專利名稱：免疫抑制化合物、方法及其相關(guān)應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
MHC分子有兩種形式I類和II類，它們都在單基因復(fù)合體中編碼。MHC基因是高度多態(tài)性的在人群中大多數(shù)基因座有多達約100個等位基因(Hansen，T.H.等，1993，″Fundamental Immunology″Paul，W.E.編著，RavenPress，New Yod，NY，第577頁)。
I類MHC分子是45kD跨膜糖蛋白，與另一糖蛋白—12kD β-2微球蛋白非共價締合。后者并沒有插入到細胞膜內(nèi)，且在MHC外編碼。人I類分子有三種不同的同種型，稱為HLA-A、HLA-B和HLA-C，它們在不同的基因座中編碼。I類分子的組織表達是普遍存在和共顯性的。幾種人和鼠I類分子的三維結(jié)構(gòu)已闡明(Bjorkman，P.J.等(1987)Nature，329，506；Garrett，T.P.J.等(1989)Nature，342，692；Madden，D.R.等(1991)Nature，353，321；Fremont，D.H-等(1992)Science，257，919)。它們的第一和第二胞外結(jié)構(gòu)域折疊成由鄰接兩個平行α-螺旋部分的β-折疊片層構(gòu)成的結(jié)合部位。所述結(jié)合部位將長7-9個氨基酸的抗原肽呈遞給抗細胞毒性效應(yīng)T淋巴細胞(Tc)(Madden等和Fremont等，出處同上)。這些肽中的大多數(shù)源自抗原呈遞細胞(APC)內(nèi)合成的蛋白質(zhì)，例如源自病毒或其它胞內(nèi)寄生物的蛋白，或者源自錯折疊的自身蛋白。根據(jù)結(jié)合部位內(nèi)的多態(tài)殘基，這三種I類同種型以及它們的等位基因形式都具有不同的肽結(jié)合特異性(Falk，K.等(1991)Nature，351，290；Falk，K.等(1992)Eur.J.Immunol.，22，277)。在與Tc細胞上選擇性表達的CD8分子相互作用的第三種I類結(jié)構(gòu)域上還存在另外的結(jié)合部位。Tc細胞活化的第一步是其抗原受體(TCR)與所呈遞的肽以及CD8與其同一I類分子上受體位點的同時相互作用。
II類MHC分子是兩種跨膜糖蛋白—35kD α鏈和28kD β鏈的非共價締合的異源二聚體。在人類中，II類分子有三種不同的同種型，稱為HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。DR中的多態(tài)性局限于β鏈，而這兩條鏈在DP同種型和DQ同種型中都存在多態(tài)性。II類分子是共顯性表達的，但與I類分子相反，它們表現(xiàn)出局限性組織分布它們僅存在于免疫系統(tǒng)的細胞表面(在B淋巴細胞和樹突細胞上組成型表達，而在T細胞和單核細胞上誘導型表達)。這三種不同的DR分子的三維結(jié)構(gòu)已確定(Brown，J.H.等(1993)，Nature，364，33；Stern，L.J.等(1994)Nature，388，215；Ghosh，P.等(1995)Nature，378，457；Dessen，A.等(1997)Immunity，7，473)?？傊鼈兊慕Y(jié)構(gòu)與I類分子的結(jié)構(gòu)非常相似。所述肽結(jié)合部位由α鏈和β鏈的第一結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，這與I類分子相反，它在兩側(cè)敞開，使得較長(長12-24個殘基)的肽可以結(jié)合(Chicz，R.M.等(1992)Nature，358，764)。β鏈的第二結(jié)構(gòu)域上的另一結(jié)合部位與在輔助T(Th)細胞上選擇性表達的CD4分子相互作用。該分子對Th細胞具有共同受體功能，這與CD8對Tc細胞具有共同受體功能類似。在II類異源二聚體的生物合成和胞內(nèi)運輸期間，它們陪伴有第三種蛋白即非多態(tài)非MHC編碼的31kD蛋白(稱為不變(Ii))鏈(Cresswell，P.(1994)Annu.Rev.Immunol.，12，259)。Ii鏈在II類分子在胞質(zhì)溶膠內(nèi)的運輸期間保護其肽結(jié)合部位，直到它們到達酸性內(nèi)體區(qū)室，在此Ii鏈被蛋白酶切割，僅留下其在結(jié)合部位中的肽，稱為CLIP。CLIP與抗原肽的交換由內(nèi)體中的另一MHC編碼的分子(稱為HLA-DM)催化(Vogt，A.B.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93，9724)?？乖闹饕獊碓从诒话痰耐獠康鞍?Germain，R.N.(1994)Cell，76，287)。
DR分子和肽之間相互作用的性質(zhì)已基本了解。在結(jié)合部位中存在一個大口袋和額外的小口袋，該大口袋對于與所述肽的疏水性錨定殘基相互作用是至關(guān)重要的，而這些小口袋含有賦予肽結(jié)合一定程度的同種異型特異性的多態(tài)β鏈殘基(Stern等，出處同上；Hammer，J.等(1993)J.Exp.Med.，176，1007；Hammer，J.等(1994)Cell.74，197；Hammer，J.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 91，4456；Hammer，J.等(1995)J.Exp.Med.，180，2353)。所述肽主鏈也與結(jié)合部位中的某些保守殘基的側(cè)鏈一起形成重要的氫鍵，后者決定所結(jié)合肽的總體構(gòu)象和側(cè)鏈取向(Stern等，出處同上)。
大量的證據(jù)證明，對許多疾病、特別是自身免疫病的敏感性與主要組織相容性復(fù)合體的特定等位基因密切相關(guān)(綜述參見Tiwari，J.和Terasaki，P.(1985)，HLA and disease association(New York；SpringerVerlag))。雖然存在某些I類相關(guān)疾病，但是已發(fā)現(xiàn)大多數(shù)自身免疫病與II類等位基因相關(guān)。例如II類等位基因DRBl*0101、0401、0404和0405在類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者體內(nèi)的存在頻率增加(McMichael，S.J.等(1977)Arthritis Rheum.，20，1037；Stasny，P.(1978)N.Engl.J.Med.，298，869；Ohta，N.等(1982)Hum.Immunol.，5，123；Schiff，B.等(1982)Ann.Rheum.Dis.，41，403)，而DRB1*1501與多發(fā)性硬化(MS)相關(guān)，DQ等位基因組合DQA1*0301/B1*0302與胰島素依賴性糖尿病(IDDM)相關(guān)。在RA中，共有＞94％的類風濕因子陽性患者攜帶所述敏感性等位基因之一(Nepom，G.T.等(1989)Arthritis，Rheum.，32，15)。
DRB1等位基因?qū)A的作用以不同的方式表現(xiàn)出來第一，疾病相關(guān)性顯示對某一等位基因有人種依賴性偏愛(Ohta等和Schiff等，出處同上)，第二，與其它等位基因相比，DRB1*0401與所述疾病的更嚴重形式相關(guān)(Lanchbury，J.S.等(1991)Hum.Immunol.，32，56)，第三，可以觀察到基因劑量效應(yīng)，因為一個敏感性等位基因或兩個敏感性等位基因的組合的純合性使RA出現(xiàn)更加嚴重的慢性形式或在青少年中發(fā)作(Wordworth，P.等(1992)Am.J.Hum.Genet.，51，585；Nepom，B.S.(1993)Clin.Immunol.Immunopathol.，67，850)。最新的發(fā)現(xiàn)表明，DRB1基因座既可以控制所述疾病的發(fā)生，又可以控制所述疾病的發(fā)展。
由RA相關(guān)DRB1等位基因編碼的DRB鏈表現(xiàn)出多態(tài)性差異，但全都在位置67-74處共享一段相同的或幾乎相同的氨基酸序列，稱為“共享表位”(Nepom等，(1989)，出處同上；Gregersen，P.K.等(1987)Arthritis Rheum.30，1205)。共享表位區(qū)內(nèi)的殘基促使α螺旋在肽結(jié)合溝一側(cè)的形成(Brown等，Stern等和Dessen等，出處同上)，因此，預(yù)期所述殘基影響肽結(jié)合。事實上，在RA相關(guān)DR同種異型的位置(p)71處的堿性殘基Lys或Arg通過在所展示肽的殘基p4上有利于負電荷而不利于正電荷來賦予對肽結(jié)合的選擇性，而在p70和p71具有酸性殘基Asp和Glu的RA不相關(guān)同種異型DRB1*0402則在所展示肽的殘基p4上顯示出相反的電荷偏愛(Hammer，J.等(1995)J.Exp.Med.，181，1847)。雖然誘發(fā)RA的自身抗原尚未了解，但是若干關(guān)節(jié)軟骨蛋白都由于p4處的酸性殘基而具有能選擇性結(jié)合RA相關(guān)DR分子的肽序列(Dessen等，Hammer等，(1995)，出處同上)。因此，這些蛋白可能是針對引起RA病理的自身免疫應(yīng)答的候選抗原(Rosloniec，E.F.等(1997)J.Exp.Med.185，1113)。已經(jīng)表明，DRB1-0402的相反(正)電荷偏愛導致選擇性呈遞源自橋粒芯蛋白3在p4處具有堿性殘基的肽，橋粒芯蛋白3是涉及0402相關(guān)自身免疫病如尋常性天皰瘡的自身抗原(Wucherpfennig，K.W.等(1995)Proc.Natl.Acad，Sci.USA，92，11935)。這些數(shù)據(jù)強有力地支持這樣的假說疾病相關(guān)MHC同種異型選擇性呈遞自身抗原肽可能是DRB1等位基因和自身免疫病之間的遺傳相關(guān)性的基礎(chǔ)機制(Todd，J.A.等(1988)Science，240，1003)。疾病過程本身由識別所述肽的Th細胞驅(qū)動。活化自身反應(yīng)性Th細胞分泌不同的促炎細胞因子，后者進而進一步將炎性細胞吸引到該部位，從而在受影響器官引起慢性炎癥。
在這兩類MHC分子中，II類分子由于下述原因而成為免疫抑制干預(yù)的首選靶第一，MHC-II分子激活在免疫調(diào)節(jié)中起主要作用的T輔助(Th)細胞，因此是炎性疾病中大部分免疫病理的原因。第二，大多數(shù)自身免疫病在遺傳學上與II類等位基因相關(guān)。第三，在正常正理或非病理條件下，MHC-II分子在免疫系統(tǒng)的細胞上選擇性表達，而MHC-I存在于幾乎所有的體細胞上。
與II類(例如DR)分子結(jié)合的肽需要在所展示肽的所謂“錨定位置”上存在限定的側(cè)鏈，它們一起形成特定的結(jié)合基序；然而，在非錨定位置，側(cè)鏈的變異是允許的，而不會影響結(jié)合(Hammer等，(1993，1994和1995)，出處同上)。這種結(jié)合機制使得給定的同種異型呈遞能手許多不同的肽。錨定位置的側(cè)鏈與結(jié)合部位內(nèi)的特定口袋相互作用，而非錨定位置的側(cè)鏈向外伸展，供Th細胞的TCR識別用。因此可以想象，由自身免疫病相關(guān)MHC分子呈遞的自身抗原肽被具有相同結(jié)合基序但在非錨定位置不同的化合物置換，可以防止自身免疫T細胞的活化，從而阻斷疾病過程。這樣的化合物將會發(fā)揮其作用的機制是對抗原呈遞位點的競爭性拮抗。因此，預(yù)期與涉及特定自身免疫病的II類分子選擇性結(jié)合的化合物能特異性干預(yù)該疾病。在例如國際專利申請WO 92/02543、WO 93/05011和WO 95/07707中公開了其它結(jié)合MHC分子并抑制T細胞活化的肽。
靶向II類MHC分子的藥物將提供幾個優(yōu)于大多數(shù)可利用的免疫抑制藥的優(yōu)點。第一，該藥物將代表基于疾病機制的干預(yù)療法，預(yù)期可阻斷致病級聯(lián)中的初始事件。第二，該藥物可以設(shè)計為只對幾種II類同種異型有選擇性，也就是說對與疾病相關(guān)的那些同種異型有改進的親和性，留下的抗原呈遞系統(tǒng)剩余部分可用于針對病原體保護性應(yīng)答，因此引起的免疫妥協(xié)副作用要比大多數(shù)免疫抑制藥的副作用小。第三，可以使用所述方法和化合物，而無需任何有關(guān)引起該疾病的實際自身抗原的專業(yè)知識。最后，如果這種藥物在某些生物學環(huán)境中顯示更好的穩(wěn)定性，則所述藥物將是有利的。例如，在哺乳動物血漿例如大鼠血漿、小鼠血漿或人血漿中有高藥物穩(wěn)定性將是十分理想的，因為免疫系統(tǒng)的許多細胞以及活性強的肽降解酶都存在于血中。在嚙齒動物血漿、尤其是大鼠血漿中的高藥物穩(wěn)定性尤其有利，因為大多數(shù)治療藥最初是在嚙齒動物模型或系統(tǒng)中測試其功效、毒性和/或藥代動力學的。針對組織蛋白酶降解的藥物穩(wěn)定性是同樣理想的，這是因為基于機制的治療干預(yù)要求靶向II類MHC分子的藥物能被胞吞并可以用含組織蛋白酶的內(nèi)體在細胞內(nèi)運輸，然后呈遞給MHC II分子。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于抑制免疫應(yīng)答、例如通過抑制II類MHC介導的T細胞活化而抑制免疫應(yīng)答的化合物、藥用組合物和方法。下面公開的化合物(包括在式II化合物中有非天然精氨酸取代)可以表現(xiàn)出在血漿(例如小鼠血漿和大鼠血漿)中穩(wěn)定性增加，對目標MHC-II類分子(0401、0101和0404)的結(jié)合親和性增加，與在取代氨基酸位置中含Arg的相應(yīng)化合物相比，增加系數(shù)高達1.25-3。此外，下面公開的化合物包含式I化合物中的封端基團。這樣的式I化合物或式II化合物也可顯示T細胞應(yīng)答的體內(nèi)抑制增加，增加系數(shù)高達1.25-3。這樣的化合物在某些免疫疾病的小鼠模型中可顯示出有效的免疫抑制。主題化合物和方法可以用來治療類風濕性關(guān)節(jié)炎和/或多發(fā)性硬化等疾病。
在某些實施方案中，主題化合物可以用來制備用于治療動物、例如人的藥用組合物，例如用于治療或預(yù)防其特征為MHC II類介導的T細胞活化或在炎癥的病理部位表達MHC II類蛋白的病癥例如自身免疫病的藥用組合物。主題化合物和/或組合物可以用于治療或預(yù)防所述疾病，包括下文具體列舉的那些疾病。
附圖簡述

圖1本發(fā)明含Gpg(脒基哌啶基甘氨酸)七聚體化合物(P53)相對于含Arg等同物(P51)對MHC II類蛋白0401的改進的結(jié)合。用已發(fā)表的前導肽(P3；Falcioni等1999；Nature Biotech 17，562-567)作為陽性對照。運用標準統(tǒng)計學軟件，使非線性邏輯斯諦回歸曲線擬合到依照實施例14所產(chǎn)生的復(fù)制數(shù)據(jù)點。根據(jù)擬合曲線估計IC50，并用相應(yīng)化合物的適當線型(P53實線、P51短劃線、P3點線)的垂直線表示。
圖2本發(fā)明含Gpg四聚體化合物(P74)相對于含Arg等同物(P71)與MHC II類蛋白0401的改進的結(jié)合。用已發(fā)表的前導肽(P3；Falcioni等1999)作為陽性對照。運用標準統(tǒng)計學軟件，使非線性邏輯斯諦回歸曲線擬合到依照實施例14所產(chǎn)生的復(fù)制數(shù)據(jù)點。根據(jù)擬合曲線估計IC50，并用相應(yīng)化合物的適當線型(P74實線、P71短劃線、P3點線)的垂直線表示。
圖3本發(fā)明的優(yōu)選含Gpg(脒基哌啶基甘氨酸)四聚體化合物(P69)相對于含Arg等同物(P82)與MHC II類蛋白0101的改進的結(jié)合。運用標準統(tǒng)計學軟件，使非線性邏輯斯諦回歸曲線擬合到依照實施例14所產(chǎn)生的復(fù)制數(shù)據(jù)點。根據(jù)擬合曲線估計IC50，并用相應(yīng)化合物的適當線型(P69實線、P82短劃線)的垂直線表示。
圖4本發(fā)明的優(yōu)選含Gpg(脒基哌啶基甘氨酸)四聚體化合物(P74)相對于含Arg等同物(P71)與MHC II類蛋白0401的改進的結(jié)合。運用標準統(tǒng)計學軟件，使非線性邏輯斯諦回歸曲線擬合到依照實施例14所產(chǎn)生的復(fù)制數(shù)據(jù)點。根據(jù)擬合曲線估計IC50，并用相應(yīng)化合物的適當線型(P74實線、P71短劃線)的垂直線表示。
圖5本發(fā)明的優(yōu)選含Gpg(脒基哌啶基甘氨酸)四聚體化合物(P101)相對于含Arg等同物(P98)與MHC II類蛋白0401的改進的結(jié)合。運用標準統(tǒng)計學軟件，使非線性邏輯斯諦回歸曲線擬合到依照實施例14所產(chǎn)生的復(fù)制數(shù)據(jù)點。根據(jù)擬合曲線估計IC50，并用相應(yīng)化合物的適當線型(P101實線、P98短劃線)的垂直線表示。
圖6本發(fā)明含Gpg七聚體化合物(P47)相對于含Arg等同物(P43)與LG2細胞表面表達的MHC II類蛋白的改進的結(jié)合。運用標準統(tǒng)計學軟件，使非線性邏輯斯諦回歸曲線擬合到依照實施例15所產(chǎn)生的復(fù)制數(shù)據(jù)點。根據(jù)擬合曲線估計IC50，并用相應(yīng)化合物的適當線型(P47實線、P43短劃線)的垂直線表示。
圖7本發(fā)明含Gpg四聚體化合物(P74)相對于含Arg等同物(P71)與Priess細胞表面表達的MHC II類蛋白的改進的結(jié)合。運用標準統(tǒng)計學軟件，使非線性邏輯斯諦回歸曲線擬合到依照實施例15所產(chǎn)生的復(fù)制數(shù)據(jù)點。根據(jù)擬合曲線估計IC50，并用相應(yīng)化合物的適當線型(P74實線、P71短劃線)的垂直線表示。
圖8本發(fā)明的含Gpg七聚體和四聚體化合物相對于含Arg等同物在大鼠血漿中24小時后的改進的穩(wěn)定性(任意單位)。相應(yīng)Gpg/Arg化合物的數(shù)據(jù)用相鄰條形圖所示。
圖9劑量-反應(yīng)曲線，證明根據(jù)T細胞活化試驗測定，P53(含Gpg)即本發(fā)明優(yōu)選七聚體化合物相對于含Arg肽(P51)的改進的免疫抑制特性。運用標準統(tǒng)計學軟件，使非線性邏輯斯諦回歸曲線擬合到依照實施例19所產(chǎn)生的復(fù)制數(shù)據(jù)點。根據(jù)擬合曲線估計IC50，并用相應(yīng)化合物的適當線型(P53實線、P51短劃線)的垂直線表示。
圖10劑量-反應(yīng)曲線，證明根據(jù)T細胞活化試驗測定，本發(fā)明的優(yōu)選化合物(a)P69、(b)P101、(c)P74和(d)P53的免疫抑制特性。
圖11劑量-反應(yīng)曲線，證明根據(jù)IL-2分泌測定，P41-1(含Gpg)(方塊和短劃線)即本發(fā)明七聚體化合物相對于含Arg肽(P40-1)(菱形和實線)的改進的免疫抑制特性。
圖12劑量-反應(yīng)曲線，證明根據(jù)IL-2分泌測定，P69(含Gpg)即本發(fā)明的優(yōu)選四聚體化合物相對于含Arg肽(P82)的改進的免疫抑制特性。運用標準統(tǒng)計學軟件，使非線性邏輯斯諦回歸曲線擬合到依照實施例20所產(chǎn)生的復(fù)制數(shù)據(jù)點。根據(jù)擬合曲線估計IC50，并用相應(yīng)化合物的適當線型(P69實線、P82短劃線)的垂直線表示。
圖13根據(jù)IL-2分泌測定，P53(含Gpg)(方塊和實線)即本發(fā)明優(yōu)選七聚體化合物相對于DMSO對照(菱形和點線)的免疫抑制特性。
圖14用抗原共免疫后，根據(jù)T細胞增殖測定，P69(含Gpg)即本發(fā)明優(yōu)選四聚體化合物相對于含Arg等同物(P82)的優(yōu)異體內(nèi)免疫抑制特性。
圖15用抗原共免疫后，根據(jù)T細胞增殖測定，本發(fā)明優(yōu)選四聚體和七聚體化合物的體內(nèi)免疫抑制特性。
圖16本發(fā)明優(yōu)選四聚體和七聚體化合物(P69、P53和P74)相對于作為對照的溶劑在CIA小鼠類風濕性關(guān)節(jié)炎模型中的功效。
圖17本發(fā)明優(yōu)選四聚體和七聚體化合物(P69、P53和P74)相對于作為對照的溶劑在EAE小鼠多發(fā)性硬化預(yù)防模型中的功效。
圖18本發(fā)明優(yōu)選四聚體和七聚體化合物(P69和P53)相對于作為對照的溶劑在EAE小鼠多發(fā)性硬化治療模型中的功效。
圖19本發(fā)明優(yōu)選含Gpc化合物(P69)相對于等同物即含Arg化合物(P82)在EAE小鼠多發(fā)性硬化模型中的優(yōu)異功效。
發(fā)明詳述I.前言本發(fā)明涉及可用于抑制不需要的免疫活性、例如通過抑制II類MHC介導的T細胞活化而抑制不需要的免疫活性的化合物例如肽模擬化合物(peptidomimetic compound)，例如用以治療或預(yù)防自身免疫病。在某些實施方案中，這些化合物的特征在于與II類分子結(jié)合、其防止自身抗原結(jié)合的能力或置換已結(jié)合II類分子的自身抗原的能力和/或其通過替代作用模式來調(diào)節(jié)受II類MHC限制的免疫應(yīng)答從而抑制T細胞活化的能力。在這樣的實施方案中，本發(fā)明的化合物可以被稱為“抑制劑”、“主題抑制劑”、“肽模擬物”(包括“七聚體化合物”和“四聚體化合物”)、“本發(fā)明化合物”或“本發(fā)明抑制劑”。在某些實施方案中，所述優(yōu)選的II類分子是DR同種型。在優(yōu)選的實施方案中，這樣的抑制劑是小分子化合物，例如其分子量小于2000amu、優(yōu)選小于1000amu、甚至更優(yōu)選小于700amu的化合物。
抑制II類MHC活性的本發(fā)明化合物在預(yù)防或治療各種II類MHC相關(guān)疾病或障礙中具有治療意義?？梢詫⒈景l(fā)明化合物給予患者，以治療免疫疾病，例如涉及不需要或不適當?shù)拿庖呋钚缘募膊?，或者可以用來制備治療藥物。特別是，可以治療性應(yīng)用有效劑量的本發(fā)明抑制劑，以緩解或預(yù)防胰島素依賴性糖尿病、多發(fā)性硬化、類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。用于治療涉及不需要或不適當?shù)腗HC活性的疾病例如自身免疫病的本發(fā)明化合物的有效劑量可以通過本領(lǐng)域已知的標準方法來確定，同時考慮到常規(guī)安全性研究、毒性研究、劑量濃度研究和給藥方法，例如大劑量給藥、連續(xù)給藥或重復(fù)給藥。在一個具體的實施方案中，可以給予的劑量為約0.01mg/kg至約500mg/kg。
II.定義本文所用的術(shù)語“MHC活性”是指MHC分子刺激免疫應(yīng)答、例如通過激活T細胞而刺激免疫應(yīng)答的能力。MHC話性的抑制劑能夠抑制這種活性，因而抑制T細胞被MHC激活。在優(yōu)選的實施方案中，主題抑制劑選擇性抑制特定II類MHC同種型或同種異型的激活作用。這樣的抑制劑能夠抑制特定不需要的MHC活性，而不干擾生物體體內(nèi)的所有MHC活性，從而選擇性治療動物、例如哺乳動物、優(yōu)選人的不需要的免疫應(yīng)答，而不使所述動物的免疫應(yīng)答總體妥協(xié)。這樣的不需要的免疫應(yīng)答可以是與特定疾病例如類風濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化相關(guān)的免疫應(yīng)答。
術(shù)語“前體藥物”意指包括在生理條件下轉(zhuǎn)變成本發(fā)明抑制劑的化合物。前體藥物的通用制備方法是選擇在生理條件下被水解以獲得所需生物活性藥物的部分。在其它實施方案中，所述前體藥物經(jīng)患者體內(nèi)的酶活性而轉(zhuǎn)化或者經(jīng)靶病原體的酶活性而轉(zhuǎn)化。本文所用的“治療”是指至少使例如疾病或病癥的一個或多個癥狀的嚴重程度減輕或者改善所述癥狀的效應(yīng)。
本文所用的“疏水的”當指某種分子形式時，是指在分配實驗中，正在研究的該分子形式中大多數(shù)分子保留在有機層而不是在水層中。優(yōu)選超過約55％、75％、85％或超過約95％的分子保留在有機層。供所述分配實驗用的合適有機溶劑是技術(shù)人員已知的，包括但不限于辛醇、乙醚、二氯甲烷和氯仿。當指官能團或殘基時，疏水性是指所述官能團或殘基當某種分子形式的結(jié)構(gòu)的一部分增加所述分子形式的疏水性的性質(zhì)。
本文所用的“預(yù)防”是指例如延遲或消除疾病或病癥的一個或多個癥狀的發(fā)作。
術(shù)語“IC50”是指抑制活性或特性50％的藥物濃度，例如降低病癥的頻率，例如細胞死亡50％的藥物濃度，減少競爭肽與MHC II蛋白結(jié)合50％的藥物濃度，或者降低活性水平例如T細胞增殖或IL2分泌50％的藥物濃度。
術(shù)語“ED50”是指產(chǎn)生規(guī)定的反應(yīng)或效應(yīng)最大值的50％的藥物劑量?；蛘?，它是指使受試者或制劑的50％產(chǎn)生預(yù)定反應(yīng)的劑量。
術(shù)語“LD50”是指使受試者的50％致死的藥物劑量。
術(shù)語“治療指數(shù)”是指藥物的治療指數(shù)，定義為LD50/ED50。
術(shù)語“患者”是指動物，優(yōu)選哺乳動物，包括人類以及牲畜或其它獸醫(yī)學研究對象。
術(shù)語“結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系”或“SAR”是指其中改變藥物的分子結(jié)構(gòu)則將會改變藥物與受體、酶等的相互作用的方式。
“小分子”是指其分子量小于約2000amu或小于約1000amu、甚至小于約700amu的分子。
術(shù)語“脂族基團”是指直鏈、支鏈或環(huán)狀烷烴、烯烴或炔烴。在某些實施方案中，本發(fā)明中的脂族基團是直鏈或支鏈且具有1個至20個碳原子。
術(shù)語“烷基”是指飽和脂族基團，包括直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán)烷基(脂環(huán)基)、烷基取代的環(huán)烷基和環(huán)烷基取代的烷基。在某些實施方案中，直鏈烷基或支鏈烷基在其主鏈中具有約30個或更少的碳原子(例如對于直鏈為C1-C30，對于支鏈為C3-C30)或約20個或更少的碳原子。同樣，環(huán)烷基在其環(huán)狀結(jié)構(gòu)中具有約3個至約10個碳原子，或者在其環(huán)狀結(jié)構(gòu)中具有約5個、6個或7個碳原子。
