專利名稱：使用細(xì)胞脫唾液酸決定簇和糖綴合物將細(xì)胞靶向組織和器官的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)和療法的領(lǐng)域。本發(fā)明涉及使用細(xì)胞表面和/或游離糖綴合物上的唾液酸或脫唾液酸決定簇，特別是新近脫唾液酸決定簇(neoasialodeterminant)，將細(xì)胞靶向目的器官的方法和組合物。
背景技術(shù)：
Morell等人確定了當(dāng)血漿銅藍(lán)蛋白的唾液酸基團(tuán)被神經(jīng)氨酸酶切除后，這種血漿蛋白質(zhì)將由血清中迅速消失。他們揭示了這種現(xiàn)象歸結(jié)于肝細(xì)胞中存在的脫唾液酸糖蛋白(ASGP)受體的攝取(J.Biol.Chem.，243155，1968)。其后，有報道說ASGP受體只存在于肝細(xì)胞中(Adv.Enzymol.，4199，1974)。根據(jù)在將脫唾液酸血漿銅藍(lán)蛋白或脫唾液酸血清類粘蛋白(用氚實(shí)驗(yàn)性標(biāo)記)注射到活體中后只在肝細(xì)胞中選擇性檢測到該同位素的事實(shí)鑒定了肝細(xì)胞的這種特異攝取。Scheinberg，I.H.等人，“Hepatic removal of circulating proteins”即“循環(huán)中蛋白質(zhì)的肝清除”，在Davidson，C.S.編的《Problems in LiverDiserses》即《肝病中的問題》中，第279-285頁，紐約，Stratton公司，1979。另外，還披露了這種受體特異識別并吸收具有D-半乳糖或N-乙酰半乳糖胺作為末端糖基的糖蛋白(Ann.Rev.Biochem.，51531，1982)。
肝細(xì)胞的細(xì)胞膜包含與以半乳糖結(jié)尾的脫唾液酸糖蛋白聯(lián)合的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。這種細(xì)胞結(jié)構(gòu)最初命名為肝結(jié)合蛋白(HBP)，但是現(xiàn)在稱為脫唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein，ASGP)受體。此外，觀察到在多種脫唾液酸糖蛋白中，脫唾液酸α(1)-酸糖蛋白即脫唾液酸血清類粘蛋白在注射后由血清消失的速度最快。因此，說明了肝細(xì)胞對脫唾液酸-α(1)-酸糖蛋白的攝取既特異又高效(J.Biol.Chem.，2454397，1970)。ASGP受體是由分子量大約40,00的單一多肽構(gòu)成的，能夠識別在糖鏈非還原性末端位置具有半乳糖殘基的糖蛋白(即脫唾液酸糖蛋白)。
盡管ASGP受體的生理學(xué)功能仍不確定，然而認(rèn)為ASGP受體參與糖蛋白的代謝。事實(shí)上，在肝病諸如慢性肝炎、肝硬化和肝癌的況中觀察到ASGP血液水平的升高。此外，在通過施用化學(xué)藥品誘發(fā)肝病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭杏^察到ASGP受體數(shù)量的減少。
考慮到這些現(xiàn)象，有可能通過評估ASGP的數(shù)量和質(zhì)量來診斷肝病，其中使用ASGP樣物質(zhì)即ASGP受體導(dǎo)向化合物來進(jìn)行測定。事實(shí)上，出于治療和診斷目的，已經(jīng)將脫唾液酸糖綴合物共價連接了其它試劑作為使將由肝攝取的化學(xué)藥品(免疫遏制藥物)和生物學(xué)試劑(抗體)具有靶向的手段(參閱如美國專利號5,346,696、5,679,323、和5,089,604)。
過繼細(xì)胞免疫療法一般指采用生物學(xué)試劑來實(shí)現(xiàn)由免疫介導(dǎo)的反應(yīng)的治療方法。目前，大多數(shù)過繼免疫療法是自身淋巴細(xì)胞療法(ALT)，使用患者自己的免疫細(xì)胞，經(jīng)過處理以增強(qiáng)由免疫細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)或識別體內(nèi)特異抗原或外來物質(zhì)，包括癌細(xì)胞。治療是如下進(jìn)行的獲取患者的淋巴細(xì)胞，并在體外將這些細(xì)胞暴露于生物制劑和藥物以激活細(xì)胞的免疫功能。一旦自體細(xì)胞得到激活，就將這些離體激活的細(xì)胞重新注入患者體內(nèi)以增強(qiáng)免疫系統(tǒng)，從而治療各種形式的癌癥、傳染病、自身免疫病或免疫缺陷病。
過繼免疫療法可以利用例如經(jīng)白介素-2(IL-2)激活的天然殺傷(NK)細(xì)胞、經(jīng)淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞和/或腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)和/或細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)。LAK療法涉及在高濃度IL-2下培養(yǎng)自體外周血淋巴細(xì)胞，從而在體外生成LAK細(xì)胞。然后在可能還涉及注入IL-2的治療中將LAK細(xì)胞重新注入癌癥患者體內(nèi)。Rosenberg等人，“Cancer immunotherapy using interleukin-2and interleukin-2 activated lymphocytes”即“使用白介素-2和經(jīng)白介素-2激活的淋巴細(xì)胞的癌癥免疫療法”，Annual Review ofImmunology，4681-709，1986。TIL療法涉及由單核細(xì)胞生成LAK細(xì)胞，這些單核細(xì)胞最初衍生自由手術(shù)切除樣本獲得的、實(shí)體瘤中及其周圍存在的炎性浸潤細(xì)胞。Rosenberg等人，“A new approach to theadoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltratinglymphocytes”即“使用腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞、針對癌癥的過繼免疫療法的新方法”，Science，2331318-1321，1986。最近幾年已經(jīng)開發(fā)了過繼免疫療法的許多進(jìn)一步變化形式。參閱如2002年6月18日授予Wood的美國專利號6,406,699，其中公開并要求保護(hù)癌抗原免疫療法的組合物和方法及其參考文獻(xiàn)中公開和引用的方法。
除了癌癥免疫療法，過繼免疫療法可應(yīng)用于與幾種疾病和狀況有關(guān)的T細(xì)胞缺乏或機(jī)能失調(diào)，包括病毒的循環(huán)感染，諸如皰疹病毒(HSV、VZV、CMV)、乙肝病毒、和乳頭瘤病毒。參閱如Spiegel，R.J.，“The alpha interferonsClinical overview”即“α-干擾素臨床綜述”，Seminars in Oncology，141，1987。還在HIV感染患者的治療中評估ALT。O.Martinez-Maza，“HIV-Induced ImmuneDysfunction and AIDS-Associated Neoplasms”即“由HIV誘發(fā)的免疫機(jī)能失調(diào)和與AIDS有關(guān)的腫瘤”，在《Biological Approaches toCancer TreatmentBiomodulation》即《癌癥治療的生物學(xué)方法生物調(diào)控》中，M.Mitchell編，McGraw-Hill公司，第9章，第181-204頁，1993。
干細(xì)胞是具有更新自身并產(chǎn)生分化細(xì)胞類型的獨(dú)特能力的特殊細(xì)胞種類。盡管身體的大多數(shù)細(xì)胞，諸如心臟細(xì)胞或皮膚細(xì)胞，已被定型成執(zhí)行特定功能，然而干細(xì)胞未被定型，并保持未被定型直至它接收信號而發(fā)育成分化細(xì)胞。在1998年，首次分離并培養(yǎng)了來自人類早期胚胎的干細(xì)胞。認(rèn)識到這些干細(xì)胞確實(shí)能夠成為身體中幾乎所有的分化細(xì)胞。在最近幾年，成人中存在的干細(xì)胞也顯示具有生成替代細(xì)胞的能力，可用于許多組織和器官，諸如心臟、肝、胰、和神經(jīng)系統(tǒng)。由此，這類成人干細(xì)胞有希望能夠修復(fù)或取代遭到許多破壞性疾病和殘廢損害或破壞的細(xì)胞或組織。通過將干細(xì)胞靶向身體特定器官，它對于進(jìn)行這些治療非常有用。
在現(xiàn)有技術(shù)中，通常通過注射到組織中或注入局部循環(huán)內(nèi)而將淋巴細(xì)胞和干細(xì)胞呈遞給期望器官。然而，通過將正常骨髓干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞注射到小鼠中已證明這些細(xì)胞定位于肝。Samlowski等人，Immunol.，88309-322，1984；Samlowski等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，822508-2512，1985。
還知道注入哺乳動物的大部分細(xì)胞粘附于肺內(nèi)皮，與細(xì)胞類型或生理學(xué)歸巢特性無關(guān)。觀察到干細(xì)胞在施用后在肺中積累。Morrison等人，Nature Medicine，21281-1282，1996；Martino等人，Eur.J.Immunol.，231023-1028，1993；Pereira等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，924857-4861，1993；和Gao等人，Cells Tissues Organs，16912-20，2001。
血清類粘蛋白、脫唾液酸血清類粘蛋白和脫半乳糖/脫唾液酸血清類粘蛋白顯示抑制嗜中性粒細(xì)胞激活、超氧化物陰離子生成、和血小板激活。Costello等人，Clin.Exp.Immunol.，55465-472，1984；和Costello等人，Nature，281677-678，1979。這些蛋白質(zhì)還誘導(dǎo)瞬時免疫遏制和提供針對TNF攻擊的保護(hù)。Bennett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，776109-6113，1980；和Libert等人，J.Exp.Med.，1801571-1575，1994。血清類粘蛋白展示與肺內(nèi)皮細(xì)胞有特異結(jié)合，這看來不依賴糖類識別位點(diǎn)。Schnitzer等人，Am.J.Physiol.，263H48-H55，1992。此外，血清類粘蛋白顯示以依賴劑量的方式結(jié)合皮膚毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而面對在對照動物中引起滲漏的炎性激動劑時維持正常的毛細(xì)血管通透性。Muchitsch等人，Arch.Int.Pharmacodyn.，331313-321，1996。類似的，注入的血清類粘蛋白結(jié)合腎毛細(xì)管并恢復(fù)腎小球過濾的選擇通透性。Muchitsch等人，Nephron.，81194-199，1999。
還報道了在肝中捕獲經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的淋巴細(xì)胞，包括在經(jīng)靜脈內(nèi)注射了分離自脾或胸腺的淋巴細(xì)胞的小鼠中由經(jīng)過同系神經(jīng)氨酸酶處理的淋巴細(xì)胞對肝細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)。Kolb-Bachofen，V.等人，Immunol.，1232830-2834，1979。關(guān)于經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的大鼠淋巴細(xì)胞與培養(yǎng)的肝細(xì)胞之間相互作用的研究證明，細(xì)胞間的粘附歸結(jié)于哺乳動物肝膜凝集素(即ASGP受體)與切除了唾液酸殘基后淋巴細(xì)胞表面上暴露的半乳糖殘基之間的立體特異相互作用。Kolb，H.等人，Adv.Exp.Med.Biol.，114219-222，1979。
綜上所述，需要開發(fā)通過循環(huán)將淋巴細(xì)胞和干細(xì)胞投遞至特定器官的方法。這些方法將提供非侵入性地靶向?qū)嶓w器官諸如肝、心臟、肺和腎的手段。另外，可以靶向非常彌散的組織，諸如不受注射藥劑作用的肺。這些方法可用于涉及諸如肝、心臟、肺和腎等器官的過繼免疫療法和再生干細(xì)胞療法。
本發(fā)明致力于這些和其它需要。
發(fā)明概述本發(fā)明的特點(diǎn)是用于將細(xì)胞投遞至哺乳動物體內(nèi)靶組織的方法，包括下列步驟對哺乳動物施用糖類呈遞分子(如糖綴合物)，然后對哺乳動物施用所述細(xì)胞。
在用于本文時，術(shù)語“施用”指誘導(dǎo)哺乳動物循環(huán)中細(xì)胞的濃度升高的任何方法，其或是通過外界來源的輸注或是通過帶動細(xì)胞由哺乳動物體內(nèi)的儲庫諸如骨髓轉(zhuǎn)移進(jìn)入循環(huán)達(dá)到的。本領(lǐng)域眾所周知帶動干細(xì)胞轉(zhuǎn)移的手段，例如使用GM-CSF和GCSF。參閱如Simmons等人，“The mobilization of primitive hemopoietic progenitors into theperipheral blood”即“動員原始造血祖細(xì)胞進(jìn)入外周血”，Stem Cells，12增刊1187-201，1994。
依照本發(fā)明的方法尤其適用于干細(xì)胞，諸如由骨髓、外周血、臍帶或者由培養(yǎng)擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的那些干細(xì)胞。本發(fā)明范圍內(nèi)的干細(xì)胞包括能夠分化成期望靶組織的任何細(xì)胞。這些細(xì)胞包括多能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、多能成年干細(xì)胞、以及祖細(xì)胞或前身細(xì)胞。
依照本發(fā)明的方法同樣尤其適用于免疫系統(tǒng)細(xì)胞，諸如經(jīng)白介素-2(IL-2)激活的天然殺傷(NK)細(xì)胞、經(jīng)淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞和/或激活的淋巴細(xì)胞，包括但不限于腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)。
本發(fā)明的方法能夠?qū)⒓?xì)胞諸如正常干細(xì)胞或免疫細(xì)胞靶向靶組織諸如心臟、肝、腎和肺等。在細(xì)胞靶向心臟的一些實(shí)施方案中，該方法的特點(diǎn)是對哺乳動物施用血清類粘蛋白(orosomucoid，O)或施用脫唾液酸血清類粘蛋白(asialoorosomucoid，ASO)，并施用所述細(xì)胞。在細(xì)胞靶向肺的實(shí)施方案中，該方法的特點(diǎn)是在鹽水或血清清蛋白-鹽水溶液或不含蛋白質(zhì)/清蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基中對哺乳動物施用細(xì)胞。在細(xì)胞靶向肝的實(shí)施方案中，該方法的特點(diǎn)是對哺乳動物施用血清類粘蛋白或脫唾液酸血清類粘蛋白并施用細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，血清類粘蛋白是在對哺乳動物施用細(xì)胞的同時或之前施用的。依照本發(fā)明的方法對于抑制或增強(qiáng)干細(xì)胞或免疫細(xì)胞在哺乳動物肝中的匯集同樣有用，甚至在沒有將細(xì)胞靶向靶器官時也如此。
本發(fā)明的糖綴合物一般可以由通式P-(S)x-Gal表述，其中P是人血清糖蛋白的肽殘基，而S是人血清糖蛋白的糖殘基；x是1-100的整數(shù)，而Gal是半乳糖殘基。糖綴合物可以是部分或完全脫唾液酸的。特別有用的糖綴合物包括胎球蛋白、脫唾液酸胎球蛋白、血清類粘蛋白和脫唾液酸血清類粘蛋白。
可以在相對于施用細(xì)胞的任何時間范圍內(nèi)對哺乳動物施用糖綴合物?？梢栽谑┯眉?xì)胞之前、之后或同時施用它們。在一個典型實(shí)施方案中，在細(xì)胞之前施用糖綴合物?？梢酝ㄟ^任何合適途徑施用糖綴合物和細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，它們是腸胃外施用于哺乳動物的，而且更優(yōu)選靜脈內(nèi)方式。
通過將天然包含目的基因或經(jīng)其轉(zhuǎn)化的細(xì)胞導(dǎo)入哺乳動物，依照本發(fā)明的方法還可用于將目的基因靶向哺乳動物體內(nèi)組織。通過對哺乳動物施用包含編碼基因產(chǎn)物的功能基因的細(xì)胞并對哺乳動物施用糖綴合物，這些方法可用于治療哺乳動物中特征為基因產(chǎn)物缺乏的疾病。依照這些方法，可以施用包含外源功能性目的基因的細(xì)胞并將其定位于體內(nèi)特定器官，在此它能夠發(fā)揮功能而生成缺乏的基因產(chǎn)物。
