征在于，P4變異蛋白具有的突變選自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基39的突變，它在野生型P4蛋白中是谷氨酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基48的突變，它在野生型P4蛋白中是苯丙氨酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64的突變，它在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基161的突變，它在野生型P4蛋白中是賴氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基218的突變，它在野生型P4蛋白中是天冬酰胺；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基35和37的突變，它們在野生型P4蛋白中是丙氨酸，其中突變不是谷氨酸、谷氨酰胺或蘇氨酸；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64和66的突變，它們在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(h)一個或多個突變(a)-(g)的組合。
2.如權(quán)利要求1所述的P4變異蛋白，其特征在于，P4變異蛋白具有的突變選自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基39的谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基48的半胱氨酸、絲氨酸或其它具有不帶電極性基團的氨基酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64的天冬酰胺、谷氨酸或丙氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基161的精氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基218的谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基35和37的天冬酰胺；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64和66的丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；(h)一個或多個突變(a)-(g)的組合。
3.如權(quán)利要求2所述的P4變異蛋白，其特征在于，所述變異蛋白是脂質(zhì)化的。
4.如權(quán)利要求3所述的P4變異蛋白，其特征在于，所述變異蛋白進一步包括融合所述P4變異蛋白的N-末端的信號肽。
5.如權(quán)利要求4所述的P4變異蛋白，其特征在于，所述信號肽是SEQ ID NO2的氨基酸1-20。
6.如權(quán)利要求2所述的P4變異蛋白，其特征在于，所述變異蛋白是非脂質(zhì)化的。
7.如權(quán)利要求2所述的P4變異蛋白，其特征在于，所述變異蛋白與載體蛋白框內(nèi)融合。
8.如權(quán)利要求7所述的P4變異蛋白，其特征在于，所述載體蛋白選自大腸桿菌DnaK蛋白、GST蛋白、分枝桿菌熱激蛋白70、白喉類毒素、破傷風類毒素、半乳糖激酶、泛素、α-交配因子、β-半乳糖苷酶和流感NS-1蛋白。
9.一種免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物包括權(quán)利要求1所述的P4變異蛋白和藥學上可接受載體。
10.如權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括佐劑。
11.如權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括另外抗原，抗原來自流感嗜血桿菌或除了流感嗜血桿菌的微生物。
12.一種免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物包括權(quán)利要求2所述的P4變異蛋白和藥學上可接受載體。
13.如權(quán)利要求12所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括佐劑。
14.如權(quán)利要求12所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括另外抗原，抗原來自流感嗜血桿菌或除了流感嗜血桿菌的微生物。
15.一種非典型流感嗜血桿菌(NTHi)的P4變異蛋白，與野生型P4蛋白相比酶活性減少且誘導野生型P4蛋白的抗體和/或具有抗NTHi的殺菌活性，其特征在于，P4變異蛋白是在野生型P4蛋白的羧基末端區(qū)域中有截短的片段。
16.如權(quán)利要求15所述的P4變異蛋白，其特征在于，截短P4變異蛋白以包含SEQ ID NO3的氨基酸1-200、1-210、1-221或1-232。
17.如權(quán)利要求16所述的P4變異蛋白，其特征在于，所述變異蛋白進一步包括一個或多個突變，突變選自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基39的突變，它在野生型P4蛋白中是谷氨酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基48的突變，它在野生型P4蛋白中是苯丙氨酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64的突變，它在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基161的突變，它在野生型P4蛋白中是賴氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基218的突變，它在野生型P4蛋白中是天冬酰胺；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基35和37的突變，它們在野生型P4蛋白中是丙氨酸，其中突變不是谷氨酸、谷氨酰胺或蘇氨酸；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64和66的突變，它們在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(h)一個或多個突變(a)-(g)的組合。
18.如權(quán)利要求16所述的P4變異蛋白，其特征在于，所述變異蛋白進一步包括一個或多個突變，突變選自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基39的谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基48的半胱氨酸、絲氨酸或其它具有不帶電極性基團的氨基酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64的天冬酰胺、谷氨酸或丙氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基161的精氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基218的谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基35和37的天冬酰胺；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64和66的丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；(h)一個或多個突變(a)-(g)的組合。