此外，術(shù)語“烷基”(或“低級烷基”)既包括“未取代的烷基”又包括“取代的烷基”，其中后者是指具有置換烴主鏈的一個或多個碳上的氫的取代基的烷基部分。這樣的取代基可以包括例如鹵基、羥基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲?；蝓；?、硫代羰基(例如硫代酸酯基、硫代乙酸酯基或硫代甲酸酯基)、烷氧基、磷?；?、膦酸酯基、亞膦酸酯基、氨基、酰胺基、脒基、亞氨基、氰基、硝基、疊氮基、巰基、烷硫基、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、磺?；㈦s環(huán)基、芳烷基或芳族或雜芳族部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會知道，烴鏈上取代的部分本身必要時可再次被取代。例如，取代烷基的取代基可以包括氨基、疊氮基、亞氨基、酰胺基、磷?；?包括膦酸酯基和亞膦酸酯基)、磺酰基(包括硫酸酯基、亞磺酰氨基、氨磺?；突撬狨セ?和甲硅烷基以及醚基、烷硫基、羰基(包括酮基、醛基、羧酸酯基和酯基)、-CF3、-CN等的取代和未取代形式。示例性的取代烷基如下所述。環(huán)烷基可以進一步被烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、氨基烷基、羰基取代的烷基、-CF3、-CN等取代。
“Ci烷基”是具有i個原子的烷基鏈。例如C4烷基含有4個碳原子。所含有的C4烷基可以是飽和烷基，或是具有一個或兩個雙鍵(順式或反式)或一個三鍵的不飽烷基。優(yōu)選的C4烷基是飽和的。優(yōu)選的不飽和C4烷基具有一個雙鍵。C4烷基可以是未取代的，或被一個或兩個取代基取代。優(yōu)選的取代基包括低級烷基、低級雜烷基、氰基、鹵基和鹵代烷基。
“雜烷基”是碳原子和至少一個雜原子的飽和或不飽和鏈，其中沒有相鄰的兩個雜原子。雜烷基鏈在鏈中含有1-18個原子(碳原子和雜原子)，優(yōu)選1-12個原子，更優(yōu)選1-6個原子，再更優(yōu)選1-4個原子。雜烷基鏈可以是直鏈或支鏈。優(yōu)選的支鏈雜烷基具有一個或兩個分支鏈，優(yōu)選具有一個分支鏈。優(yōu)選的雜烷基是飽和的。不飽和的雜烷基具有一個或多個雙鍵和/或一個或多個三鍵。優(yōu)選的不飽和雜烷基具有一個或兩個雙鍵或一個三鍵，更優(yōu)選一個雙鍵。除非另有說明，雜烷基鏈可以是未取代的，或者被1個至約4個取代基取代。優(yōu)選雜烷基是未取代的。優(yōu)選雜烷基取代基包括鹵基、芳基(例如苯基、甲苯基、烷氧基苯基、烷氧基羰基苯基、鹵代苯基)、雜環(huán)基、雜芳基。例如，被下列取代基取代的烷基鏈是雜烷基烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基)、芳氧基(例如苯氧基、氯苯氧基、甲苯氧基、甲氧基苯氧基、芐氧基、烷氧基羰基苯氧基、酰氧基苯氧基)、酰氧基(例如丙酰氧基、苯甲酰氧基、乙酰氧基)、氨基甲酰氧基、羧基、巰基、烷硫基、酰硫基、芳硫基(例如苯硫基、氯苯硫基、烷基苯硫基、烷氧基苯硫基、芐基硫基、烷氧基羰基苯硫基)、氨基(例如氨基、一C1-C3烷基氨基和二C1-C3烷基氨基、甲基苯基氨基、甲基芐氨基、C1-C3烷基酰胺基、氨基甲酰胺基、脲基、胍基)。
“Mi雜烷基”是具有i個原子的雜烷基鏈。例如，M4雜烷基含有一個或兩個不相鄰的雜原子。含有1個雜原子的M4雜烷基可以是飽和雜烷基，或是具有一個雙鍵(順式或反式)或一個三鍵的不飽雜烷基。含有2個雜原子的優(yōu)選M4雜烷基是飽和雜環(huán)烷基。優(yōu)選的不飽和M4雜烷基具有一個雙鍵。M4雜烷基可以是未取代的，或者被一個或兩個取代基取代。優(yōu)選的取代基包括低級烷基、低級雜烷基、氰基、鹵基和鹵代烷基。
術(shù)語“芳烷基”是指被芳基(例如芳族基團或雜芳族基團)取代的烷基。
術(shù)語“烯基”和“炔基”是指長度相似且可能的取代與上述烷基相似、但分別含有至少一個雙鍵或三鍵的不飽和脂族基團。
除非碳數(shù)目另有說明，否則“低級烷基”是指如上定義的、但在其主鏈結(jié)構(gòu)中具有1-10個碳原子、或1-6個碳原子的烷基。同樣，“低級烯基”和“低級炔基”的鏈長相似。
術(shù)語“雜原子”是指除碳和氫以外的任何元素的原子。說明性的雜原子包括硼、氮、氧、磷、硫和硒，或者氧、氮或硫。
術(shù)語“氨基酸”是指帶有一個羧酸基團和一個氨基、優(yōu)選與同一碳原子連接或與相鄰碳原子連接、最優(yōu)選與同一碳原子連接的有機化合物。示例性的氨基酸是那些天然存在的氨基酸，例如用于在細胞中合成蛋白質(zhì)的氨基酸，雖然也考慮了非天然氨基酸，例如實施例部分所用的或以其它方式為本領(lǐng)域公認的那些非天然氨基酸?！鞍被釟埢笔侵赴被岬难苌?，其中氨基和羧酸基團的任一個或兩個已與其它部分連接，例如形成酰胺、硫代酰胺、磺酰胺等等。
術(shù)語“氨基酸類似物”包括氨基酸樣分子或它們的殘基，其中羧酸基團的羰基被另一親電子部分例如硫代羰基或磺酰基取代。該術(shù)語也包括二肽類似物，例如下面討論的[SΨ(oxaz)L]和[SΨ(imid)L]部分以及其中內(nèi)部酰胺鍵被烯烴取代的二肽類擬物。適合用于本發(fā)明的其它氨基酸類似物是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。包含一個或多個氨基酸類似物的化合物如本發(fā)明抑制劑通常被稱為“肽模擬化合物”或“模擬化合物”。
術(shù)語“芳基”包括可以含有0-4個雜原子的5元、6元和7元單環(huán)芳族基團，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪和嘧啶等。那些在環(huán)狀結(jié)構(gòu)中具有雜原子的芳基也可以被稱為“芳基雜環(huán)”或“雜芳基”。所述芳環(huán)可以在一個或多個環(huán)位置上被如上所述的這類取代基取代例如鹵基、疊氮基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、烷氧基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、酰胺基、膦酸酯基、亞膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷硫基、磺?；喕酋０被?、酮基、醛基、酯基、雜環(huán)基、芳族或雜芳族部分、-CF3、-CN等。術(shù)語“芳基”也包括具有兩個或更多個環(huán)的多環(huán)體系，其中兩個或多個碳是兩個鄰接環(huán)所共用的(所述環(huán)是“稠環(huán)”)，其中所述環(huán)中至少一個環(huán)是芳環(huán)，例如其它環(huán)可以是環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)基。
術(shù)語鄰位、間位或?qū)ξ环謩e適用于1，2-二取代的苯、1，3-二取代的苯和1，4-二取代的苯。例如，名稱1，2-二甲基苯和鄰二甲基苯是同義詞。
術(shù)語“雜環(huán)基”是指3元至約10元環(huán)狀結(jié)構(gòu)，或指3元至約7元環(huán)，其中環(huán)狀結(jié)構(gòu)包括1-4個雜原子。雜環(huán)也可以是多環(huán)。雜環(huán)基包括例如噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、異苯并呋喃、苯并吡喃、咕噸、苯并氧硫雜環(huán)己二烯(phenoxathiin)、吡咯、咪唑、吡唑、異噻唑、異噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、吲嗪、異吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、異喹啉、喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩砒嗪、吩噻嗪、呋咱、吩嗪、吡咯烷、氧雜環(huán)戊烷、硫雜環(huán)戊烷、噁唑、哌啶、哌嗪、嗎啉、內(nèi)酯、內(nèi)酰胺例如β-丙內(nèi)酰胺和吡咯烷酮、磺內(nèi)酰胺、磺酸內(nèi)酯等。所雜述環(huán)可以在一個或多個位置上被如上所述的這類取代基取代例如鹵基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、酰胺基、膦酸酯基、亞膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷硫基、磺?；⑼?、醛基、酯基、雜環(huán)基、芳族或雜芳族部分、-CF3、-CN等。
術(shù)語“多環(huán)基”是指其中兩個或更多個碳是兩個鄰接環(huán)(例如所述環(huán)是“稠環(huán)”)所共用的兩個或更多個環(huán)(例如環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)基)。通過非相鄰原子連接的環(huán)被稱為“橋”環(huán)。多環(huán)中的每個環(huán)都可以被如上所述的這類取代基取代例如鹵基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、酰胺基、膦酸酯基、亞膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷硫基、磺?；?、酮基、醛基、酯基、雜環(huán)基、芳族或雜芳族部分、-CF3、-CN等。
術(shù)語“碳環(huán)”是指環(huán)中每個原子都為碳原子的芳環(huán)或非芳環(huán)。
術(shù)語“硝基”是指-NO2；術(shù)語“鹵基”是指-F、-Cl、-Br或-I；術(shù)語“巰基”是指-SH；術(shù)語“羥基”是指-OH；術(shù)語“磺?；笔侵?SO2。
術(shù)語“胺基”和“氨基”是本領(lǐng)域公認的，既指未取代的胺又指取代的胺，例如可以由以下通式表示的部分 其R50、R51和R52各自獨立代表氫、烷基、烯基、-(CH2)m-R61，或者R50和R51與連接它們的N原子結(jié)合在一起形成其環(huán)狀結(jié)構(gòu)中具有4-8個原子的雜環(huán)；R61代表芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)或多環(huán)；且m為0或1-8范圍內(nèi)的整數(shù)。在某些實施方案中，R50或R51中僅一個可以為羰基，例如R50、R51和氮一起不形成二酰亞胺。在其它實施方案中，R50和R51(和任選的R52)各自獨立代表氫、烷基、烯基或-(CH2)m-R61。因此，術(shù)語“烷基胺”包括如上定義的、具有與其連接的取代或未取代的烷基的胺基，也就是R50或R51中至少一個為烷基。
術(shù)語“酰氨基”是本領(lǐng)域公認的，是指可以由以下通式表示的部分 其中R50如上定義，而R54代表氫、烷基、烯基或-(CH2)m-R61，其中m和R61如上定義。
術(shù)語“酰胺基”是本領(lǐng)域公認的氨基取代的羰基，包括可由以下通式表示的部分
其中R50和R51如上定義。本發(fā)明中酰胺的某些實施方案將不包括可能是不穩(wěn)定的二酰亞胺。
術(shù)語“烷硫基”是指如上定義的、具有一個與其連接的硫基團的烷基。在某些實施方案中，“烷硫基”部分由-S-烷基、-S-烯基、-S-炔基和-S-(CH2)m-R61之一表示，其中m和R61如上定義。代表性的烷硫基包括甲硫基、乙硫基等。
術(shù)語“羰基”是本領(lǐng)域公認的，包括可由以下通式表示的部分 其中X50為化學鍵，或者代表氧或硫，且R55代表氫、烷基、烯基、-(CH2)m-R61或藥學上可接受的鹽，R56代表氫、烷基、烯基或-(CH2)m-R61，其中m和R61如上定義。在X50為氧且R55或R56不為氫的情況下，該式代表“酯”。在X50為氧且R56如上定義的情況下，該部分在本文被稱為羧基，特別是當R56為氫時，該式代表“羧酸”。在X50為氧且R55為氫的情況下，該式代表“甲酸酯”。一般而言，在上式中氧原子被硫原子取代的情況下，該式代表“硫代羰基”。在X50為硫且R55或R56不為氫的情況下，該式代表“硫代酸酯”。在X50為硫且R56為氫的情況下，該式代表“硫代羧酸”。在X50為硫且R55為氫的情況下，該式代表“硫代甲酸酯”。另一方面，在X50為化學鍵且R55不為氫的情況下，上式代表“酮”基。在X50為化學鍵且R55為氫的情況下，上式代表“醛”基。
術(shù)語“烷氧基”是指如上定義的、具有與其連接的氧基團的烷基。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等?！懊选笔莾蓚€通過氧共價連接的烴。因此，使烷基變成醚的烷基的取代基是烷氧基或者類似于烷氧基，例如可以由下式之一表示-O-烷基、-O-烯基、-O-炔基、-O-(CH2)m-R61，其中m和R61如上所述。
術(shù)語“磺酸酯基”是本領(lǐng)域公認的，包括可由以下通式表示的部分 其中R57為電子對、氫、烷基、環(huán)烷基或芳基。
術(shù)語“硫酸酯基”是本領(lǐng)域公認的，包括可由以下通式表示的部分 其中R57如上定義。
術(shù)語“亞磺酰氨基”是本領(lǐng)域公認的，包括可由以下通式表示的部分 其中R50和R56如上定義。
術(shù)語“氨磺酰基”是本領(lǐng)域公認的，包括可由以下通式表示的部分 其中R50和R51如上定義。
術(shù)語“磺?；笔侵缚捎梢韵峦ㄊ奖硎镜牟糠?br> 其中R58為下列基團之一氫、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基。
術(shù)語“亞砜基”是指可由以下通式表示的部分 其中R58如上定義。
可以對烯基和炔基進行類似的取代，以產(chǎn)生例如氨基烯基、氨基炔基、酰胺基烯基、酰胺基炔基、亞氨基烯基、亞氨基炔基、硫代烯基、硫代炔基、羰基取代的烯基或炔基。
對每種表達方式例如烷基、m、n、p等的定義，當其在任一結(jié)構(gòu)中不止出現(xiàn)一次時，意味著獨立其相同結(jié)構(gòu)中在另外一處的定義。
“硒烷基”是指具有與其連接的取代硒基的烷基?？梢栽谕榛先〈氖纠浴拔选边x自-Se-烷基、-Se-烯基、-Se-炔基和-Se-(CH2)m-R61之一，m和R61如上定義。
術(shù)語三氟甲磺?；?、甲苯磺酰基、甲磺酰基和九氟甲磺?；潜绢I(lǐng)域公認的，分別指三氟甲磺?；?、對甲苯磺?；?、甲磺?；途欧』酋；?。術(shù)語三氟甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、甲磺酸酯基和九氟甲磺?；潜绢I(lǐng)域公認的，分別指三氟甲磺酸酯基、對甲苯磺酸酯基、甲磺酸酯基和九氟丁磺酸酯基官能團和含有所述基團的分子。
縮寫Me、Et、Ph、Tf、Nf、Ts、Ms分別表示甲基、乙基、苯基、三氟甲磺?；⒕欧』酋；?、對甲苯磺?；图谆酋；?。本領(lǐng)域普通有機化學家所用的縮寫的更詳盡一覽表參見Journal ofOrganic Chemistry每卷的第一期；該一覽表通常在題為 Standard List ofAbbreviations的表中給出。
本發(fā)明的某些單體亞單元可以以特定幾何形式或立體異構(gòu)形式存在。另外，本發(fā)明的寡聚體也可以是旋光的。本發(fā)明考慮了所有這樣的化合物，包括順式-異構(gòu)體和反式-異構(gòu)體、R-對映異構(gòu)體和S-對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、(D)-異構(gòu)體、(L)-異構(gòu)體、其外消旋混合物及它們的其它混合物，全都屬于本發(fā)明的范圍之列。在取代基例如烷基中可以存在另外的不對稱碳原子。所有這樣的異構(gòu)體以及它們的混合物都有意包括在本發(fā)明中。
如果例如本發(fā)明化合物的具體對映異構(gòu)體是所需的，則它可以通過不對稱合成來制備，或者通過用手性助劑衍生化，其中分離所得的非對映異構(gòu)體混合物并切下所述輔助基團，以提供所需的純對映異構(gòu)體?；蛘撸谒龇肿雍幸粋€堿性官能團(例如氨基)或酸性堿性官能團(例如羧基)的情況下，可以與合適的旋光酸或旋光堿形成非對映異構(gòu)體的鹽，接著通過本領(lǐng)域眾所周知的分級分離結(jié)晶法或色譜法，對如此形成的非對映異構(gòu)體進行拆分，隨后回收所述純對映異構(gòu)體。
可以理解“取代”或“被……取代”包括隱含的附加條件，即這樣的取代依照取代原子和取代基的允許化合價進行，并且取代產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物，例如不自發(fā)地例如通過重排、環(huán)化、消除或其它反應(yīng)等發(fā)生轉(zhuǎn)化。
術(shù)語“取代的”也意指包括有機化合物的所有容許的取代基。廣義上，所述容許的取代基包括有機化合物的無環(huán)和有環(huán)、分支和不分支、碳環(huán)和雜環(huán)、芳族和非芳族取代基。說明性的取代基包括例如上文描述的那些取代基。容許的取代基對于合適的有機化合物可以是一種或多種以及相同或不同的取代基。對于本發(fā)明而言，諸如氮的雜原子可具有氫取代基和/或本文描述的滿足雜原子化合價的有機化合物的任何容許的取代基。本發(fā)明并不以任何方式受到有機化合物的容許取代基的限制。
對于本發(fā)明而言，化學元素依照以下文獻進行鑒定the PeriodicTable of the Elements，CAS version，Handbook of Chemistry and Physics，第67版，1986-87，封二。對于本發(fā)明而言，也考慮了術(shù)語“烴”包括具有至少一個氫原子和一個碳原子的所有容許的化合物，廣義上，所述容許的烴包括無環(huán)和有環(huán)、分支和不分支、碳環(huán)和雜環(huán)、芳族和非芳族的、可以被取代或者是未取代的有機化合物。
短語“保護基”是指保護潛在反應(yīng)性官能團避免不需要的化學轉(zhuǎn)化的臨時取代基。這類保護基的實例分別包括羧酸的酯、醇的甲硅烷基醚以及醛和酮的縮醛和縮酮。保護基化學領(lǐng)域已有綜述。Greene等， Protective Groups in Organic Synthesi，第二版；Wiley；New York，1991。
術(shù)語“吸電子基團”是本領(lǐng)域公認的，是指有傾向于從相鄰原子吸引原子價電子的取代基，即所述取代基相對于相鄰原子是電負性的。對吸電子能力水平的定量以Hammettσ(σ)常數(shù)給出。這個熟知的常數(shù)在許多參考文獻中有描述，例如March， Advanced OrganicChemistry 251-59，McGraw Hill Book Company，New York，(1977)。Hammett常數(shù)值對于給電子基團來講通常是負值(對于NH2，σ(P)＝-0.66)，而對于吸電子基團是正值(對于硝基，σ(P)＝0.78)，σ(P)表示對位取代。示例性的吸電子基團包括硝基、?；?、甲?；⒒酋；⑷谆?、氰基、氯離子等。示例性的給電子基團包括氨基、甲氧基等。
考慮了上述寡聚體、亞單元和其它組合物的等同實施方案包括在其它方面符合上述化合物并且具有上述化合物相同的一般特性(例如生物相容性、抗腫瘤活性)的化合物，其中對取代基進行一種或多種不負面影響所述分子功效的簡單變化，以達到其預(yù)定目標。一般而言，本發(fā)明化合物可以采用容易得到的原料、試劑和常規(guī)合成方法，通過通用反應(yīng)流程舉例說明的方法(例如下述方法)，或者通過其改進方法來制備。在這些反應(yīng)中，也有可能利用本身已知的但此處并未提及的變異體。
III.本發(fā)明的化合物本發(fā)明提供可抑制免疫應(yīng)答、例如通過抑制II類MHC介導的T細胞活化來抑制免疫應(yīng)答的肽模擬化合物。例如，合適的肽模擬物包括具有式I結(jié)構(gòu)的化合物 式I其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則A不存在，或者代表1-4個氨基酸或氨基酸類似物殘基序列，優(yōu)選不存在；B代表2-8個氨基酸或氨基酸類似物殘基序列，優(yōu)選2-6個氨基酸或氨基酸類似物殘基序列；X不存在，或者代表O、S或NR；W代表封端基團，例如OR7或NR8R9；V每次出現(xiàn)時獨立代表C＝O、C＝S或SO2；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或低級烷基，優(yōu)選H；R1代表取代或未取代的烷基、雜烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)基烷基部分，優(yōu)選疏水部分，最優(yōu)選包含1-8個碳原子；R2代表取代或未取代的烷基、雜烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)基烷基部分，優(yōu)選疏水部分，或者R2和R結(jié)合在一起形成環(huán)，所述環(huán)具有5-7元、任選被1-5個取代基取代和/或與一個或多個其它環(huán)例如芳基、雜環(huán)基或碳環(huán)形成多環(huán)結(jié)構(gòu)，例如稠合二環(huán)；R3代表取代或未取代的烷基、雜烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)基烷基部分，優(yōu)選包括堿性氮原子(例如它在生理條件下可被質(zhì)子化和/或其共軛酸在水溶液中的pKa介于6和12之間，優(yōu)選介于7和10之間)；且R7、R8和R9獨立代表選自以下的取代基H和取代或未取代的烷基、雜烷基、芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基和雜環(huán)基烷基，或者其中R8和R9結(jié)合在一起形成環(huán)，所述環(huán)具有5-7元、任選被1-5個取代基取代和/或與一個或多個其它環(huán)例如芳基、雜環(huán)基或碳環(huán)形成多環(huán)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明提供可抑制免疫應(yīng)答、例如通過抑制II類MHC介導的T細胞活化來抑制免疫應(yīng)答的肽模擬化合物。例如，合適的肽模擬物包括具有式II結(jié)構(gòu)的化合物 式II其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則A不存在，或者代表1-4個氨基酸或氨基酸類似物殘基序列，優(yōu)選不存在；B代表2-8個氨基酸或氨基酸類似物殘基序列，優(yōu)選2-6個氨基酸或氨基酸類似物殘基序列；X不存在，或者代表O、S或NR；W代表OR7或NR8R9；V每次出現(xiàn)時獨立代表C＝O、C＝S或SO2；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或低級烷基，優(yōu)選H；R1代表取代或未取代的烷基、雜烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)基烷基部分，優(yōu)選疏水部分，最優(yōu)選包含1-8個碳原子；R2代表取代或未取代的烷基、雜烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)基烷基部分，優(yōu)選疏水部分，或者R2和R結(jié)合在一起形成環(huán)，所述環(huán)具有5-7元、任選被1-5個取代基取代和/或與一個或多個其它環(huán)例如芳基、雜環(huán)基或碳環(huán)形成多環(huán)結(jié)構(gòu)，例如稠合二環(huán)；i為0-1的整數(shù)，優(yōu)選0；j為1-2的整數(shù)，優(yōu)選1；k為1-3的整數(shù)，優(yōu)選2；R6不存在，或者代表1-4個與其連接的含氮環(huán)上的取代基，選自取代或未取代的低級烷基、鹵代烷基、鹵基、羥基和氨基；且R7，R8和R9獨立代表選自以下的取代基H和取代或未取代的烷基、雜烷基、芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基和雜環(huán)基烷基，或者其中R8和R9結(jié)合在一起形成環(huán)，所述環(huán)具有5-7元、任選被1-5個取代基取代和/或與一個或多個其它環(huán)例如芳基、雜環(huán)基或碳環(huán)形成多環(huán)結(jié)構(gòu)。
在式I的某些實施方案中，R3代表精氨酸或賴氨酸的側(cè)鏈或具有以下結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈 其中i、j、k和R6的定義如對式II中的描述。在式I的某些實施方案中，R3包括胍或胍鹽部分，例如包括在環(huán)中或者與環(huán)連接，或者包括在鏈中或鏈的末端。在式I的某些實施方案中，R3代表環(huán)烷基、烷基或氨基烷基，例如別異亮氨酸、環(huán)己基甘氨酸、瓜氨酸、賴氨酸或鳥氨酸的側(cè)鏈，包括賴氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸的N-甲基和N，N-二甲基變體。
在式I的某些實施方案中，B代表2個氨基酸或氨基酸類似物殘基，而W包括如下文更詳細描述的封端基團。優(yōu)選氨基酸或類似物殘基通過第二個酰胺鍵連接在一起(即其中氮帶有一個氫取代基)。
在式II的某些實施方案中，R6不存在，而在其它實施方案中，R6包括低級烷基取代基。
在式I和式II的某些實施方案中，R2代表取代或未取代的環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、芳基、芳烷基。
在式I和式II的某些實施方案中，B的第一個殘基(與V連接的氨基酸或類似物殘基)具有側(cè)鏈即H或優(yōu)選C1-C8烷基或M1-M8雜烷基(包括例如丙氨酸、Acm-半胱氨酸、Prm-半胱氨酸、乙酰-半胱氨酸和Nva，例如C1-C6烷基或M1-M6雜烷基)，或者取代或未取代的芳基、芳烷基、雜芳基或雜烷基(例如甲基苯基或苯基甲基)，或者B的第一個殘基是包含帶有C＝O、C＝S或SO2基團、任選與苯環(huán)(例如Tic、azaTic、Disc、Thiq等)稠合的5-8元含氮雜環(huán)的氨基酸類似物。雖然在該位置上可以存在表1-3的實例中在該位置上所用的任何殘基，但是該位置上優(yōu)選的殘基包括Tic和Disc。
在式I和式II的某些實施方案中，B的第二個殘基(與V連接的氨基酸或類似物殘基是第一個殘基)具有側(cè)鏈即H或優(yōu)選C1-C6烷基、M1-M6雜烷基或環(huán)烷基、甚至更優(yōu)選C3-C5烷基或M3-M5雜烷基、或者分支或者不分支、或環(huán)烷基。示例性的殘基包括甘氨酸、異亮氨酸、Nle、Chg、Met(O)(氧化甲硫氨酸)和α-氨基異丁酸。在某些實施方案中，B的第二個殘基是實質(zhì)上與二肽(如在Odapdc或Haic殘基(如下定義)上)同分異構(gòu)的殘基。雖然在該位置上可以存在表1-3的實例中在該位置上所用的任何殘基，但是在該位置上優(yōu)選的殘基包括Met和Nle。
在式I和式II的某些實施方案中，R和R2結(jié)合在一起不形成環(huán)。在其中R和R2結(jié)合在一起形成環(huán)的實施方案中，所述環(huán)最好是6元環(huán)或7元環(huán)，或者是取代的(例如雙環(huán))5元環(huán)。