同樣，通過對哺乳動物施用細(xì)胞并施用糖綴合物，依照本發(fā)明的方法可用于治療哺乳動物中特征為組織損傷的疾病。因?yàn)楦杉?xì)胞具有生成多種組織和器官(諸如心臟、胰、和神經(jīng)系統(tǒng))的取代細(xì)胞的潛力，所以可以將干細(xì)胞靶向身體內(nèi)特定器官，以修復(fù)或取代遭到許多破壞性疾病和殘廢損傷或破壞的細(xì)胞或組織。在一些實(shí)施方案中，疾病可以是心臟病、肺病、腎病或肝病，例如心肌梗死、肺氣腫、囊性纖維化、微量蛋白尿、腎炎、中風(fēng)或肝炎。
通過對哺乳動物施用糖綴合物并施用動員干細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)的化學(xué)藥品或生物藥品，依照本發(fā)明的方法還可用于治療哺乳動物中特征為組織損傷的疾病。循環(huán)中被動員干細(xì)胞的濃度可能受到限制，因?yàn)槟承┢鞴倏赡軈R集干細(xì)胞，從而限制將有效劑量投遞至受損器官。通過抑制匯集，本發(fā)明的糖綴合物提高了器官中的細(xì)胞劑量；從而提高生成取代細(xì)胞的潛力。包括動員干細(xì)胞的試劑的這些方法還可用于多種組織和器官，諸如心臟、胰、和神經(jīng)系統(tǒng)?？梢詫⒈粍訂T的干細(xì)胞靶向體內(nèi)特定器官，以修復(fù)或取代遭到許多破壞性疾病和殘廢損傷或破壞的細(xì)胞或組織。在干細(xì)胞被動員的一些實(shí)施方案中，疾病可以是心臟病、肺病、腎病、神經(jīng)學(xué)疾病或肝病，諸如例如心肌梗死、肺氣腫、囊性纖維化、微量蛋白尿、腎炎、中風(fēng)或肝炎。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含細(xì)胞和糖綴合物如糖蛋白的制藥學(xué)組合物?？捎糜诒景l(fā)明的糖蛋白包括例如胎球蛋白、血清類粘蛋白(O)和脫唾液酸血清類粘蛋白(ASO)。在其它方面，本發(fā)明的特點(diǎn)是制造的產(chǎn)品，包括包裝材料和包裝材料中所包含的制藥學(xué)試劑，其中制藥學(xué)試劑包含本發(fā)明的糖綴合物，其能夠依照本發(fā)明在治療上有效地將細(xì)胞靶向期望器官，且其中包裝材料包含標(biāo)簽，其依照本發(fā)明指示所述制藥學(xué)試劑可用于將細(xì)胞靶向期望器官。在一些實(shí)施方案中，制造的產(chǎn)品還包括額外試劑，諸如用于制備將要施用的細(xì)胞懸浮液的溶液，和/或印刷的說明書，用于依照本發(fā)明對細(xì)胞進(jìn)行靶向。這些產(chǎn)品包括例如用于在哺乳動物中治療組織損傷或?qū)⒐δ芑蚧蚧虍a(chǎn)物投遞至組織、包括細(xì)胞和糖蛋白的試劑盒。可用于本發(fā)明的制造產(chǎn)品的糖蛋白包括胎球蛋白、脫唾液酸胎球蛋白、血清類粘蛋白和脫唾液酸血清類粘蛋白。
在還有一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于衍生干細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞群從而生成攜帶脫唾液酸決定簇的細(xì)胞制劑以促進(jìn)肝捕獲的方法。具體而言，本發(fā)明提供了衍生化的、激活的干細(xì)胞或淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞在其表面上具有通過酶或化學(xué)手段生成的脫唾液酸決定簇使得這些細(xì)胞在腸胃外施用后循環(huán)、結(jié)合、并通過ASGP受體被肝匯集或捕獲。本領(lǐng)域知道用唾液酸酶諸如神經(jīng)氨酸酶處理整個存活細(xì)胞的方法。參閱如Neubauer，R.H.等人，“Identification of normal andtransformed lymphocyte subsets of nonhuman primates withmonoclonal antibodies to human lymphocytes”即“使用針對人淋巴細(xì)胞的單克隆抗體鑒定非人靈長類的正常和經(jīng)轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞子集”，J.Immunol.，1301323-1329，1983；Kolb-Bachofen，V.等人，1979，見上文；和Kolb，H.等人，1979，見上文。
例如，本發(fā)明提供了衍生干細(xì)胞從而在這些細(xì)胞的表面上生成新近脫唾液酸決定簇的方法，目的是將這些細(xì)胞導(dǎo)向肝以修復(fù)或再生肝功能和結(jié)構(gòu)，或者用于投遞正?；蚧蚪?jīng)過基因工程改造的細(xì)胞，以治愈或改善疾病狀況。本發(fā)明這個方面的可操作元素是指導(dǎo)注入的攜帶人工產(chǎn)生的新近脫唾液酸糖決定簇的干細(xì)胞定位的能力、它們與受者生成微嵌合體的能力、以及新決定簇被肝特異匯集的機(jī)制。由此，這些攜帶新近脫唾液酸糖決定簇的細(xì)胞的同化將導(dǎo)致微嵌合(衍生的干細(xì)胞與遺傳學(xué)異常的原始宿主細(xì)胞的混合物)。經(jīng)修飾的干細(xì)胞至少將表達(dá)逆轉(zhuǎn)或改善疾病表型所需要的異?；蛉笔У鞍踪|(zhì)或調(diào)控功能的最小需求量。經(jīng)修飾的干細(xì)胞可以衍生自患者的血液、骨髓或生成干細(xì)胞的其它器官，諸如脂肪組織，或者可以衍生自另一個體或干細(xì)胞系。
通過用生成“新近脫唾液酸決定簇”的酶對細(xì)胞表面進(jìn)行衍生化而特異推動腸胃外施用的激活后淋巴細(xì)胞的肝匯集，本發(fā)明還提供了用于操縱淋巴樣溶細(xì)胞性細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞運(yùn)輸模式的方法。由此，激活的淋巴樣細(xì)胞群具有能夠結(jié)合ASGP受體的細(xì)胞表面脫唾液酸決定簇，而且通過生成新細(xì)胞表面脫唾液酸決定簇的酶處理，這種結(jié)合能夠得到進(jìn)一步的增強(qiáng)。
通過促進(jìn)腸胃外施用的經(jīng)衍生而生成細(xì)胞表面脫唾液酸決定簇的細(xì)胞的肝捕獲(通過ASGP受體)，這些方法可用于例如提高針對肝轉(zhuǎn)移或原發(fā)性肝腫瘤的過繼免疫療法的效率。多種癌癥在轉(zhuǎn)移到肝后難以治療。例如，在收獲骨髓或自體干細(xì)胞產(chǎn)品用于移植之前，必須消除乳腺癌向肝的轉(zhuǎn)移。為了實(shí)現(xiàn)完全反應(yīng)，化療本身可能需要幾個月。它常常導(dǎo)致骨髓遏制，使得由個體收獲干細(xì)胞極其困難。在腫瘤耐受化療的情況中，治療選擇將會很少。過繼免疫療法確實(shí)存在，可以在培養(yǎng)中“訓(xùn)練”患者自身細(xì)胞識別腫瘤，然后將這些細(xì)胞靜脈內(nèi)轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)以尋找并破壞腫瘤。
若腫瘤主要在肝中，則進(jìn)行幾個循環(huán)的特異致力于由肝消除腫瘤的治療可能是有用的。依照本發(fā)明，這可以通過用酶(包括但不限于唾液酸酶，諸如神經(jīng)氨酸酶)處理激活的淋巴樣細(xì)胞群(已經(jīng)在培養(yǎng)中生長或受“訓(xùn)練”)或修飾細(xì)胞表面糖基化位點(diǎn)以暴露脫唾液酸決定簇的其它處理來實(shí)現(xiàn)。這些決定簇的數(shù)目因而顯著增加，與攜帶“正?！睌?shù)目的脫唾液酸決定簇的細(xì)胞相比，經(jīng)修飾細(xì)胞因而更易于結(jié)合肝ASGP受體且較少解離。
攜帶新近脫唾液酸糖決定簇的淋巴樣細(xì)胞的同化作用導(dǎo)致微嵌合，正如上文關(guān)于干細(xì)胞所述，即注入的經(jīng)過或未經(jīng)基因工程改造的淋巴細(xì)胞與該部位存在的原始宿主淋巴樣細(xì)胞的混合物。通過分開并進(jìn)入循環(huán)且征募其它細(xì)胞群來參與局部免疫應(yīng)答，注入的淋巴樣細(xì)胞將提高或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。肝環(huán)境理想地適合于免疫應(yīng)答的發(fā)展，這要?dú)w結(jié)于先天免疫系統(tǒng)細(xì)胞以及竇狀隙和脈管系統(tǒng)特別是門靜脈系中消化性抗原呈遞細(xì)胞(professional antigen presenting cells)的存在。
例如，幾項(xiàng)研究顯示，通過對肝局部施用激活的淋巴細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)對例如轉(zhuǎn)移性皮膚黑素瘤的應(yīng)答。參閱如Keilhoiz，U.等人，“Regional adoptive immunotherapy with interleukin-2 andlymphokine-activated killer(LAK)cells for liver metastasis”即“使用白介素-2和經(jīng)淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞、針對肝轉(zhuǎn)移的局部過繼免疫療法”，Eur.J.Cancer，3OA103-105，1994。使用經(jīng)過修飾而生成額外細(xì)胞表面脫唾液酸決定簇的激活淋巴細(xì)胞的本發(fā)明方法能夠通過肝動脈或門靜脈或外周靜脈而將激活后的淋巴細(xì)胞局部投遞至肝，無需使用侵入性操作來將這些細(xì)胞投遞至原發(fā)性肝或非肝瘤，或者投遞至遠(yuǎn)離原發(fā)性肝或非肝癌的轉(zhuǎn)移性損傷處。
附圖簡述

圖1提供了肝中骨髓干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的肝捕獲的示意圖。細(xì)胞表面上的脫唾液酸糖決定簇與肝細(xì)胞表面上的ASGP受體發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致肝中骨髓干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的定位。包括脫唾液酸糖綴合物在內(nèi)的糖綴合物可阻斷細(xì)胞表面上的脫唾液酸糖決定簇與肝細(xì)胞表面上的ASGP受體之間的這些相互作用。
圖2顯示了本發(fā)明的兩種例示性糖蛋白的糖類結(jié)構(gòu)。
圖3顯示了不同糖類對ASGP受體的相對結(jié)合親和力。
圖4顯示了不同糖類對ASGP受體的相對結(jié)合親和力。
圖5顯示了用于研究NK/LAK細(xì)胞粘附(1)人肝癌細(xì)胞系(HEP2G)(相對于人肝組織的細(xì)胞展示最小偏差的一種脫唾液酸糖蛋白受體陽性(ASGPR+)細(xì)胞系)，和(2)人腎細(xì)胞癌細(xì)胞系(CAKI-2)(一種ASGPR-細(xì)胞系)單層培養(yǎng)物的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的示意圖。
圖6顯示了測試脫唾液酸胎球蛋白(ASF)和胎球蛋白(F)在4℃對NK/LAK細(xì)胞(表述為NK/LAK活性)粘附HEP2G單層的影響的結(jié)果圖。在存在完全唾液酸化的對照蛋白質(zhì)即胎球蛋白即F(LAK-NA/F)時，LAK活性(50％)在4℃粘附人最小偏差肝癌，HEPG2。在存在脫唾液酸胎球蛋白即ASF(LAK-NA/ASF)時，LAK活性不粘附HEPG2單層。在只存在ASF時，將LAK細(xì)胞保溫，即沒有進(jìn)行對單層的粘附(LAK/ASF)。對照細(xì)胞不殺傷RAJI靶(對照)。**這代表了三名不同供體。
圖7顯示了測試脫唾液酸胎球蛋白(ASF)和胎球蛋白(F)在23℃對NK/LAK細(xì)胞粘附HEP2G和CAKI-2細(xì)胞的影響的結(jié)果。效應(yīng)細(xì)胞群是未經(jīng)處理的3日齡LAK制劑(LAK)和經(jīng)過霍亂弧菌(Vibrio cholera)神經(jīng)氨酸酶處理的相同細(xì)胞群(LAK/NS)。在存在ASF或F時LAK對HEPG2(ASGPR+)和CAKI-2(ASGPR-)的粘附在K562上進(jìn)行測定。(LAK＝3日齡LAK；K5＝K562靶；FET＝胎球蛋白；ASF＝脫唾液酸胎球蛋白；LAK/CAKI/ASF/K5＝LAK對經(jīng)過ASF預(yù)處理的CAKI的粘附，在K562上進(jìn)行測定)。
圖8顯示了如圖7所示測試脫唾液酸胎球蛋白(ASF)和胎球蛋白(F)在23℃對NK/LAK細(xì)胞向HEP2G和CAKI-2細(xì)胞的粘附產(chǎn)生的影響的額外結(jié)果。在存在ASF或F時，經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的LAK與HEPG2(ASGPR+)和CAKI-2(ASGPR-)的粘附(LAK/NS＝經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的LAK；范例-LAK/CAK/NS/ASF/K5＝經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的LAK對經(jīng)過ASF預(yù)處理的CAKI的粘附，在K562上進(jìn)行測定)。
圖9顯示了如圖7所示測試脫唾液酸胎球蛋白(ASF)和胎球蛋白(F)在23℃對NK/LAK細(xì)胞向HEP2G和CAKI-2細(xì)胞的粘附產(chǎn)生的影響的額外結(jié)果。在存在ASF或F時LAK粘附HEPG2(ASGPR+)和CAKI-2(ASGPR-)的情況在RAJI上進(jìn)行測定。(LAK＝3日齡LAK；R＝RAJI靶；FET＝胎球蛋白；ASF＝脫唾液酸胎球蛋白；LAK/CAKI/ASF/R＝LAK對經(jīng)過ASF預(yù)處理的CAKI的粘附，在RAJI上進(jìn)行測定)。
圖10顯示了如圖7所示測試脫唾液酸胎球蛋白(ASF)和胎球蛋白(F)在23℃對NK/LAK細(xì)胞向HEP2G和CAKI-2細(xì)胞的粘附產(chǎn)生的影響的額外結(jié)果。在存在ASF或F時經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的LAK粘附HEPG2(ASGPR+)和CAKI-2(ASGPR-)。(LAK/NS＝經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的LAK；范例-LAK/CAK/NS/ASF/R＝經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的LAK對經(jīng)過ASF預(yù)處理的CAKI的粘附，在RAJI上進(jìn)行測定)。
圖11顯示了測試細(xì)胞表面修飾對NK/LAK細(xì)胞粘附HEP2G細(xì)胞單層的影響的結(jié)果。5日齡LAK、經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的LAK、和對照(無IL-2)的細(xì)胞毒性活性，在K562上進(jìn)行測定。
圖12顯示了如圖11所示測試細(xì)胞表面修飾對NK/LAK細(xì)胞粘附HEP2G細(xì)胞單層的影響的額外結(jié)果。5日齡LAK、經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的LAK、和對照(無IL-2)的細(xì)胞毒性活性，在RAJI細(xì)胞上進(jìn)行測定。
圖13顯示了如圖11所示測試細(xì)胞表面修飾對NK/LAK細(xì)胞粘附HEP2G細(xì)胞單層的影響的額外結(jié)果。在用神經(jīng)氨酸酶、2，3-或2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行細(xì)胞表面修飾后LAK活性對HEPG2(ASGPR+)的粘附。(范例LAK/HEP/NASE/K5＝經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的LAK粘附HEPG2，在K562上進(jìn)行測定)。
圖14顯示了如圖11所示測試細(xì)胞表面修飾對NK/LAK細(xì)胞粘附HEP2G和CAKI-2細(xì)胞單層的影響的額外結(jié)果。在用神經(jīng)氨酸酶、2，3-或2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行細(xì)胞表面修飾后LAK活性對CAKI-2(ASGPR-)的粘附。(圖13和14中的虛線是相同對照)。
圖15顯示了如圖11所示測試細(xì)胞表面修飾對NK/LAK細(xì)胞粘附HEP2G和CAKI-2細(xì)胞單層的影響的額外結(jié)果。在用神經(jīng)氨酸酶、2，3-或2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行細(xì)胞表面修飾后LAK活性對HEPG2(ASGPR+)的粘附。
