專利名稱：用于改善動(dòng)脈粥樣硬化的g類多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)脈粥樣硬化領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及通過口服給藥，而且能改善動(dòng)脈粥樣硬化或炎癥應(yīng)答的特征性其它疾病的一種或多種癥狀的一類肽的鑒定。
背景技術(shù)：
抑制素的引入(如Mevacor，Lipitor)在心臟病發(fā)作和中風(fēng)方面降低了死亡率約1/3。但是，心臟病發(fā)作和中風(fēng)仍然是死亡和殘疾的主要原因，尤其是在美國和西歐國家。心臟病發(fā)作和中風(fēng)是慢性炎癥疾病的結(jié)果，其被稱作動(dòng)脈粥樣硬化。
心血管疾病的形成中涉及到一些病原性因素，包括疾病的遺傳性因素，性別，生活方式因素如吸煙和飲食，年齡，高血壓和高血脂癥，包括高膽固醇血癥。其中一些因素，尤其是高血脂癥和高膽固醇血癥(高血液膽固醇濃度)提供了與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的重要危險(xiǎn)因子。
膽固醇在血液中以游離狀態(tài)和脂蛋白顆粒內(nèi)的酯化膽固醇存在，通常稱為乳糜顆粒，極低密度脂蛋白(VLDLs)，低密度脂蛋白(LDLs)和高密度脂蛋白(HDLs)。血液中總膽固醇的濃度受下列因素的影響(1)從消化道中吸收的膽固醇，(2)從飲食成分如碳水化合物，蛋白質(zhì)，脂肪和乙醇中合成的膽固醇，和(3)通過組織，尤其是肝臟從血液中去除膽固醇，并隨后將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，類固醇激素和膽汁膽固醇。
血液膽固醇濃度的維持受遺傳和環(huán)境因素的影響。遺傳因素包括膽固醇生物合成中的限速酶濃度，肝臟中低密度脂蛋白的受體濃度，膽固醇膽汁酸轉(zhuǎn)化的限速酶濃度，脂蛋白的合成和分泌速率以及人的性別。影響人體中血液膽固醇濃度的環(huán)境因素包括飲食結(jié)構(gòu)，吸煙的頻率，身體活動(dòng)和各種藥劑的使用。飲食變量包括脂肪的含量和類型(飽和的和多不飽和脂肪酸)，膽固醇的含量，纖維的含量和類型，和可能的維生素如維生素C和D以及礦物質(zhì)如鈣的量。
動(dòng)脈粥樣硬化的致病與低密度脂蛋白(LDL)的氧化密切相關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高密度脂蛋白(HDL)能防止LDL被氧化，但是在一些實(shí)例中發(fā)現(xiàn)加速了LDL氧化。動(dòng)脈粥樣硬化中的重要起始因子包括LDL-衍生的氧化磷脂產(chǎn)物。
正常的HDL能防止這些氧化磷脂的形成，而且一旦它們形成也能使其失活。但是，在一些情況下，HDL能從一種抗炎分子轉(zhuǎn)化為實(shí)際上促進(jìn)了這些氧化磷脂形成的前炎癥分子。
已經(jīng)表明HDL和LDL為先天免疫系統(tǒng)的部分(Navab et al.(2001)Arterioscler Thromb Vasc Biol.21481-488)。已經(jīng)使用模擬HDL，載脂蛋白A-I(apoA-1)的主要蛋白質(zhì)的A類兩親性螺旋多肽獲得了抗炎癥HDL(見如WO，02/15923)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了改善動(dòng)脈粥樣硬化和其它炎癥疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，狼瘡紅斑，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎(polyarteritis nodosa)，骨質(zhì)疏松癥，阿爾茨海默病(Altzheimer′s disease)和病毒性疾病如A型流感的癥狀的新的組合物和方法。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案中提供了“分離的”多肽，該多肽改善了動(dòng)脈粥樣硬化或與炎癥應(yīng)答相關(guān)的其它病變的癥狀，和/或包含該多肽的組合物。該多肽典型地包含一種在多肽的極性表面具有帶電荷殘基，而且具有寬大的非極性表面的兩親性螺旋多肽。該多肽長度一般至少為約10個(gè)氨基酸，和/或長度大約為40個(gè)或更小的多肽。多肽典型優(yōu)選含有G*兩親性螺旋。在某些實(shí)施方案中，多肽顯示與apo J有大于約50％，優(yōu)選大于約75％，更優(yōu)選大于約85％的序列同一性(在與所述多肽相同長度的結(jié)構(gòu)域之上)。