在式I和式II的某些實施方案中，R1XV結(jié)合在一起代表烷酰基、烯酰基、芳基羰基或氨基烷?；?。在某些這樣的實施方案中，所述?；潜郊柞；?、低級烷?；虻图壈被轷；?，例如乙酰基、丙?；被；虬被□；?。
在式I和式II的某些實施方案中，B代表2-6個氨基酸或氨基酸類似物殘基，優(yōu)選2-5個氨基酸或氨基酸類似物殘基。在某些實施方案中，特別是其中B代表4個或更少的氨基酸或氨基酸類似物殘基，優(yōu)選3個或更少，W則代表封端基團。示例性的封端基團示于表1(a、b和c)，包括帶有選自以下取代基的氮原子(例如與B的末端羧基形成酰胺)H、取代和未取代的烷基、芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基和雜環(huán)基烷基，優(yōu)選選自H、取代和未取代的烷基、芳基、芳烷基、環(huán)烷基和環(huán)烷基烷基。合適的取代基包括羥基、醚和氨基取代基。封端基團最好包括至少6個非氫原子(包括與B連接的氮)，優(yōu)選至少8個非氫原子。封端基團W最好包括被芳烷基或雜芳烷基取代基如芐基或苯乙基取代基取代的氮。在某些這樣的實施方案中，所述氮帶有選自以下的第二取代基H、低級烷基、羥基-低級烷基和羥基-低級烷基-O-低級烷基。在某些實施方案中，封端基團W是含氮雜環(huán)基取代基，優(yōu)選與芳環(huán)或雜芳環(huán)稠合、通過環(huán)中的氮原子與B連接的取代基。這樣的封端基團包括四氫異喹啉、二氫吲哚、異二氫吲哚、嗎啉、哌啶等。
式I和式II的某些實施方案例如通過對R1或W、優(yōu)選R7、R8或R9的適當選擇，可以提供在生理條件下轉(zhuǎn)化成本發(fā)明活性化合物的前體藥物。例如，在W為酯的一部分時，所述酯可以在生理條件下被切割。
在式I和式II的某些實施方案中，R1、R7、R8或R9中至少一個為疏水殘基，優(yōu)選R8或R9。在其它實施方案中，所述化合物的疏水性例如經(jīng)采用Meyan等(1995)的方法(J.Pharm Sci.8483-92)估算，介于cLogP約2.0至約6.0之間，優(yōu)選介于約3.0至約6.0之間，最優(yōu)選介于約4.0至約5.5之間。然而，本發(fā)明考慮了其cLogP估計值超出該范圍的化合物，例如其cLogP約3.0至約4.0的化合物。
在式I和式II的某些實施方案中，A和B一起包括2-8個、例如3-6個氨基酸或氨基酸類似物殘基。優(yōu)選A和B一起包括約2個或約5個氨基酸或氨基酸類似物殘基。
式I和式II中鄰接(但不包括)B和(VCHR2)的部分在本文被稱為“精氨酸樣”殘基。在其中i為0、j為1且k為2的實施方案中，所述精氨酸樣殘基在本文被稱為Gpg殘基(脒基哌啶基甘氨酸)。這樣的殘基是本領(lǐng)域已知的，描述于PCT公布號WO 00/78796及其中引用的參考文獻。在優(yōu)選的實施方案中，所述精氨酸樣殘基在所述氨基酸的α立體中心富含S-構(gòu)型，例如該殘基中S-對映異構(gòu)體最好富含至少60％、75％、85％、90％或甚至95％或更高。在某些實施方案中，主題抑制劑表現(xiàn)出穩(wěn)定性增加，例如其血漿半壽期比其中所述精氨酸樣殘基被精氨酸取代的類似肽基化合物的血漿半壽期至少長1.25倍、1.5倍或優(yōu)選3倍，優(yōu)選至少長5倍；以及與MHC II類分子(例如0401、0101或0404)的結(jié)合親和性增加，例如其結(jié)合親和性比其中所述精氨酸樣殘基被精氨酸取代的類似肽基化合物的結(jié)合親和性至少高1.25倍、1.5倍或優(yōu)選3倍。
描述精氨酸樣殘基且可用于本發(fā)明的其它參考文獻包括國際申請?zhí)朩O 99/61476和WO 01/27141，Jones等，Bioorg Med.Chem.Lett.1999，9，2109-2114；Cunningham等，Bioorg.Med.Chem.Lett.1997，7，19-24；Hanson等，Bioorg.Med.Chem.Lett.1996，6，1931-1936；Jones等，Bioorg.Med.Chem.Lett.1999，9，2115-2118，Tamura等，Bioorg Med.Chem.Lett.2000，10，745-49，F(xiàn)alcioni等，1999，Nature Biotech 17，562-567和Schmidt等，Proc.Am.Pept.Symp.，第16期(2000)，會議日期1999，634-635。
在式I和式II的某些實施方案中，A和/或B的氨基酸包括跨細胞多肽序列，例如在美國專利第6,495,526號中描述的跨細胞多肽序列?？缂毎嚯男蛄锌梢允莾?nèi)化肽，例如可以衍生自選自以下的多肽antepennepedia蛋白、HIV反式激活(TAT)蛋白、肥大細胞脫粒肽、蜂毒肽、bombolittin、δ溶血素、摩西魚毒肽(pardaxin)、假單胞菌外毒素A、網(wǎng)格蛋白、白喉毒素和C9補體蛋白或它們的片段。
在一個實施方案中，所述內(nèi)化肽衍生自果蠅antepennepedia蛋白或其同系物。已證明同源異型蛋白antepennepedia的60個氨基酸長的長同源異型域通過生物膜轉(zhuǎn)運，并且可以促進與其偶聯(lián)的異源多肽的轉(zhuǎn)運。參見例如Derossi等(1994)J Biol Chem 26910444-10450；和Perez等(1992)J Cell Sci 102717-722。最近，已證明該蛋白的長度小到16個氨基酸的片段足以驅(qū)動內(nèi)化。參見Derossi等(1996)J BiolChem 27118188-18193。本發(fā)明考慮了將antepennepedia蛋白(或其同系物)的至少一部分與式I或式II的肽或肽模擬物偶聯(lián)，以相對于單獨的化合物，所述化合物跨膜運輸?shù)脑黾恿坑薪y(tǒng)計學顯著性。
內(nèi)化肽的另一個實例是HIV反式激活蛋白(TAT)蛋白。該蛋白似乎被分成四個結(jié)構(gòu)域(Kuppuswamy等(1989)Nucl.Acids Res.173551-3561)。純化的TAT蛋白在組織培養(yǎng)物中被細胞攝取(Frankel和Pabo，(1989)Cell 551189-1193)，而肽例如對應(yīng)于TAT的殘基37-62的片段在體外被細胞快速攝取(Green和Loewenstein，(1989)Cell551179-1188)。所述高堿性區(qū)介導內(nèi)化并且使內(nèi)化部分靶向細胞核(Ruben等，(1989)J Virol.631-8)。包括高堿性區(qū)中存在的序列例如CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS或其亞序列例如YGRKKRRQRRR在內(nèi)的肽或類似物可以與式I化合物或式II化合物綴合，以有助于內(nèi)化和使所述化合物靶向胞內(nèi)環(huán)境。
在某些這樣的實施方案中，A或B的氨基酸序列比式I或式II中定義的氨基酸的長度要長，以允許足夠長度的氨基酸序列連接，從而促進所述化合物的內(nèi)化。
本發(fā)明特別優(yōu)選的化合物是下文描述的化合物，如P53、P74、P101、P102和P69，最優(yōu)選P69(參見表1a)。
本發(fā)明化合物也可以用作用于開發(fā)類似化合物的先導化合物。所述類似物應(yīng)具有穩(wěn)定的電子構(gòu)型和分子構(gòu)象，使得關(guān)鍵性的官能團以與先導化合物基本相同的方式呈遞給例如MHC II類蛋白。特別是，所述類似化合物具有與結(jié)合區(qū)相當?shù)目臻g電子特性，但可以是比先導化合物更大或更小的分子。通過應(yīng)用自洽場(SCF)分析、組態(tài)相互作用(CI)分析和簡正模式動力學分析等技術(shù)，可以對類似化合物進行鑒定。因此，本發(fā)明化合物作為先導化合物可被進一步修飾，以達到(h)改進的作用位點、活性譜、器官特異性，和/或(i)改進的效力，和/或(j)降低的毒性(改進的治療指數(shù))，和/或(k)降低的副作用，和/或(l)改進的治療作用開始、作用的持續(xù)時間，和/或(m)改進的藥代動力學參數(shù)(吸收、分布、代謝和排泄)，和/或(n)改進的理化參數(shù)(溶解度、吸濕性、顏色、味道、氣味、穩(wěn)定性、狀態(tài))，和/或(o)改進的一般特異性、器官/組織特異性，和/或(p)通過以下方式優(yōu)化的應(yīng)用形式和途徑(q)羧基被酯化，或(r)羥基被碳氫酸酯化，或(s)羥基被酯化成例如磷酸酯、焦磷酸酯或硫酸脂或半琥珀酸酯，或(t)形成藥學上可接受的鹽，或(u)形成藥學上可接受的絡(luò)合物，或(v)合成藥理學活性聚合物，或(w)引入親水部分，或
(x)引入/交換芳族基團或側(cè)鏈上的取代基，改變?nèi)〈Ｊ?，?y)通過引入等排部分或生物等排部分而改性，或(z)合成同系化合物，或(aa)引入分支側(cè)鏈，或(bb)使烷基取代基轉(zhuǎn)變成環(huán)狀類似物，或(cc)羥基衍生成縮酮、縮醛，或(dd)N-乙?；癁轷０?、氨基甲酸苯酯，或(ee)合成曼尼希堿、亞胺，或(ff)酮或醛被轉(zhuǎn)化成席夫堿、肟、縮醛、縮酮、烯醇酯、噁唑烷、噻唑烷，或它們中任一項的組合。上面敘述的各個步驟是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，用于實施這些技術(shù)的計算機程序是可得到的；例如得自Rein，Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions(Alan Liss，New York，1989)。化學衍生物與類似物的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，描述于例如Beilstein，Handbook of OrganicChemistry，Springer edition New York Inc.，175 Fifth Avenue，New York，N.Y.10010 U.S.A.和Organic Synthesis，Wiley，New York，USA。此外，例如，按照上述方法，可以使用肽模擬物和/或輔助設(shè)計的合適衍生物和類似物的計算機。藥物發(fā)現(xiàn)中用以產(chǎn)生先導化合物的方法也包括應(yīng)用蛋白質(zhì)檢測方法，例如質(zhì)譜法(Cheng等J.Am.Chem.Soc.117(1995)，8859-8860)和某些核磁共振(NMR)方法(Fejzo等，Chem.Biol.6(1999)，755-769；Lin等，J.Org.Chem.62(1997)，8930-8931)。所述方法也可以包括或依賴于定量結(jié)構(gòu)-作用關(guān)系(QSAR)分析(Kubinyi，J.Med.Chem.41(1993)，2553-2564，Kubinyi，Pharm.UnsererZeit 23(1994)，281-290)組合生物化學、經(jīng)典化學等(參見例如Holzgrabe和Bechtold，Pharm.Acta Helv.74(2000)，149-155)。
本發(fā)明還涉及包含主題化合物和賦形劑例如藥學上可接受的賦形劑或無菌賦形劑的治療制劑。本發(fā)明還涉及用于治療或預(yù)防其特征為MHC-II介導的T細胞活化的病癥的方法，所述方法包括給予動物例如人包含如上所述的化合物的組合物。本發(fā)明還涉及主題化合物在制備藥用組合物中的用途。這樣的藥用組合物可適合用于治療或預(yù)防其特征為MHC-II介導的T細胞活化的病癥。在某些實施方案中，所述病癥是自身免疫病，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化。
在某些實施方案中，主題抑制劑對一種治療同種型或同種異型例如HLA-DR或DRB1*0101相對于第二種同種型或同種異型或相對于大多數(shù)其它同種型或同種異型而言是選擇性的。因此，主題抑制劑對一種同種型或同種異型相對于對一種或多種其它HLA同種型或同種異型的ED50可低至少5倍或10倍，優(yōu)選低至少100倍，甚至更優(yōu)選低至少1000倍。同樣，主題抑制劑對一種同種型或同種異型相對于對一種或多種其它HLA同種型或同種異型的ED50可低至少5倍或10倍，優(yōu)選低至少100倍，甚至更優(yōu)選低至少1000倍。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供經(jīng)營藥品生意的方法，即根據(jù)化合物結(jié)合MHC II類蛋白的能力選擇出本文中公開的一種或多種化合物，確定所述化合物對動物功效和毒性的治療分布型，制作說明應(yīng)用所述化合物抑制免疫應(yīng)答的包裝插頁，將用于抑制免疫應(yīng)答的多價組合物在市場上銷售。本發(fā)明也提供藥盒，所述藥盒包含本文公開的化合物并給予所述化合物以抑制免疫應(yīng)答的說明書。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供進行生命科學商業(yè)活動的方法，即根據(jù)化合物結(jié)合MHC II類蛋白的能力選擇出本文中公開的一種或多種化合物，以及獲得專利許可、共同開發(fā)或向第三方出售生產(chǎn)、經(jīng)營、銷售或使用所述抑制免疫應(yīng)答化合物的權(quán)利。
IV.治療應(yīng)用對于各種各樣的醫(yī)學治療都可以使用主題化合物。例如，主題化合物可以與實體器官移植物聯(lián)合使用。優(yōu)選所述器官選自心臟、肝臟、腎臟、腎上腺皮質(zhì)、肺、腸、胰腺、角膜和皮膚。最優(yōu)選所述靶器官選自心臟、腎臟、肝臟、角膜和皮膚。例如，患者可以在接受移植或同種異體移植之前或之后用主題化合物進行治療，以預(yù)防或減輕可能導致移植排斥或移植物抗宿主病的免疫反應(yīng)。也考慮了主題化合物的持續(xù)釋放，例如從生物可降解聚合物移植物或生物可降解聚合物微?；蚣{米粒中的持續(xù)釋放。
本發(fā)明化合物也可用于治療其特征為T細胞被MHC II類多肽不需要的、功能障礙性或異常激活的免疫系統(tǒng)疾病。這樣的免疫性疾病包括但不限于類風濕性關(guān)節(jié)炎、青少年關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、格雷夫斯病(Grave′s disease)、胰島素依賴性糖尿病、發(fā)作性睡眠、牛皮癬、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、關(guān)節(jié)強硬性脊椎炎、同種異體移植物排斥、橋本甲狀腺炎(Hashimoto′s disease)、重癥肌無力、尋常性天皰瘡、甲狀腺炎、腎小球性腎炎、胰島炎、過敏性腸疾病、胰腺炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化。可以用本發(fā)明化合物減輕癥狀或者治療或預(yù)防其發(fā)生或復(fù)發(fā)的其它疾病包括例如斯耶格倫綜合征(Sjogren syndrome)、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、大皰性類天皰瘡、古德帕斯徹綜合征(Goodpasture′s syndrome)、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜和艾迪生病(Addison′s disease)等。對于這樣的治療，可以給予足夠量的本文描述的化合物，以治療有效量地抑制MHC-II介導的T細胞活化。
特定的自身免疫功能障礙通常與特定的MHC類型相關(guān)。人類中DQ/DR單倍型及其與自身免疫病的關(guān)系是眾所周知的，例如描述于美國專利第6,045,796號。在某些實施方案中，以下做法是有利的，即確定準備用主題抑制劑進行治療的患者的基因型和/或表型，例如以選擇適合治療與患者單倍型相關(guān)的疾病或病癥的藥物，或者，適當時，確定患者的基因型和/或表型，以選擇具體的藥物和/或開出具體的藥物處方。在一個優(yōu)選的實施方案中，疾病和特定MHC類型之間的關(guān)系如此密切，使得可能不需要確定患者的基因型和/或表型。測定動物例如人的單倍型的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且任何合適的技術(shù)都可以用來進行這樣的測定，例如，通過采用對待檢查MHC基因座特異性的DNA探針來分析DNA限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)。MHC基因座探針的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見例如Gregersen等，(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.795966，所述文獻通過引用結(jié)合到本文中。然后將患者的單倍型與已知疾病相關(guān)性單倍型進行比較。作為一個實例，90％以上的類風濕性關(guān)節(jié)炎患者的單倍型為DR4 (Dw4)、DR4(Dw14)或DR1。特別是，青少年類風濕性關(guān)節(jié)炎(例如少關(guān)節(jié)性青少年類風濕性關(guān)節(jié)炎)與HLA-DPB2.1相關(guān)(Begovich等，1989，PNAS 869489-9493)。約70％的胰島素依賴性糖尿病患者表達HLA-DQ3.2B、DQA1或DQB1，并且自身免疫性皮膚病如尋常性天皰瘡的敏感性與HLA-DQB1.3的表達有關(guān)(Scharf等，1989，PNAS 866215-6219)。已知對豚草的過敏反應(yīng)與DR2等位基因相關(guān)。Marsh等，(1989)Cold Spring Harb Symp Quant Biol 54459-70，所述文獻通過引用結(jié)合到本文中。
體外試驗方法可以在各種系統(tǒng)中測定所述抑制劑的生物學活性，例如所述抑制劑抑制抗原特異性T細胞活化的能力。在一種方法中，將純化的II類MHC分子通過去垢劑透析而摻入到磷脂小泡中。然后讓所得小泡與清潔的蓋玻片融合，在每個小泡都產(chǎn)生含MHC分子的平面脂質(zhì)雙層(Brian和McConnell，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)816159)。將待測抑制劑進行可檢測標記，然后在板上與已配制成脂質(zhì)膜雙層的純化MHC蛋白一起保溫。通過檢測與板結(jié)合的標記而鑒定與MHC分子結(jié)合的抑制劑。
在第二個示例性方案中，將過量的抑制劑與表達目標MHC同種異型(例如目標DR)的抗原呈遞細胞和識別所選肽(例如破傷風毒素830-843)和MHC分子(例如目標DR)的T細胞克隆以及抗原肽本身一起孵育。將所述測定培養(yǎng)物孵育足夠的時間，使T細胞增殖，例如孵育4天，然后采用標準方法，例如在孵育的最后18小時給予氚標記胸苷脈沖，來測定增殖情況。然后計算與不接受抑制劑的對照相比的抑制百分率。
在美國專利第5,736,507號中描述了第三種方案。在該專利的公開內(nèi)容中，采用先前描述的半定量結(jié)合測定(Joosten等，Int.Immunol.6751，1994)的改進形式，進行肽結(jié)合研究。適合于本發(fā)明，可以將純化MHC分子(0.5-500nM)在pH＝5.0時與50nM生物素化指示肽一起溫育，可以使用不同濃度范圍的抑制劑，終體積為25μl結(jié)合緩沖液(例如PBS、1mM AEBSF、1mM N-乙基馬來酰亞胺、8mMEDTA、10μM胃蛋白酶抑制劑A、0.01％NaN3、0.05％NP-40和5％DMSO)。
在室溫下約溫育45小時后，可以通過SDS-PAGE并結(jié)合硝酸纖維素濾膜(BioRad)上的印跡或使用硝酸纖維素濾膜(BioRad)的真空DOT印跡以及96孔Hybry Dot裝置(BRL)，分離出結(jié)合和未結(jié)合的指示肽。印跡可以用0.5％DNA封閉劑(Boehringer Mannheim，德國)在0.1M馬來酸pH＝7.5、150mM NaCl中進行封閉。1/2小時后，印跡在PBS、0.02％Tween 20(Sigma，St.Louis，USA)中進行洗滌，然后分別以1∶40,000或1∶5,000的稀釋度與鏈霉抗生物素蛋白-HRPO(Southern Biotechnology)一起溫育。采用蛋白質(zhì)印跡ECL試劑盒(Amersham，U.K.)，按照生產(chǎn)商的說明，通過增強化學發(fā)光來檢測DR-結(jié)合的生物素化指示肽。將Preflashed膠片(hyperfilm-ECL，Amersham，U.K.)曝光10分鐘。給定肽的相對結(jié)合親和性與指示肽的競爭有關(guān)。該相對親和性被定義為信號減弱至50％時的抑制劑濃度(RIC50)。
下面實施例部分詳細描述的相似方案基于Siklodi等(HumanImmunology，59(1998)463-471)介紹的方案，并且使用主題抑制劑的競爭性結(jié)合。任何合適的MHC-II同種異型都可以用于這樣的測定中，如下所述，所述方法適合于篩選所述化合物的文庫，以尋找所述化合物結(jié)合MHC-II分子的能力。
其它測定抑制劑的體外生物學活性的合適方法在下面的實施例中進行說明。
體內(nèi)試驗?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)化合物在體外測定中抑制抗原呈遞的能力與所述化合物抑制體內(nèi)免疫應(yīng)答的能力有關(guān)。體內(nèi)活性可以在動物模型中進行測定，例如通過將已知限制特定目標MHC分子的抗原與本發(fā)明的試驗抑制劑一起給予一測定。隨后取出所述動物的T淋巴細胞，與各種劑量的抗原一起進行培養(yǎng)。通過常規(guī)方法例如用3H-胸苷脈沖并將其與合適對照進行比較，來測量對刺激的抑制。最好按照下面實施例部分描述的方法，將動物模型進行遺傳修飾，以表達目標人MHC II類同種異型而不表達內(nèi)源MHC II類分子。某些實驗細節(jié)對于技術(shù)人員而言自然是顯而易見的。另見Adorini等，Nature 334623-625(1988)和Ito等(1996)J.Exp.Med.1832635-2644，這兩個文獻均通過引用結(jié)合到本文中。
下面是示例性的免疫系統(tǒng)疾病模型系統(tǒng)，所述模型系統(tǒng)可用于評價本發(fā)明化合物對這些病癥的影響。技術(shù)人員將不超越常規(guī)實驗或研究范圍就能夠鑒定出適合于測試本發(fā)明化合物抵抗免疫系統(tǒng)的這些疾病和其它疾病的其它模型。
實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是用髓鞘蛋白例如髓鞘堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PP)或小鼠少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG)，按照Ito等(1996)介紹的方法，免疫MS相關(guān)人II類同種異型轉(zhuǎn)基因和小鼠II類分子有缺陷的小鼠而誘發(fā)的多發(fā)性硬化(MS)模型。
膠原蛋白誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(CIA)是用II型膠原蛋白免疫RA相關(guān)人II類分子轉(zhuǎn)基因小鼠而誘發(fā)的類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)模型(Rosloniec等，J.Exp.Med.1851113(1997)和J.Immunol.1602573-2578，(1998))。
V.藥用組合物另一方面，本發(fā)明提供包含治療有效量的一種或多種主題化合物(例如上述化合物)的藥學上可接受的組合物，所述化合物與一種或多種藥學上可接受的載體(添加劑)和/或稀釋劑配制在一起，用于治療異常T細胞活化或自身免疫病，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化。如下文詳細描述的，本發(fā)明的藥用組合物可以具體配制成用于給藥的固體或液體形式，包括適合于以下的那些形式(1)口服給藥，例如獸用頓服藥(水性或非水性溶液劑或混懸劑)、片劑、膠囊劑、大丸劑、散劑、顆粒劑、舌用糊劑等；(2)胃腸外給藥，例如皮下注射、肌內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射，例如無菌溶液劑或混懸劑等；(3)局部應(yīng)用，用于皮膚的乳膏劑、軟膏劑或噴霧劑等；或(4)陰道內(nèi)或直腸內(nèi)給藥，例如子宮托、乳膏劑、泡沫劑或栓劑等。在某些實施方案中，所述藥用制劑可以是無熱原的，即不會升高患者的體溫。
本文所用的短語“治療有效量”是指化合物、物質(zhì)或包含本發(fā)明抑制劑的組合物有效產(chǎn)生某種所需療效的量。這樣的療效可以由于例如對不需要的T細胞活化進行抑制而產(chǎn)生。
本文所用的短語“藥學上可接受的”是指在合理的醫(yī)療判斷范圍內(nèi)、適合用于與人類和動物組織接觸時無過度毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥、同時具有合理利益/風險比的那些化合物、物質(zhì)、組合物和/或劑型。
本文所用的短語“藥學上可接受的載體”是指參與將本發(fā)明主題化合物從機體的一種器官或部分運送或轉(zhuǎn)運到機體的另一種器官或部分的藥學上可接受的材料、組合物或溶媒，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包囊材料。每種載體必須在與制劑的其它組分相容的意義上是“可接受的”并且對患者不造成傷害?？捎米魉帉W上可接受的載體的材料的某些實例包括(1)糖類，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉狀西黃蓍膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；(9)油類，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和豆油；(10)二元醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯類，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)藻酸；(16)無熱原水；(17)等滲鹽水；(18)Ringer氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖溶液；和(21)藥用制劑中所用的其它無毒性相容的物質(zhì)。