圖16顯示了如圖11所示測試細(xì)胞表面修飾對NK/LAK細(xì)胞粘附HEP2G和CAKI-2細(xì)胞單層的影響的額外結(jié)果。在用神經(jīng)氨酸酶、2，3-或2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行細(xì)胞表面修飾后LAK活性對CAKI-2(ASGPR-)的粘附，在RAJI細(xì)胞上進(jìn)行測定。
發(fā)明詳述A.導(dǎo)言本發(fā)明致力于用于將細(xì)胞投遞至哺乳動物體內(nèi)靶組織的方法。該方法包括下列步驟對哺乳動物同時或順序施用糖類呈遞分子(如糖綴合物)和細(xì)胞。在本發(fā)明的方法中，認(rèn)為糖綴合物，尤其是脫唾液酸糖綴合物，包括脫唾液酸血漿蛋白質(zhì)諸如脫唾液酸血清類粘蛋白(脫唾液酸α-1-酸糖蛋白)，可瞬時結(jié)合肝ASGP受體，從而競爭性抑制攜帶脫唾液酸決定簇的細(xì)胞粘附這些受體。不希望受到理論的約束但推測缺唾液酸化和脫唾液酸化的蛋白質(zhì)/糖綴合物(也稱為脫唾液酸糖綴合物)和攜帶相似決定簇的細(xì)胞在肝中因結(jié)合肝ASGP受體而被縛或“捕獲”(見圖1)。脫唾液酸糖綴合物對受體的占據(jù)抑制了攜帶相似的目的決定簇的細(xì)胞在肝中匯集。
另外，本公開書顯示本發(fā)明的糖綴合物可預(yù)防注入的細(xì)胞在肺泡脈管系統(tǒng)中集中。這個發(fā)現(xiàn)說明細(xì)胞的肺匯集可能與內(nèi)皮細(xì)胞上炎性受體的表達(dá)有關(guān)，與重輸注綜合癥類似(參閱如Kilgore等人，Cardiovasc.Res.，28437-444，1994；和Eror等人，Clin.Immunol.，90266-275，1999)。這得到了下面的報告的支持血清類粘蛋白、ASO和脫半乳糖/脫唾液酸血清類粘蛋白抑制嗜中性粒細(xì)胞激活、超氧化物陰離子生成、以及血小板激活，正如上文所述。
本發(fā)明還證明，通過改變施用的特定糖綴合物，糖蛋白可用于將細(xì)胞運(yùn)輸或靶向至身體特定器官。這些方法可用于改善骨髓和干細(xì)胞移植、組織修復(fù)、基因療法或過繼免疫療法的功效。
在細(xì)胞靶向肺的實(shí)施方案中，這些方法的特點(diǎn)是在鹽水或血清清蛋白-鹽水溶液中對哺乳動物施用細(xì)胞。在造血干細(xì)胞靶向心臟的一些實(shí)施方案中，這些方法的特點(diǎn)是對哺乳動物施用脫唾液酸血清類粘蛋白并施用細(xì)胞。在間充質(zhì)干細(xì)胞靶向心臟的其它實(shí)施方案中，這些方法的特點(diǎn)是對哺乳動物施用血清類粘蛋白并施用細(xì)胞。在造血干細(xì)胞靶向肝的實(shí)施方案中，這些方法的特點(diǎn)是對哺乳動物施用血清類粘蛋白并施用細(xì)胞。在間充質(zhì)干細(xì)胞靶向肝的其它實(shí)施方案中，這些方法的特點(diǎn)是對哺乳動物施用脫唾液酸血清類粘蛋白并施用細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，血清類粘蛋白或脫唾液酸血清類粘蛋白是在對哺乳動物施用細(xì)胞之前在至少兩次輸注中施用的。依照本發(fā)明的方法也可用于抑制細(xì)胞在哺乳動物肝中的匯集，甚至在沒有將細(xì)胞靶向靶器官時也可如此。
脫唾液酸糖綴合物，例如脫唾液酸胎球蛋白和其它脫唾液酸血漿蛋白質(zhì)，能夠結(jié)合肝實(shí)質(zhì)和枯否細(xì)胞ASGP受體。阻斷這些受體結(jié)合并捕獲攜帶脫唾液酸決定簇的細(xì)胞，諸如骨髓細(xì)胞，可促進(jìn)并延長它們系統(tǒng)循環(huán)的時間間隔。在骨髓干細(xì)胞的情況中，施用這些化合物可預(yù)防骨髓干細(xì)胞的損失和破壞并提高移入的效率。骨髓細(xì)胞具有能夠結(jié)合ASGP受體的細(xì)胞表面脫唾液酸決定簇，而且這種結(jié)合能夠被ASGP的應(yīng)用所抑制。
本發(fā)明基于的是如下觀察結(jié)果在將人外周造血干(CD34+)細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞注入免疫缺陷小鼠的頸靜脈后，它們主要定位于肺中。若在細(xì)胞之前注入脫唾液酸血清類粘蛋白，則造血干細(xì)胞主要定位于心臟，而間充質(zhì)干細(xì)胞定位于肝?；蛘?，若在細(xì)胞之前注入血清類粘蛋白(O)，則造血干細(xì)胞定位于肝，而間充質(zhì)干細(xì)胞主要定位于心臟。
與不進(jìn)行蛋白質(zhì)輸注時發(fā)生的定位相比，這些蛋白質(zhì)輸注引起更大量的向特定器官的定位。此外，因脫唾液酸血清類粘蛋白的影響而定位于心臟的造血干細(xì)胞在輸注后一小時離開血管空間并在心肌細(xì)胞中觀察到。此外，一旦進(jìn)入組織，這些細(xì)胞就喪失了它們的CD34抗原，指示它們進(jìn)入了分化成心肌細(xì)胞或心臟構(gòu)件(如血管)的過程。另外，證明了CD34+細(xì)胞在一小時時由脈管系統(tǒng)移動到肺組織。在經(jīng)過血清類粘蛋白處理的小鼠中，在肝實(shí)質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了干細(xì)胞簇，還證明它們喪失了CD34抗原，再次說明分化成肝細(xì)胞/肝實(shí)質(zhì)。
本發(fā)明證明了以無損傷的方式將高濃度的干細(xì)胞導(dǎo)向特定器官的能力。這增強(qiáng)了干細(xì)胞遷移到靶組織中并分化成期望細(xì)胞類型的概率和速率。本發(fā)明利用了將血清類粘蛋白或ASO投遞至接近心臟的血管引起輸注的干細(xì)胞在心臟中積累的觀察結(jié)果。不希望受到理論的約束，推測注入糖蛋白使得緊挨輸注部位的下游內(nèi)皮變得敏感，這使得內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合干細(xì)胞并增強(qiáng)它們穿過內(nèi)皮而進(jìn)入組織的遷移，由此可以引起該效果。
使用糖綴合物得到的這些發(fā)現(xiàn)指示干細(xì)胞輸注的大多數(shù)能夠在靶器官中集中，從而提供了投遞有效攝取細(xì)胞劑量的手段。這樣就有可能非侵入性靶向?qū)嶓w器官，諸如心臟，從而與侵入性直接注射法相抗衡。可能更重要的是，糖綴合物提供了靶向非常彌散的組織的手段，諸如不受注射藥劑作用的肝和腎。
已認(rèn)識到由骨髓、外周血或臍帶血回收的造血干細(xì)胞(HSC)以及由骨髓基質(zhì)細(xì)胞、來自吸脂術(shù)脂肪的基質(zhì)細(xì)胞回收的或由清除了臍血的胎盤中的靜止基質(zhì)祖細(xì)胞擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)似乎在它們的分化能力上幾乎可互換，而且可作為多能干細(xì)胞發(fā)揮作用。
這些細(xì)胞顯示在定位于特定器官和組織后分化成功能細(xì)胞肝中的肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞(cholangiocyte)，心臟中的心肌細(xì)胞和動脈平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，肺泡中的肺細(xì)胞I和II和肺中的支氣管上皮，用于軟骨恢復(fù)的軟骨細(xì)胞，以及腸粘膜細(xì)胞、心臟中的小、中和大血管，等。
B.干細(xì)胞干細(xì)胞可能是取代許多破壞性疾病中喪失的細(xì)胞的關(guān)鍵，諸如帕金森病、糖尿病、急性和慢性心臟病、末期腎病、肝功能衰竭、和癌癥。對于許多疾病，沒有有效治療方法，但是目標(biāo)是找到取代天然過程所喪失的東西的方法。
至今為止，發(fā)表的科學(xué)論文指出已經(jīng)在腦、骨髓、外周血、血管、骨骼肌、皮膚和消化系統(tǒng)的上皮、角膜、牙齒的牙髓、視網(wǎng)膜、肝、和胰中鑒定了成人干細(xì)胞。由此，已經(jīng)在由所有三個胚胎胚層發(fā)育而成的組織中發(fā)現(xiàn)了成人干細(xì)胞。
作為定義，本領(lǐng)域這樣理解下列術(shù)語“干細(xì)胞”指來自胚胎、胎兒或成人，且在某些條件下具有長期或者在成人干細(xì)胞的情況中是指在生物體的整個壽命期間再生自身的能力的細(xì)胞。它還能夠生成構(gòu)成身體的組織和器官的分化細(xì)胞。
“多能干細(xì)胞”具有生成由三個胚層(中胚層、內(nèi)胚層、和外胚層)發(fā)育而成的細(xì)胞類型的能力。身體的所有細(xì)胞都是由這三個胚層生成的。人多能干細(xì)胞的唯一已知來源是由早期人胚胎和注定成為生殖腺一部分的胎兒組織分離并培養(yǎng)的那些干細(xì)胞。
“胚胎干細(xì)胞”衍生自稱為內(nèi)細(xì)胞群的一組細(xì)胞，它是稱為胚泡的早期(4-5天)胚胎的一部分。一旦脫離胚泡，內(nèi)細(xì)胞群的細(xì)胞可以被培養(yǎng)成胚胎干細(xì)胞。這些胚胎干細(xì)胞自身并不是胚胎。
“成人干細(xì)胞”指分化組織中存在的、自我更新并在轉(zhuǎn)移到適當(dāng)組織后分化產(chǎn)生它所放置的組織中的所有分化細(xì)胞類型的未分化細(xì)胞。成人干細(xì)胞能夠在生物體的一生中生成相同拷貝的自身。這種特性稱為“自我更新”。成人干細(xì)胞常常分裂生成祖細(xì)胞或前身細(xì)胞，后者再分化或發(fā)育成具有特征形態(tài)和專門功能的“成熟”細(xì)胞類型，如肌細(xì)胞收縮或神經(jīng)細(xì)胞發(fā)送信號。成人干細(xì)胞的來源包括骨髓、血液、眼睛的角膜和視網(wǎng)膜、腦、骨骼肌、牙髓、肝、皮膚、胃腸道內(nèi)層和胰。
來自骨髓的干細(xì)胞是研究得最多的一類成人干細(xì)胞。目前，它們在臨床上已被用于通過移植恢復(fù)骨髓的各種血液和免疫成分。目前在骨髓中鑒定了兩種主要的干細(xì)胞類型通常視為形成血液和免疫細(xì)胞的造血干細(xì)胞(HSC，或CD34+細(xì)胞)，和通常視為形成骨、軟骨、肌肉和脂肪的基質(zhì)(間充質(zhì))干細(xì)胞(MSC)。然而，最近證明了這兩種骨髓衍生干細(xì)胞在形成相同組織的能力方面有廣泛可塑性和多能性。
位于骨骼骨髓腔內(nèi)的骨髓是成人體內(nèi)造血的唯一部位。它產(chǎn)生大約六十億個細(xì)胞每千克體重每天。造血活性(紅色)骨髓在出生后退化，直至青春期晚期，然后它集中于下部頭骨、肩和腰帶、肋骨、和胸骨。脂肪細(xì)胞代替手、腳、腿和臂骨骼中的造血細(xì)胞(黃骨髓)。脂肪在成人中占據(jù)了紅色骨髓大約百分之五十的空間，而且進(jìn)一步的脂肪變態(tài)隨著衰老而緩慢繼續(xù)。在很老的個體中，可能發(fā)生脂肪凝膠狀轉(zhuǎn)化成粘液狀物質(zhì)(白色骨髓)。如果存在長期需要，諸如患有溶血性貧血，黃色骨髓可以回復(fù)成造血活性骨髓。由此，可以通過增加紅色骨髓的體積和縮短由祖細(xì)胞發(fā)育(轉(zhuǎn)變)成成熟細(xì)胞所需要的時間來擴(kuò)大造血。
骨髓基質(zhì)主要由竇網(wǎng)組成，它在骨內(nèi)膜由皮層毛細(xì)管起源，并在進(jìn)入全身靜脈循環(huán)的收集血管中終止。三層竇壁由內(nèi)皮細(xì)胞、不發(fā)達(dá)的薄基底膜、和外膜網(wǎng)狀細(xì)胞(能夠轉(zhuǎn)化成脂肪細(xì)胞的成纖維細(xì)胞)組成。內(nèi)皮和網(wǎng)狀細(xì)胞是造血細(xì)胞因子的來源。造血在竇間空間進(jìn)行，而且受到刺激性和抑制性細(xì)胞因子的復(fù)雜陣列、細(xì)胞-細(xì)胞接觸、胞外基質(zhì)成分對附近細(xì)胞的影響的控制。在這種獨(dú)特環(huán)境中，淋巴造血干細(xì)胞分化成所有的血細(xì)胞類型。生成并釋放成熟細(xì)胞以維持穩(wěn)態(tài)血細(xì)胞水平。由于失血、溶血、發(fā)炎、免疫細(xì)胞減少(immunecytopenias)、和其它原因，系統(tǒng)可能會滿足對額外細(xì)胞的更大需求?？梢酝ㄟ^預(yù)防肝經(jīng)由肝ASGP受體的捕獲來提高骨髓干細(xì)胞的輸注效率。
“祖細(xì)胞或前身細(xì)胞”存在于胎兒或成人組織中，而且是部分分化的；它分裂并生成分化細(xì)胞。研究人員通常能夠?qū)⑶吧砑?xì)胞/祖細(xì)胞與成人干細(xì)胞區(qū)分開來，依據(jù)是干細(xì)胞分裂后，兩個新細(xì)胞中的一個常常是能夠再次復(fù)制自身的干細(xì)胞。相反，祖細(xì)胞/前身細(xì)胞分裂后，它能夠形成更多的祖細(xì)胞/前身細(xì)胞，或者它能夠形成兩個分化細(xì)胞。祖細(xì)胞/前身細(xì)胞能夠取代受損或死亡的細(xì)胞，由此維持組織諸如肝或腦的完整性和功能。
用于分離并培養(yǎng)可用于本發(fā)明的干細(xì)胞的方法是眾所周知的。臍帶血是造血干細(xì)胞的豐富來源。由臍帶血獲得的干細(xì)胞和由骨髓或外周血獲得的干細(xì)胞對于移植用途顯得非常相似。胎盤是間充質(zhì)干細(xì)胞的極佳的、易得到的來源。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞顯示可以由脂肪組織和骨髓基質(zhì)細(xì)胞衍生，且推測存在于其它組織中。盡管能夠衍生成人干細(xì)胞的器官在質(zhì)量上和數(shù)量上存在顯著差異，但細(xì)胞之間的最初差異可能相對膚淺，而且可以通過它們所展示的可塑性相似范圍得到平衡。例如，在適當(dāng)條件下，造血和間充質(zhì)成人干細(xì)胞都能夠變成心肌細(xì)胞。對成人干細(xì)胞潛力的完整闡述才剛開始。
可以使用已知方法來分離干細(xì)胞以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)和分化。例如，在小鼠中，通過處死小鼠并用剪刀切下腿骨來分離骨髓細(xì)胞。還可以通過用結(jié)合不需要的細(xì)胞(諸如CD4+和CD8+(T細(xì)胞)、CD45+(panB細(xì)胞)、GR-1(粒細(xì)胞)、和lad(分化抗原呈遞細(xì)胞))的抗體淘選骨髓細(xì)胞而由骨髓細(xì)胞分離干細(xì)胞。關(guān)于這個方案的范例可參閱Inaba等人，I.Exp.Med.，1761693-1702，1992。
在人中，可以由多種來源獲得CD34+造血干細(xì)胞，包括臍血髓、和活動化外周血?？梢酝ㄟ^抗體親和流程來實(shí)現(xiàn)CD34+細(xì)胞的純化。Ho等人，Stem Cells，13增刊31100-105，1995描述了用于分離CD34+細(xì)胞的親和柱分離流程。還可參閱Brenner，Journal ofHematotherapy，27-17，1993。用于分離、純化和培養(yǎng)擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞的方法是已知的。MSC的特異抗原也是已知的(參閱美國專利號5,486,359和5,837,539)。
C.糖類呈遞細(xì)胞可用于本發(fā)明的糖類呈遞分子可以是能夠呈遞適當(dāng)糖類結(jié)構(gòu)從而增強(qiáng)或抑制將目的細(xì)胞靶向靶組織的任何分子。可以使用糖類分子來進(jìn)行靶向功能，諸如寡糖、多糖，或者可以將糖類結(jié)構(gòu)結(jié)合大型分子或載體上，本文稱為糖綴合物。通常，糖類分子將連接天然存在的載體(如作為糖蛋白或糖脂的一部分)或合成載體(如經(jīng)過改造的多肽序列)。技術(shù)人員將認(rèn)識到許多載體可用于呈遞適當(dāng)結(jié)構(gòu)。適當(dāng)載體分子的范例包括多肽、脂、諸如此類。本領(lǐng)域描述了使用脫唾液酸糖類模塊的靶向化合物的制備和使用(參閱如美國專利號5,679,323、5,089,604、5,032,678和5,284,646)。技術(shù)人員將認(rèn)識到這些化合物還可作為可用于本發(fā)明的糖類呈遞分子。
在糖綴合物是糖蛋白的情況中，它一般可以由通式P-(S)x-Gal表述，其中P是人血清糖蛋白的肽殘基，而S是人血清糖蛋白的糖殘基；x是1-100的整數(shù)，而Gal是半乳糖殘基。特別有用的糖綴合物包括胎球蛋白、脫唾液酸胎球蛋白(見圖2)、血清類粘蛋白、脫唾液酸血清類粘蛋白、半乳糖鍵合聚葡糖胺、諸如此類。
本發(fā)明的方法能夠?qū)⒓?xì)胞諸如干細(xì)胞靶向靶組織諸如心臟、肝、腎和肺等。腸胃外施用糖綴合物，諸如脫唾液酸血清類粘蛋白，可用于阻斷肝ASGP受體，使得攜帶表面脫唾液酸決定簇的細(xì)胞(例如花生凝集素(PNA)+細(xì)胞)繼續(xù)循環(huán)并移動到骨髓空間。脫唾液酸血清類粘蛋白是顯示可結(jié)合肝ASGP受體并廣泛用于鑒定這種受體的一種糖蛋白。
根據(jù)所呈遞的糖類，不同化合物對于ASGP受體具有不同結(jié)合親和力(見圖3和4)。由此，技術(shù)人員可以通過使用呈遞不同糖類結(jié)構(gòu)的化合物來調(diào)控細(xì)胞靶向。