19.一種免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物包括權(quán)利要求15所述的P4變異蛋白和藥學上可接受載體。
20.如權(quán)利要求19所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括佐劑。
21.如權(quán)利要求19所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括另外抗原，抗原來自流感嗜血桿菌或除了流感嗜血桿菌的微生物。
22.一種免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物包括權(quán)利要求16所述的P4變異蛋白和藥學上可接受載體。
23.如權(quán)利要求22所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括佐劑。
24.如權(quán)利要求22所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括另外抗原，抗原來自流感嗜血桿菌或除了流感嗜血桿菌的微生物。
25.一種分離的核苷酸分子，所含核酸序列與編碼NTHi的P4變異蛋白的核酸序列至少70％同源，P4變異蛋白與野生型P4蛋白相比酶活性減少且誘導野生型P4蛋白的抗體和/或具有抗NTHi的殺菌活性，其特征在于，P4變異蛋白具有的突變選自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基39的突變，它在野生型P4蛋白中是谷氨酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基48的突變，它在野生型P4蛋白中是苯丙氨酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64的突變，它在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基161的突變，它在野生型P4蛋白中是賴氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基218的突變，它在野生型P4蛋白中是天冬酰胺；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基35和37的突變，它們在野生型P4蛋白中是丙氨酸，其中突變不是谷氨酸、谷氨酰胺或蘇氨酸；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64和66的突變，它們在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(h)一個或多個突變(a)-(g)的組合。
26.如權(quán)利要求25所述的分離核苷酸分子，其特征在于，核酸序列與編碼NTHi的P4變異蛋白的核酸序列至少80％同源。
27.如權(quán)利要求26所述的分離核苷酸分子，其特征在于，核酸序列與編碼NTHi的P4變異蛋白的核酸序列至少90％同源。
28.如權(quán)利要求25所述的分離核苷酸分子，其特征在于，所述核酸序列在指導宿主細胞中P4變異蛋白表達的調(diào)節(jié)序列的控制下。
29.一種分離的核苷酸分子，所含核酸序列與編碼NTHi的P4變異蛋白的核酸序列至少70％同源，P4變異蛋白與野生型P4蛋白相比酶活性減少且誘導野生型P4蛋白的抗體和/或具有抗NTHi的殺菌活性，其特征在于，P4變異蛋白具有的突變選自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基39的谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基48的半胱氨酸、絲氨酸或其它具有不帶電極性基團的氨基酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64的天冬酰胺、谷氨酸或丙氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基161的精氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基218的谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基35和37的天冬酰胺；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64和66的丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；(h)一個或多個突變(a)-(g)的組合，其中核酸序列編碼至少突變(a)-(g)中的一個。
30.如權(quán)利要求29所述的分離核苷酸分子，其特征在于，核酸序列與編碼NTHi的P4變異蛋白的核酸序列至少80％同源。
31.如權(quán)利要求30所述的分離核苷酸分子，其特征在于，核酸序列與編碼NTHi的P4變異蛋白的核酸序列至少90％同源。
32.如權(quán)利要求29所述的分離核苷酸分子，其特征在于，所述核酸序列在指導宿主細胞中P4變異蛋白表達的調(diào)節(jié)序列的控制下。
33.一種分離的核苷酸分子，所含核酸序列與編碼NTHi的P4變異蛋白的核酸序列至少70％同源，P4變異蛋白與野生型P4蛋白相比酶活性減少且誘導野生型P4蛋白的抗體和/或具有抗NTHi的殺菌活性，其特征在于，P4變異蛋白是在野生型P4蛋白的羧基末端區(qū)域有截短的片段。
34.如權(quán)利要求33所述的分離核苷酸分子，其特征在于，核酸序列與編碼NTHi的截短P4蛋白的核酸序列至少70％同源。
35.如權(quán)利要求34所述的分離核苷酸分子，其特征在于，核酸序列與編碼NTHi的截短P4蛋白的核酸序列至少80％同源。
36.如權(quán)利要求35所述的分離核苷酸分子，其特征在于，核酸序列與編碼NTHi的截短P4蛋白的核酸序列至少90％同源。