如上所述，本發(fā)明化合物的某些實施方案可含有堿性官能團，例如氨基或烷基氨基，因而能夠與藥學上可接受的酸形成藥學上可接受的鹽。在該方面，術(shù)語“藥學上可接受的鹽”是指這類MHC活性抑制劑的相對無毒性無機酸加成鹽和有機酸加成鹽。這些鹽可以在本發(fā)明化合物的最后分離和純化期間在現(xiàn)場制備，或者通過使本發(fā)明的純化化合物以其游離堿形式與合適的有機酸或無機酸分別反應(yīng)，并且分離如此形成的鹽。代表性的鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、醋酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘酸鹽、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳二糖酸鹽和月桂基磺酸鹽等。(參見例如Berge等(1977)″Pharmaceutical Salts(藥用鹽)″，J.Pharm.Sci.661-19)。
在其它情況下，本發(fā)明化合物可以含有一個或多個酸性官能團，因而能夠與藥學上可接受的堿形成藥學上可接受的鹽。在這些情況下，術(shù)語“藥學上可接受的鹽”是指MHC活性(如T細胞活化)抑制劑的相對無毒性無機堿加成鹽和有機堿加成鹽。這些鹽同樣可以在本發(fā)明化合物的最后分離和純化期間在現(xiàn)場制備，或者通過使本發(fā)明的純化化合物以其游離酸形式與合適的堿(例如藥學上可接受的金屬陽離子的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽)與氨或與藥學上可接受的有機伯胺、仲胺或叔胺分別反應(yīng)。代表性的堿金屬鹽或堿土金屬鹽包括鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽和鋁鹽等?？捎糜谛纬蓧A加成鹽的代表性有機胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。(參見例如Berge等，參見上文)。
在所述組合物中也可以存在潤濕劑、乳化劑和潤滑劑例如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、矯味劑和香味劑、防腐劑和抗氧化劑。
藥學上可接受的抗氧化劑的實例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；(2)脂溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螫合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
本發(fā)明的制劑包括適合于經(jīng)口、鼻、局部(包括口腔含化和舌下)、直腸、陰道和/或胃腸外給藥的那些制劑。所述制劑可以方便地呈單位劑型，并且可以通過藥學領(lǐng)域熟知的任何方法來制備?？梢耘c載體材料混合以生產(chǎn)單劑型的活性成分的量將會根據(jù)待治療宿主、具體的給藥模式而變化?？梢耘c載體材料混合以生產(chǎn)單劑型的活性成分的量一般將是產(chǎn)生療效的抑制劑的量。一般而言，在100％范圍以內(nèi)，該量的范圍將為活性成分約1％至約99％，優(yōu)選約5％至約70％，最優(yōu)選約10％至約30％。
這些制劑或組合物的制備方法包括使本發(fā)明化合物與所述載體且任選與一種或多種助劑混合的步驟。一般而言，通過使本發(fā)明抑制劑與液體載體或微細固體載體或它們兩者十分均勻混合，然后必要時使所述產(chǎn)物成形，來制備所述制劑。
適合于口服給藥的本發(fā)明制劑可以為以下形式膠囊劑、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(使用矯味基質(zhì)，通常為蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠)、散劑、顆粒劑，或者為水性或非水性液體中的溶液劑或混懸劑，或者為水包油液體乳劑或油包水液體乳劑，或者為酏劑或糖漿劑，或者為軟錠劑(使用惰性基質(zhì)，例如明膠和甘油，或者蔗糖和阿拉伯膠)和/或漱口劑等，每種劑型都含有預(yù)定量的作為活性成分的本發(fā)明化合物。本發(fā)明化合物也可以作為大丸劑、干藥糖劑或糊劑給予。
在本發(fā)明供口服給藥用的固體劑型(膠囊劑、片劑、丸劑、糖錠劑、散劑、顆粒劑等)中，將所述活性成分與一種或多種藥學上可接受的載體例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣和/或任一下述物質(zhì)混合(1)填充劑或增量劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠等；(3)濕潤劑，例如甘油；(4)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(5)溶液型阻滯劑，例如石蠟；(6)吸收加速劑，例如季銨化合物；(7)潤濕劑，例如鯨蠟醇和甘油單硬脂酸酯等；(8)吸收劑，例如高嶺土和膨潤土；(9)潤滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固態(tài)聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉和它們的混合物；和(10)著色劑。就膠囊劑、片劑和丸劑而論，所述藥用組合物也可以包含緩沖劑。使用如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等賦形劑，相似類型的固體組合物也可以用作填充軟明膠和填充硬明膠的膠囊劑中的填充劑。
片劑可以通過壓制或模制、任選與一種或多種助劑一起壓制或模制來制備。壓制片劑可以使用以下物質(zhì)來制備粘合劑(例如明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如淀粉羥乙酸鈉或交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑?？梢酝ㄟ^使用惰性液態(tài)稀釋劑濕潤的粉狀抑制劑的混合物在合適的機器中塑型，制備模制片劑。
本發(fā)明藥用組合物的片劑和其它固體劑型例如糖錠劑、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可以任選用包衣劑和殼體(例如腸溶衣或制藥領(lǐng)域熟知的其它包衣劑)刻痕或包衣。也可以例如提供所需釋放分布型的不同比例的羥丙基甲基纖維素、其它聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球體，將其配制成提供緩慢釋放或控制釋放其中的活性成分。它們可以通過例如除菌濾器來過濾除菌，或者通過在無菌固體組合物形式中摻入殺菌劑，臨用前將該無菌固體組合物溶于無菌水或某些其它無菌注射用介質(zhì)中。這些組合物也可以任選含有遮光劑，并且可以為它們僅釋放所述活性成分或者優(yōu)先在胃腸道的某一部位(例如小腸或大腸)中釋放所述活性成分、任選以延遲方式釋放所述活性成分的組合物?？梢允褂玫陌窠M合物的實例包括聚合物和蠟。所述活性成分也可以為微囊化形式，適當時含有一種或多種上述賦形劑。
本發(fā)明化合物用于口服給藥的液體劑型包括藥學上可接受的乳劑、微乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑。所述液體劑型除含有所述活性成分，還可以含有本領(lǐng)域中常用的惰性稀釋劑例如水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油類(特別是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇、聚乙二醇和脫水山梨糖醇的脂肪酸酯以及它們的混合物。
除惰性稀釋劑外，所述口服組合物還可以包括輔料，例如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑、著色劑、芳香劑和防腐劑。
混懸劑除含有所述活性抑制劑外，還可以含有懸浮劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化(metahydroxide)鋁、膨潤土、瓊脂和西黃蓍膠以及它們的混合物。
可供直腸或陰道給藥用的本發(fā)明藥用組合物的制劑可以為栓劑，所述栓劑可以通過將一種或多種本發(fā)明化合物與一種或多種合適的非刺激性賦形劑或載體混合來制備，所述栓劑包含例如可可脂、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸酯，所述栓劑在室溫下為固體，但在體溫下為液體，因此，在直腸或陰道腔內(nèi)會熔化并釋放所述活性抑制劑。
適用于陰道給藥的本發(fā)明制劑適當時也包括含所述載體的子宮托、棉塞、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧劑，這是本領(lǐng)域已知的。
用于局部或透皮給予本發(fā)明化合物的劑型包括散劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、溶液劑、貼劑和吸入劑?？梢詫⑺龌钚曰衔锱c藥學上可接受的載體以及任何可能需要的防腐劑、緩沖劑或拋射劑在無菌條件下混合。
所述軟膏劑、糊劑、乳膏劑和凝膠劑除含有活性抑制劑外，還可以含有賦形劑例如動物和植物脂肪、油、蠟、石蠟、淀粉、西黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、硅酸、滑石粉和氧化鋅或它們的混合物。
散劑和噴霧劑除含有本發(fā)明化合物外，還可以含有賦形劑例如乳糖、滑石粉、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉末或這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑可另外還含有常用的拋射劑(例如含氯氟烴)和揮發(fā)性未取代烴(例如丁烷和丙烷)。
透皮貼劑具有提供給機體控制傳遞本發(fā)明化合物的附加優(yōu)點。這樣的劑型可以通過將本發(fā)明抑制劑溶于或分散在合適的介質(zhì)中來制備。也可以用吸收增強劑來增強所述藥物對皮膚的穿透性。這樣的穿透速率可以通過提供速率控制膜或本發(fā)明化合物在聚合物基質(zhì)或凝膠中分散來控制。
眼用制劑、眼膏劑、散劑、溶液劑等也考慮在本發(fā)明范圍內(nèi)。
適用于胃腸外給藥的本發(fā)明藥用組合物包含一種或多種本發(fā)明抑制劑以及一種或多種藥學上可接受的無菌等滲水性或非水性溶液劑、分散劑、懸浮劑或乳劑，或者臨用前可以在無菌注射用溶液或分散體中重建的無菌粉針劑，還可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、使所述制劑與計劃受體血液等滲的溶質(zhì)或懸浮劑或增稠劑。
可用于本發(fā)明藥用組合物中的合適水性和非水性載體的實例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它們的合適混合物、植物油(例如橄欖油)和注射用有機酯(例如油酸乙酯)?？梢岳缤ㄟ^使用包衣材料例如卵磷脂、就分散體而論保持所需粒徑以及使用表面活性劑，來維持適當?shù)牧鲃有浴?br> 這些組合物也可以含有輔料，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^包括各種抗細菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，來確保防止微生物的作用。在所述組合物中可能最好還包括等滲劑例如糖、氯化鈉等。另外，可以通過包括延遲吸收的試劑例如一硬脂酸鋁和明膠，來延長吸收所述注射藥物形式。
在某些情況下，為了延長抑制劑的治療效果，最好使皮下或肌內(nèi)注射的抑制劑緩慢吸收。通過使用水溶性差的晶形或非晶形材料的液體混懸劑，可以完成這一步。所述抑制劑的吸收速率則取決于其溶解率，后者則取決于晶體大小和晶形。另一方面，通過將所述抑制劑溶于或懸浮于油性溶媒中，可完成胃腸外給予的抑制劑形式的延遲吸收。
注射用貯庫(depot)形式通過使主題抑制劑在生物可降解聚合物例如聚交酯-聚乙醇酸交酯中形成微囊化基質(zhì)而制備。根據(jù)藥物與聚合物之比以及所用具體聚合物的性質(zhì)，可以控制藥物釋放的速率。其它生物可降解聚合物的實例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。貯庫注射制劑也可通過將所述藥物包封在與機體組織相容的脂質(zhì)體或微乳劑中來制備。
在某些實施方案中，將本文描述的化合物與其它治療劑例如其它的免疫抑制藥、觸發(fā)不需要的免疫應(yīng)答的因子或物質(zhì)(例如移植細胞)或與免疫抑制劑一起發(fā)揮作用以達到所需療效的藥物(例如抗炎藥)聯(lián)合給藥。例如，所述化合物和因子或物質(zhì)可以在一種組合物例如片劑中給藥、在不同的組合物中同時給藥或者在不同的組合物中在不同時間作為治療方案的一部分給藥等。
當本發(fā)明化合物作為藥物給予人類和動物時，它們可以照原樣給予或者作為含有例如0.1-99.5％(更優(yōu)選0.5-90％)的活性成分以及藥學上可接受的載體的藥用組合物給予。
本發(fā)明的制劑可以經(jīng)口、胃腸外、局部或直腸給予。它們當然通過適合于每種給藥途徑的形式給予。例如，它們以片劑或膠囊劑形式通過注射、吸入、洗眼劑、軟膏劑、栓劑等給予，通過注射、輸注或吸入給予；通過洗劑或軟膏劑局部給予；以及通過栓劑經(jīng)直腸給予。優(yōu)選口服給藥。
本文所用的短語“胃腸給藥”是指除腸內(nèi)給藥和局部給藥以外的給藥模式，通常通過注射給藥，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、被膜下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)和胸骨內(nèi)注射和輸注。
本文所用的短語“系統(tǒng)給藥”和“外周給藥”是指將化合物、藥物或其它物質(zhì)間接給予中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，致使其進入到患者的系統(tǒng)內(nèi)，因而經(jīng)過代謝和其它類似的過程，例如皮下給藥。
無論選擇何種給藥途徑，可以合適的水合形式使用可用于主題方法的抑制劑，和/或可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，將本發(fā)明藥用組合物配制成藥學上可接受的劑型。
本發(fā)明藥用組合物中活性成分的實際劑量水平可以根據(jù)具體患者、組合物和給藥模式而變化，以便獲得有效達到所需治療反應(yīng)(例如緩解類風濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化的癥狀)而對所述患者無毒的活性成分的量。
所選劑量水平將會取決于各種各樣的因素，包括所用的具體抑制劑或其酯、鹽或酰胺的活性、給藥途徑、給藥時間、待用具體化合物的排泄率、治療持續(xù)時間、結(jié)合所用的具體抑制劑一起使用的其它藥物、化合物和/或物質(zhì)、待治療患者的年齡、性別、體重、病癥、一般健康狀況和先前的藥物史以及藥學領(lǐng)域熟知的其它因素。
掌握本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)的主治醫(yī)師或獸醫(yī)可以容易地確定所需藥用組合物的有效量并開出處方。例如，主治醫(yī)師或獸醫(yī)可以開始以低于需要達到所需療效的水平給予所述藥用組合物中所用的本發(fā)明化合物，然后逐漸增加劑量直到達到所需的效果。
一般而言，有效抑制劑的合適日劑量(例如其EC50在1mM至納摩爾以下范圍內(nèi))必將是產(chǎn)生療效的最低有效劑量的化合物的劑量。一般而言，這樣的有效劑量將取決于上述因素?？偟膩碇v，對于患者，當用于指定效果時，本發(fā)明化合物的靜脈內(nèi)、腦室內(nèi)和皮下劑量范圍為每天每千克體重約0.0001mg至約1000mg，盡管優(yōu)選約0.5mg/kg至約300mg/kg。
如果需要，所述活性抑制劑的有效日劑量可以在一天內(nèi)、以適當?shù)拈g隔、任選在單位劑型內(nèi)，以獨立給予的2、3、4、5、6或更多個亞劑量給藥。
在一個優(yōu)選的實施方案中，將所述抑制劑配制成用于口服給藥，例如以固體片劑、丸劑、膠囊劑、膠囊形片劑等(在下文統(tǒng)稱為“片劑”)或水性溶液劑或混懸劑的形式。在所述抑制劑的片劑形式的一個優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選將所述片劑配制成在20片片劑中提供抑制劑的劑量，如果合起來看，將提供至少半數(shù)有效劑量(ED50)的劑量，例如至少50％的個體表現(xiàn)出療效的劑量。例如，對于抑制劑，療效將是MHC II類分子介導的T細胞活化被抑制的計數(shù)效應(yīng)(例如炎癥統(tǒng)計學顯著性減輕)。更優(yōu)選所述片劑的配制使得在10、5、2或1片片劑中提供的抑制劑的總劑量將給患者(人或非人類哺乳動物)提供至少ED50劑量。在其它實施方案中，在24小時內(nèi)攝取的20、10、5或2片片劑中提供的抑制劑的劑量將提供一種給藥方案，條件是抑制劑的平均血漿水平為至少ED50濃度(例如抑制MHC活性的最大效應(yīng)的50％的濃度)，盡管優(yōu)選小于100倍ED50，甚至更優(yōu)選小于10倍或5倍ED50。在優(yōu)選的實施方案中，一劑片劑(1-20片片劑)就可提供約0.25mg至1250mg抑制劑。
同樣，所述抑制劑可以配制用于胃腸外給藥，例如用于皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，例如所述抑制劑可以以無菌溶液劑或混懸劑(在下文統(tǒng)稱為“注射液”)提供。優(yōu)選所述注射液的配制使得在200cc大劑量注射液中提供的抑制劑劑量將提供至少半數(shù)有效劑量的劑量，盡管優(yōu)選小于100倍ED50，甚至更優(yōu)選小于10倍或5倍ED50。更優(yōu)選所述注射液的配制使得在100cc、50cc、25cc、10cc、5cc、2.5cc或1cc注射液中提供的抑制劑總劑量將給患者提供ED50劑量，優(yōu)選小于100倍ED50，甚至更優(yōu)選小于10倍或5倍ED50。在其它實施方案中，在24小時內(nèi)至少注射2次，在注射的總體積為100cc、50cc、25cc、5cc或2cc中提供的抑制劑劑量將提供一種給藥方案，條件是抑制劑的平均血漿水平為至少ED50濃度，盡管優(yōu)選小于100倍ED50，甚至更優(yōu)選小于10倍或5倍ED50。在優(yōu)選的實施方案中，一劑注射液提供約0.25mg至1250mg抑制劑。
對于連續(xù)靜脈內(nèi)注射例如滴注或推注，所述抑制劑可以在無菌稀釋溶液或混懸劑(在下文統(tǒng)稱為“靜脈內(nèi)注射液”)中提供。優(yōu)選所述靜脈內(nèi)注射液的配制使得在1升溶液中所提供的抑制劑劑量將提供一劑(如果在15分鐘或少于15分鐘內(nèi)給藥的話)的至少半數(shù)有效劑量，盡管優(yōu)選小于100倍ED50，甚至更優(yōu)選小于10倍或5倍ED50。更優(yōu)選靜脈內(nèi)注射液的配制使得在1升溶液中所提供的在60分鐘、90分鐘、120分鐘或240分鐘內(nèi)給予的抑制劑總劑量將給患者提供ED50劑量，盡管優(yōu)選小于100倍ED50，甚至更優(yōu)選小于10倍或5倍ED50。在優(yōu)選的實施方案中，單個靜脈內(nèi)“輸液袋”提供每升靜脈內(nèi)注射液約0.25mg至5000mg抑制劑，更優(yōu)選0.25mg至2500mg抑制劑，甚至更優(yōu)選0.25mg至1250mg抑制劑。
對于人，ED50劑量基于體重2Kg至125Kg，盡管更優(yōu)選對于成人，體重在50至125Kg的范圍內(nèi)。
可以采用本領(lǐng)域眾所周知的多種技術(shù)中的任一技術(shù)，例如上述技術(shù)，來評價潛在抑制劑的對任何抑制的ED50值，包括例如針對類風濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化的治療活性。
VI.主題抑制劑的組合合成本發(fā)明化合物、特別是具有各類代表性取代基的變異體的文庫適合于組合化學和其它平行合成方案(參見例如PCT WO 94/08051)。結(jié)果是例如采用本文中描述的一種測定，可以在高通量測定中對相關(guān)化合物的大文庫、例如對由上式I_或上式II_表示的化合物的花斑文庫(variegated library)進行快速篩選，以便鑒定出潛在的先導化合物以及改進先導化合物的特異性、毒性和/或細胞毒性-動力學分布型。
僅僅用以說明，對本發(fā)明而言，組合文庫是可以根據(jù)所需特性一起篩選的化學上相關(guān)化合物的混合物。在一個反應(yīng)中制備許多相關(guān)化合物大大減少和簡化了需要進行的多個篩選過程。可以通過常規(guī)方法對合適的物理性質(zhì)進行篩選。
可以在多個不同水平上創(chuàng)建文庫的多樣性。例如，組合反應(yīng)中所用的底物芳基就核心芳基部分而論可以是多樣化的、例如就環(huán)狀結(jié)構(gòu)而論的花斑，和/或可以隨其它取代基而變化。
在本領(lǐng)域可以利用各種各樣的技術(shù)來產(chǎn)生有機小分子例如本發(fā)明主題抑制劑的組合文庫。參見例如Blondelle等(1995)Trends Anal.Chem.1483；the Affymax的美國專利5,359,115和5,362,899theEllman的美國專利5,288,514the Still等的PCT公布號WO 94/08051；Chen等(1994)JACS 1162661Kerr等(1993)JACS 115252；PCT公布號WO92/10092、WO93/09668和WO91/07087；和the Lerner等的PCT公布號WO93/20242)。因此，可以合成本發(fā)明主題抑制劑數(shù)量級約100-1,000,000或更多的多樣化單體(diversomer)的種類繁多的文庫，并可以根據(jù)特定活性或特性進行篩選。
A)直接表征組合化學領(lǐng)域的發(fā)展方向是利用挖掘出質(zhì)譜法(MS)等技術(shù)的靈敏度，例如可以用來表征費摩爾量以下(sub-femtomolar amount)的化合物，及直接測定選自組合文庫的化合物的化學組成。例如，當文庫在不溶性支持體基質(zhì)上提供時，獨特的化合物群體可以首先從所述支持體中釋放出來，并通過MS表征。在其它實施方案中，作為MS樣品制備技術(shù)的一部分，諸如MALDI的MS技術(shù)可以用來從基質(zhì)中釋放出化合物，特別是在不穩(wěn)定鍵最初用來使所述化合物束縛在基質(zhì)上時。例如，選自文庫的珠可以在MALDI步驟中被照射，以便從基質(zhì)中釋放出多樣化單體，并使所述多樣化單體離子化，供MS分析用。
B)多針(Multipin)合成主題方法的文庫可以采取多針文庫形式。簡而言之，Geysen及其同事(Geysen等(1984)PNAS 813998-4002)提出了一種通過在按微量滴定板形式排列的聚丙烯酸門控的聚乙烯針上平行合成而產(chǎn)生化合物文庫的方法。Geysen技術(shù)采用多針法可以用來每周合成并篩選數(shù)千種化合物，所述束縛化合物可以在許多測定中重復(fù)使用。合適的接頭部分也可以附到所述針上，致使化合物可以在合成后從所述支持體上切割下來，用以評價純度和進一步進行評價(參見Bray等(1990)Tetrahedron Lett 315811-5814；Valerio等(1991)Anal Biochem197168-177；Bray等(1991)Tetrahedron Lett 326163-6166)。
C)分開-偶聯(lián)-重組法(Divide-Couple-Recombine)在又一個實施方案中，化合物的花斑文庫可以利用分開-偶聯(lián)-重組策略在一組珠上提供(參見例如Houghten(1985)PNAS 825131-5135；和美國專利4,631,211、5,440,016、5,480,971)。簡而言之，同其名稱所暗示的一樣，在其中將簡并性引入所述文庫的每個合成步驟中，將所述珠分成不同的組，組數(shù)與所述文庫的特定位置上加入的不同取代基數(shù)目相等，不同的取代基在不同的反應(yīng)中進行偶聯(lián)，將所述珠重新組合成一個庫(pool)，供下一個重復(fù)使用。
在一個實施方案中，可以采用與所謂的“茶袋(tea bag)”法類似的方法，進行所述分開-偶聯(lián)-重組策略，所述“茶袋”法首先由Houghten開發(fā)出來，在所述方法中化合物合成在裝入多孔聚丙烯袋內(nèi)并密封好的樹脂上進行(Houghten等(1986)PNAS 825131-5135)。通過將所述袋置入合適的反應(yīng)溶液中，使取代基與帶有化合物的樹脂進行偶聯(lián)，而所有共同步驟例如樹脂洗滌和脫保護都同時在一個反應(yīng)容器中進行。合成結(jié)束時，每個袋子都包含一種化合物。
D)空間可尋址平行化學合成化合物的身份通過其在合成基片上的位置給出的組合合成方案被稱為空間可尋址合成。在一個實施方案中，通過控制將化學試劑加入到固體支持體上的特定位置，進行組合過程。例如，本發(fā)明化合物(例如表1和表2中所示的那些化合物的類擬物)組合合成的優(yōu)選方法是EP0651762中介紹的SPOT技術(shù)，該技術(shù)的改進和應(yīng)用描述于WO 00/12575、WO 01/18545和Reinehe等2001(Current Opinions inBiotech 1259-64)中。通過應(yīng)用微通道創(chuàng)建候選化合物或變體化合物的組合陣列，例如WO 99/67024和WO 99/56878中介紹的組合陣列，提供了另一優(yōu)選的方法。
或者，可以通過光控合成產(chǎn)生空間可尋址形式的組合化學(Dower等(1991)Annu Rep Med Chem 26271-280；Fodor，S.P.A.(1991)Science251767；Pirrung等(1992)的美國專利第5,143,854號；Jacobs等(1994)Trends Biotechnol 1219-26)。光刻法的空間分辨率達到了微型化。該技術(shù)通過應(yīng)用與光不穩(wěn)定保護基的保護/脫保護反應(yīng)來實施。
該項技術(shù)的關(guān)鍵點在以下文獻中有說明Gallop等(1994)J MedChem 371233-1251。通過被光不穩(wěn)定硝基藜蘆基氧基羰基(NVOC)保護的氨基接頭或其它光不穩(wěn)定接頭的共價連接制備合成基片,以供偶聯(lián)。用光選擇性激活用于偶聯(lián)的合成支持體的特定區(qū)。通過光除去光不穩(wěn)定保護基(脫保護)導致所選區(qū)域的激活。激活后，一組氨基酸類似物的第一個，每個都在氨基末端帶有光不穩(wěn)定保護基，暴露于整個表面。偶聯(lián)只在前一步驟中通過光尋址的區(qū)域中發(fā)生。使反應(yīng)停止，洗滌各板，基片通過第二個掩膜，再次被照射，激活不同的區(qū)域，接著與第二個被保護單位的構(gòu)件單元反應(yīng)。掩膜的模式和反應(yīng)物的次序決定了產(chǎn)物及其位置。由于該過程利用光刻技術(shù)，因此可以合成的化合物數(shù)目僅受到可以用合適分辨率尋址的合成位點數(shù)目的限制?？蓽蚀_知道每個化合物的位置；因此可以直接評價化合物與其它分子的相互作用。