靜脈內(nèi)施用糖綴合物，尤其是ASGP諸如脫唾液酸血清類粘蛋白，可用于阻斷肝ASGP受體，使得攜帶表面脫唾液酸決定簇的細(xì)胞繼續(xù)循環(huán)并移動到骨髓空間或目的器官?？梢栽谙鄬τ诩?xì)胞的任何時間范圍內(nèi)對哺乳動物施用糖綴合物，但是在一些實(shí)施方案中，在施用細(xì)胞之前施用糖綴合物。可以通過任何合適途徑施用脫唾液酸糖綴合物和細(xì)胞，但是在一些實(shí)施方案中，它們是經(jīng)靜脈內(nèi)施用于哺乳動物的，而在其它實(shí)施方案中，它們是腸胃外施用的。在細(xì)胞靶向肺的實(shí)施方案中，這些方法的特點(diǎn)可以是在鹽水或血清清蛋白-鹽水溶液中對哺乳動物施用細(xì)胞。在將造血干細(xì)胞靶向心臟的一些實(shí)施方案中，這些方法的特點(diǎn)可以是對哺乳動物施用脫唾液酸血清類粘蛋白并施用細(xì)胞。在將間充質(zhì)干細(xì)胞靶向心臟的其它實(shí)施方案中，這些方法的特點(diǎn)可以是對哺乳動物施用血清類粘蛋白并施用細(xì)胞。在將造血干細(xì)胞靶向肝的實(shí)施方案中，這些方法的特點(diǎn)可以是對哺乳動物施用血清類粘蛋白并施用細(xì)胞。在將間充質(zhì)干細(xì)胞靶向肝的其它實(shí)施方案中，這些方法的特點(diǎn)可以是對哺乳動物施用脫唾液酸血清類粘蛋白并施用細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，血清類粘蛋白或脫唾液酸血清類粘蛋白是在對哺乳動物施用細(xì)胞之前或之后在至少兩次輸注中施用的。依照本發(fā)明的方法對于抑制細(xì)胞在哺乳動物肝中的匯集同樣有用，甚至在沒有將細(xì)胞靶向靶器官時也如此。
α-(1)-酸糖蛋白(血清類粘蛋白或AAG)是人血漿的正常組分(650±215μg/ml)，在與急性發(fā)炎和癌癥有關(guān)時它的濃度提高了高達(dá)五倍，因而被看作是急性階段蛋白質(zhì)。血清類粘蛋白由單一多肽鏈構(gòu)成，分子量是44,100，而且包含大約45％糖類，包括12％唾液酸。它是帶最多負(fù)電荷的血漿蛋白質(zhì)。血清類粘蛋白的某些生物學(xué)特性與其唾液酸含量有關(guān)。由此，血清類粘蛋白的清除和免疫原性在脫唾液酸后顯著增加。血清類粘蛋白的生物學(xué)功能在很大程度上是未知的。血清類粘蛋白具有抑制某些淋巴細(xì)胞反應(yīng)性的能力，包括應(yīng)答伴刀血球蛋白A、植物血球凝集素和異源細(xì)胞的母細(xì)胞化，而且這些抑制效果在脫唾液酸后得到增強(qiáng)。有報道說不符合生理學(xué)的大量(5-15mg/ml)血清類粘蛋白抑制由ADP和腎上腺素誘導(dǎo)的血小板聚集，而且有證據(jù)表明缺乏唾液酸的血清類粘蛋白種類在幾種慢性疾病狀況中升高。
D.基因療法本發(fā)明還致力于使用活細(xì)胞將治療性基因投遞到體內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，治療性基因是轉(zhuǎn)基因。例如，由體內(nèi)獲取投遞細(xì)胞，即一類肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、或成纖維細(xì)胞，并通過本領(lǐng)域熟煉技術(shù)人員眾所周知的載體將治療性轉(zhuǎn)基因?qū)脒@些細(xì)胞，諸如直接基因轉(zhuǎn)移法中所使用的那些載體。盡管仍然處于實(shí)驗(yàn)室階段，測試了經(jīng)過遺傳修飾的細(xì)胞，然后使其生長并擴(kuò)增，最后輸注回患者體內(nèi)?；蛘?，攜帶正常內(nèi)源基因的異源細(xì)胞能夠逆轉(zhuǎn)特定靶組織中的缺乏癥。使用攜帶轉(zhuǎn)基因或正常內(nèi)源基因的細(xì)胞在本文中稱為基因療法。
與直接將基因轉(zhuǎn)移到體內(nèi)相比，使用經(jīng)過遺傳修飾的細(xì)胞的基因療法提供了幾項(xiàng)獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。首先，向投遞細(xì)胞中加入治療性轉(zhuǎn)基因是在患者體外進(jìn)行的，這為臨床醫(yī)生提供了重要的控制措施，因?yàn)樗麄兡軌蛑贿x擇并使用既包含轉(zhuǎn)基因又生成足夠量治療劑的那些細(xì)胞。
對于具有治療目的的基于干細(xì)胞的基因療法嘗試，大約三分之一集中于癌癥(如卵巢癌、腦癌、乳癌、骨髓瘤、白血病、和淋巴瘤)，三分之一集中于人免疫缺陷病毒病(HIV-1)，還有三分之一集中于所謂的單基因病(如Gaucher氏病、重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)、范可尼貧血、法布里氏病、和白細(xì)胞粘附缺陷)。
綜上所述，通過對哺乳動物導(dǎo)入包含目的基因的細(xì)胞并施用糖綴合物，依照本發(fā)明的方法可用于將目的基因(或是轉(zhuǎn)基因或是內(nèi)源基因)靶向哺乳動物體內(nèi)組織。通過對哺乳動物施用包含編碼基因產(chǎn)物的功能基因的細(xì)胞并對哺乳動物施用糖綴合物，這些方法可用于治療哺乳動物中特征為基因產(chǎn)物缺乏的疾病。干細(xì)胞可以作為載體用于將基因投遞至體內(nèi)特定組織。基于干細(xì)胞的療法是癌癥研究中的主要研究領(lǐng)域。
本發(fā)明為輸注的細(xì)胞諸如干細(xì)胞提供了定位，從而向受到由基因缺乏引起的疾病困擾的患者提供該功能基因。在基于遺傳學(xué)的疾病的許多情況中，該基因產(chǎn)物的低水平生成將有效減輕或治愈該疾病。通過將來自正常供體的干細(xì)胞輸注到患者體內(nèi)而提供缺乏的基因，可以指導(dǎo)干細(xì)胞定位于選擇的器官或組織，在該器官或組織中引起該患者的微嵌合，該基因產(chǎn)物可以由該器官或組織投遞至患者。因此，本發(fā)明提供了指導(dǎo)輸注細(xì)胞定位的能力，諸如具有穩(wěn)定的、正常的基因的異源干細(xì)胞。然后，這些輸注細(xì)胞生成受者的穩(wěn)定微嵌合體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道引起許多基于遺傳學(xué)的疾病的遺傳缺陷。能夠治療的例示性基因和疾病包括囊性纖維化中的CTFR蛋白質(zhì)以及與肝中凝血病有關(guān)的蛋白質(zhì)。例如，可以使用基因療法來實(shí)現(xiàn)血友病A的治療。在這些實(shí)施方案中，可以輸注細(xì)胞，諸如臍帶血造血干細(xì)胞，以投遞完整的正常因子VIII基因?；蛘?，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中可以包含正常的野生型因子VIII基因?？梢灾笇?dǎo)攜帶功能性因子VIII基因的這些細(xì)胞定位于肝，優(yōu)選通過在輸注干細(xì)胞之前輸注血清類粘蛋白或脫唾液酸血清類粘蛋白來達(dá)到。細(xì)胞轉(zhuǎn)化成干細(xì)胞，并開始向血液中分泌因子VIII。
依照本發(fā)明的基因療法的其它實(shí)施方案包括治療血友病B(因子IX缺乏)、以及抗凝血酶III、蛋白C、和蛋白S缺陷。盡管這些疾病都涉及凝血系統(tǒng)，然而基因療法可能包括治療不同組織，諸如肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化、諸如此類。
E.將轉(zhuǎn)基因?qū)敫杉?xì)胞用于將轉(zhuǎn)基因?qū)爰?xì)胞的方法是眾所周知的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道用于在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)投遞和表達(dá)核酸的多種方法。這些方法包括例如病毒載體、基于脂質(zhì)體的基因投遞(WO 93/24640；ManninoGould-Fogerite，BioTechniques，6(7)682-691，1988；美國專利號5,279,833；WO 91/06309；Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847413-7414，1987；和Budker等人，Nature Biotechnology，14(6)760-764，1996)。熟煉技術(shù)人員知道的其它方法包括孔(美國專利號5,545,130、4,970,154、5,098,843、和5,128,257)、直接基因轉(zhuǎn)移、細(xì)胞融合、沉淀法、微粒轟擊、和由受體介導(dǎo)的攝取(美國專利號5,547,932、5,525,503、5,547,932、和5,460,831)。還可參閱美國專利號5,399,346。
廣泛使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、及其聯(lián)合的那些載體。參閱如Buchscher等人，J.Virol.，66(5)2731-2739，1992；Johann等人，J.Virol.，66(5)1635-1640，1992；Sommerfelt等人，Virol.，17658-59，1990；Wilson等人，J.Virol.，632374-2378，1989；Miller等人，J.Virol.，652220-2224，1991；PCT/US94/05700；以及Rosenburg和Fauci，在《Fundamental Immunology》即《基礎(chǔ)免疫學(xué)》中，第三版，Paul編，1993)。
基于AAV的載體也可用于用靶核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，如在體外核酸和多肽生成中，以及在體內(nèi)和離體基因療法流程中。關(guān)于AAV載體的綜述請參閱West等人，Virology，16038-47，1987；美國專利號4,797,368；WO 93/24641；Kotin，Human Gene Therapy，5793-801，1994；Muzyczka，J.Clin.Invst.，941351，1994；以及Samuiski，見上文。許多發(fā)表物中描述了重組AAV載體的構(gòu)建，包括Lebkowski，美國專利號5,173,414；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.，113251-3260，1985；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.，42072-2081，1984；Hermonat和Muzyczka，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816466-6470，1984；以及Samulski等人，J.Virol.，633822-3828，1989。
通常將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于可用于本發(fā)明的細(xì)胞。這些載體可能包括例如HIV-2顆粒中包裝的HIV-2可包裝核酸(通常使用包裝細(xì)胞系)。作為將基因?qū)氚屑?xì)胞的方法，細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)載體具有可觀的商業(yè)價值。具體而言，可以使用基因療法流程，其中將本發(fā)明的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)載體用于在體內(nèi)或離體流程中用治療性核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞?；虔煼ㄌ峁┝擞糜诳箵粲苫蛉毕菀鸬穆约膊?、傳染性疾病諸如HIV及非傳染性疾病諸如癌癥的方法。
干細(xì)胞諸如CD34+干細(xì)胞可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因療法的離體流程中。本發(fā)明利用了干細(xì)胞在體外分化成其它細(xì)胞類型或能夠?qū)氩溉閯游?諸如細(xì)胞供體)的特點(diǎn)，其中，它們將遷入骨髓中(除非靶向另一種器官以便分化)。由此，本發(fā)明延伸至將干細(xì)胞導(dǎo)向特定器官以再生組織，諸如導(dǎo)向心臟以再生心肌細(xì)胞，導(dǎo)向肺以再生肺泡，和導(dǎo)向腎以再生組織，以及將細(xì)胞諸如CD34+干細(xì)胞導(dǎo)向器官以通過提供有效量的所缺乏基因產(chǎn)物來緩解遺傳異常。使用細(xì)胞因子諸如GM-CSF、IFN-γ和TNF-α在體外使CD34+細(xì)胞分化成臨床上重要的免疫細(xì)胞類型的方法是已知的(參閱Inaba等人，J.Exp.Med.，1761693-1702，1992；以及Szabolcs等人，缺雜志名，1545851-5861，1995)。Yu等人，PNAS，92699-703，1995描述了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)來自人胎兒臍血的CD34+細(xì)胞的方法。
F.制藥學(xué)組合物在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的細(xì)胞和糖綴合物的制藥學(xué)組合物。例示性糖蛋白包括血清類粘蛋白和脫唾液酸血清類粘蛋白。在其它方面，本發(fā)明涉及包括細(xì)胞和糖蛋白的試劑盒，用于治療組織損傷，或用于將功能基因或基因產(chǎn)物投遞至哺乳動物體內(nèi)組織。通常將干細(xì)胞呈遞給期望器官，其或是通過直接注射到組織中，通過輸注到局部循環(huán)中，或是通過帶動來自骨髓的自體干細(xì)胞遷移來達(dá)到的，在可行的情況中，這伴隨著在帶動遷移之前預(yù)先切除捕獲干細(xì)胞的器官，即脾切除術(shù)。
可以在注入干細(xì)胞之前、同時、或之后施用糖綴合物。在一些實(shí)施方案中，可以使用靜脈內(nèi)液袋來施用糖綴合物，它包含在含有或不含蛋白質(zhì)的鹽水或葡萄糖溶液中，或者在不含血清的培養(yǎng)基中，包括但不限于RPMI 1640或AIM-V。在這些實(shí)施方案中，糖綴合物可以在相同袋中或在“piggyback”中與細(xì)胞混合。糖綴合物還可以在施用細(xì)胞后繼續(xù)施用，以延長全身循環(huán)時間或增加特定器官積累?？梢园凑諏⒅委焺┝康募?xì)胞投遞至靶器官所需重復(fù)這個流程?？紤]到來自動物研究的數(shù)據(jù)證明3-7mg糖綴合物每ml血容量(可高達(dá)12mg/小鼠)的劑量沒有副作用，使用該制劑時不用過多擔(dān)心臟毒性。
離體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的施用可以是通過任何常用于導(dǎo)入細(xì)胞或分子使之最終接觸血液或組織細(xì)胞的途徑?？梢砸匀魏魏线m方式施用轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，優(yōu)選使用制藥學(xué)可接受載體。可以找到對患者施用本發(fā)明內(nèi)容中的這些細(xì)胞的合適方法，而且盡管有一種以上路徑可用于施用特定組合物，然而特定路徑常?？梢蕴峁┍绕渌窂礁苯忧腋行У姆磻?yīng)。
制藥學(xué)可接受載體部分是由施用的具體組合物以及用于施用組合物的具體方法決定。因此，本發(fā)明的制藥學(xué)組合物存在多種合適配方。
適用于腸胃外施用的配方，諸如例如關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、和皮下路徑，包括水性和非水性等滲無菌注射液以及水性和非水性無菌懸浮液，其中前者可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、和使得配方與預(yù)期受者血液等滲的溶質(zhì)，后者可以包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、和防腐劑。腸胃外施用是一種有用的施用方法。配方可以裝在單劑或多劑密閉容器中，諸如安瓿和小瓶中，而在一些實(shí)施方案中，配方可以儲藏在凍干條件下，只需要在使用前添加無菌液態(tài)載體例如水用于注射?？梢詫⑦@些配方與可帶動期望類型的成人干細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)的因子一起施用。
可以由先前描述的無菌粉劑、顆粒、和片劑種類制備即時注射溶液和懸浮液。也可以如上所述腸胃外施用用上文離體療法中所描述的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，只是凍干方式通常是不合適的，因?yàn)閮龈蓵茐募?xì)胞。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，施用于患者的劑量應(yīng)當(dāng)足以在患者中隨著時間流逝實(shí)現(xiàn)有利治療反應(yīng)。劑量將由所采用特定細(xì)胞的功效和患者狀況以及待治療患者的體重決定。劑量大小還將由在特定患者中施用細(xì)胞類型所伴隨的任何不利副作用的存在、本質(zhì)、和程度決定。確定疾病的治療或預(yù)防中所施用的細(xì)胞的有效量時，醫(yī)師應(yīng)當(dāng)評估循環(huán)血漿水平，而在取代療法的情況中，還應(yīng)當(dāng)評估目的基因產(chǎn)物的生成。