37.如權(quán)利要求36所述的分離核苷酸分子，其特征在于，核酸分子進一步編碼截短的P4蛋白片段，片段具有的突變選自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基39的突變，它在野生型P4蛋白中是谷氨酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基48的突變，它在野生型P4蛋白中是苯丙氨酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64的突變，它在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基161的突變，它在野生型P4蛋白中是賴氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基218的突變，它在野生型P4蛋白中是天冬酰胺；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基35和37的突變，它們在野生型P4蛋白中是丙氨酸，其中突變不是谷氨酸、谷氨酰胺或蘇氨酸；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64和66的突變，它們在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(h)一個或多個突變(a)-(g)的組合，其中核酸序列編碼至少突變(a)-(g)中的一個。
38.如權(quán)利要求37所述的分離核苷酸分子，其特征在于，核酸分子進一步編碼截短的P4蛋白片段，片段具有的突變選自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基39的谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基48的半胱氨酸、絲氨酸或其它具有不帶電極性基團的氨基酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64的天冬酰胺、谷氨酸或丙氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基161的精氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基218的谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基35和37的天冬酰胺；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸殘基64和66的丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；(h)一個或多個突變(a)-(g)的組合，其中核酸序列編碼至少突變(a)-(g)中的一個。
39.如權(quán)利要求25所述的分離核苷酸分子，其特征在于，所述分子是質(zhì)粒載體。
40.一種宿主細胞，其特征在于，所述細胞用權(quán)利要求39所述的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導。
41.如權(quán)利要求29所述的分離核苷酸分子，其特征在于，所述分子是質(zhì)粒載體。
42.一種宿主細胞，其特征在于，所述細胞用權(quán)利要求41所述的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導。
43.如權(quán)利要求33所述的分離核苷酸分子，其特征在于，所述分子是質(zhì)粒載體。
44.一種宿主細胞，其特征在于，所述細胞用權(quán)利要求43所述的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導。
45.一種免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物包括權(quán)利要求25所述的核苷酸分子和藥學上可接受載體。
46.一種免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物包括權(quán)利要求29所述的核苷酸分子和藥學上可接受載體。
47.一種免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物包括權(quán)利要求33所述的核苷酸分子和藥學上可接受載體。
48.一種在人中誘導抗非典型流感嗜血桿菌的免疫反應的方法，其特征在于，所述方法包括步驟施用有效量的權(quán)利要求9所述免疫原性組合物給所述人。
49.一種在人中誘導抗非典型流感嗜血桿菌的免疫反應的方法，其特征在于，所述方法包括步驟施用有效量的權(quán)利要求19所述免疫原性組合物給所述人。
50.一種在人中誘導抗非典型流感嗜血桿菌的免疫反應的方法，其特征在于，所述方法包括步驟施用有效量的權(quán)利要求45所述免疫原性組合物給所述人。
51.一種在人中誘導抗非典型流感嗜血桿菌的免疫反應的方法，其特征在于，所述方法包括步驟施用有效量的權(quán)利要求46所述免疫原性組合物給所述人。
52.一種在人中誘導抗非典型流感嗜血桿菌的免疫反應的方法，其特征在于，所述方法包括步驟施用有效量的權(quán)利要求47所述免疫原性組合物給所述人。
53.一種產(chǎn)生P4變異蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括在適合產(chǎn)生P4變異蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求40所述宿主細胞并從培養(yǎng)物中回收P4變異蛋白。
54.一種產(chǎn)生P4變異蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括在適合產(chǎn)生P4變異蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求42所述宿主細胞并從培養(yǎng)物中回收P4變異蛋白。
55.一種產(chǎn)生P4變異蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括在適合產(chǎn)生P4變異蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求44所述宿主細胞并從培養(yǎng)物中回收P4變異蛋白。
56.如權(quán)利要求1所述的P4變異蛋白，其特征在于，所述變異蛋白用作另一種抗原的載體蛋白。
57.如權(quán)利要求56所述的P4變異蛋白，其特征在于，所述變異蛋白化學綴合多糖、寡糖、糖類、脂多糖、脂寡糖或脂糖。
58.如權(quán)利要求56所述的P4變異蛋白，其特征在于，所述變異蛋白與蛋白、多肽或肽融合。
59.如權(quán)利要求15所述的P4變異蛋白，其特征在于，所述變異蛋白用作另一種抗原的載體蛋白。
60.如權(quán)利要求59所述的P4變異蛋白，其特征在于，所述變異蛋白化學綴合多糖、寡糖、糖類、脂多糖、脂寡糖或脂糖。
61.如權(quán)利要求59所述的P4變異蛋白，其特征在于，所述變異蛋白與蛋白、多肽或肽融合。
全文摘要
P4變異蛋白的酶活性減少且誘導野生型P4蛋白的抗體和/或具有抗非典型流感嗜血桿菌(NTHi)的良好殺菌活性，它用作人的免疫原性組合物中的活性成分。也提供了使用這些蛋白和組合物的方法，組合物含與另外的抗原組合的蛋白。
文檔編號A61P31/04GK1653084SQ03809166
公開日2005年8月10日 申請日期2003年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月15日
發(fā)明者B·A·格林, G·W·洛特尼克, L·D·弗萊徹, A·L·史密斯, T·J·雷利 申請人:惠氏控股有限公司, 密蘇里州立大學校董