在光控化學合成中，產(chǎn)物取決于照射的模式和反應(yīng)物加入的次序。通過改變刻蝕模式，可以同時合成多組不同的試驗化合物；該特征導致產(chǎn)生許多不同的掩膜策略。
E)編碼的組合文庫在又一個實施方案中，主題方法利用提供有編碼標記系統(tǒng)的化合物文庫。從組合文庫中鑒定出活性化合物的最新改進利用化學指標化系統(tǒng)，所述化學指標化系統(tǒng)采用能獨特地編碼給定珠所經(jīng)歷的反應(yīng)步驟及經(jīng)推斷其攜帶的結(jié)構(gòu)的標志。從概念上講，該方法模擬了噬菌體展示文庫，在該文庫中，活性源自已表達的肽，但活性肽的結(jié)構(gòu)可從相應(yīng)基因組DNA序列推導出。合成組合文庫的第一個編碼形式應(yīng)用DNA作為密碼。多種其它形式的編碼已有報道，包括用可測序生物寡聚體(例如寡核苷酸和肽)的編碼和用另外的不可測序標志的雙元編碼。
1)用可測序生物寡聚體標記利用寡核苷酸編碼組合合成文庫的原理描述于1992年(Brenner等(1992)PNAS 895381-5383)，這樣的文庫的實例出現(xiàn)在第二年(Needles等(1993)PNAS 9010700-10704)。標稱77(＝823,543)肽的組合文庫由Arg、Gln、Phe、Lys、Val、D-Val和Thr(三字母氨基酸密碼)的所有組合組成，其中每個由特定的二核苷酸(分別為TA、TC、CT、AT、TT、CA和AC)編碼，該組合文庫通過固體支持體上肽和寡核苷酸合成的連續(xù)交替循環(huán)來制備。在該項工作中，使珠上的胺連接官能團對肽或寡核苷酸合成特異性分化，這通過將珠與產(chǎn)生被保護OH基團(用于寡核苷酸合成)和被保護NH2基團(用于肽合成)(在此，比率為1∶20)的試劑一起預(yù)保溫來實現(xiàn)。當完成時，各標志分別由69聚體組成，其中14個單元攜帶密碼。將珠結(jié)合的文庫與熒光標記的抗體一起保溫，通過熒光激活細胞分選儀(FACS)收獲發(fā)強熒光的含結(jié)合抗體的珠。DNA標志通過PCR擴增并進行測序，然后合成預(yù)測肽。按照這樣的技術(shù)，可以將化合物文庫用于主題方法中，其中所述標志的寡核苷酸序列鑒定出特定珠所經(jīng)歷的序貫組合反應(yīng)，因此，提供珠上化合物的身份。
寡核苷酸標志的應(yīng)用使得可以精巧而靈敏地進行標記分析。雖然如此，所述方法要求對改變標志和文庫成員的交替同合成所需的保護基正交組進行小心的選擇。此外，標志、特別是磷酸酯和糖端基異構(gòu)連接的化學不穩(wěn)定性，可以限制對可用于非寡聚體文庫合成的試劑和條件的選擇。在優(yōu)選的實施方案中，所述文庫利用允許試驗化合物文庫成員的選擇性分離以供測定的接頭。
也可用肽作為組合文庫的標記分子。兩種示例性的方法在本領(lǐng)域已有描述，它們兩者均應(yīng)用于固相上，分支接頭在固相上交替制作編碼鏈和配體鏈。在第一種方法(Kerr等(1993)JACS 1152529-2531)中，合成的正交性通過應(yīng)用對編碼鏈的酸不穩(wěn)定保護以及對化合物鏈的堿不穩(wěn)定保護而實現(xiàn)。
在一個替代方法(Nikolaiev等(1993)Pept Res 6161-170)中，使用分支接頭，使得編碼單位和試驗化合物兩者都與樹脂上的同一官能團連接。在一個實施方案中，可切割基團可位于分支點和珠之間，致使切割釋放既含有密碼又含有化合物的分子(Ptek等(1991)Tetrahedron Lett 32389l-3894)。在另一個實施方案中，可以這樣放置可切割基團，使得試驗化合物可以從珠中選擇性分離出來，而留下所述密碼。這最后的構(gòu)建體特別有價值，因為它允許篩選試驗化合物而不潛在干擾編碼基團。肽文庫成員及其相應(yīng)標志的獨立切割和測序的現(xiàn)有技術(shù)實例已證實，所述標志可以準確預(yù)測肽結(jié)構(gòu)。
2)不可測序標記雙元編碼編碼試驗化合物文庫的替代形式利用一組用作雙元密碼的不可測序electrophoric標記分子(Ohlmeyer等(1993)PNAS 9010922-10926)。示例性的標志是可通過電子俘獲氣相色譜法(ECGC)、用其三甲基甲硅烷基醚以低于費摩爾水平檢測的鹵代芳族烷基醚。烷基鏈長度的改變以及芳族鹵取代基的性質(zhì)和位置，允許合成至少40個這樣的標志，理論上可編碼240(例如超過1012)個不同的分子。在原始報告(Ohlmeyer等，參見上文)中，所述標志與肽文庫中約1％的可利用胺基通過可光解鄰硝基芐基接頭結(jié)合在一起。該方法當制備肽樣或其它含胺分子的組合文庫時是合理而可行的。然而，已開發(fā)出一個更多用處的系統(tǒng)，使得可以編碼基本上任何組合文庫。在此，所述化合物通過可光解接頭與固體支持體連接，而標志通過插入到珠基質(zhì)中的碳烯而與兒茶酚醚接頭連接(Nestler等(1994)J Org Chem594723-4724)。這種正交連接策略允許選擇性分離用于在溶液中供測定用的文庫成員，隨后在各組標志的氧化性分離后通過ECGC解碼。
雖然現(xiàn)有技術(shù)中若干酰胺連接的文庫利用具有與胺基連接的electrophoric標志的雙元編碼，但使這些標志直接與珠基質(zhì)連接，提供可以在所編碼的組合文庫中制備的結(jié)構(gòu)的多得多的多用途。以這種方式進行連接，所述標志及其接頭幾乎同珠基質(zhì)本身一樣是無反應(yīng)性的。兩種雙元編碼的組合文庫已有報道，其中electrophoric標志直接與固相連接(Ohlmeyer等(1995)PNAS 926027-6031)，從而為產(chǎn)生主題化合物文庫提供了指導。這兩種文庫均采用正交連接策略來構(gòu)建，其中文庫成員通過光不穩(wěn)定接頭與固體支持體連接，標志與僅可通過劇烈氧化切割接頭連接。因為所述文庫成員可以從固體支持體中重復(fù)地光洗脫，所述文庫成員可以用于多項測定中。連續(xù)光洗脫也允許極高通量的重復(fù)篩選策略第一，將多個珠置于96孔微量滴定板中；第二，使化合物部分分離，然后轉(zhuǎn)移到測定板中；第三，金屬結(jié)合測定鑒定出活性孔；第四，相應(yīng)的珠僅僅進行重排成新的微量滴定板；第五，鑒定單活性化合物；第六，對結(jié)構(gòu)進行解碼。
可以采用諸如上面描述的技術(shù)合成本發(fā)明的肽模擬化合物，以提供大的高度多樣化的候選抑制劑文庫，因為本發(fā)明化合物可以容易地通過在溫和條件下連續(xù)形成一系列碳-雜原子鍵例如酰胺鍵或脲鍵來制備。因此，根據(jù)一組不連續(xù)的亞單元例如氨基酸和摻入了二環(huán)芳基-1，2-二氮雜環(huán)己烷亞單元的亞單元，可以快速容易地合成這些亞單元的各種組合和排列，并且對其生物學活性進行測試。
實施例部分現(xiàn)在，參照以下用于具體敘述優(yōu)選實施方案的實施例，說明本發(fā)明。然而，應(yīng)注意到，這些實施方案是說明性的，并且不應(yīng)認為是以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1肽模擬化合物的制備通過采用標準固相肽化學(R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154(1963)，G.Barany，R.B.Merrifield in The Peptides，第2卷(E.Gross，J.Meienhofer主編)1-284(Academic，New York；1980))，在肽合成儀(ACT90，Advanced ChemTech)中裝配各構(gòu)件單元來制備肽模擬化合物，并且通過高效液相色譜(HPLC)純化。
HPLC在Vision色譜儀(PerSeptive Biosystems)上進行。分析型HPLC使用waters μBondapak C18柱(0.46×25cm，5μ或0.39×30cm，10μ)或Nucleosil C18柱(0.46×25cm，5μ或0.4×30cm，10μ)以反相模式進行，這兩種柱均得自CS-Chromatographie Service，Langerwehe，德國。制備型HPLC使用waters μBondapak C18柱(1.9×30cm，10μ)或Nucleosil C18柱(2.0×30cm，10μ)以反相模式進行，這兩種柱均得自CS-Chromatographie Service。快速色譜在Merck Kieselgel 60(0.063-0.200mm，商品號1.07734，Merck Darmstadt，德國)上進行。T.L.C.在在鋁片Silica gel 60 F254(商品號1.05554，Merck Darmstadt，德國)上進行。1H-NMR-譜采用四甲基硅烷作為內(nèi)標在200MHz處測定，并用相對于四甲基硅烷的化學位移(δ)值的百萬分之一表示，并如下指定s＝單峰；m＝多重峰；d＝雙重峰；t＝三重峰；q＝四重峰，sp＝七重峰，br＝寬峰。
使用以下縮寫B(tài)oc＝叔丁氧羰基，F(xiàn)moc＝9-芴基甲氧羰基，Acm＝乙酰氨基甲基，Prm＝丙酰氨基甲基，DCM＝二氯甲烷；DMF＝N，N-二甲基甲酰胺，DMAP＝4-二甲氨基吡啶，HOBt＝1-羥基苯并三唑；DIC＝二異丙基碳二亞胺，TBTU＝2-(1-H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基四氟硼酸脲鎓，THF＝四氫呋喃，DIPEA＝二異丙基乙胺，TFA＝三氟乙酸，Me＝甲基，Ac＝乙?；?，tBu＝叔丁基，Bn＝芐基，Ph＝苯基，h＝小時，min＝分鐘，aq.＝水溶液，r.t.＝室溫(18-26℃)，Pmc＝2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；琍yBOP＝六氟合磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基-鏻，Z＝芐氧羰基，EDCI＝1-乙基-3(3′-二甲氨基丙基)碳二亞胺，DBU＝1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯，Cit＝(L)瓜氨?；?，Cha＝(L)-環(huán)己基丙氨酰基，Gpg＝(L)-N-脒基-4-哌啶基甘氨?；?，βPhPro＝2-(S)-3-(R)-3-苯基脯氨?；?，Tic＝(L)-四氫異喹啉-3-羰基，azaTic＝3，4-二氫-1H-酞嗪-2-羰基，Disc＝(D，L)1，2-二氫-2H-異吲哚羰基，Thiq＝(L)-四氫異喹啉-1-羰基，Hbc＝(D，L)-2，3，4，5-四氫-1H-苯并[d]吖庚因-2-羰基，Haic＝(2S，5S)-5-氨基-1，2，3，4，5，6，7-六氫-吖庚因并[3，2，1-h，i]吲哚-4-酮-2-羰基，Odapdc＝(1S，9S)-9-氨基八氫-6，10-二氧代-6H-噠嗪并-[1，2-a][1，2]二氮雜庚因-1-羰基，[SΨ(oxaz)L]＝S-L的噁唑模擬物，[SΨ(imid)L]＝S-L的咪唑模擬物，A＝Ala＝(L)-丙氨?；?，R＝Arg＝(L)-精氨酰基，C＝Cys＝(L)-半胱氨?；現(xiàn)＝Phe＝(L)-苯丙氨?；琕＝Val＝(L)-纈氨?；琈et＝(L)-甲硫氨?；琋le＝(L)-正亮氨?；?，S＝Ser＝(L)-絲氨?；?，L＝Leu＝(L)-亮氨?；琣lle＝(L)-別異亮氨?；琋va＝(L)-正纈氨?；?，Pya＝(L)-吡啶基丙氨?；?，Om＝(L)-鳥氨?；珻hg＝(L)-環(huán)己基甘氨?；?，Hfe＝(L)-高苯丙氨?；?，Thi＝(L)-2-噻吩基丙氨酰基，Coa＝(L)-環(huán)辛基丙氨?；?，Nba＝(L)-降冰片基丙氨?；?br> 按照文獻方法(J.Barbiere，Bull.Soc.Chim.Fr.5，7，1940，621)，從2-苯乙基氯和乙醇胺制備N-(2-苯乙基)乙醇胺。市售的Fmoc氨基酸、HOBt、TBTU和PyBOP購自Advanced ChemTech，Novabiochem，Bachem，Neosystems或RSP Amino Acid Analogsues。所有其它化學藥品和溶劑都購自Merck Darmstadt或Sigma-Aldrich-Fluka，并且無需進一步純化就可直接使用。DMF經(jīng)分子篩4干燥至少4周，與酸性氧化鋁一起攪拌20分鐘以除去痕量的胺，然后臨用前通過0.2μm濾器過濾。
表1(a、b和c)列出了本發(fā)明示例性的某些式I和式II化合物。表2列出了采用本文中描述的各項測定檢測其免疫調(diào)節(jié)特性及其它特性的其它化合物。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在讀完本發(fā)明說明書后，較表1中敘述的七聚體短的肽模擬物可用于某些應(yīng)用中。因此，較短的肽模擬物也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這些較短的肽的優(yōu)選長度是四聚體或五聚體。
實施例2Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[SΨ(oxaz)L] NMe2(P53)的制備2.1Fmoc-βPhPro-OH的制備
將44.61g N-乙酰-反式-3(R)-苯基-(S)-脯氨酸-1-(S)-苯乙酰胺(J.Y.L.Chung，J.T.Wasicak，W.A.Arnold，C.S.May，A.N.Nadzan，M.W.Holladay，J.Org.Chem.1990，55，270-275)溶于730ml 8N HCl和360ml乙酸中。將所得溶液加熱至140℃達16小時。冷卻至室溫后，將該溶液蒸發(fā)至干。將殘余物溶于1000ml水中。水溶液用乙酸乙酯(3×200ml)洗滌，減壓濃縮至終體積為300ml。加入400ml 10％Na2CO3水溶液，水層用乙酸乙酯(4×200ml)洗滌。加入200ml 10％Na2CO3水溶液，將所得溶液冷卻至0℃。在1.5小時內(nèi)，滴加51.22 gFmocCl的300ml二噁烷溶液，將所得懸浮液在室溫下攪拌18小時。通過傾析除去沉淀。水溶液用乙醚(1×200ml)洗滌，用1N HCl酸化至pH3，然后用DCM(2×300ml)萃取。將所得沉淀溶于乙酸乙酯中。所得溶液用飽和NaHCO3水溶液萃取。水層用濃鹽酸酸化至pH3，然后用DCM萃取。合并的DCM層經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)至干。使殘余物預(yù)吸收到硅膠上并用快速色譜純化(用乙酸乙酯/己烷/乙酸150∶50∶1作為洗脫液)。將含有所需產(chǎn)物的流分(經(jīng)T.L.C.檢查)合并并蒸發(fā)。所得殘余物從CHCl3/己烷1∶2中重結(jié)晶，所獲得的總收率為24.92g(55％)。
1H-NMR(CDCl3)1.95-2.15(m，1H，F(xiàn)mocNCH2CHH)，2.24-2.47(m，1H，F(xiàn)mocNCH2CHH)，3.43-3.85(m，3H)，4.06-4.58(m，4H)，6.2(br s，1H，COOH)7.11-7.82(m，13H，arom.Hs)。
2.2 H[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe2的制備2.2.1二肽I的制備
在-5℃，將10.0g N-(二苯基亞甲基)甘氨酸甲酯(M.J.O′Donnell，R.L.Polt，J.Org.Chem.1982，47，2663-2666)加入到4.87g KOtBu的100ml無水THF溶液中，將所得溶液于0℃攪拌15分鐘。在3.5小時內(nèi)，將該溶液于-78℃加入到7.1ml異丁酰氯的300ml無水THF溶液中。加入完成后，讓所得橙色反應(yīng)混合物升至室溫。所得黃色溶液用200ml 1N HCl處理，然后將混合物在室溫下攪拌15分鐘。減壓蒸發(fā)有機溶劑。水層用乙酸乙酯(4×100ml)洗滌并蒸發(fā)至干，得到10.2g殘余物。
在Ar氣氛下，將11.66g Z-Ser(tBu)OH溶于200ml無水THF中，然后將溶液冷卻至-18℃。加入5.48ml三乙胺，接著加入5.2ml氯甲酸異丁酯。將所得懸浮液在-18℃攪拌15分鐘。加入上述殘余物，在1小時內(nèi)滴加5.48ml三乙胺的80ml無水THF溶液。加入完成后，將所得懸浮液在-18℃再攪拌1.5小時，然后讓其升至室溫。加入飽和NaCl水溶液(200ml)，將混合物攪拌15分鐘。分離水層，然后用乙醚(3×100ml)萃取。合并的有機層用pH7磷酸鹽緩沖液(1×50ml)洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)至干。殘余物用快速色譜純化(用乙酸乙酯/己烷(1∶3→1∶2)作為洗脫液)，得到14.4g(84％)的所需化合物，為非對映體的混合物。
1H-NMR(CDCl3)1.09-1.28(m 15H，CHMe2，tBu)，3.05(sp，1H，CHMe2)，3.38-3.45(m，1H，CHHOtBu)，3.78，3.79(2s，3H，OMe)，3.75-3.88(br s，1H，CHHOtBu)，5.05-5.18(m，2H，CH2Ph)，5.38(d，J＝6.8Hz，1H，COCHCO)，5.70(br s，1H，氨基甲酸酯-NH)，7.25-7.42(m，5H，Ph)，7.95(br s，1H，酰胺-NH)。
2.2.2 Z[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]OMe的制備 將55.0g氧化三苯基膦和31.3mlDBU于0℃加入到30.5g二肽I的38ml無水四氯化碳、38ml無水乙腈和38ml無水吡啶溶液中。將所得混合物在室溫下攪拌20小時。減壓除去溶劑，殘余物與甲苯(4×150ml)一起共蒸發(fā)。將所得殘余物溶于900ml DCM中。所得溶液用5％KHSO4水溶液(5×200ml)和pH7磷酸鹽緩沖液(2×150ml)洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)至干。將殘余物溶于450ml乙酸乙酯中，將所得懸浮液超聲處理并過濾。濃縮濾液至終體積為100ml。加入300ml己烷，將所得懸浮液再次超聲處理并過濾。將濾液蒸發(fā)至干，殘余物用快速色譜純化(用乙酸乙酯/己烷(1∶3)作為洗脫液)，得到24.7g(85％)為淡黃色油狀物的標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)1.07(s，9H，tBu)，1.23-1.28(m，6H，CHMe2)，3.64(dd，J＝，1H，4.0，9.2Hz，1H，CHHOtBu)，3.68-3.85(m，2H，CHMe2，CHHOtBu)，3.90(s，3H，OMe)，5.00-5.11(br m，1H，CHNHCO)，5.13(s，2H，CH2Ph)，5.79(brd，J＝7.4Hz，1H，NH)，7.25-7.41(m，5H，Ph)。
2.2.3 Z[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe2的制備
將24.71g Z[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]OMe溶于200ml甲醇中，然后將溶液冷卻至0℃。在35分鐘內(nèi)滴加1.84g LiOH的80ml水溶液。將混合物于0℃攪拌1.5小時，然后在室溫下攪拌16小時。所得溶液用1N HCl中和，減壓蒸發(fā)甲醇。所得水溶液用1N HCl酸化至pH4，然后用DCM(4×100ml)萃取。合并的有機層經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)。將殘余物溶于250ml無水DMF中，然后將所得溶液冷卻至0℃。依次加入11.3g HOBt、14.1g EDCI、7.6ml三乙胺、13.8g二甲胺鹽酸鹽和15.7ml三乙胺，將所得混合物在室溫下攪拌17小時。減壓蒸發(fā)溶液，所得殘余物與甲苯(1×100ml)一起共蒸發(fā)。將殘余物溶于400ml乙酸乙酯中，將所得懸浮液過濾，濾液用5％KHSO4水溶液(3×100ml)、飽和NaHCO3水溶液(2×100ml)和pH7磷酸鹽緩沖液(2×100ml)洗滌。有機層經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)。殘余物用快速色譜純化(用乙酸乙酯/己烷(2∶3)作為洗脫液)，得到23.3g(92％)油狀標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)1.07(s，9H，tBu)，1.22-1.26(m，6H，CHMe2)，3.03，3.18(2s，2×3H，NMe2)，3.51(sp，J＝7.0Hz，1H，CHMe2)，3.65(dd，J＝4.0，8.8Fz，1H，CHHOtBu)，3.78(br m，1H，CHHOtBu)，4.98-5.09(br m，1H，CHNHCO)，5.10-5.21(m，2H，CH2Ph)，5.70(br d，J＝7.3Hz，1H，NH)，7.21-7.45(m，5H，Ph)。
2.2.4 H[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe2的制備
在氫氣氛下，將23.3g Z[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe2的100ml乙醇溶液加入到2.35g Pd/C(10％)懸浮液中，所得混合物在室溫下攪拌18小時。懸浮液通過Celite過濾，將濾液蒸發(fā)至干，得到14.5g(90％)標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)1.15(s，9H，tBu)，1.27(d，J＝7.0Hz，6H，CHMe2)，2.04(s，2H，NH2)，3.04，3.23(2s，2×3H，NMe2)，3.50(sp，J＝7.0Hz，1H，CHMe2)，3.60(dd，J＝6.5，8.8Hz，1H，CHHOtBu)，3.69(dd，J＝4.4，8.8Hz，1H，CHHOtBu)，4.14(dd，J＝4.4，6.5Hz，1H，CHNH2)。
2.3 HβPhPro-2-氯三苯甲基樹脂的制備將7.4g Fmoc-βPhPro-OH的120ml無水DCM溶液加入到12.0g2-氯三苯甲基氯樹脂(0.83mmol/g，Novabiochem)中。加入DIPEA(3.0ml)，將混合物振蕩10分鐘。再加入4.5ml DIPEA，繼續(xù)振蕩145分鐘。加入甲醇(10ml)，將混合物再振蕩25分鐘。濾出樹脂，依次用DCM(5×100ml)、甲醇(2×100ml)和DCM(4×100ml)洗滌。將小樣本小心地干燥并用DCM/哌啶(1∶1)脫保護30分鐘。用光度法測定所得Fmoc-哌啶加合物(在301nm的吸收)，得到0.54mmol/g樹脂填料。剩余的樹脂用100ml DCM和80ml哌啶在室溫下處理160分鐘，用DCM(10×100ml)和乙醚(4×80ml)洗滌，然后真空干燥，得到14.37g HβPhPro-2-氯三苯甲基樹脂。
2.4.Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe2(P53)的制備從HβPhPro-2-氯三苯甲基氯樹脂(2416mg，1.3mmol)開始，在底部裝有玻璃料(frit)的50ml反應(yīng)容器(Advanced ChemTech ACT90)中，通過Fmoc固相合成制備肽模擬物(peptididomimetic)。
通過用DMF(4×1min)處理樹脂，進行樹脂溶脹。用20％哌啶的DMF溶液(1×3min，1×7min，各20ml)使樹脂脫保護，隨后用DMF(10×20ml)洗滌。通過加入FmocNleOH(1380mg，3.9mmol)、DMF(8.2ml)、HOBt(600mg，3.9mmol)和DIC(0.61ml，3.9mmol)，進行?；磻?yīng)。讓該偶聯(lián)進行18小時，用DMF(7×20ml)洗滌。采用Chloranil試驗(J.Blake，C.H.Li，Int.J.Peptide Protein Res.，1975，7，495)，取一小部分檢查?；磻?yīng)的完成情況。使用乙酸酐(2M)和DMAP(0.1M)的DMF溶液(20ml，1×10min)給樹脂封端，隨后用DMF(12×20ml)洗滌。樹脂如上進行脫保護、洗滌、封端和洗滌，然后用FmocTicOH(1.56g，3.9mmol)、TBTU(1.26g，3.9mmol)和DIPEA(0.71ml，4.16mmol)在8ml DMF中偶聯(lián)75分鐘。
樹脂如上進行脫保護、洗滌、封端和洗滌，用FmocGpg(Pmc)OH(1.35g，1.95mmol)、HOBt(0.3g，1.95mmol)和DIC(0.305ml，1.95mmol)在7ml DMF中偶聯(lián)16小時。
樹脂如上進行脫保護、洗滌、封端和洗滌，用FmocChaOH(1.54g，3.9mmol)、HOBt(0.6g，3.9mmol)和DIC(0.61ml，3.9mmol)在8mlDMF中偶聯(lián)3小時。
如上進行脫保護和洗滌，用乙酸酐(2M)和DMAP(0.1M)在20mlDMF中處理3×20分鐘，進行封端。樹脂用DMF(12×20ml)、MeOH(3×50ml)、Et2O(3×40ml)洗滌，然后真空干燥。
樹脂用33ml DCM/三氟乙醇/乙酸(8∶1∶1)在室溫下處理45分鐘，過濾，然后用65ml DCM/三氟乙醇/乙酸(8∶1∶1)和100ml DCM洗滌。向濾液中加入250ml正己烷，將所得懸浮液蒸發(fā)至干，殘余物與正己烷(3×100ml)一起共蒸發(fā)，得到1.188g粗制Ac-Cha-Gpg(Pmc)-Tic-Nle-βPhPro-OH。將殘余物溶于5ml無水DMF中并冷卻至0℃。加入332mg HOBt、642mg H[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe2和415mg EDCI后，將所得溶液于0℃攪拌1.5小時，然后在室溫下再攪拌16小時。減壓除去溶劑，將殘余物溶于80ml乙酸乙酯中。所得溶液用5％KHSO4水溶液(1×40ml)、飽和NaHCO3水溶液和pH7磷酸鹽緩沖液洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)至干。殘余物用20ml TFA/水/茴香硫醚/1，2-乙二硫醇/三乙基硅烷(85.5∶5∶5∶2.5∶2)在室溫下處理3.7小時。通過向溶液中加入550ml冷凍乙醚使產(chǎn)物沉淀。懸浮液以3300rpm離心10分鐘，棄去上清液，將沉淀重懸于冷凍乙醚中，再次離心，再一次棄去上清液。將沉淀溶于乙腈和0.1％TFA水溶液中。減壓蒸發(fā)有機溶劑，將水溶液冷凍干燥。粗產(chǎn)物(931mg)用HPLC純化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)，得到584mg純的Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe2x TFA。產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜法表征，MALDI-TOF MS∶M/Z＝1064.57，(MH+)，1102.53(MK+)。