可按照已經(jīng)建立的方法制備用于再輸注的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。參閱Abrahamsen等人，J.Clin.Apheresis，648-53，1991；Carter等人，J.Clin.Apheresis，4113-117，1988；Aebersold等人，J.Immunol.Methods，1121-7，1988；Muul等人，J.Immunol.Methods，101171-181，1987；以及Carter等人，Transfusion，27362-365，1987。培養(yǎng)大約2-4周后，細(xì)胞數(shù)目可能達(dá)到1×106-1×1010。在這個方面，細(xì)胞的生長特征將因患者的不同和細(xì)胞類型的不同而變化。在再輸注轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞前大約72小時，取小樣分析表型和表達(dá)治療劑的細(xì)胞所占百分比。
對于施用，在應(yīng)用于群眾和患者的全面健康時，可以以根據(jù)細(xì)胞類型的LD-50和細(xì)胞類型在各種濃度下的副作用所確定的速率來施用本發(fā)明細(xì)胞?？梢酝ㄟ^單一或分開的藥劑來進(jìn)行施用。還可以使用刺激組織或空間內(nèi)生成并排出成人干細(xì)胞的外源施用因子來帶動成人干細(xì)胞遷移，可以包括但不限于骨髓或脂肪組織?？梢栽趲痈杉?xì)胞遷移的同時、之前和/或之后，或者在外周循環(huán)中的細(xì)胞數(shù)量對于期望的治療終點(diǎn)是最理想的時候施用例示性糖綴合物。
G.過繼免疫療法早就顯示靜脈內(nèi)施用的LAK細(xì)胞主要在肺和肝中匯集(Lotze，M.T.等人，“The in vivo distribution of autologous human andmurine lymphoid cells grown in T cell growth factor(TCGF)-Implication for the adoptive immunotherapy of tumors”即“在T細(xì)胞生長因子(TCGF)中培養(yǎng)的自體人和鼠淋巴樣細(xì)胞的體內(nèi)分布-腫瘤過繼免疫療法的含義”，J.Immunol.，1251487-1493，1980)，這可能歸結(jié)于LAK細(xì)胞表面上的脫唾液酸決定簇與內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、和肝細(xì)胞表面上的ASGP受體間的相互作用(Kolb等人，1979，見上文；Kolb-Bachofen等人，1984，見上文)，而且LAK療法能夠顯著減小這些器官中的轉(zhuǎn)移性腫瘤(Rosenberg，1987，見上文)。靜脈內(nèi)注射的鼠骨髓細(xì)胞、經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的淋巴細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、和LAK細(xì)胞都享有這種相同的運(yùn)輸模式(Samlowski等人，1984，見上文；Samlowski等人，1985，見上文；Kolb等人，1979，見上文；Kolb-Bachofen等人，1984，見上文；Rolstad，B.等人，“Natural killer cell activity in the rat V.The circulation patternsand tissue localization of peripheral blood large granular lymphocytes(LOL)”即“大鼠V中的天然殺傷細(xì)胞活性。外周血大顆粒淋巴細(xì)胞(LOL)的循環(huán)模式和組織定位”，J.Immunol.，1362800-2808，1986；Rosenberg，1987，見上文)。此外，所有這些細(xì)胞在其表面都具有脫唾液酸決定簇。Kradin，R.L.等人(“Tumor-derivedinterleukin-2-dependent lymphocytes in adoptive immunotherapy oflung cancer”即“肺癌過繼免疫療法中的由腫瘤衍生的、依賴白介素-2的淋巴細(xì)胞”，Cancer Immunol.Immunother.，2476-85，1987)讓患者在接受111In標(biāo)記的由腫瘤衍生的、依賴白介素-2的淋巴細(xì)胞(衍生自肺中的轉(zhuǎn)移性腺癌)后進(jìn)行伽馬攝像機(jī)成像。衍生自人腫瘤的這些T“殺傷”細(xì)胞也移動至肝和肺。根據(jù)人LAK細(xì)胞在肝中的這種優(yōu)先定位和它們殺傷肝細(xì)胞癌的能力，Hsieh等人(“Lysis ofprimary hepatic tumors by lymphokine activated killer cells”即“由淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞對原發(fā)性肝腫瘤的消融”，Gut，28117-124，1987)進(jìn)行了這種腫瘤治療的I期試驗(yàn)。還提出對于肝腫瘤的治療而言，通過插入肝動脈的導(dǎo)管選擇性施用LAK細(xì)胞和IL-2應(yīng)當(dāng)是一種有效的施用手段，這可能降低副作用的程度和范圍(Fagan，E.A.等人，“Immunotherapy for Cancerthe use of lymphokine-activatedkiller(LAK)cells”即“癌癥免疫療法由淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞的用途”，Gut，28113-116，1987)。
人、大鼠、和小鼠肝顯示可通過高親和力肝脫唾液酸糖蛋白受體對切除唾液酸后由半乳糖殘基構(gòu)成的末端(即脫唾液酸糖蛋白)和老化的脫唾液酸紅血球的識別而特異匯集、捕獲、或“清除”脫唾液酸血清糖蛋白(如脫唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白)(Ashwell，G.，“The role ofcell-surface carbohydrates in bingding phenomena”即“細(xì)胞表面糖類在結(jié)合現(xiàn)象中的作用”，在《Mammalian Cell Membranse》即《哺乳動物細(xì)胞膜》中，第4卷，Butterworth，倫敦，OX，1977；Asbwell等人，“Carbohydrate-specific receptors of the liver”即“肝的糖類特異受體”，Ann.Rev.Biochem.，51531-554，1982；Harford等人，“The hepatic receptor for asialoglycoproteins”即“脫唾液酸糖蛋白的肝受體”，在《The Glycoconjugates》即《糖綴合物》中，第4卷，B部分，M.I.Horowitz編，Academic出版社，紐約，1982)。人、大鼠和兔ASGP受體顯示實(shí)際上相同的特征特異性、陽離子要求、最佳pH、親和力、亞基大小、以及依賴溫度的受體內(nèi)在化和脫唾液酸配體降解(Dunn等人，“Low temperature selectively inhibitsfusion between pinocytotic vesicles and lysosomes during heterophagyof125I-asialofetuin by the perfused rat liver”即“在輸注大鼠肝對125I-脫唾液酸胎球蛋白的異噬過程中低溫選擇性抑制胞飲小泡與溶酶體之間的融合”，J.Biol.Chem.，2255971-5978，1980；Schwartz等人，“Characterization of the ASGP receptor in a continuous hepatomaline”即“連續(xù)肝瘤系中ASGP受體的鑒定”，J.Biol.Chem.，256，8878-8881，1981；Ashwell等人，1982，見上文；Mueller等人，“Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rathepatocytesreceptor-positive and receptor-negative endosomes”即“由受體介導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞對脫唾液酸糖蛋白的內(nèi)吞受體陽性和受體陰性內(nèi)吞泡”，J.Cell.Biol.，102932-947，1986。在5-20℃，配體受體復(fù)合物不內(nèi)在化；而在37℃，該復(fù)合物內(nèi)在化并降解，而且受體以未損壞狀態(tài)循環(huán)至細(xì)胞表面。Mueller等人，1986，見上文)。平均而言，包含225,000個受體的細(xì)胞每細(xì)胞每分鐘能夠使大約30,000個可溶性配體分子內(nèi)在化；每個功能受體每八分鐘能夠結(jié)合一個配體并使之內(nèi)在化(Schwartz等人，1982，見上文)。肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞共享脫唾液酸或GalNAc/Gal特異受體(Kolb-Bachhofen等人，1984，見上文)，而且肝瘤系HEPG2就這種受體而言已經(jīng)充分鑒定(Schwartz等人，1981，見上文)。每個HEPG2細(xì)胞有150,000個高親和力位點(diǎn)，而每個正常肝細(xì)胞有500,000個；二者的Kd都是大約7×109M。由此，使用充分鑒定的脫唾液酸糖蛋白受體對細(xì)胞系諸如HEPG2的粘附作為體內(nèi)粘附的體外模型(見下文實(shí)施例)是一種費(fèi)用上有效且簡單的系統(tǒng)，可用于確定體內(nèi)運(yùn)輸研究中將遭遇的參數(shù)和可能的問題。
腸胃外施用脫唾液酸糖綴合物(如脫唾液酸胎球蛋白)以阻斷脫唾液酸糖蛋白受體早已顯示可通過阻斷肝ASGP受體繼而阻斷這些細(xì)胞的肝匯集而將骨髓輸注的效率提高5-10倍(Samlowski等人，1984，見上文)。考慮到LAK細(xì)胞在其表面上具有脫唾液酸決定簇，正如本文體外研究所示(見實(shí)施例5-16)，那么它們也最有可能在肝中通過ASGP受體攝取或匯集。這將導(dǎo)致能夠參與腫瘤縮小或消融的LAK效應(yīng)細(xì)胞循環(huán)數(shù)目的凈損失。匯集的LAK細(xì)胞可能不能到達(dá)腫瘤。依照本發(fā)明，可以通過阻斷肝ASGP受體來預(yù)防肝匯集。最后，通過靜脈內(nèi)施用脫唾液酸糖綴合物，或者用唾液酸酶或唾液酸轉(zhuǎn)移酶修飾LAK細(xì)胞表面，可以消除這些細(xì)胞的肝匯集，繼而提高LAK療法的功效。這將容許在治療過程中使用較少的LAK細(xì)胞或較少次數(shù)的LAK治療或者甚至較少的IL-2，從而降低與LAK療法有關(guān)的毒性。
理論上，LAK療法應(yīng)當(dāng)是對于癌癥治療而言最安全且毒性最小的療法之一；然而，它尚未達(dá)到期望目標(biāo)(Rosenberg，1987，見上文；Durant，“Immunotherapy of cancerThe end of the beginning？”即“癌癥免疫療法一開始就結(jié)束”，N.Eng.J.Med.，316939-940，1987)。一些研究人員顯示，LAK細(xì)胞還殺傷未經(jīng)修飾的正常細(xì)胞，包括正常淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、和肝細(xì)胞，而其他研究人員的結(jié)果并不如此。通過增加循環(huán)“殺傷”細(xì)胞數(shù)目，從而改進(jìn)這些細(xì)胞將遭遇定位于外周、而非主要在肝中匯集的腫瘤細(xì)胞的概率，本發(fā)明改進(jìn)了LAK療法的功效。因此，消除肝匯集應(yīng)當(dāng)能夠改善LAK療法對定位于肝以外器官的腫瘤的反應(yīng)速率。預(yù)防LAK細(xì)胞的肝匯集還應(yīng)當(dāng)能夠降低與這種療法有關(guān)的嚴(yán)重毒性和肝損傷。另外，這還將降低由捕獲的淋巴細(xì)胞對肝實(shí)質(zhì)的自身免疫破壞引起的永久損傷的可能性(Kolb-Bachofen等人，1979，見上文；Anderson等人，“Toxicity ofhuman recombinant interleukin-2 in the mouse is mediated byinterleukin-activated lymphocytes”即“人重組白介素-2在小鼠中的毒性是通過由白介素激活的淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的”，Lab.Investigation，59598-612，1988)。
實(shí)施例流程在麻醉狀態(tài)下(公共動物護(hù)理和使用委員會方案#AM87046-07)，將靜脈內(nèi)套管置于NOD-SCID小鼠的外部頸靜脈中，從而能夠靜脈內(nèi)有效投遞111In標(biāo)記的干細(xì)胞。由麻醉狀態(tài)蘇醒后經(jīng)口服施用泰諾林酏劑。用100-250μl溶于鹽水的5％人血漿清蛋白懸浮經(jīng)過簡單放射性標(biāo)記的CD34+細(xì)胞，并注射到套管中，然后用50μl清蛋白-鹽水進(jìn)行沖洗。通過核醫(yī)學(xué)使小鼠成像。
小鼠1-2月齡的NOD-SCID雌性小鼠(非肥胖性糖尿病/LtSz-scid/scid)來自緬因州巴港的杰克遜實(shí)驗(yàn)室。在專用隔離室中在微型隔離籠中飼養(yǎng)這些動物?？諝饨?jīng)過HEPA過濾，而且在層流罩中在設(shè)備內(nèi)操作動物。所有食物、襯墊、和水都經(jīng)過滅菌。NOD-SCID小鼠理想的適合于異種移植腫瘤以及造血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的研究，因?yàn)樗鼈兊拿庖吖δ懿蝗∟K活性大大降低。參閱如Hogan等人，Biology of Blood & Marrow Transplantation，3236-246，1997；Noort等人，Bone Marrow Transplantation，22增刊1S58-60，1998。
試劑或細(xì)胞的所有施用都是通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)進(jìn)行的。
干細(xì)胞由衍生自已故癌癥患者的成分血干細(xì)胞收集產(chǎn)物分離CD34+干細(xì)胞。使用與磁珠(MACS分離柱，Miltenyi Biotec，奧本，加利福尼亞州)綴合的抗CD34抗體將它們純化至95-99％純度并冷藏。
通過FDA監(jiān)控的付費(fèi)骨髓捐獻(xiàn)程序獲得的人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC；PT-2501)購自Poietics Technologies，Bio Whittaker(Walkerville，馬里蘭州)。依照制造商的建議將細(xì)胞解凍，重懸，并在間充質(zhì)干細(xì)胞基本培養(yǎng)基(MSCBM)中放射性標(biāo)記。
施用的蛋白質(zhì)在含有0.16mM辛酸鹽、10mM Tris、150mMNaCl，pH7.0的緩沖液中施用血清類粘蛋白(α-1-酸糖蛋白)和脫唾液酸血清類粘蛋白(ASO)。
麻醉和鎮(zhèn)痛每只20-30g小鼠腹膜內(nèi)施用0.04ml嚙齒類麻醉混合物(嚙齒類混合物處方1.5ml 50mg/ml氯胺酮、1.5ml 20mg/ml甲苯噻嗪、0.5ml 50mg/ml乙酰丙嗪)。如下所述腹膜內(nèi)施用麻醉劑即嚙齒類麻醉混合物1)用于手術(shù)-每只20-30g小鼠0.04ml，和2)用于成像-每種20-30g小鼠0.02ml。
手術(shù)后鎮(zhèn)痛麻醉部分減弱后經(jīng)口服施用泰諾林60μl/20g小鼠(6.10mg)。手術(shù)后立即經(jīng)口施用鎮(zhèn)痛劑即泰諾林60μl(6.10mg)/20g小鼠，或者在首次發(fā)現(xiàn)傷痛征候時施用。麻醉劑配方中所含的甲苯噻嗪也可作為鎮(zhèn)痛劑。
手術(shù)流程(標(biāo)準(zhǔn)套管安置)如上所述麻醉動物后，將用于縫合裝滿檸檬酸鹽鹽水的套管的線浸泡在70％乙醇中。用操作臺上的紙帶固定經(jīng)過麻醉的動物，腹部向上。將鎖骨以下至耳的區(qū)域刮毛。用Betadine清潔刮毛區(qū)域，并用70％乙醇沖洗。在右頸部由肋骨架上部至頜骨垂直切開皮膚以暴露胸鎖乳突肌，外部頸靜脈就在下面。為了清楚暴露手術(shù)區(qū)，用線鉤(用小重物固定)拉緊皮膚。這不應(yīng)扭曲下面的組織，但是應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定區(qū)域以便于觀察和插入套管。使用顯微鑷清除靜脈上面的脂肪和筋膜。使用4O絲質(zhì)手術(shù)縫合線打一個半結(jié)以截斷上腔靜脈中的循環(huán)。用夾緊的止血鉗固定線的一頭。將第二根線繞著靜脈底部成環(huán)，打一個半結(jié)而無需拉緊。一旦將套管插入外部頸靜脈后，此環(huán)用于固定套管。用顯微剪在靜脈表面割一個小口。將套管插入靜脈，斜面向上。使套管沿對角線向下滑動直至錨與靜脈壁齊平，并扎緊下面的結(jié)。通過推動鹽水穿過它來測試套管。確認(rèn)沒有泄漏后完成下面的結(jié)。用上面的線繞著套管打一個全結(jié)。監(jiān)測套管中的鹽水水流。用上面的線從下面穿過，抓住組織，并用這根線繞著套管再打一個結(jié)。用上面的線和下面的線的末端打一個全結(jié)。這固定了繞過套管套筒的上面和下面的線以預(yù)防意外逐出。夾緊套管，除去注射器。將套管置于頸部皮膚的下面，并在旋轉(zhuǎn)動物(背部向上)的同時由頸背緊貼枕部下面取出。在接近出口的適當(dāng)位置，用自動小夾釘住套管的熱收縮部分。將套管切成合理長度(1.5-2.0英寸)，并塞入一個線團(tuán)。將動物翻身到其最初位置并用自動小夾封閉頸部，小心不要刺破套管。