實施例3Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe2(P51)的制備所述肽模擬物采用與實施例2.4描述的同樣方法來制備，只是在固相合成期間，在更小規(guī)模上，使用更少的樹脂、25ml反應(yīng)容器和7ml溶劑部分進行溶脹、洗滌、封端、脫保護和偶聯(lián)。使用FmocNleOH、HOBt、DIC(各3當量)在βPhPro上偶聯(lián)16小時，使用FmocTicOH(3當量)、TBTU(3當量)和DIPEA(3.2當量)在Nle上偶聯(lián)1.5小時，使用FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3當量)在Tic上偶聯(lián)16小時，使用FmocChaOH、HOBt、DIC(各3當量)在Arg上偶聯(lián)3小時。使用H[S(OtBu)Ψ(oxaz)L]NMe2(2當量)、PyBOP(2當量)和4-甲基嗎啉(4當量)在DMF中于0℃進行溶液偶聯(lián)1小時，然后在室溫下進行溶液偶聯(lián)16小時。將所得混合物蒸發(fā)至干，殘余物用TFA/水/茴香硫醚/1，2-乙二硫醇/三乙基硅烷(85.5∶5∶5∶2.5∶2)在室溫下處理3.5小時。通過加入200ml冷凍乙醚使產(chǎn)物沉淀。將懸浮液在0℃保持1小時，然后按照實施例2.4所述方法進行處理。粗產(chǎn)物用HPLC純化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)。MALDI-TOF MSM/Z＝1038.70(MH+)，1060.36(MNa+)，1076.61(MK+)。
實施例4Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe2(P33)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe2(P60)的制備肽模擬物P33(Arg)按照實施例3所述方法來制備，只是樹脂在偶聯(lián)步驟1中用FmocMetOH代替FmocNleOH進行偶聯(lián)。MALDI-TOFMSM/Z＝1057.00(MH+)，1079.01(MNa+)，1094.98(MK+)。
肽模擬物P60(Gpg)按照實施例3所述方法來制備，只是樹脂在偶聯(lián)步驟1中用FmocMetOH代替FmocNleOH進行偶聯(lián)，而在偶聯(lián)步驟3中用FmocGpg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各1.5當量)代替FmocArg(Pmc)OH、HOBt和DIC(各3當量)進行偶聯(lián)。MALDI-TOF MSM/Z＝1082.54(MH+)，1120.51(MK+)。
實施例5Ac-Cha-Arg-Tic-Met(O)-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe2(P43)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Met(O)-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe2(P47)的制備肽模擬物P43(Arg)按照實施例3所述方法來制備，只是樹脂在偶聯(lián)步驟1中用FmocMet(O)OH代替FmocNleOH進行偶聯(lián)。MALDI-TOF MSM/Z＝1072.57(MH+)。
肽模擬物P47(Gpg)按照實施例3所述方法來制備，只是樹脂在偶聯(lián)步驟1中用FmocMet(O)OH代替FmocNleOH進行偶聯(lián)，而在偶聯(lián)步驟3用FmocGpg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各1.5當量)代替FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3當量)進行偶聯(lián)。MALDI-TOF MSM/Z＝1098.73(MH+)，1120.70(MNa+)，1136.68(MK+)。
實施例6Ac-Cha-Arg-Disc-Met-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe2(P40)和Ac-Cha-Gpg-Disc-Met-βPhPro-[SΨ(oxaz)L]NMe2(P41)的制備肽模擬物P40(Arg)按照實施例4中P33的所述方法來制備，只是樹脂在偶聯(lián)步驟2中用外消旋FmocDiscOH代替FmocTicOH進行偶聯(lián)。所獲得的兩種非對映體在最后的HPLC步驟中使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度進行分離。分離出每種立體異構(gòu)體，或者以“快”流分(化合物名稱中的后綴-1)表示，或者以“慢”流分(化合物名稱中的后綴-2)表示，在后續(xù)生物學測定中分別對其進行測試。MALDI-TOFMS(P40-1)M/Z＝1042.67(MH+)，1058.66(MNa+)，1080.63(MK+)。MALDI-TOF MS(P40-2)M/Z＝1042.69(MH+)，1058.66(MNa+)，1080.62(MK+)。
肽模擬物P41(Gpg)按照實施例4中P60的所述方法來制備，只是樹脂在偶聯(lián)步驟2中用外消旋FmocDiscOH代替FmocTicOH進行偶聯(lián)。所獲得的兩種非對映體在最后的HPLC步驟中使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度進行分離。分離出每種立體異構(gòu)體，或者以“快”流分(化合物名稱中的后綴-1)表示，或者以“慢”流分(化合物名稱中的后綴-2)表示，在后續(xù)生物學測定中分別對其進行測試。
MALDI-TaOF MS(P41-1)M/Z＝1068.43(MH+)，1106.38(MK+)。MALDI-TOF MS(P41-2)M/Z＝1068.42(MH+)，1106.36(MK+)。
實施例7Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-NHCH2CH2Ph(P69)和Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-NHCH2CH2Ph(P82)的制備7.1 HNle-2-氯三苯甲基樹脂的制備樹脂采用與實施例2步驟2.3中描述的同樣方法來制備，從FmocNleOH(4.37g)和2-氯三苯甲基氯樹脂(7.45g，0.83mmol/g，Novabiochem)開始，得到7.77g HNle-2-氯三苯甲基樹脂(填料0.50mmol/g)。
7.2 Ac-Cha-Gpg(Pmc)-Tic-Nle-OH的制備肽模擬物采用與實施例1.4描述的同樣方法來制備，即通過脫保護和偶聯(lián)，使用HNle-2-氯三苯甲基樹脂(2.52g)。使用TBTU(1.09g，1.35mmol)、DIPEA(0.62ml，1.44mmol)和FmocTicOH(1.36g，1.35mmol)，在7ml DMF中，偶聯(lián)時間為2.5小時，在Nle上進行偶聯(lián)。使用FmocGpg(Pmc)OH(1.17g，0.68mmol)、HOBt(0.26g，0.68mmol)和DIC(0.27ml，0.68mmol)，在6ml DMF中，在17小時內(nèi)，在Tic上進行偶聯(lián)，而使用FmocChaOH(1.34g，1.35mmol)、HOBt(0.52g，1.35mmol)和DIC(0.53ml，1.35mmol)，在6ml DMF中，在2.5小時內(nèi)，在Gpg上進行偶聯(lián)。分別按照Kaiser試驗或Chloroanil試驗(E.Kaiser等(1970)Anal.Biochem.34，595；J.Blake，C.H.Li，Int.J.PeptideProtein Res.，1975，7，495)，檢查偶聯(lián)的完成情況。最后的乙酰化反應(yīng)、樹脂切割和蒸發(fā)(與實施例1.4類似)后，分離出1.59g粗制Ac-Cha-Gpg(Pmc)-Tic-Nle-OH。
7.3 Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-NHCH2CH2Ph(P69)的制備在0℃，Ac-Cha-Gpg(Pmc)-Tic-Nle-OH(730mg，0.78mmol)的5ml無水DMF溶液用HOBt(239mg，1.56mmol)、PyBOP(812mg，1.56mmol)和2-苯乙胺(0.45ml，3.65mmol)處理。將反應(yīng)物在0℃攪拌1.5小時，然后在室溫下攪拌13小時。減壓蒸發(fā)溶劑，殘余物用10ml TFA/水/茴香硫醚/1，2-乙二硫醇/三乙基硅烷(85.5∶5∶5∶2.5∶2)在室溫下處理4小時。通過向溶液中加入500ml冷凍乙醚使產(chǎn)物沉淀。懸浮液以3300rpm離心10分鐘，棄去上清液，將沉淀重懸于冷凍乙醚中，再次離心，再一次棄去上清液。將沉淀溶于乙腈和0.1％TFA水溶液中。減壓蒸發(fā)有機溶劑，將水溶液冷凍干燥。粗產(chǎn)物(767mg)用HPLC純化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)，得到256mg純的Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-NHCH2CH2Ph。產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜法表征，MALDI-TOF MSM/Z＝771.310，(MH+)，793.286(MNa+)，809.257(MK+)。
肽模擬物P82采用與實施例3描述的同樣方法來制備，只是使用HNle-2-氯三苯甲基樹脂(實施例7.1)代替HβPhPro-2-氯三苯甲基氯樹脂。使用FmocTicOH(3當量)、TBTU(3當量)和DIPEA(3.2當量)在Nle上偶聯(lián)1.5小時，使用FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3當量)在Tic上偶聯(lián)14小時，用FmocChaOH、HOBt、DIC(各3當量)在Arg上偶聯(lián)3小時。使用N-(2-苯乙基)胺(4當量)、HOBt(2當量)和PyBOP(2當量)，在DMF中，于0℃進行溶液偶聯(lián)1小時，然后在室溫下偶聯(lián)15小時。所得混合物按照實施例3所述方法進行處理。粗產(chǎn)物用HPLC純化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)。MALDI-TOFMSM/Z＝745.61(MH+)，767.56(MNa+)。
實施例8Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-N(Me)Bn(P71)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(Me)Bn(P74)的制備肽模擬物P71(Gpg)按照實施例7中P82的方法來制備，只是使粗制Ac-Cha-Arg(Pmc)-Tic-Nle-OH與N-甲基芐胺(4當量)反應(yīng)而不是與N-(2-苯乙基)胺反應(yīng)。用HPLC純化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)，得到所需要的產(chǎn)物。MALDI-TOF MSM/Z＝745.56(MH+)，783.49(MK+)。
肽模擬物P74(Gpg)按照實施例7中P69的方法來制備，只是使粗制Ac-Cha-Gpg(Pmc)-Tic-Nle-OH與N-甲基芐胺(4當量)反應(yīng)而不是與2-苯乙胺反應(yīng)。用HPLC純化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)，得到所需要的產(chǎn)物。MALDI-TOF MS(P41-1)M/Z＝771.63(MH+)，793.63(MNa+)。
實施例9Ac-Cha-Arg-Disc-Nle-N(Me)Bn(P72)和Ac-Cha-Gpg-Disc-Nle-N(Me)Bn(P76)的制備肽模擬物P72采用與實施例8中P71描述的同樣方法來制備，只是在偶聯(lián)步驟1中使用外消旋FmocDiscOH代替FmocTicOH。所獲得的兩種非對映體在最后的HPLC步驟中使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度進行分離，并如實施例6所述表示。MALDI-TOF MS(P72-1)M/Z＝731.57(MH+)，753.55(MNa+)，769.52(MK+)。MALDI-TOFMS(P72-2)M/Z＝731.56(MH+)，753.55(MNa+)，769.52(MK+)。
肽模擬物P76采用與實施例9中P72描述的同樣方法來制備，只是在偶聯(lián)步驟2中使用FmocGpg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各1.5當量)代替FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3當量)。所獲得的兩種非對映體在最后的HPLC步驟中使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度進行分離，并如實施例6.1所述表示。MALDI-TOF MS(P76-1)M/Z＝757.31(MH+)，779.27(MNa+)，795.24(MK+)。MALDI-TOF MS(P76-2)M/Z＝757.37(MH+)，779.34(MNa+)，795.31(MK+)。
實施例10Ac-Cha-Arg-Tic-Met-NH2(P1)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-NH2(P67)的制備10.1 FmocMet-Rinkamide樹脂的制備從3.65g Fmoc-Rinkamide樹脂(0.59mmol/g，Novabiochem)開始，在底部裝有玻璃料的50ml反應(yīng)容器(Advanced ChemTech ACT90)中，通過Fmoc固相合成制備FmocMet-Rinkamide樹脂。
通過用DMF處理樹脂(4×1分鐘)，進行樹脂溶脹。
使用20％哌啶的DMF溶液(1×3min，1×7min，各20ml)使樹脂脫保護，隨后用DMF(10×20ml)洗滌。通過加入FmocMetOH(2.4g，3當量)、DMF(10ml)、HOBt(990mg、3當量)以及DIC(1.01ml，3當量)和DMAP(260mg，0.1當量)，進行?；磻?yīng)。讓該偶聯(lián)反應(yīng)進行4小時，樹脂用DMF(7×20ml)洗滌。將小樣本小心地干燥并用DCM/哌啶(1∶1)脫保護30分鐘。用光度法測定所得Fmoc-哌啶加合物(在301nm的吸收)，得到0.43mmol/g樹脂填料。剩余的樹脂用乙酸酐(2M)和DMAP(0.1M)的DMF溶液(20ml，1×10min)封端，隨后用DMF(12×20ml)，甲醇(3×40ml)和乙醚(3×40ml)洗滌，并真空干燥，得到3.9g FmocMet-Rinkamide樹脂。
10.2 Ac-Cha-Arg-Tic-Met-NH2(P1)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-NH2(P67)的制備從FmocMet-Rinkamide樹脂開始，采用與實施例3中P51相同的方案，但從脫保護步驟開始，使用Fmoc固相合成制備肽模擬物P1。使用FmocTicOH(3當量)、TBTU(3當量)和DIPEA(3.2當量)在Met上偶聯(lián)1.5小時，使用FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3當量)在Tic上偶聯(lián)16小時，使用FmocChaOH、HOBt、DIC(各3當量)在Arg上偶聯(lián)3小時。在Cha的最后乙酰化后，樹脂用DMF(12×7ml)、MeOH(3×20ml)、Et2O(3×20ml)洗滌，真空干燥，然后用TFA/水/茴香硫醚/1，2-乙二硫醇/三乙基硅烷(85.5∶5∶5∶2.5∶2)在室溫下處理3.5小時。濾出樹脂，用TFA洗滌，通過加入200ml冷凍乙醚沉淀出濾液中的產(chǎn)物。將懸浮液在0℃保持1小時，然后按照實施例2.4所述方法進行處理。粗產(chǎn)物用HPLC純化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)。MALDI-TOF MSM/Z＝659(MH+)，681(MNa+)，697(MK+)。
肽模擬物P67按照實施例10中P1所述方法來制備，只是樹脂在偶聯(lián)步驟2中與FmocGpg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各1.5當量)而不是與FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3當量)進行偶聯(lián)。MALDI-TOF MSM/Z＝685.29(MH+)，707.23(MNa+)，723.23(MK+)。
實施例11Ac-Cha-Arg-Disc-Met-NH2(P12)和Ac-Cha-Gpg-Disc-Met-NH2(P66)的制備肽模擬物P12按照實施例10中P1所述方法來制備，只是在偶聯(lián)步驟1中使用外消旋FmocDiscOH代替FmocTicOH。所獲得的兩種非對映體在最后的HPLC步驟中使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度進行分離，并如實施例6所述表示。MALDI-TOF MS(P12-1)M/Z＝645(MH+)，667(MNa+)。MALDI-TOF MS(P12-2)M/Z＝645(MH+)，667(MNa+)。
肽模擬物P66按照實施例10中P1所述方法來制備，只是在偶聯(lián)步驟1中使用外消旋FmocDiscOH代替FmocTicOH，而在偶聯(lián)步驟2中使用FmocGpg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各1.5當量)代替FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3當量)。所獲得的兩種非對映體在最后的HPLC步驟中使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度進行分離，并如實施例6所述表示。MALDI-TOF MS(P66-1)M/Z＝671.25(MH+)。MALDI-TOF MS(P66-2)M/Z＝671.29(MH+)。
實施例12Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-NH2(P31)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-βPhProNH2(P80)的制備12.1 FmocβPhPro-Rinkamide樹脂的制備按照實施例10.1對FmocMet-Rinkamide樹脂描述的方法，只是在偶聯(lián)步驟1中使用FmocβPhProOH代替FmocMetOH，通過Fmoc固相合成制備FmocβPhPro-Rinkamide樹脂。
12.2. Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-NH2(P31)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Met-βPhProNH2(P80)的制備從Fmoc-βPhPro-Rinkamide樹脂開始，按照實施例3中對P51描述的相同方案，但從脫保護步驟開始，采用Fmoc固相合成制備肽模擬物P31。使用FmocMetOH、HOBt、DIC(各3當量)在βPhPro上偶聯(lián)14小時，使用FmocTicOH(3當量)、TBTU(3當量)和DIPEA(3.2當量)在Met上偶聯(lián)1.5小時，使用FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3當量)在Tic上偶聯(lián)16小時，使用FmocChaOH、HOBt、DIC(各3當量)在Arg上偶聯(lián)3小時。Cha的最后乙?；螅瑯渲凑諏嵤├?0.2所述方法進行處理。粗產(chǎn)物用HPLC純化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)。MALDI-TOF MSM/Z＝832.64(MH+)。
肽模擬物P80如P31所述方法來制備，只是在偶聯(lián)步驟3中使用FmocGpg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各1.5當量)代替FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3當量)。MALDI-TOF MSM/Z＝859.19(MH+)，896.14(MK+)。
實施例13Ac-Cha-Arg-Tic-Nle-N(Bn)CH2CH2OCH2CH2OH(P98)和Ac-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(Bn)CH2CH2OCH2CH2OH(P101)的制備13.12-(2-芐基-[2-(2-羥基-乙氧基)乙基]-氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯的制備 將2-(2-氨基乙氧基)-乙醇(10ml，100mmol)溶于無水THF(80ml)中。加入苯甲醛(10.5ml，103mmol)，接著加入MS 4，將所得混合物在室溫下攪拌3.5小時。將所得溶液過濾并減壓濃縮，得到17.41g油狀殘余物(89mmol)。將該殘余物溶于無水THF(180ml)中，將所得溶液冷卻至0℃。加入NaBH4(98mmol)，將混合物在室溫下攪拌3小時。通過加入5N HCl水溶液(70ml)猝滅反應(yīng)。通過加入Na2CO3將pH調(diào)至11，混合物用CH2Cl2(4x)萃取。合并的有機萃取液經(jīng)K2CO3干燥，過濾并減壓濃縮，得到15.3g 2-(2-芐氨基乙氧基)-乙醇，其純度足以進行進一步反應(yīng)。
將粗制2-(2-芐氨基乙氧基)-乙醇(5.27g，27.0mmol)溶于二噁烷(25ml)中。加入Na2CO3(10％的水溶液，35ml)，將混合物冷卻至0℃。加入FmocCl(7.81g；30.2mmol)后，將所得混合物攪拌3.25小時。減壓濃縮混合物，以除去二噁烷。所得含水混合物用CH2Cl2(3×75ml)萃取。合并的有機萃取液經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并減壓濃縮。殘余用快速色譜純化(用乙酸乙酯/己烷(1∶1)作為洗脫液)，得到9.1g油狀標題化合物。1H-NMR(CDCl3)3.05-3.35(m，3H)，3.45-3.75(m，5H)，4.20-4.30(m，1H)，4.45-4.55(m，3H)，4.69-4.68(m，1H)，7.00-7.45(m，10H)，7.55-7.80(m，3H)。
13.2FmocN(Bn)CH2CH2OCH2CH2O-2-氯三苯甲基樹脂的制備將THF(15ml)加入到2-氯三苯甲基氯樹脂(4.0g，1.2mmol/g)中，將所得混合物攪拌25分鐘。加入FmocN(Bn)CH2CH2OCH2CH2OH(6.1g，14.7mmol)的THF(25ml)溶液，然后加入吡啶(850μl，10.5mmol)，將混合物加熱至65℃達15小時。加入MeOH(5ml)，繼續(xù)加熱35分鐘。將樹脂過濾，用DMF(3x)、CH2Cl2(3x)、MeOH(3x)和Et2O(3x)洗滌，得到5.0g。將小樣本小心地干燥并用DCM/哌啶(1∶1)脫保護30分鐘。用光度法測定所得Fmoc-哌啶加合物(在301nm的吸收)，得到0.45mmol/g樹脂填料。
肽模擬物P98采用與實施例2.4描述的同樣方法來制備，即脫保護并使用FmocN(Bn)CH2CH2OCH2CH2O-2-氯三苯甲基樹脂(4.93g，2.2mmol)進行偶聯(lián)，從脫保護步驟開始。使用HOBt(2.5當量)、DIC(2.5當量)和FmocNleOH(2.5當量)在HN(Bn)CH2CH2OCH2CH2O-2-氯三苯甲基樹脂上偶聯(lián)21小時，使用TBTU(3當量)、DIPEA(3.2當量)和FmocTicOH(3當量)，在12ml DMF中，偶聯(lián)時間為1.5小時，在Nle上進行偶聯(lián)。使用FmocArg(Pmc)OH(3當量)、HOBt(3當量)和DIC(3當量)，在15ml DMF中，在20小時內(nèi)，在Tic上進行偶聯(lián)，而使用FmocChaOH(3當量)、TBTU(3當量)和DIPEA(3.2當量)，在15ml DMF中，在1.5小時，在Arg上進行偶聯(lián)。最后的乙?；?，樹脂用DMF(3x)、MeOH(3x)和Et2O(3x)洗滌，得到6.67g。樹脂用50ml TFA/水/茴香硫醚/1，2-乙二硫醇/三乙基硅烷(85.5∶5∶5∶2.5∶2)在室溫下處理3.5小時。濾出樹脂，用TFA洗滌，減壓濃縮濾液。通過向殘余物中加入450ml冷凍乙醚使產(chǎn)物沉淀。懸浮液以3300rpm離心10分鐘，棄去上清液，將沉淀重懸于冷凍乙醚中，再次離心，再一次棄去上清液。將沉淀溶于乙腈和0.1％TFA水溶液中。減壓蒸發(fā)有機溶劑，將水溶液冷凍干燥，得到1.38g粗產(chǎn)物。該產(chǎn)物中的300mg用HPLC純化(使用乙腈的0.1％TFA水溶液梯度)，得到209mg純的P98。MALDI-TOF MSM/Z＝819.29(MH+)。
肽模擬物P101如P98所述方法來制備，只是在偶聯(lián)步驟3中使用FmocGpg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各1.5當量)代替FmocArg(Pmc)OH、HOBt、DIC(各3當量)。MALDI-TOF MSM/Z＝845.39(MH+)，867.38(MNa+)，883.36(MK+)。
實施例14化合物與MHC-II蛋白DR4Dw4和DR1的競爭性結(jié)合用6-(生物素酰氨基)-己酰-YAAFRAAASAKAAA-NH2作為指示肽，按照Ito等(Exp.Med.1996；1832635-2644)和Siklodi等(HumanImmunology 1998；59463-471)的通用方案并作稍許改進，檢測肽模擬化合物(1nM-100μM)對DR4Dw4(DRA1*0101 DRB1*0401)、DR1(DRA1*0101 DRB1*0101)和DR4Dw14(DRA1*0101 DRB1*0404)的競爭性結(jié)合。
在室溫下用1％BSA/PBS封閉1小時的96孔聚丙烯板中，制備溶于25％(v/v)DMSO/50mM磷酸鈉、150mM氯化鈉，pH7.5(PBS)中的10倍連續(xù)稀釋的化合物(4nM-400μM)。在同樣封閉的96孔聚丙烯板中如下制備MHC-化合物互作混合物向40μl2×緩沖液(PBS，50mM，pH7.5，2％(w/v)NP-40，3.2mM EDTA，6.25％蛋白酶抑制劑混合物胰凝乳蛋白酶抑制劑、抗蛋白酶、胃蛋白酶抑制劑A、大豆胰蛋白酶抑制劑和亮抑制表酶肽各0.32g/l)中加入10μl 0.8μM指示肽、20μl適當稀釋的化合物溶液和10μlMHC-II DRA1*0101DRB1*0401(0.06g/l)、DRA1*0101 DRB1*0101(0.03g/l)或DRA1*0101 DRB1*0404(0.015g/l)的0.5％(w/v)NP-40/PBS。用不含肽模擬化合物的互作混合物以及不含肽模擬化合物和MHC-II的互作混合物分別作為陽性對照和陰性對照。所有互作混合物使用一式兩份，并在室溫下保溫16小時。
高結(jié)合力黑色FIA板(Greiner，捕獲板)預(yù)先用100μl/孔mAbLB3.1(0.01g/l)的PBS于4℃包被過夜，然后用200μl/孔1％(w/v)BSA/PBS在室溫下封閉1小時。用PBS洗滌后，將60μl MHC-II-化合物互作混合物從互作板轉(zhuǎn)移到捕獲板的適當孔內(nèi)，然后于4℃保溫2小時。各孔用200μl/孔冷卻的(4-8℃)1× DELFIA洗滌液(Wallac-ADL-GmbH，F(xiàn)reiburg)洗滌6次，與100μl冷卻的銪-鏈霉抗生物素蛋白綴合物(Wallac-ADL-GmbH，F(xiàn)reiburg；用DELFIA測定緩沖液以1/1000稀釋)一起于4℃保溫30分鐘，再次用冷卻的1×DELFIA洗滌液洗滌6次，最后，與200μl冷卻的DELFIA增強溶液(Wallac-ADL-GmbH，F(xiàn)reiburg)一起在室溫下保溫1小時，然后在λexEu3+∶340nm和λemEu3+613(615)nm，讀出時間分辨銪熒光(Wallac Victor21420Multilabel Counter，Wallac-ADL-GmbH，F(xiàn)reiburg)。
表3a顯示(粗體)本發(fā)明含Gpg化合物對某些MHCII蛋白根據(jù)本實施例IC50測定的改進的親和性。表3b顯示式I化合物對相同MHCII蛋白的親和性。圖1顯示P53(含Gpg)即本發(fā)明的優(yōu)選七聚體化合物相對于含Arg肽(P51)對MHCII 0401的改進的IC50，而圖3顯示P74(含Gpg)即本發(fā)明的優(yōu)選四聚體相對于含Arg肽(P71)對MHCII 0101的改進的IC50。圖3顯示P69(含Gpg)即本發(fā)明的優(yōu)選四聚體化合物相對于含Arg肽(P82)的改進的IC50。圖4顯示P74(含Gpg)即本發(fā)明的優(yōu)選四聚體化合物相對于含Arg肽(P71)對0401的改進的IC50。圖5顯示P101(含Gpg)即本發(fā)明的優(yōu)選四聚體化合物相對于含Arg肽(P98)的改進的IC50。
實施例15化合物與在PRIESS細胞和LG2細胞上表達的MHC II蛋白的競爭性結(jié)合用6-(生物素酰氨基)-己酰-Cha-Arg-Tic-Met-NH2作為指示肽，檢測肽模擬化合物(4nM-400μM)對Priess細胞(DR4Dw4∶DRA1*0101DRB1*0401)和LG2細胞(DR1∶DRA1*0101 DRB1*0101)的競爭性結(jié)合。將所述細胞在補充10％熱滅活FCS(Biowhittaker)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸貯液(Gibco 11140-035；100×MEM)、1mM丙酮酸鈉、0.1mg/ml卡那霉素和3.4ppm β-巰基乙醇的RPMI 1640(1×Gibco 42401-042)培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。為了供結(jié)合測定用，將所述細胞以2.5×106細胞/ml的密度重懸于含有1％FCS的培養(yǎng)液中。
在無菌的96孔聚苯乙烯微量滴定板中進行該項測定。用含有10％DMSO/水的5mM或10mM化合物貯備液制備含有1％FCS的10倍連續(xù)稀釋的化合物(16nM-1615μM)。以一式兩份將50μl各化合物稀釋液加入到50μl含有1％FCS的16μM指示肽溶液中。通過向各孔中加入100μl 2.5×106細皰/ml 1％ FCS啟動細胞結(jié)合。包括含有最高濃度化合物的溶液中存在的DMSO濃度的對照。所述細胞在37℃、6％CO2下孵育。4小時后，所述細胞用200μlPBS洗滌，然后在200μl裂解緩沖液(50mM磷酸鈉、150mM氯化鈉、1％(w/v)NP-40、25mM碘乙酰胺、1mM PMSF、3.1％蛋白酶抑制劑混合物胰凝乳蛋白酶抑制劑、抗蛋白酶、胃蛋白酶抑制劑A、大豆胰蛋白酶抑制劑和亮抑制表酶肽各0.32g/l，pH 7.5)中裂解10分鐘。
高結(jié)合力黑色FIA板(Greiner，捕獲板)預(yù)先用含有50mM磷酸鈉、150mM氯化鈉pH 7.5(PBS)的100μl/孔mAb LB3.1(0.01g/1)于4℃包被過夜，然后用200μl/孔 1％(w/v)BSA/PBS在室溫下封閉1小時。用PBS洗滌后，將190μl細胞裂解液轉(zhuǎn)移到捕獲板的適當孔內(nèi)，然后于4℃保溫2小時。各孔用200μl/孔冷卻的(4-8℃)1×DELFIA洗滌液(Wallac-ADL-GmbH，F(xiàn)reiburg)洗滌6次，與100μl冷卻的銪-鏈霉抗生物素蛋白綴合物(Wallac-ADL-GmbH，F(xiàn)reiburg；用DELFIA測定緩沖液以1/1000稀釋)一起于4℃保溫30分鐘，再次用冷卻的1×DELFIA洗滌液洗滌6次，最后，與200μl冷卻的DELFIA增強溶液(Wallac-ADL-GmbH，F(xiàn)reiburg)一起在室溫下保溫1小時，然后在λexEu3+∶340nm和λemEu3+∶613(615)nm，讀出時間分辨銪熒光(WallacVictor21420 Multilabel Counter，Wallac-ADL-GmbH，F(xiàn)reiburg)。
表3a顯示本發(fā)明含Gpg化合物對細胞表面表達的某些MHCII蛋白根據(jù)本實施例IC50測定的改進的親和性。表3b顯示式I化合物對所述細胞上表達的相同蛋白的親和性。圖6顯示肽P47(含Gpg)即本發(fā)明優(yōu)選七聚體化合物相對于含Arg肽(P43)與LG2細胞上表達的MHC蛋白的結(jié)合被抑制的改進的IC50。圖7顯示肽P74(含Gpg)即本發(fā)明優(yōu)選四聚體化合物相對于含Arg肽(P71)與Priess細胞上表達的MHC蛋白的結(jié)合被抑制的改進的IC50。
實施例16化合物在血漿中的穩(wěn)定性測定肽模擬化合物在大鼠血漿(Charles River Laboratories，Sulzfeld)、小鼠血漿(Charles River Laboratories，Sulzfeld)和人血漿(Bayerisches Rotes Kreuz，München)中的穩(wěn)定性(E.R.Garrett和M.R.Gardner，J Pharmaceutical Sciences 71(1982)14-25)。
表3a顯示本發(fā)明含Gpg化合物在血漿中的改進的穩(wěn)定性(粗體)，而圖8顯示24小時后本發(fā)明含Gpg七聚體化合物(P53)相對于含Arg等同物(P51)在大鼠血漿中的改進的穩(wěn)定性(任意單位)；本發(fā)明含Gpg四聚體化合物(P66-1)相對于含Arg等同物(P12-1)在大鼠血漿中的改進的穩(wěn)定性(任意單位)；本發(fā)明含Gpg四聚體化合物(P69)相對于含Arg等同物(P82)在大鼠血漿中的改進的穩(wěn)定性(任意單位)；本發(fā)明其它優(yōu)選的化合物相對于其含Arg等同物在大鼠血漿中的改進的穩(wěn)定性(任意單位)。表3b顯示式I化合物相對于含有NH2封端基團的化合物的改進的穩(wěn)定性(粗體)。
將化合物儲備液在血漿中稀釋，所獲得的化合物終濃度為5μM。將所得混合物在37℃保溫。在0小時、6小時和24小時，取出1ml樣品，通過加入3ml乙腈(p.a.)并進行渦旋混合使血漿蛋白沉淀。所得沉淀以2000g離心5分鐘而成塊。將上清液蒸發(fā)至干，殘余物在400μl 50％乙腈的0.1％TFA水溶液中重建。
過濾(0.2μm)后，通過反相HPLC(PerSeptive Biosystems；Nucleosil 100-5 C18，12.5×0.46cm；20-50％乙腈的0.1％TFA水溶液，在30分鐘內(nèi))，對200μl溶液進行分析，通過對合適峰積分，估計剩余化合物的含量。因此，制備不穩(wěn)定化合物的PBS對照。
實施例17化合物對組織蛋白酶B1和D降解的穩(wěn)定性檢查肽模擬化合物對溶酶體降解的穩(wěn)定性，即與組織蛋白酶B1(EC 3.4.22.1，得自牛脾；Sigma-Aldrich，Taufkirchen；以10000U/L溶于ddH2O中)和組織蛋白酶D(EC 3.4.23.5，得自牛脾；Sigma-Aldrich，Taufkirchen；以10000U/L溶于DDH2O中)一起于37℃保溫4小時，所使用的化合物濃度為50μM，酶/底物的比率為0.4U/μmol。樣品含有25ppm 4-異丙基芐醇(IPBA；Sigma-Aldrich，Taufkirchen)，作為內(nèi)標。
通過將35μl 1％ IPBA的DMSO溶液和28μl 10000U/L組織蛋白酶B1或組織蛋白酶D儲備液分別加入到14ml 100mM乙酸鈉、1mM EDTA、1mM DTT、pH5.00或100mM乙酸鈉pH4.50中，制備測定緩沖液。將8.8μl 5mM(或4.4μl 10mM)化合物儲備液(溶于10％DMSO/水中)加入到1.5ml Eppendorf管中。通過向各管中加入875μl完全測定緩沖液、渦旋混合并于37℃保溫，使反應(yīng)開始。在0小時和4小時，取出400μl樣品，通過加入40μl 50％ TFA水溶液使酶失活。將樣品于-20℃冷凍保存，直到通過RP-HPLC分析(200μl注射體積；Nucleosil 100-5 C18，12.5×4.6cm；梯度20-50％乙腈，在30分鐘內(nèi))。
通過分別與Ac-Cha-RAMASL-NH2和QYIKANSLFIGITELK保溫來控制組織蛋白酶B1和組織蛋白酶D的酶活性，這兩種酶均在4小時內(nèi)被完全降解。
在RP-HPLC分析期間，檢測化合物與內(nèi)標的共洗脫，無需實施例16的標準品。
表3(a、b和c)顯示本發(fā)明化合物對某些組織蛋白酶酶的穩(wěn)定性。
實施例180401(DR4)和0404(DR14)嵌合MHCII-小鼠T細胞活化在體內(nèi)被共免疫抑制小鼠品系DR4和DR14攜帶有嵌合MHC-II轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因編碼鼠II類分子I Ed的相應(yīng)DR分子N-末端結(jié)構(gòu)域(形成肽結(jié)合部位)和剩余結(jié)構(gòu)域(第二胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域)。這些小鼠品系是其它鼠II類缺陷的，因此在相應(yīng)人MHC-II結(jié)合部位中存在的肽可觸發(fā)所有輔助T細胞應(yīng)答。根據(jù)設(shè)計與DR結(jié)合的主題抑制劑的初步體內(nèi)試驗，DR-轉(zhuǎn)基因小鼠用預(yù)定劑量的蛋白抗原和不同劑量的待測化合物拮抗劑共同免疫。在該方案中，將抗原和化合物一起在完全弗氏佐劑(CFA)中乳化，因此，對這兩種組分對DR呈遞的直接競爭進行測試。測定的讀出是共免疫后9天移植的局部淋巴結(jié)T細胞的離體抗原特異性活化。在一個典型實驗中，對抗原劑量-反應(yīng)進行研究，將用抗原免疫的小鼠的曲線與用抗原+化合物共免疫的小鼠的曲線進行比較。每個實驗組使用2-3只小鼠，用按等數(shù)目合并的淋巴結(jié)細胞產(chǎn)生劑量反應(yīng)曲線。該實驗系統(tǒng)也允許評價化合物拮抗劑的固有抗原性。研究時用不同濃度的化合物代替抗原，進行一項來自同一細胞庫的劑量-反應(yīng)研究，可以做到這一點。作為特異性對照，在同一細胞庫中，對純化蛋白衍生物(PPD)即CFA的主要蛋白組分進行測試。
圖14顯示本發(fā)明優(yōu)選四聚體化合物(P69)相對于含Arg等同物(P82)的改進的體內(nèi)抑制效應(yīng)。圖15顯示本發(fā)明優(yōu)選四聚體和七聚體化合物的體內(nèi)抑制效應(yīng)。
通過計算對照相對于三種抗原濃度即6.7μg、20μg和60μg的平均抑制百分率，求出正在研究之中的化合物的總體抑制潛力的估計值。表4顯示本發(fā)明的某些化合物與某些含Arg等同物的總體抑制潛力的估計值。在所述體內(nèi)模型的一個或兩個中，所有含Gpg化合物全都具有顯著性免疫抑制特性。含Gpg化合物也顯示相對于含Arg等同物的改進的活性或改進的特異性。此外，在該項測定中，式I化合物顯示有活性。
18.1共免疫用化合物的制備本發(fā)明化合物作為用CFA(Bacto Adjuvant Complete H37 Ra，Difco，批號3113-60)、10mg/ml蛋白的PBS溶液、5μM抑制劑的10％DMSO溶液制備的乳劑注射給藥。將CFA、PBS、抗原和抑制劑置于一個5-ml注射針筒(總體積不超過1ml)內(nèi)。所得混合物按振輻小于40％(30-35％)進行超聲處理2次，每次15秒。此時乳劑應(yīng)看上去很硬但不是液態(tài)。水表面的乳滴不應(yīng)散開。通過針頭將所得乳劑吸到帶有針頭(Gr.18，26G×1″)的1ml注射器內(nèi)，然后排出氣泡。將100μl最終含有50μg蛋白和210nM化合物的乳劑注射到小鼠尾巴末端，共同免疫小鼠?？乖?化合物和CFA按1∶1體積/體積混合。用HEL免疫的DR 4小鼠和用OVA免疫的DR 14小鼠獲得了最佳結(jié)果。
18.2小鼠的免疫如下給小鼠尾巴末端進行注射用大姆指和中指抓住小鼠尾巴，將食指放在小鼠尾巴的末端。將注射器的針頭在距尾末端(毛發(fā)端)約1.5cm處插入皮下并推入尾中約1cm。給小鼠注射100μl乳劑。9天后，處死小鼠，取出淋巴結(jié)。
18.3共免疫后T細胞增殖測定使用從先用雞卵溶菌酶+化合物共免疫的嵌合DR4-IE轉(zhuǎn)基因小鼠(Taconic，USA)或用卵清蛋白+化合物共免疫的DR14-IE轉(zhuǎn)基因小鼠的淋巴結(jié)中分離的T細胞和抗原呈遞細胞，按照標準方法(Adorini等，1988，Mueller等，1990；Current Protocols in Immunology，第2卷，7.21；Ito等，1996)，測試候選化合物對T細胞活化的抑制效應(yīng)。
免疫后約9天(例如8-10天)，處死小鼠，取出淋巴結(jié)，使用逐漸增加量的已用蛋白抗原和化合物拮抗劑共免疫的小鼠淋巴結(jié)細胞上的抗原，按照實施例19.1進行T細胞增殖測定。對照系不用化合物免疫。
按照下面的測定計劃，制備抗原稀釋液并分配在96-U-Well-MTP上。PPD用作T細胞增殖的陽性對照。
培養(yǎng)基(陰性對照)100μl HL-1100μl細胞(2.5×105細胞)PPD(陽性對照)100μlPPD溶液(100μg/ml)100μl細胞(2.5×105細胞)抑制劑對照100μl化合物溶液(100-3.125μM)100μl細胞(2.5×105細胞)抗原-滴定(600μg/ml-0.82μg/ml)100μl抗原溶液100μl細胞(2.5×105細胞)洗滌培養(yǎng)基97.5％RPMI1.5％FCS1％卡那霉素(儲備液10mg/ml→終濃度0.1mg/ml)HL-1培養(yǎng)基98％HL-1培養(yǎng)基(Bio Wittaker Europe，批號77201)1％L-谷氨酰胺(儲備液200mM→終濃度2mM)1％卡那霉素(儲備液10mg/ml→終濃度0.1mg/ml)無血清儲備液HEL(溶菌酶III級得自雞卵白；Sigma L-7011)10mg/ml PBSOVA(白蛋白，雞卵；Sigma A-2512)4mg/ml PBSPPD(結(jié)核菌素PPD；Statens Serum Institut；批號2391)1mg/ml(待用)所用的溶液HEL儲備液(120μg/ml)用HL-1培養(yǎng)基按1∶83稀釋→終濃度30μg/ml/孔。
OVA儲備液(84μg/ml)用HL-1培養(yǎng)基按1∶48稀釋→終濃度21μg/ml/孔。
PPD儲備液(100μg/ml)用HL-1培養(yǎng)基按1∶10稀釋→終濃度25μg/ml/孔。
實施例19本發(fā)明化合物體外抑制T細胞活化采用測量T細胞增殖的試驗，對正在研究的化合物的免疫調(diào)節(jié)特性進行測試。表3(a和b)顯示某些化合物的IC50(μM)和最大抑制(％)。圖9顯示劑量-反應(yīng)曲線，證明根據(jù)T細胞活化試驗測定，P53(含Gpg)即本發(fā)明優(yōu)選七聚體化合物相對于含Arg肽(P51)的改進的免疫抑制特性。也顯示了本發(fā)明的另一化合物(P41-1)的劑量-反應(yīng)曲線。圖10顯示劑量-反應(yīng)曲線，證明根據(jù)T細胞活化試驗測定，本發(fā)明的各種優(yōu)選化合物如P69、P74、P101和P53的免疫抑制特性。
如下測試抑制抗原致敏淋巴結(jié)細胞的增殖性T細胞應(yīng)答并缺乏鼠II類分子的化合物，所述細胞來自攜帶具有RA相關(guān)肽結(jié)合部位的嵌合小鼠-人II類轉(zhuǎn)基因的小鼠(Muller等，1990；Woods等，1994；Current Protocols in Immunology，第2卷，7.21；Ito等，1996)。在此，免疫在體內(nèi)發(fā)生，但抑制和讀出卻是在活體外進行。表達具有RA相關(guān)分子結(jié)合部位的MHC II類分子DRB*0401的轉(zhuǎn)基因小鼠是市售的。這些小鼠缺乏鼠MHC II類，因而所有Th應(yīng)答都通過一種人RA相關(guān)MHC II類分子的通道(Ito等1996)。這些轉(zhuǎn)基因小鼠代表一種人II類拮抗劑試驗?zāi)Ｐ汀?br> 19.1 T細胞增殖測定使用先前用雞卵卵清蛋白免疫的嵌合0401-IE轉(zhuǎn)基因小鼠(Taconic，USA)淋巴結(jié)中分離的嵌合T細胞和抗原呈遞細胞(Ito等1996)，按照標準方法，對正在研究的化合物對所測量的T-細胞增殖的抑制效應(yīng)進行測試。在每孔各裝有0.2ml的96孔組織培養(yǎng)板中，在卵清蛋白(30μg/孔-半數(shù)最大刺激濃度)和連續(xù)稀釋的待測化合物(約0.1μM至200μM)存在下，在含有2mM L-谷氨酰胺和0.1g/l卡那霉素的無血清HL-1培養(yǎng)基中，將1.5×105細胞孵育3天。在培養(yǎng)的最后16小時期間，通過3H-甲基-胸苷(1μCi/孔)摻入測定抗原特異性增殖(Falcioni等，1999)。收獲細胞，并用閃爍計數(shù)器(TopCount，WallacFinland)測定3H摻入?？梢杂^察到與含有抗原的對照孔相比，用所述化合物處理可抑制T細胞增殖。
實施例20本發(fā)明化合物抑制T細胞雜交瘤細胞的IL-2分泌在測量無限增殖化T細胞的IL-2分泌的測定中，本發(fā)明含Gpg化合物表現(xiàn)出相當大的免疫調(diào)節(jié)特性。表3a顯示Gpg化合物在該測定中的IC50(μM)和最大抑制(％)。表3b顯示式I的四聚體化合物相對于含有NH2封端基團的那些化合物的改進的活性(粗體)。圖11顯示劑量-反應(yīng)曲線，證明根據(jù)IL-2分泌測定，P41-1(含Gpg)即本發(fā)明七聚體化合物相對于含Arg肽(P40-1)的改進的免疫抑制特性，而圖12顯示劑量-反應(yīng)曲線，證明根據(jù)IL-2分泌測定，P69(含Gpg)即本發(fā)明四聚體化合物相對于含Arg肽(P82)的改進的免疫抑制特性。圖13顯示P53(含Gpg)即本發(fā)明優(yōu)選七聚體化合物相對于DMSO對照的免疫抑制特性。
通過測量經(jīng)刺激的雜交瘤細胞系T-Hyb 1的IL-2分泌，使用DR-轉(zhuǎn)基因抗原呈遞細胞(APC)，在半數(shù)最大抗原刺激條件下，對正在研究的化合物的免疫調(diào)節(jié)特性進行研究。采用由Pharmingen(Torrey Pine，CA，USA)的OptiEIA小鼠IL-2試劑盒提供的標準ELISA方法，檢查并測量IL-2分泌。按照標準方法，從未免疫的嵌合0401-IE轉(zhuǎn)基因小鼠(Ito等1996)的脾中分離出APC。將1.5×105APC加入到每孔裝有0.2ml含以下添加劑(全都得自Gibco BRL和PAA)的RPMI培養(yǎng)基的96孔板中10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉和0.1g/l卡那霉素。加入雞卵卵清蛋白，至終濃度為200μg/ml，終體積為100μl上述培養(yǎng)基，所述細胞與該抗原一起在6％CO2下于37℃孵育30分鐘。向各孔中加入不同濃度的化合物(濃度通常在0.1-200μM范圍內(nèi))，將所述板在37℃/6％CO2下保溫1小時，然后加入2×105T-Hyb 1細胞，得到終體積為200μl上述培養(yǎng)基。孵育24小時后，將100μl上清液轉(zhuǎn)移到先前用IL-2捕獲抗體(BDPharmingen，Torrey Pine，CA，USA)包被的ELISA板(Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp surface，Nunc，Roskilde，DK)中，使用OptiEIA小鼠IL-2試劑盒，按照生產(chǎn)商的說明，對IL-2含量進行定量，并且采用VictorV讀出器(Wallac，F(xiàn)inland)讀板。所分泌的IL-2(pg/ml)采用試劑盒中提供的IL-2標準品校準。
通過使胸腺瘤系BW 5147(ATCC)的T細胞受體陰性變異體和先前用雞卵卵清蛋白(Ito等1996)免疫的嵌合0401-IE轉(zhuǎn)基因小鼠的淋巴結(jié)細胞融合，建立T細胞雜交瘤系T-Hyb1?？寺-Hyb1根據(jù)所述測定進行選擇，因為該克隆對具有高IL-2分泌的抗原特異性刺激有反應(yīng)。
實施例21本發(fā)明化合物在小鼠疾病模型中的免疫調(diào)節(jié)活性測試顯示最佳分布型(結(jié)合親和性、蛋白酶穩(wěn)定性、T細胞體外和體內(nèi)抑制)的化合物在以下模型中的治療潛力MHC-II轉(zhuǎn)基因小鼠自身免疫病模型，即膠原蛋白誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(CIA)-類風濕性關(guān)節(jié)炎模型和實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)-多發(fā)性硬化模型。
按照Rosloniec等介紹的方法(J.Exp.Med.1997；185113)，用II型膠原蛋白免疫HLA-DR1轉(zhuǎn)基因小鼠，誘發(fā)CIA。疾病發(fā)作后，小鼠用最大耐受劑量的化合物治療兩周(皮下給藥)，與僅用溶劑治療的小鼠相比，疾病發(fā)展如下天數(shù) 治療1免疫(牛C-II+CFA)19-40疾病發(fā)作時開始皮下注射化合物，每周5次，共3周疾病嚴重程度評分1.紅斑和輕度腫脹，局限于跗骨或踝關(guān)節(jié)2.紅斑和輕度腫脹，從踝關(guān)節(jié)延伸至跗骨3.紅斑和中度溶脹，從踝關(guān)節(jié)延伸至趾骨關(guān)節(jié)4.紅斑和嚴重溶脹，包括踝關(guān)節(jié)、足和趾圖16顯示本發(fā)明的優(yōu)選化合物(P96、P53和P74)相對于作為對照的溶劑在CIA小鼠模型中對類風濕性關(guān)節(jié)炎的功效。
按照Ito等(1996)介紹的方法，給DR4轉(zhuǎn)基因小鼠注射髓鞘少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG)，誘發(fā)EAE。疾病發(fā)作后，小鼠用化合物進行治療并進行如下研究天數(shù) 治療0 免疫(MOG+CFA)14-36 疾病誘發(fā)或發(fā)作時開始皮下注射化合物，每周5次疾病評分
1.尾部張力缺乏2.后肢無力3.后肢麻痹4.后肢麻痹，前肢無力或麻痹5.瀕死狀態(tài)圖17顯示本發(fā)明的優(yōu)選化合物(P69、P53和P74)相對于作為對照的溶劑在EAE小鼠模型中對多發(fā)性硬化預(yù)防的功效。
圖18顯示本發(fā)明的優(yōu)選化合物(P69和P53)相對于作為對照的溶劑在EAE小鼠模型中對多發(fā)性硬化治療的功效。
圖19顯示本發(fā)明的優(yōu)選含Gpc化合物(P69)相對于等同的含Arg化合物(P82)在EAE小鼠多發(fā)性硬化模型中的功效。Gpg化合物的功效就疾病治療而論優(yōu)于Arg化合物，盡管是以Arg化合物(250nM)的一半濃度(125nM)進行治療。
實施例22藥用組合物為了選擇出本發(fā)明最合適的化合物進入下一步實驗并且評價所述化合物用于免疫系統(tǒng)疾病治療的治療組合物中的適合性，采集另外的數(shù)據(jù)。每種化合物的這類數(shù)據(jù)可包括根據(jù)體外估計的親和性、反應(yīng)性、特異性、IC50值、對IL-2分泌和T細胞增殖的抑制以及類風濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化的DR-轉(zhuǎn)基因模型。
對于給定疾病，可以將本發(fā)明化合物的活性與先前接受的療法或治療藥進行比較。例如，可以將本發(fā)明的具體化合物與干擾素-β-多發(fā)性硬化已接受的療法進行比較。
可以選擇出顯示合適親和性、最佳特異性和/或T細胞增殖或IL-2分泌的最高抑制以及在合適模型中抑制類風濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化有高功效的化合物做進一步實驗。這樣的實驗可包括例如在動物中的治療分布型和毒理學以及人體I期臨床試驗。