手術(shù)流程(達(dá)芬奇微口血管系統(tǒng)套管安置)達(dá)芬奇微口血管系統(tǒng)(Da Vinci Biomedical，南蘭開斯特，麻薩諸塞州)是能夠早在運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)前兩周就植入而無明顯損失的封閉注射路徑。本質(zhì)差異是端口不像以前那樣外在的。這消除了由咀嚼和抓搔引起套管污染和損壞的額外風(fēng)險。
在最初的切割前用Betadine清潔切割部位。然后將小鼠綁在手術(shù)臺上(背部向上)。做3-4mm的切口。接著，在胸部做4-5mm切口。由后面的切口至前面的切口做一通道，用于由背至胸插入套管。推動肝素穿過套管。然后使用止血鉗拉出套管。由背部組織松松的扯起皮膚以放置端口。將端口縫合在脖子上部中間的組織下面。使用三聯(lián)結(jié)在兩個位置進(jìn)行縫合。接著，翻轉(zhuǎn)小鼠使之背部向下、胸部向上。然后以一定角度切斷套管，使得至少1mm且至多2mm套管插入頸靜脈。除去一些脂肪和組織后，分離胸腔中的頸靜脈。將小鼠的四肢向下綁在兩側(cè)，因?yàn)檫@促使胸部向上并進(jìn)一步暴露頸靜脈。一旦分離出頸靜脈，圍繞它放置兩條縫合線。結(jié)扎靜脈頂端，要求足以減緩血流，但又不完全止住血流。下面的結(jié)距離頂端1-2mm，而且不扎緊。下面的結(jié)稍后用于固定套管的位置并止住頸靜脈的過度出血。接著，在頸靜脈上在兩個結(jié)之間做一個小切口，從而能夠?qū)⑻坠懿迦腱o脈。一旦將套管置于靜脈中，將下面的結(jié)圍繞靜脈中的套管扎緊。接著，注入肝素穿過套管，檢查套管是否泄漏。確認(rèn)沒有泄漏后，關(guān)閉這兩個切口。
111銦-oxine標(biāo)記流程使用用于標(biāo)記自體淋巴細(xì)胞的AmershamHealthcare流程的改版進(jìn)行成人CD34+或間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC111In-oxine標(biāo)記。
收集組織用于組織病理學(xué)安樂死后收集組織。一小時成像后，收集器官，并將器官的一半在10％中性緩沖福爾馬林中固定，將另一半在OTC中冷凍用于冰凍切片。本文呈現(xiàn)的影像來自固定化組織。
用于收集小鼠組織的尸檢流程首先由頸前區(qū)域至恥骨邊緣沿中線切開皮膚，然后沿著白線由胸骨至恥骨剖開腹部，沿著接近尾部的肋骨切開從而側(cè)向翻開腹壁。首先在大約肋骨軟骨接合的水平切斷肋骨從而翻開胸骨，然后根據(jù)需要切開橫膈膜和心包。首先延伸翻開的胸骨至包括腹側(cè)頸肌以暴露氣管。在頸中區(qū)域切斷氣管和食道并向后翻開，根據(jù)需要切斷粘連以全部取出胸廓臟器。取出胸廓臟器后，解離出整個心臟并浸泡在10％中性緩沖福爾馬林中。浸泡后，用鋸齒狀組織鑷輕輕按摩心臟，迫使固定劑進(jìn)入心腔。然后將氣管連同連接的肺浸泡在固定液中，無需進(jìn)一步解離。將脾暴露，切斷網(wǎng)膜粘連，取出整個脾并浸泡在福爾馬林固定液中。首先切斷直腸并翻開內(nèi)臟，同時根據(jù)需要切斷粘連，從而取出胃和腸道。取出整個肝并整個浸泡在福爾馬林固定液中。取出腎并整個浸泡在福爾馬林固定液中。將胰與前面的十二指腸切開，并浸泡在福爾馬林固定液中。
用于石蠟處理和切片的組織的修整將心臟置于修理板上，右心室在上，而左心室在下、貼著修整板。由上至下做一個切口，穿過右心室和心房以及心臟底部的大血管，繼續(xù)穿過室間隔和左心腔，得到大致相等的兩半。將每一半置于分開的包埋盒中，盒中裝有固定液飽和過的泡沫墊，并標(biāo)上“心臟1”和“心臟2”。將整個左肺和右肺與中間組織分開，并平放在盒中固定液飽和過的泡沫墊上，標(biāo)上“左肺”和“右肺”。由右側(cè)和中間肝葉獲取肝切片并置于適當(dāng)標(biāo)記的盒中。以相似方式切割并處理左側(cè)和中間肝葉。將整個脾置于適當(dāng)標(biāo)記的包埋盒中，定向是長邊在下，利用彎曲來增加最初切片的面積。對于一個腎，由腎的中點(diǎn)獲取整冠切片。對另一個腎進(jìn)行縱向切片。將兩個切片置于一個盒中。將收集的胰置于適當(dāng)標(biāo)記盒中的福爾馬林飽和泡沫墊上。
成像流程核醫(yī)學(xué)。使用嚙齒類麻醉混合物將NOD-SCID小鼠麻醉。一旦麻醉，將小鼠置于泡沫塑料半圓柱體小鼠定位裝置(MPD)上，并用圓筒短襪覆蓋。與將小鼠置于平臺上相比，MPD能夠更好的在視覺上分開肺與肝。放置小鼠的泡沫塑料和覆蓋小鼠的圓筒短襪維持舒適的溫度，從而容許更長時間的成像而無需額外麻醉。將MPD置于西門子E.Cam伽馬攝像機(jī)的兩個鏡頭之間的窄臺上，并以2-D或SPECT靜態(tài)或動態(tài)成像。使用57Co-斑點(diǎn)標(biāo)記物來標(biāo)記解剖學(xué)位置(鼻、尾、套管、等)。使用西門子ICON系統(tǒng)對目的區(qū)域或注射劑量百分比分析數(shù)據(jù)(如肝、脾、心臟)。
CT成像使用Arata，L.，“Clinical Uses for Medical ImageRegistrationExperiences at Three Hospitals”即“醫(yī)學(xué)成像記錄的臨床用途三家醫(yī)院的經(jīng)驗(yàn)”，PACMEDTec檀香山討論會記錄，夏威夷，1998年8月17-21日和Nelson等人，Electromedica，6845-48，2000描述的方法，進(jìn)行CT掃描(G.E.醫(yī)學(xué)系統(tǒng)高速螺旋隧洞)以評估腫瘤，而且能夠記錄/比對核醫(yī)學(xué)影像與CT影像，以確定注射的放射性標(biāo)記干細(xì)胞的準(zhǔn)確位置。在核醫(yī)學(xué)成像過程中動物仍處于麻醉狀態(tài)下進(jìn)行CT掃描。在核醫(yī)學(xué)掃描之前或之后，立即將麻醉的動物轉(zhuǎn)移到CT上。通常每只動物只進(jìn)行一次CT。通過將CT影像與核醫(yī)學(xué)SPECT影像融合，從而將CT用于在解剖學(xué)上準(zhǔn)確定位放射性標(biāo)記的物質(zhì)。
使用西門子E.Cam雙鏡頭伽馬攝像機(jī)的伽馬攝像機(jī)成像監(jiān)測下文實(shí)施例中所描述的所有人干細(xì)胞的體內(nèi)運(yùn)輸模式。將小鼠置于小鼠定位裝置(Mouse Positioning Device，MPD)上，并置于成像臺上的探測器之間。
實(shí)施例1靜脈內(nèi)施用的ASO將人CD34+導(dǎo)向心臟脫唾液酸血清類粘蛋白(ASO)/高劑量HSC若在輸注5.75×106個HSC之前先施用3.3mg ASO，則輸注后立即能在心臟中發(fā)現(xiàn)有77±1％的注入細(xì)胞，1.5小時時心臟區(qū)域中保留了75±5％，24小時時下降到52±1％。
對來自緬因州巴港的杰克遜實(shí)驗(yàn)室的2月齡NOD-SCID雌性小鼠(非肥胖性糖尿病/LtSz-scid/scid)通過頸外靜脈套管靜脈內(nèi)施用5.75×106個111In-標(biāo)記的人CD34+(hCD34+)外周血干細(xì)胞。通過靜脈內(nèi)施用3.3mg脫唾液酸血清類粘蛋白(ASO)對小鼠進(jìn)行預(yù)處理后，施用放射性標(biāo)記的CD34+干細(xì)胞。使用西門子E.Cam雙鏡頭伽馬攝像機(jī)通過伽馬攝像機(jī)成像追蹤體內(nèi)運(yùn)輸模式，從注射后立即開始直至輸注后36小時。由衍生自已故癌癥患者的成分血干細(xì)胞收集產(chǎn)物分離人CD34+。使用與磁珠(MACS分離柱，Miltenyi Biotec，奧本，加利福尼亞州)綴合的抗CD34抗體將它們純化至95-99％純度并冷藏。
在ASO后施用的放射性標(biāo)記CD34+干細(xì)胞立即移動到心臟。利用放置在套管水平的57Co-點(diǎn)來源方便了解剖學(xué)定位。在1.5小時時多達(dá)79.2％的注射劑量位于心臟中。根據(jù)輸注后追蹤影像，這些細(xì)胞早期尚未移動到肝和脾，但在24小時后可在肝中找到。然而，24小時時最初注射劑量的51.6-53.2％仍保留在心臟中。在36小時時進(jìn)行套管在體內(nèi)時的攝像和除去套管并放置在處死動物旁的攝像。這些影像顯示了注射細(xì)胞并未被捕獲在套管里，而確實(shí)是在心臟中。
實(shí)施例2靜脈內(nèi)施用的O使人CD34+細(xì)胞移動至肝和脾而非心臟中血清類粘蛋白/高劑量HSC若在輸注5.75×106個HSC之前先施用5.5mg血清類粘蛋白，則輸注后立即能在肝和脾中發(fā)現(xiàn)有74±3％的注入細(xì)胞，1.5小時時肝區(qū)域中保留了74±4％的細(xì)胞，24小時時下降到63±1％。
重復(fù)實(shí)施例1中所述的制備和流程。
對來自緬因州巴港的杰克遜實(shí)驗(yàn)室的2月齡NOD-SCID雌性小鼠(非肥胖性糖尿病/LtSz-scid/scid)通過頸外靜脈套管靜脈內(nèi)施用5.75×106個111In-標(biāo)記的人CD34+(hCD34+)外周血干細(xì)胞。通過靜脈內(nèi)施用5.5mg血清類粘蛋白(O)對小鼠進(jìn)行預(yù)處理后，施用放射性標(biāo)記的CD34+干細(xì)胞。
如實(shí)施例1中所述對小鼠進(jìn)行成像并監(jiān)測放射性標(biāo)記的hCD34+細(xì)胞的生物學(xué)分布。在O后施用的放射性標(biāo)記hCD34+立即移動到肝/脾區(qū)域并在該處保留至36小時。利用放置在套管水平的57Co-點(diǎn)來源方便了解剖學(xué)定位。肝/脾區(qū)域的定位的范圍為輸注后的76.3％至24小時時的63.6％。在心臟的區(qū)域內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)111In-標(biāo)記的細(xì)胞。
在36小時時進(jìn)行套管在體內(nèi)時的攝像和除去套管并放置在處死動物旁的攝像。這些影像顯示了注入細(xì)胞并未被捕獲在套管里。發(fā)現(xiàn)放射性位于套管放置處或以下，即在肝/脾區(qū)域內(nèi)。
實(shí)施例3O使Hcd34+細(xì)胞移動至肝/脾，而無顯著的向心臟移動血清類粘蛋白/低劑量HSC若在輸注0.5×106個HSC(先前細(xì)胞劑量的十分之一)之前先施用11mg血清類粘蛋白，則輸注后立即能在肝和脾中發(fā)現(xiàn)有43±2％的注入細(xì)胞，1小時時肝區(qū)域保留了40±3％的細(xì)胞。
重復(fù)實(shí)施例1中所述的制備和流程。對來自緬因州巴港的杰克遜實(shí)驗(yàn)室的2月齡NOD-SCID雌性小鼠(非肥胖性糖尿病/LtSz-scid/scid)通過外部頸靜脈套管靜脈內(nèi)施用0.5×106個111In-標(biāo)記的人CD34+(hCD34+)外周血干細(xì)胞。通過靜脈內(nèi)施用11.0mg血清類粘蛋白(O)對小鼠進(jìn)行預(yù)處理后，施用放射性標(biāo)記的CD34+干細(xì)胞。
如上所述對小鼠進(jìn)行成像并監(jiān)測放射性標(biāo)記的hCD34+細(xì)胞的生物分布。在注射后約1小時，處死小鼠并收集器官，將器官的一半在10％中性緩沖福爾馬林中固定。對人CD34細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色并通過原位雜交使人DNA顯影后，用顯微鏡檢查組織切片。在輸注后最初十分鐘和一小時進(jìn)行的核醫(yī)學(xué)監(jiān)測顯示了放射性標(biāo)記的hCD34+細(xì)胞定位于肝/脾區(qū)域。
對CD34進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后心臟的顯微鏡檢查證明了心臟內(nèi)血管中存在hCD34+細(xì)胞。在肺中肺泡隔膜中可以看到一些hCD34+細(xì)胞。在肝竇狀隙內(nèi)可以看到具有干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞簇。人DNA的原位雜交清楚顯示了在心肌或室間隔中沒有hCD34+細(xì)胞，但肺中有。
實(shí)施例4先ASO后O可將hCD34+細(xì)胞導(dǎo)向心臟和肺中而非肝/脾區(qū)域脫唾液酸血清類粘蛋白(ASO)+血清類粘蛋白(O)/低劑量HSC在注入的ASO引起HSC定位于心臟時，將方案改成在大劑量ASO后追加大劑量血清粘蛋白，以測試HSC在心臟中的積累是否維持。若在注入0.5×106個HSC之前先施用3.3mg ASO，然后5.5mg血清類粘蛋白，則HSC再次在心臟集中。這造成44±5％的注入細(xì)胞在輸注后立即在心臟中積累。1小時時心臟中保留了37±3％的注入細(xì)胞。雖然注入細(xì)胞在心臟中的百分?jǐn)?shù)從實(shí)施例1所示的約75％減少到了此實(shí)施例的44％，但是心臟中的定位仍是細(xì)胞的主要集中信號。
重復(fù)實(shí)施例1中所述的制備和流程。對來自緬因州巴港的杰克遜實(shí)驗(yàn)室的2月齡NOD-SCID雌性小鼠(非肥胖性糖尿病/LtSz-scid/scid)通過外部頸靜脈套管靜脈內(nèi)施用0.5×106個111In-標(biāo)記的人CD34+(hCD34+)外周血干細(xì)胞。通過靜脈內(nèi)施用3.3mg ASO及隨后的5.5mg O對小鼠進(jìn)行預(yù)處理后，施用放射性標(biāo)記的CD34+干細(xì)胞。
如實(shí)施例1所述對小鼠進(jìn)行成像并監(jiān)測放射性標(biāo)記的hCD34+細(xì)胞的生物學(xué)分布。在注射后最初10分鐘和1小時進(jìn)行的核醫(yī)學(xué)監(jiān)測顯示了放射性標(biāo)記的hCD34+細(xì)胞定位于心臟中。
在注射后約1小時時，處死小鼠并收集器官，將器官的一半在10％中性緩沖福爾馬林中固定。
對CD34細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后對心臟進(jìn)行的顯微鏡檢查揭示了室間隔中的hCD34+細(xì)胞簇，以及那些簇中形態(tài)上與染色細(xì)胞相似但是CD34陰性的細(xì)胞。這些影像反映了核醫(yī)學(xué)研究所描繪的生物學(xué)分布。原位雜交顯著證明了hCD34+細(xì)胞在存在于心臟中。CD34的免疫組織化學(xué)染色和人DNA的原位雜交都證明了注入的干細(xì)胞定位于肺中，而且很容易在肺泡隔片、血管、和其它結(jié)構(gòu)中看到。DNA的檢測揭示了肺和心臟中存在的細(xì)胞比CD34染色所預(yù)測的多得多。在肝、脾或腎中沒有找到hCD34+細(xì)胞或形態(tài)類似hCD34+細(xì)胞的細(xì)胞。
實(shí)施例5在5％人血清白蛋白中施用的HSC(不含血清類粘蛋白或ASO)主要移動至肺血漿白蛋白/高劑量HSC在未預(yù)先注入蛋白質(zhì)的情況下通過導(dǎo)管施用HSC時，0小時時在肺中發(fā)現(xiàn)有78±13％的注入細(xì)胞，1小時時是54±10％，12小時時是50±13％。對同樣處理的小鼠的肺進(jìn)行的組織學(xué)檢查證明了注入細(xì)胞位于肺泡隔片和血管系統(tǒng)中。
通過植入2月齡雌性NOD-SCID小鼠外部頸靜脈中的套管靜脈內(nèi)施用0.1ml含5％人血清白蛋白的鹽水中的2.7×106個111In-標(biāo)記HSC。如實(shí)施例1所述對小鼠進(jìn)行成像并監(jiān)測放射性標(biāo)記的hCD34+細(xì)胞的生物學(xué)分布。
在含5％人血清白蛋白的鹽水中施用的放射性標(biāo)記HSC立即移動至肺。利用位于肩胛骨和鼻下面套管出口位置水平的57Co點(diǎn)源方便了地對經(jīng)標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行解剖學(xué)定位。此外，通過CT全身掃描、橫向和冠狀切片證實(shí)了導(dǎo)管處的位置標(biāo)記物處于隔膜處。套管出口位置處的夾子作為界標(biāo)。在鼻標(biāo)記的下面和套管標(biāo)記的上面看到了肺，在套管標(biāo)記的下面看到了肝和脾。在最初成像時多達(dá)95.4％的注入細(xì)胞定位于肺中(表1)。在四只小鼠中，最初成像時肺中的細(xì)胞占到了全身摻入細(xì)胞的52.6-95.4％。1小時時，HSC主要定位于肺中，血液循環(huán)中能夠看到一些計(jì)數(shù)。在一只小鼠中，在1小時時在套管標(biāo)記下面看到一些定位，這可能是肝和脾；然而，輪廓不清楚。12小時時，在該小鼠中，在肝/脾區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了放射性標(biāo)記的CD34+干細(xì)胞。然而，在12小時成像時，在其它動物的肺中仍保留了最初注入劑量的34.7％以上(范圍為34.7-68.5％)的。
盡管注射后(起始或0小時時間點(diǎn))肺中的定位隨動物而變化，但是肺的最初定位與隨后掃描中保留的百分?jǐn)?shù)更為恒定。1小時時使用背部成像，肺區(qū)域保留了最初定位于肺的細(xì)胞的72.1-75.5％。12小時時使用背部成像，在成像的三只小鼠中，肺中保留了最初肺摻入的78％、72.1％和50.5％。
實(shí)施例6血清類粘蛋白使MSC導(dǎo)向心臟血清類粘蛋白/低劑量MSC若在輸注人間充質(zhì)干細(xì)胞(0.56×106個細(xì)胞)之前先施用11mg血清類粘蛋白，則0小時時在心臟中發(fā)現(xiàn)有68±7％的注入細(xì)胞，1小時時則有61±3％。
MSC來自Bio Whittaker(Poietics Division，冷藏的PT-2501，＞750,000個細(xì)胞/安瓿)并如上文實(shí)施例所述用111In標(biāo)記，只是在含5％人血清白蛋白(HSA)的基本干細(xì)胞培養(yǎng)基(Poietics)中標(biāo)記、清洗、和注射MSC。對2月齡雌性NOD-SCID小鼠通過植入外部頸靜脈的達(dá)芬奇微端口血管系統(tǒng)套管施用0.21ml含5％人血清白蛋白(HSA)的基本干細(xì)胞培養(yǎng)基中的0.56×106個111In標(biāo)記的人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。就在施用MSC前，靜脈內(nèi)施用0.2ml中的11.0mg血清類粘蛋白。
如實(shí)施例1所述對小鼠進(jìn)行成像并監(jiān)測放射性標(biāo)記的MSC細(xì)胞的生物學(xué)分布。在最初(0小時)和輸注后1小時時進(jìn)行的伽馬攝像機(jī)監(jiān)測顯示放射性標(biāo)記的MSC定位于心臟區(qū)域。對目的區(qū)域影像的分析揭示了注入的放射性中大約61.7-75.5％最初定位于心臟，而且1小時時仍有大約58-64％的注入細(xì)胞保留在該區(qū)域。通過CT掃描(冠狀切片)確認(rèn)了套管、膈膜、心臟、肺、和肝的定位。原位雜交顯示人細(xì)胞主要位于心臟中而非肝中。
實(shí)施例7先ASO后血清類粘蛋白將MSC導(dǎo)向肝/脾MSC來自Bio Whittaker(Poietics Division，冷藏的PT-2501，＞750,000個細(xì)胞/安瓿)并用111In標(biāo)記。如實(shí)施例6所述，在含5％人血清白蛋白(HSA)的基本干細(xì)胞培養(yǎng)基(Poietics)中標(biāo)記、清洗、和注射MSC。
脫唾液酸血清類粘蛋白(ASO)+血清類粘蛋白/低劑量MSC此實(shí)施例設(shè)計(jì)用于比較低細(xì)胞劑量下MSC與HSC(實(shí)施例4)的運(yùn)輸，因此采用實(shí)施例4中所使用的順序注入ASO和血清類粘蛋白。在注入人間充質(zhì)干細(xì)胞(0.56×106個細(xì)胞)之前先順序輸入4.3mg ASO和5.5mg血清類粘蛋白。0小時時在肝和脾中發(fā)現(xiàn)有63±5％的注入細(xì)胞，1小時時則有57±7％。
在0.21ml含5％人血清白蛋白(HSA)的基本干細(xì)胞培養(yǎng)基中靜脈內(nèi)施用0.56×106個111In標(biāo)記的MSC。在施用MSC之前，靜脈內(nèi)施用含4.3mg ASO的0.1ml，隨后施用含5.5mg血清類粘蛋白的0.1ml。ASO、血清類粘蛋白和MSC都是通過植入外部頸靜脈的達(dá)芬奇微端口血管系統(tǒng)套管施用于2月齡雌性NOD-SCID小鼠的。
如實(shí)施例1所述對小鼠進(jìn)行成像并監(jiān)測放射性標(biāo)記的MSC細(xì)胞的生物學(xué)分布。最初和輸注后1小時的伽馬攝像機(jī)監(jiān)測顯示放射性標(biāo)記的MSC位于肝/脾區(qū)域。對目的區(qū)域最初影像的分析揭示了所注入放射性的大約59.2-66.7％定位于肝/脾，而且1小時時仍有大約51.9-61.1％的注入細(xì)胞保留在該區(qū)域。
通過CT掃描確認(rèn)了套管、膈膜、心臟、肺、和肝的定位。原位雜交確認(rèn)了伽馬攝像機(jī)生物學(xué)分布數(shù)據(jù)。含人DNA的細(xì)胞主要發(fā)現(xiàn)于肝中。
實(shí)施例8單用鹽水、單用RPMI-1640、或含5％人血清清蛋白(不含血清類粘蛋白或ASO)的鹽水施用的MSC移動至肺和腎MSC來自Bio Whittaker(Poietics Division，冷藏的PT-2501，＞750,000個細(xì)胞/安瓿)并用111In標(biāo)記。如實(shí)施例6所述，單用鹽水、單用RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO BRL，格蘭德島，紐約州)和含5％人血清白蛋白(HSA)的鹽水標(biāo)記、清洗、和注射MSC。
單用鹽水-單用0.20ml鹽水靜脈內(nèi)施用1.14×106個111In-標(biāo)記的MSC。MSC是通過植入于2月齡雌性NOD-SCID小鼠外部頸靜脈的達(dá)芬奇微端口血管系統(tǒng)套管施用的。
如實(shí)施例1所述對小鼠進(jìn)行成像并監(jiān)測放射性標(biāo)記的MSC細(xì)胞的生物學(xué)分布。最初的輸注后伽馬攝像機(jī)監(jiān)測顯示放射性標(biāo)記的MSC位于肺區(qū)域。對目的區(qū)域最初影像的分析揭示了所注入放射性的95％定位于肺。1小時時，分別有87％和4％定位于肺和腎；24小時時，分別有61％和13％定位于肺和腎；而48小時時，則分別有59％和14％定位于肺和腎。
通過CT掃描確認(rèn)了套管、隔膜、心臟、肺、和肝的定位，而57Co-斑點(diǎn)標(biāo)記物則用于標(biāo)記解剖學(xué)位置(鼻、尾部、套管等)。
單用RPMI-1640溶液-單用0.20ml RPMI-1640溶液靜脈內(nèi)施用1.14×106個111In-標(biāo)記的MSC。MSC是通過植入于2月齡雌性NOD-SCID小鼠外部頸靜脈的達(dá)芬奇微端口血管系統(tǒng)套管施用的。
如實(shí)施例1所述對小鼠進(jìn)行成像并監(jiān)測放射性標(biāo)記的MSC細(xì)胞的生物學(xué)分布。最初的輸注后伽馬攝像機(jī)監(jiān)測顯示放射性標(biāo)記的MSC位于肺區(qū)域。對目的區(qū)域最初影像的分析揭示了所注入放射性的大約95％定位于肺。1小時時，分別有74％和7％定位于肺和腎；24小時時，分別有69％和9％定位于肺和腎。
通過CT掃描確認(rèn)了套管、隔膜、心臟、肺、和肝的定位，而57Co-斑點(diǎn)標(biāo)記物則用于標(biāo)記解剖學(xué)位置(鼻、尾部、套管等)。
含5％人血清白蛋白(HSA)的鹽水-用0.20ml含5％HSA的鹽水靜脈內(nèi)施用1.14×106個111In-標(biāo)記的MSC。MSC是通過植入于2月齡雌性NOD-SCID小鼠外部頸靜脈的達(dá)芬奇微端口血管系統(tǒng)套管施用的。
如實(shí)施例1所述對小鼠進(jìn)行成像并監(jiān)測放射性標(biāo)記的MSC細(xì)胞的生物學(xué)分布。最初的輸注后伽馬攝像機(jī)監(jiān)測顯示放射性標(biāo)記的MSC位于肺區(qū)域。對目的區(qū)域最初影像的分析揭示了所注入放射性的94％定位于肺。1小時時，分別有87％和2％定位于肺和腎；24小時時，分別有59％和11％定位于肺和腎；而48小時時，則分別有57％和14％定位于肺和腎。
結(jié)果下文表1總結(jié)了上文所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
表1.實(shí)施例1-8的結(jié)果總結(jié)
實(shí)施例9以下實(shí)驗(yàn)的主要目的是確定人LAK細(xì)胞群是否通過ASGP受體特異結(jié)合人肝瘤細(xì)胞，如果是這樣，那么確定如何操縱此細(xì)胞識別系統(tǒng)來使淋巴細(xì)胞具有靶向。一般實(shí)驗(yàn)方案使用相似的含唾液酸-脫唾液酸血漿蛋白質(zhì)在體外系統(tǒng)中模擬與攜帶ASGP受體的肝細(xì)胞的接觸，正如圖5所示。
NK/LAK與人最小偏差肝細(xì)胞瘤單層的粘附活性將對照細(xì)胞(未經(jīng)IL-2處理)或LAK細(xì)胞(經(jīng)過IL-2處理的人外周血淋巴細(xì)胞，用10U IL-2/ml培養(yǎng)了3天)于4℃粘附至HEP G2細(xì)胞單層達(dá)2小時。用培養(yǎng)基中的脫唾液酸胎球蛋白(ASF，200μg/ml)或培養(yǎng)基中的胎球蛋白(F，對照，200μg/ml)預(yù)處理單層細(xì)胞。將對照或LAK細(xì)胞在單層細(xì)胞上進(jìn)行保溫后，將這些細(xì)胞輕輕倒出、清洗、并測試在51Cr-釋放測定法中針對NK耐受性靶Raji的細(xì)胞毒性能力。E∶T比例是40∶1、20∶1、10∶1、和5∶1；顯示了平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差；將E∶T比率對LOG E∶T作圖。圖6圖示了結(jié)果。
結(jié)論通過將這些細(xì)胞在經(jīng)過對照(完全唾液酸化)蛋白質(zhì)胎球蛋白(不阻斷ASGP受體)處理的HEPG2單層上保溫，LAK活性降低了大約50％。將這些細(xì)胞在經(jīng)過脫唾液酸胎球蛋白(以阻斷ASGP受體)預(yù)處理的HEPG2單層上保溫未能消除LAK活性。LAK或?qū)φ罩苿┰谂c胎球蛋白或脫唾液酸胎球蛋白(200μg/ml)于4℃保溫2小時后具有與未處理LAK細(xì)胞群相同的活性。這些數(shù)據(jù)支持這樣的觀點(diǎn)，即LAK細(xì)胞結(jié)合肝ASGP受體，而且這種結(jié)合可以通過用脫唾液酸胎球蛋白阻斷這種受體而得到抑制。這一發(fā)現(xiàn)的延伸是LAK細(xì)胞的肝匯集至少部分歸結(jié)于ASGP受體，而且施用脫唾液酸糖綴合物諸如脫唾液酸胎球蛋白能夠預(yù)防這種捕獲并改變LAK細(xì)胞運(yùn)輸。
23℃時對HEPG2(ASGP受體陽性，“ASGPR+”)和CAKI-2(ASGP受體陰性，“ASGPR-”)的粘附此實(shí)驗(yàn)與上文相同，只是對單層的粘附是在23℃而非4℃進(jìn)行2小時。使用了兩種單層HEPG2，一種ASGPR+細(xì)胞系；和CAKI-2(人腎細(xì)胞癌)，一種ASGPR-細(xì)胞系。使用的效應(yīng)細(xì)胞群是未處理的3日齡LAK制劑(LAK)和用霍亂弧菌神經(jīng)氨酸酶處理的相同細(xì)胞群(LAK/NS)(30mU/1×107個細(xì)胞/200μl)。經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的細(xì)胞群是脫唾液酸陽性淋巴細(xì)胞對照。不管是否經(jīng)過處理，所有細(xì)胞群在測定時的存活率都大于90％。將每種效應(yīng)細(xì)胞群在單用培養(yǎng)基、200μg/ml ASF或F中保溫作為對照。所有效應(yīng)細(xì)胞都在RAJI(LAK敏感靶；NK不敏感靶)或K562(NK/LAK敏感靶)上進(jìn)行測定；E∶T比例和圖解顯示與上文相同。
結(jié)果上面的實(shí)驗(yàn)給出了下面結(jié)果(見圖6-8)。對于下面的討論，對RAJI的活性將稱為“LAK”活性；對K562的活性將稱為“IL-2激活的NK”活性。一些研究人員認(rèn)為NK和LAK識別并殺死使用相同靶結(jié)構(gòu)的靶細(xì)胞(新鮮和培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞)。
(1)將未經(jīng)處理(LAK)或經(jīng)過處理(LAK/NS)的效應(yīng)細(xì)胞與ASF或F預(yù)保溫不影響效應(yīng)細(xì)胞殺傷RAJI或K562細(xì)胞的能力。
(2)神經(jīng)氨酸酶處理增強(qiáng)了LAK對RAJI的活性，但不增強(qiáng)IL-2激活的NK對K562的活性(見圖11和12)(3)經(jīng)過或未經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的IL-2激活的NK對HEPG2的粘附在23℃可被ASF部分抑制，但不被F抑制。(圖7和8)(4)LAK活性對HEPG2的粘附在23℃可被ASF或F抑制。(圖9和10)(5)經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的細(xì)胞群的LAK活性對HEPG2的粘附只能略微被ASF抑制，而不能被F所抑制。(圖10)(6)IL-2激活的NK或LAK活性對CAKI-2的粘附在23℃不被ASF或F抑制。(圖7-10)結(jié)論LAK活性(在RAJI靶細(xì)胞上進(jìn)行測定)和IL-2激活的NK活性(在K562靶細(xì)胞上進(jìn)行測定)展示對ASGPR+細(xì)胞系HEPG2有不同粘附特征。在23℃使用ASF時，LAK活性對HEPG2的粘附不受抑制；而IL-2激活的NK活性對HEPG2的粘附則被部分抑制。在4℃時，事實(shí)上所有LAK活性都可受到ASF抑制而不能粘附于HEPG2單層。對CAKI-2(ASGPR-)單層的粘附則不會在23℃被ASF阻斷。
這些數(shù)據(jù)說明，對HEPG2單層的粘附部分是由ASGP受體介導(dǎo)的，而對CAKI-2單層的粘附則不涉及此受體。一種可行的假設(shè)是LAK/NK細(xì)胞通過至少兩種或識別結(jié)構(gòu)而結(jié)合HEPG21)ASGPR，它結(jié)合LAK/NK細(xì)胞群上的脫唾液酸決定簇；和2)針對靶表位的“LAK”或“NK”識別結(jié)構(gòu)。前者應(yīng)當(dāng)可被ASF抑制；后者則不應(yīng)當(dāng)如此。與CAKI-2(ASPGR-)的結(jié)合不應(yīng)受到ASF的抑制，這歸結(jié)于與靶表位結(jié)合的LAK/NK細(xì)胞識別結(jié)構(gòu)。這一點(diǎn)可以通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(見下文)得到進(jìn)一步的支持，在該實(shí)驗(yàn)中，向針對經(jīng)標(biāo)記靶CAKI-2的LAK效應(yīng)細(xì)胞的51Cr-釋放測定法中添加了250μg/孔的ASF或F。即使在1mg/ml的濃度，ASF也未抑制LAK殺傷CAKI-2靶的能力。
根據(jù)Schwartz等人，“Characterization of the ASGP receptor ina continuous hepatoma line”即“ASGP受體在連續(xù)肝瘤系中的表征”，J.Biol.Chem.，2568878-，1981；Schwartz，A.L.等人，“Recyclingof the ASGP receptorbiochemical and immunocytochemicalevidence”即“ASGP受體的循環(huán)生物化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)的證據(jù)”，Phil.Trans.R.Soc.Lond.，300229-235，1982，ASGPR在23℃時發(fā)生再循環(huán)，而在4℃時則不會如此。在抑制粘附的能力方面所看到的差異可以由ASGPR再循環(huán)的溫度依賴性來解釋，還可能是靶細(xì)胞上的LAK識別結(jié)構(gòu)所致。在4℃時通過ASGPR或LAK識別結(jié)構(gòu)的LAK靶細(xì)胞結(jié)合都可能具有與23℃時不同的配體親和力，或者，能在溫度升高時，其它粘附分子能夠增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞相互作用。即，在4℃時，HEPG2上以任何可觀親和力結(jié)合LAK的唯一受體是ASGPR，而此靜態(tài)受體在此溫度下能夠容易的受到其配體ASF的抑制。在23℃時，不僅是ASGPR介導(dǎo)LAK細(xì)胞結(jié)合靶細(xì)胞；在存在配體ASF時，ASGPR進(jìn)行再循環(huán)，至少將LAK識別結(jié)構(gòu)留給靶細(xì)胞，并可能以其它次級粘附分子“鞏固”相互作用。
這些數(shù)據(jù)還說明LAK(在RAJI上進(jìn)行測定)和IL-2誘導(dǎo)的NK(在K562上進(jìn)行測定)細(xì)胞對HEPG2的粘附有不同親和受體或不同結(jié)合/解離速率。