對于治療或預(yù)防應(yīng)用，可以將本發(fā)明化合物以常規(guī)藥用組合物的形式給予溫血動物例如人，其中的典型實例包括以下實例注射液將0.01-100mg活性成分溶于至多2mL水性注射溶媒中，所獲得的活性成分濃度介于0.01-100mg/mL之間。水性注射溶媒用藥學上可接受的緩沖劑(例如磷酸鹽或醋酸鹽)按需緩沖至pH 5和pH 8之間，并且含有所加入的藥學上可接受的張力調(diào)節(jié)劑(例如NaCl或葡萄糖)，以達到等滲性。溶媒也任選含有其它藥學上可接受的賦形劑例如增溶劑(例如DMSO、乙醇、丙二醇、聚乙二醇等)、防腐劑和抗氧化劑。所述活性成分通?？梢允侨缟纤龅幕衔?，并且一般為藥學上可接受的鹽。本發(fā)明化合物可以與一種或多種其它活性成分一起給予。這樣的組合物可以是含有若干這類活性成分的單包裝、丸劑或敷劑，或者這樣的給藥可以含包括本發(fā)明化合物在內(nèi)的獨立活性成分的序貫或重復(fù)給藥。
等同實施方案本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認識到或者能夠確定，使用不超過常規(guī)實驗部分，本說明書中描述了本發(fā)明化合物的許多等同實施方案及其使用方法。這樣的等同實施方案被認為在本發(fā)明范圍內(nèi)，并且所附權(quán)利要求書包括這樣的等同實施方案。
此中引用的所有專利、公布的專利申請和出版物通過引用全部結(jié)合到本文中。
表1.本發(fā)明含Gpg化合物a.本發(fā)明的優(yōu)選含Gpg化合物編號 Pos.2 序列P41-1GpgAc-Cha-Gpg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P41-2GpgAc-Cha-Gpg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P45-1GpgAc-Cha-Gpg-Disc-Met-βPhPro-OHP45-2GpgAc-Cha-Gpg-Disc-Met-βPhPro-OHP47 GpgAc-Cha-Gpg-Tic-Met(O)-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P52 GpgAc-Phe-Gpg-Tic-Met(O)-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P53 GpgAc-Cha-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P54 GpgAc-Cha-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-N(Me)CH2CH2OHP55 GpgAc-Phe-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P56 GpgAc-Phe-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-N(Me)CH2CH2OHP57 GpgAc-Hfe-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P58 GpgAc-Thi-Gpg-Tic-Nle-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P59 GpgAc-Cha-Gpg-Tic-Ile-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P60 GpgAc-Cha-Gpg-Tic-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P61-1GpgAc-Cha-Gpg-Disc-Nle-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P61-2GpgAc-Cha-Gpg-Disc-Nle-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P62-1GpgAc-Phe-Gpg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P62-2GpgAc-Phe-Gpg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P63-1GpgAc-Thi-Gpg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P63-2GpgAc-Thi-Gpg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P64 GpgAc-Cha-Gpg-Disc-Met(O)-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P65 GpgAc-Thi-Gpg-Disc-Met(O)-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P66-1GpgAc-Cha-Gpg-Disc-Met-NH2P66-2GpgAc-Cha-Gpg-Disc-Met-NH2P67 GpgAc-Cha-Gpg-Tic-Met-NH2P68 GpgAc-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(H)BnP69 GpgAc-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(H)CH2CH2PhP70 GpgAc-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(H)CH2CH2OCH2CH2OHP74 GpgAc-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(Me)BnP76-1GpgAc-Cha-Gpg-Disc-Nle-N(Me)BnP76-2GpgAc-Cha-Gpg-Disc-Nle-N(Me)BnP77 GpgAc-Cha-Gpg-Tic-Nle-四氫異喹啉P78 GpgAc-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(Bn)CH2CH2OHP80 GpgAc-Cha-Gpg-Tic-Met-βPhProNH2P101 GpgAc-Cha-Gpg-Tic-Nle-N(Bn)CH2CH2OCH2CH2OHP102 GpgAc-Cha-Gpg-Tic-Met-N(Bn)CH2CH2OCH2CH2OH
表1(續(xù)).本發(fā)明含Gpg化合物b.式II的前導天然肽的優(yōu)選模擬取代(Falcioni等；1999)前導肽Ac(Cha)RA M ASL -NH2AcCha Gpg AlaMetAla Ser Leu-NH2優(yōu)4-氨基丁?；? Nba C(Acm) Nleβ-PhPro tLeu選3-氨基丙基4-MeCha C(Prm) Chg -------N(H)CH(CH2OH)2-------的取Coa MePhg -----Halc----- -------N(CH3)CH2CH2OH-------代Hfe C(Ac) ----Odapdc---- --------N(H)CH2CH2OH--------Phe NvaMet(O) ---[S-Ψ(oxaz)-L]-N(CH3)2---TicIle ---[S-Ψ(lmid)-L]-N(CH3)2---Disc---------N(H)CH2tBu---------Thiq----------D-Leu-ol----------azaTic ----------D-Pro-ol--------------------N(H)Bn----------------------N(CH3)Bn------------------N(H)CH2CH2Ph----------------N(CH3)CH2CH2Ph--------------N(CH3)CH2CH2OH--------------N(Bn)CH2CH2OH------------N(CH2CH2Ph)CH2CH2OH----------N(H)CH2CH2OCH2CH2OH----------N(Bn)CH2CH2OCH2CH2OH------N(CH2CH2Ph)CH2CH2OCH2CH2OH-------------四氫異喹啉--------------------異二氫吲哚---------
表1(續(xù)).本發(fā)明的其它化合物c.式I的前導天然肽的優(yōu)選四聚體模擬取代(Falcioni等；1999)前導肽Ac(Cha) R A M AS L -NH2AcCha Gpg Ala Met -----------N(H)Bn-----------------優(yōu)4-氨基丁?；? Nba Arg C(Acm) Nle ----------N(CH3)Bn----------------選3-氨基丙基4-MeCha Orn C(Prm) Chg ---------N(H)CH2CH2Ph-------------的取Coa 4-Pya MePhg Ile --------N(CH3)CH2CH2Ph------------代Hfe αMeOrn C(Ac) Met(O) --------N(CH3)CH2CH2OH------------Phe Cit Nva---------N(Bn)CH2CH2OH------------alle Tic-------N(CH2CH2Ph)CH2CH2OH--------Val Disc -------N(H)CH2CH2OCH2CH2OH--------3-PyaThiq -------N(Bn)CH2CH2OCH2CH2OH-----------Odapdc---- ----N(CH2CH2Ph)CH2CH2OCH2CH2OH----azaTic -----------四氫異喹啉------------------------異二氫吲哚-------------
表2.用本文介紹的測定所研究的其它化合物編號 Pos.2序列編號 Pos.2 序列Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Haic-[S(oxaz)L]-N(CH3)2 P38-2 ArgAc-Cha-Arg-(Et2)-Disc-Met-NH2Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Haic-NH2 P39OrnAc-Cha-Orn-Tic-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]NMe2Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Haic-Ser-MeLeu-NH2 P40-1 ArgAc-Cha-Arg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]NMe2-Aly-Ref NoGPCG-PWO-130Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-Ser-tLeu-NH2 P40-2 ArgAc-Cha-Arg-Disc-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P1 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Met-NH2 P42ArgH-Cha-Arg-Tic-Met-NH2P3 Arg Ac-Cha-RAMASL-NH2 P43ArgAc-Cha-Arg-Tic-Met(O)-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P6 Arg Ac-Cha-Arg-Thiq-Met-NH2 P44-1 ArgAc-Cha-Arg-Disc-Met-βPhPro-N(Me)CH2CH2OHP8 Orn Ac-Cha-Orn-Tic-Met-NH2 P44-2 ArgAc-Cha-Arg-Disc-Met-βPhPro-N(Me)CH2CH2OHP9 Orn Ac-Cha-Orn-Thiq-Met-NH2 P48N/AO，O’-Bis-(CH2-CH2-NH-CO-Cha-Arg-Tic-Met-NH2)-PEG 3400P10 Val Ac-Cha-Val-Tic-Met-NH2 P49ArgAc-Phe-Arg-Tic-Met-NH2P11 Val Ac-Cha-Val-Thiq-Met-NH2 P50ArgAc-Cha-Arg-Tic-Ile-NH2P12-1Arg Ac-Cha-Arg-Disc-Met-NH2 P51ArgAc-Cha-Arg-Tic-Nle-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2P12-2Arg Ac-Cha-Arg-Disc-Met-NH2 P71ArgAc-Cha-Arg-Tic-Nle-N(Me)BnP13 alle Ac-Cha-alle-Tic-Met-NH2 P72-1 ArgAc-Cha-Arg-Disc-Nle-N(Me)BnP14 alle Ac-Cha-alle-Thiq-Met-NH2P72-2 ArgAc-Cha-Arg-Disc-Nle-N(Me)BnP15-1Val Ac-Cha-Val-Disc-Met-NH2 P73ArgH-Cha-Arg-Tic-Nle-NMe2P15-2Val Ac-Cha-Val-Disc-Met-NH2 P75-1 ArgAc-Cha-Arg-Hbc-Nle-N(Me)BnP16-1Orn Ac-Cha-Orn-Disc-Met-NH2 P75-2 ArgAc-Cha-Arg-Hbc-Nle-N(Me)BnP16-2Orn Ac-Cha-Orn-Disc-Met-NH2 P79ArgAc-Cha-Arg-Phe-Nle-N(Me)BnP17-1alle Ac-Cha-alle-Disc-Met-NH2P81ArgAc-Cha-Arg-Tic-Nle-N(CH2CH2OH)CH2CH2PhP17-2alle Ac-Cha-alle-Disc-Met-NH2P82ArgAc-Cha-Arg-Tic-Nle-N(H)CH2CH2PhP18-1Orn Ac-Cha-Orn-azaTicMet(O)-NH2 P83ArgAc-Cha-Arg-Tic-Nle-N(Me)CH2CH2PhP18-2Orn Ac-Cha-Orn-azaTic-Met-NH2 P84ArgAc-Cha-Arg-Tic-Met-N(Me)CH2CH2PhP20 Arg Ac-Cha-Arg-azaTic-Met-NH2 P85ArgAc-Cha-Arg-Tic-Met-N(CH2CH2OH)CH2CH2PhP21 Arg Ac-Cha-Arg-D-Tic-Met-NH2P86ArgAc-Cha-Arg-Tic-Nle-N(CH2CH2Ph)CH2CH2OCH2CH2OHP22 Cit Ac-Cha-Cit-Disc-Met-NH2 P89ArgAc-Cha-Arg-Tic-NBu2P24 Cit Ac-Cha-Cit-D-Tic-Met-NH2P90ArgAc-Cha-Arg-Tic-Gly-N(Me)BnP25 Cit Ac-Cha-Cit-Tic-Met-NH2 P91ArgAc-Cha-Arg-Tic-Aib-N(Me)BnP26 Orn Ac-Cha-Orn-D-Tic-Met-NH2P92ArgAc-Cha-Arg-Tic-Nle-N(Me)CH2CH2OHP28 “Arg”Ac-YGRKKRRQRRR-(ACS)Cha-R-Tic-M-NH2 P93ArgZ-Cha-Arg-N(Me)BnP30 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-OH P94ArgAc-Cha-Arg-Tic-Aib-N(Bn)CH2CH2OHP31 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-NH2 P95ArgAc-Cha-Arg-Tic-Gly-N(Bn)CH2CH2OHP32 3Pya Ac-Cha-3Pya-Tic-Met-NH2 P96ArgAc-Cha-Arg-Tic-Met-N(CH2CH2Ph)CH2CH2OCH2CH2OHP33 Arg Ac-Cha-Arg-Tic-Met-βPhPro-[S(oxaz)L]-NMe2 P97ArgAc-Cha-Arg-Tic-N(H)BuP34 4Pya Ac-Cha-4Pya-Tic-Met-NH2 P98ArgAc-Cha-Arg-Tic-Nle-N(Bn)CH2CH2OCH2CH2OHP35-1aMeOrn Ac-Cha-αMeOrn-Tic-Met-NH2 P99ArgAc-Cha-Arg-Tic-Met-N(Bn)CH2CH2OCH2CH2OHP35-2aMeOrn Ac-Cha-αMeOrn-Tic-Met-NH2 P100 ArgAc-Cha-Arg-Tic-NH(C5H11)P36 Arg Ac-Cha-Arg-(N，N′-Et2)-Tic-Met-NH2
表3.a.根據(jù)式II的本發(fā)明某些化合物的生物學特性
表3.(續(xù))b.本發(fā)明式I的某些化合物的生物學特性
表4.本發(fā)明某些化合物及其某些含Arg等同物的T細胞活化在體內(nèi)被共免疫抑制
權(quán)利要求
1.一種具有式II結(jié)構(gòu)的化合物， 式II其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則A不存在，或者代表1-4個氨基酸或氨基酸類似物殘基序列；B代表2-8個氨基酸或氨基酸類似物殘基序列；W代表OR7或NR8R9，V每次出現(xiàn)時獨立代表C＝O、C＝S或SO2；X不存在，或者代表O、S或NR；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或低級烷基；R1代表取代或未取代的烷基、雜烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)基烷基部分；R2代表取代或未取代的烷基、雜烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)基烷基部分，優(yōu)選疏水部分，或者R2和R結(jié)合在一起形成環(huán)，所述環(huán)具有5-7元、優(yōu)選6-7元、任選被1-5個取代基取代和/或與一個或多個其它環(huán)例如芳環(huán)、雜環(huán)或碳環(huán)形成多環(huán)結(jié)構(gòu)；i為0-1的整數(shù)；j為1-2的整數(shù)；k為1-3的整數(shù)；且R6不存在，或者代表1-4個與其連接的含氮環(huán)上的取代基，所述取代基選自取代或未取代的低級烷基、鹵代烷基、鹵基、羥基和氨基。R7、R8和R9獨立代表選自以下的取代基H以及取代或未取代的烷基、雜烷基、芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基和雜環(huán)基烷基，或者其中R8和R9結(jié)合在一起形成環(huán)，所述環(huán)具有5-7元、任選被1-5個取代基取代和/或與一個或多個其它環(huán)例如芳環(huán)、雜環(huán)或碳環(huán)形成多環(huán)結(jié)構(gòu)。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R6不存在。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中R1、R7、R8和R9中至少一個為疏水殘基。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中A代表0或1個氨基酸或氨基酸類似物殘基。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中B代表2-6個氨基酸或氨基酸類似物殘基。
6.權(quán)利要求1的化合物，其中B代表2-4個氨基酸或氨基酸類似物殘基。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物具有免疫抑制活性。
8.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物抑制MHC介導的T細胞活化。
9.權(quán)利要求1的化合物，其中所述氨基酸殘基是α-氨基酸殘基。
10.權(quán)利要求1的化合物，其中R1XV結(jié)合在一起代表?；?br> 11.權(quán)利要求10的化合物，其中所述?；峭榛驶?、芳基羰基或氨基烷基羰基。
12.權(quán)利要求10的化合物，其中所述酰基是苯甲?；?、低級烷?；虻图壈被轷；?br> 13.權(quán)利要求10的化合物，其中所述?；且阴；?。
14.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物的結(jié)構(gòu)選自表1a中給出的結(jié)構(gòu)或由表1b的含Gpg的優(yōu)選亞單元構(gòu)建的結(jié)構(gòu)。
15.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物選自P60、P53、P47、P41-1、P69、P66-1、P76-1、P67、P74、P80、P101和P102。
16.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物與MHC II類蛋白結(jié)合。
17.權(quán)利要求16的化合物，其中所述MHC II類蛋白是DR分子。
18.權(quán)利要求16的化合物，其中所述MHC II類蛋白選自0401、0101和0404。
19.權(quán)利要求16的化合物，其中所述化合物與所述MHC II類蛋白結(jié)合的IC50高于選自以下的數(shù)值4μM、2μM、1μM、500nM和200nM。
20.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物顯示在小鼠血清中24小時后的穩(wěn)定性大于50％、60％、70％、80％和90％中的至少一個。
21.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物顯示在大鼠血清中24小時后的穩(wěn)定性大于10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％和90％中的至少一個。
22.一種藥用組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1的化合物以及藥學上可接受的賦形劑。
23.權(quán)利要求1的化合物在制備藥用組合物中的用途。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述藥用組合物用于治療或預(yù)防以MHC II類介導的T細胞活化或MHC II類蛋白在病理性炎癥部位表達為特征的病癥。
25.權(quán)利要求24的用途，其中所述病癥選自類風濕性關(guān)節(jié)炎、青少年關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、格雷夫斯病、胰島素依賴性糖尿病、發(fā)作性睡眠、牛皮癬、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、關(guān)節(jié)強硬性脊椎炎、同種異體移植物排斥、移植排斥、移植物抗宿主病、橋本甲狀腺炎、重癥肌無力、尋常性天皰瘡、甲狀腺炎、腎小球性腎炎、胰腺炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、斯耶格倫綜合征、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、大皰性類天皰瘡、古德帕斯徹綜合征、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、胰島炎、過敏性腸疾病和艾迪生病。
26.權(quán)利要求24的用途，其中所述病癥選自類風濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化。
27.一種用于抑制免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予動物權(quán)利要求1的化合物。
28.一種具有式I結(jié)構(gòu)的化合物， 式I其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則A不存在，或者代表1-4個氨基酸或氨基酸類似物殘基序列；B代表2-8個氨基酸或氨基酸類似物殘基序列；X不存在，或者代表O、S或NR；W代表OR7或NR8R9，V每次出現(xiàn)時獨立代表C＝O、C＝S或SO2；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或低級烷基；R1代表取代或未取代的烷基、雜烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)基烷基部分；R2代表取代或未取代的烷基、雜烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)基烷基部分，或者R2和R結(jié)合在一起形成環(huán)，所述環(huán)具有5-7元、任選被1-5個取代基取代和/或與一個具有一個或多個其它環(huán)形成多環(huán)結(jié)構(gòu)；R3代表取代或未取代的烷基、雜烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基或雜環(huán)基烷基部分；且R7、R8和R9獨立代表選自以下的取代基H以及取代或未取代的烷基、雜烷基、芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基和雜環(huán)基烷基，或者其中R8和R9結(jié)合在一起形成環(huán)，所述環(huán)具有5-7元、任選被1-5個取代基取代和/或與一個或多個其它環(huán)形成多環(huán)結(jié)構(gòu)；其中W包括至少6個非氫原子。
29.權(quán)利要求30的化合物，其中R8和R9中至少一個選自芐基、苯乙基、2-羥乙基和-CH2CH2OCH2CH2OH。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于抑制免疫應(yīng)答、例如通過抑制II類MHC介導的T細胞活化而抑制免疫應(yīng)答的組合物和方法。本發(fā)明化合物和方法可以用來治療或預(yù)防類風濕性關(guān)節(jié)炎和/或多發(fā)性硬化等疾病。
文檔編號A61P5/40GK1652810SQ03811094
公開日2005年8月10日 申請日期2003年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月22日
發(fā)明者Z·納吉, T·布蘭德斯特特爾 申請人:Gpc生物科技股份公司