理論上，神經(jīng)氨酸酶處理應(yīng)當(dāng)增了LAK細(xì)胞與HEPG2單層的結(jié)合，因?yàn)橥ㄟ^這種處理生成了額外數(shù)目的脫唾液酸決定簇，但事實(shí)并非如此。如果脫唾液酸決定簇的數(shù)目早就足以占據(jù)HEPG2上最大數(shù)目的ASGPR，那么增加這些決定簇的數(shù)目將不會改變最終的結(jié)果。還有可能存在涉及結(jié)合的特定脫唾液酸決定簇，而且生成更多但無關(guān)的決定簇并不會增強(qiáng)粘附。這提出了一種有趣的可能性，即LAK和IL-2激活細(xì)胞群可能在參與這種HEPG2粘附的配體上有所不同。
LAK細(xì)胞殺傷腫瘤靶的作用在靶的預(yù)處理中或添加到51Cr-釋放測定法中不被ASF或F阻斷因?yàn)槊撏僖核釠Q定簇可能在LAK-靶細(xì)胞相互作用和LAK運(yùn)輸及肝粘附中都發(fā)揮作用，所以確定在體內(nèi)使用脫唾液酸糖蛋白試劑來改變運(yùn)輸模式是否也抑制細(xì)胞毒性活性從而使得這種操作達(dá)不到預(yù)定效果是重要的。在測定中向預(yù)保溫的靶細(xì)胞中添加250μg/孔的脫唾液酸胎球蛋白或胎球蛋白并不阻斷LAK殺傷腫瘤靶CAKI-2。LAK制劑是標(biāo)準(zhǔn)的5日制劑；然而，使用3日制劑也重復(fù)了這些數(shù)據(jù)。(從一式四份樣品測定特異釋放百分比，這些樣品每分鐘原始計(jì)數(shù)的差異小于10個百分點(diǎn)；測定過程進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)的4小時保溫。)表2.CAKI-2靶的51鉻釋放百分比
自發(fā)釋放(單用培養(yǎng)基)2183cpm。
自發(fā)釋放(單用胎球蛋白)2267cpm。
自發(fā)釋放(單用脫唾液酸胎球蛋白)2147cpm。
總釋放量30600cpm。
用神經(jīng)氨酸酶或2，3-和2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶修飾細(xì)胞表面后NK/LAK活性的粘附以每107個細(xì)胞30mU霍亂弧菌神經(jīng)氨酸酶、0.48mU 2，3-或10mU2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的量處理(依照B.1.2.3&1.2.4中的方案)在AIM-V培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)的5日LAK制劑(20U/ml；1個Dupont單位＝44.5個BRMP單位)。將一些效應(yīng)細(xì)胞在培養(yǎng)基即含10％PBS的RPMJ 1640中于23℃保溫2小時。將來自未經(jīng)處理的LAK、經(jīng)過神經(jīng)氨酸酶處理的LAK、經(jīng)過2，3-或2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理的LAK的2×107個效應(yīng)細(xì)胞懸浮于15ml培養(yǎng)基中，并在HEPG2(ASGPR+)或CAKI-2(ASGPR-)單層上于23℃保溫2小時。每15分鐘搖動培養(yǎng)瓶。除了未粘附細(xì)胞對照，還輕輕倒出這些單層上的未粘附細(xì)胞，并針對K562和RAJI進(jìn)行測定。圖11-16顯示了結(jié)果。所用E∶T比例是40、20、10和5比1。
結(jié)果小結(jié)見上文表2。圖11-16圖解了這些數(shù)據(jù)。
(1)IL-2激活的NK(殺傷K562靶)不受任何細(xì)胞表面修飾的影響(圖11、12和13，頂部的4條虛線)；而LAK活性(殺死RAJI)得到神經(jīng)氨酸酶處理的顯著增強(qiáng)(圖12、15和16)，但不受2，3-或2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理的影響(圖15和16)。
(2)與未經(jīng)處理的LAK相比，LAK細(xì)胞表面的修飾沒有改變對CAKI-2的粘附(在RAJI上進(jìn)行測定)(圖15)。相反，神經(jīng)氨酸酶處理促進(jìn)IL-2激活的NK活性對CAKI-2的粘附(圖14，底部實(shí)線；在K562上進(jìn)行測定)，用2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行的處理也是如此(圖14，神經(jīng)氨酸酶上面的實(shí)線)。用2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行的處理不影響LAK或IL-2激活的NK對CAKI-2的粘附。
(3)細(xì)胞表面修飾沒有顯著改變LAK活性對HEPG2的粘附(圖15)；然而，2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理顯著促進(jìn)IL-2激活的NK的粘附(圖13，底部實(shí)線)；而相反的是，2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理顯著防止了這些細(xì)胞粘附HEPG2(圖13，頂部實(shí)線)。
結(jié)論IL-2激活的NK殺傷和LAK受到神經(jīng)氨酸酶處理的不同影響。
IL-2激活的NK對HEPG2的粘附因細(xì)胞表面修飾而改變；LAK粘附不受這些修飾的影響。這可能歸結(jié)于可以添加到LAK細(xì)胞表面的唾液酸的量，這可以通過2，3-和2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的劑量應(yīng)答來測定。
IL-2激活的NK對HEPG2的粘附在23℃能夠被ASF部分抑制(先前有過報告)，也可通過由2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶添加唾液酸來抑制(而2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理促進(jìn)粘附)。
有必要確定在23℃或甚至37℃時添加更高濃度的ASF(或另一種脫唾液酸化合物，如脫唾液酸GM1-糖)作為ASGPR再循環(huán)的補(bǔ)償手段是否能夠防止IL-2激活的NK或LAK的粘附。同樣的，用2，3-和2.6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行劑量應(yīng)答實(shí)驗(yàn)以實(shí)現(xiàn)最大量添加唾液酸可能能夠剖析粘附機(jī)制，因?yàn)槊糠N酶添加至不同的結(jié)構(gòu)2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶添加至與絲氨酸/蘇氨酸連接的O-連接糖，而2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶添加至與天冬酰胺連接的N-連接糖。這些糖基轉(zhuǎn)移酶在區(qū)別對IL-2激活的NK(殺傷K562)負(fù)責(zé)的細(xì)胞群與對LAK(殺傷RAJI)負(fù)責(zé)的細(xì)胞群時可能是同等重要的。
說明書中提及的所有發(fā)表物、專利、專利申請、和其它文件都指示本發(fā)明所屬領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員的水平。本文出于所有目的完整收錄所有發(fā)表物、專利、專利申請、和其它文件作為參考，正如同樣程度的專門且個別指出本文出于所有目的完整收錄每一份個別發(fā)表物專利、專利申請、和其它文件一樣。使用小標(biāo)題只是為了方便查閱文獻(xiàn)而非以任何方式意欲限制文獻(xiàn)的內(nèi)容。
盡管為了清楚理解而作為例示和實(shí)例略為詳細(xì)的描述了上述發(fā)明，然而顯然可以在本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)進(jìn)行某些改變和修飾。
權(quán)利要求
1.用于將干細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞投遞至哺乳動物體內(nèi)靶組織的方法，包括下列步驟(a)對哺乳動物施用糖綴合物；并(b)對哺乳動物施用所述細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞是造血干細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2的方法，其中干細(xì)胞是由骨髓、胎盤、肌肉、脂肪或臍帶獲得的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中淋巴樣細(xì)胞選自下組天然殺傷(NK)細(xì)胞、經(jīng)淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)、細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)、及其混合物。
5.權(quán)利要求1的方法，其中糖綴合物由通式P-(S)x-Gal表述，其中P是人血清糖蛋白的肽殘基，而S是人血清糖蛋白的糖殘基；x是1-100的整數(shù)，而Gal是半乳糖殘基。
6.權(quán)利要求1的方法，其中糖綴合物選自下組血清類粘蛋白和脫唾液酸血清類粘蛋白。
7.權(quán)利要求1的方法，其中靶組織是選自下組的器官組織心臟、肝、肺、和腎。
8.權(quán)利要求1的方法，其中在細(xì)胞之前將糖綴合物施用于哺乳動物。
9.權(quán)利要求1的方法，其中將糖綴合物和細(xì)胞靜脈內(nèi)施用于哺乳動物。
10.用于將造血干細(xì)胞靶向哺乳動物的心臟的方法，包括下列步驟(a)對哺乳動物施用脫唾液酸血清類粘蛋白；并(b)對哺乳動物施用細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的方法，其中在施用脫唾液酸血清類粘蛋白的步驟之后施用細(xì)胞。
12.權(quán)利要求10的方法，其中通過接近心臟的血管施用脫唾液酸血清類粘蛋白。
13.權(quán)利要求12的方法，其中通過頸靜脈施用脫唾液酸血清類粘蛋白。
14.權(quán)利要求10的方法，其中哺乳動物的心臟在施用脫唾液酸血清類粘蛋白之前受到缺血性損傷的困擾。
15.用于將間充質(zhì)干細(xì)胞靶向哺乳動物的心臟的方法，包括下列步驟(a)對哺乳動物施用血清類粘蛋白；并(b)對哺乳動物施用所述細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中通過接近心臟的血管施用血清類粘蛋白。
17.權(quán)利要求16的方法，其中通過頸靜脈施用血清類粘蛋白。
18.權(quán)利要求15的方法，其中哺乳動物的心臟在施用血清類粘蛋白之前受到缺血性損傷的困擾。
19.權(quán)利要求15的方法，其中在施用血清類粘蛋白的步驟之后施用所述細(xì)胞。
20.用于將造血干細(xì)胞靶向哺乳動物的肝的方法，包括下列步驟(a)對哺乳動物施用血清類粘蛋白；并(b)對哺乳動物施用所述細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20的方法，其中在施用血清類粘蛋白的步驟之后施用所述細(xì)胞。
22.用于將間充質(zhì)干細(xì)胞靶向哺乳動物的肝的方法，包括下列步驟(a)對哺乳動物施用脫唾液酸血清類粘蛋白；并(b)對哺乳動物施用所述細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22的方法，其中在施用血清類粘蛋白的步驟之后施用所述細(xì)胞。
24.用于將目的基因靶向哺乳動物體內(nèi)組織的方法，其中所述目的基因包含轉(zhuǎn)基因，所述方法包括下列步驟(a)向哺乳動物導(dǎo)入包含目的基因的細(xì)胞；并(b)施用糖綴合物。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述細(xì)胞是造血干細(xì)胞。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述細(xì)胞是淋巴樣細(xì)胞。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述干細(xì)胞是由骨髓、外周循環(huán)或臍帶獲得的。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述糖綴合物選自下組血清類粘蛋白和脫唾液酸血清類粘蛋白。
29.用于治療哺乳動物中特征為組織損傷的疾病的方法，包括下列步驟(a)對哺乳動物施用干細(xì)胞；并(b)對哺乳動物施用糖綴合物。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述干細(xì)胞是由骨髓、外周循環(huán)或臍帶獲得的。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述糖綴合物選自下組血清類粘蛋白和脫唾液酸血清類粘蛋白。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述疾病選自下組心臟病、肺病、肝病、神經(jīng)學(xué)疾病和腎病。
33.權(quán)利要求29的方法，其中所述疾病選自下組心肌梗死、肺氣腫、囊性纖維化、肝炎、中風(fēng)、腎炎和微量蛋白尿。
34.包含淋巴樣細(xì)胞或干細(xì)胞和糖綴合物的制藥學(xué)組合物。
35.權(quán)利要求34的制藥學(xué)組合物，其中糖綴合物選自下組血清類粘蛋白和脫唾液酸血清類粘蛋白。
36.權(quán)利要求34的制藥學(xué)組合物，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞。
37.權(quán)利要求34的制藥學(xué)組合物，其中所述細(xì)胞是淋巴樣細(xì)胞。
38.制造的商品，包括包裝材料和該包裝材料中所包含的制藥學(xué)組合物，其中所述制藥學(xué)組合物包含在治療上有效的將細(xì)胞靶向期望器官的糖綴合物，并且其中包裝材料包含標(biāo)簽，指示該制藥學(xué)組合物可用于將細(xì)胞靶向期望器官。
39.權(quán)利要求38的制造的商品，其中還包括額外試劑，用于制備將施用于哺乳動物的細(xì)胞懸浮液，以及印刷的說明書，用于靶向細(xì)胞。
40.權(quán)利要求39的制造的商品，其中還包括一定數(shù)量的干細(xì)胞，適用于在哺乳動物中對這些細(xì)胞進(jìn)行靶向。
41.權(quán)利要求38的制造的商品，其中糖綴合物選自下組血清類粘蛋白和脫唾液酸血清類粘蛋白。
42.權(quán)利要求40的制造的商品，其中所述細(xì)胞是造血干細(xì)胞。
43.用于改進(jìn)使用淋巴樣細(xì)胞進(jìn)行的過繼免疫療法的效力的方法，包括對該淋巴樣細(xì)胞表面上的唾液酸糖蛋白決定簇進(jìn)行修飾。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述修飾包括切除唾液酸以生成新的脫唾液酸糖蛋白決定簇。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述修飾包括通過酶切除唾液酸。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述修飾包括通過神經(jīng)氨酸酶切除唾液酸。
47.權(quán)利要求43的方法，其中所述修飾包括通過酶添加唾液酸。
48.權(quán)利要求43的方法，其中對于肝轉(zhuǎn)移或原發(fā)性肝腫瘤而言，過繼免疫療法是將經(jīng)激活的淋巴細(xì)胞區(qū)域性地施用于肝。
49.權(quán)利要求6的方法，其中通過接近靶組織所處的器官的血管施用糖綴合物。
50.權(quán)利要求6的方法，其中所述器官是肝，而通過肝動脈或門靜脈或外周靜脈施用糖綴合物。
全文摘要
本發(fā)明針對的是將細(xì)胞投遞至哺乳動物體內(nèi)靶組織的方法，其中使用糖綴合物將細(xì)胞運(yùn)輸至哺乳動物體內(nèi)的期望器官。依照本發(fā)明的方法尤其可應(yīng)用于施用淋巴樣細(xì)胞，諸如經(jīng)白介素－2(IL－2)激活的天然殺傷(NK)細(xì)胞、經(jīng)淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞和/或腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)和/或細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)，或干細(xì)胞，諸如由骨髓或臍帶組織衍生的那些干細(xì)胞。該方法還可用于將目的基因靶向哺乳動物體內(nèi)組織，其中包括向哺乳動物體內(nèi)導(dǎo)入包含目的基因的細(xì)胞并施用糖綴合物。
文檔編號A61K38/19GK1649621SQ03809426
公開日2005年8月3日 申請日期2003年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月15日
發(fā)明者C·A·菲利普斯 申請人:退伍軍人事務(wù)研發(fā)服務(wù)部