本發(fā)明多肽優(yōu)選防止磷脂(例如，1-棕櫚酰-2-花生四烯酰(arachidonoyl)-sn-甘油-3-磷酸膽堿(PAPC)，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(SAPC)，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(SAPE)被氧化劑(例如13(S)-HPODE，15(S)-HPETE，HPODE，HPETE，HODE和HETE)所氧化。尤其優(yōu)選含有或由下面氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)所組成的多肽LLEQLNEQFNWVSRLANLTQGE(SEQ ID NO1)，LLEQLNEQFNWVSRLANL(SEQ ID NO2)，NELQEMSNQGSKYVNKEIQNAVNGV(SEQ IDNO3)，IQNAVNG VKQIKTLIEKTNEE(SEQ ID NO4)，RKTLLSNLEEAKKKKEDALNETRESETKLKEL(SEQ ID NO5)，PGVCNETMMALWEECK(SEQ ID NO6)，PCLKQTCMKFYARVCR(SEQ ID NO7)，ECKPCLKQTCMKFYARVCR(SEQ ID NO8)，LVGRQLEE FL(SEQ IDNO9)，MNGDRIDSLLEN(SEQ ID NO10)，QQTHMLDV MQD(SEQ IDNO11)，F(xiàn)SRASSIIDELFQD(SEQ ID NO12)，PFLEM IHEAQQAMDI(SEQID NO13)，PTEFIREGDDD(SEQ ID NO14)，RMKDQCDKCREILSV(SEQID NO15)，PSQAKLRRELDESLQVAE RLTRKYNELLKSYQ(SEQ ID NO16)，LLEQLNEQFNWVSRLANLT EGE(SEQ ID NO17)，DQYYLRVTTVA(SEQ ID NO18)，PSGVTEV VVKLFDS(SEQ ID NO19)，PKFMETVAEKALQEYRKKHRE(SEQ ID NO20)，WDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQF(SEQ ID NO21)，VATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQK(SEQ ID NO22)，RWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEEL(SEQ ID NO23)，LSSQVTQELRALMDETMKELKELKAYKSELEEQLT(SEQ ID NO24)，ARLSKELQAAQARLGADMEDVCGRLV(SEQ ID NO25)，VRLASHLRKLRKRLLR DADDLQKRLA(SEQ ID NO26)，PLVEDMQRQWAGLVEKVQA(SEQ IDNO27)，MSTYTGIFTDQVLSVLK(SEQ ID NO28)，和LLSFMQGYMKHATKTAKDALSS(SEQ ID NO29)。在某些實(shí)施方案中，多肽是這些氨基酸序列中兩種和多種的多聯(lián)體(concatamer)，和/或這些氨基酸序列中的一種或多種與apo A-I序列或其模擬物的多聯(lián)體(見如PCT公開WO02/15923與apo A-I相關(guān)的多肽/模擬物)。本發(fā)明的多肽含有保護(hù)基團(tuán)(如在氨基和/或羧基末端的保護(hù)基團(tuán))。保護(hù)基團(tuán)優(yōu)選包括，但不限于乙?；?，酰胺(amide)，3到20個(gè)碳原子的烷基，F(xiàn)moc，t-boc，9-芴乙?；?，1-芴羧基，9-芴羧基，9-芴酮-1-羧基，芐氧羰基，呫噸基(Xan)、三苯甲基(Trt)，4-甲基三苯甲基(Mtt)，4-甲氧基三苯甲基(Mmt)，4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰(Mtr)，1，3，5-三甲基苯(Mesitylene)-2-磺酰(Mts)，4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)，甲苯磺酰基(Tos)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃(chroman)-6-磺酰(Pmc)，4-甲芐基(MeBzl)，4-甲氧基芐基(MeOBzl)，芐氧基(BzlO)，芐基(Bzl)，苯甲?；?Bz)，3-硝基-2-吡啶磺酰基(sulphenyl)(Npys)，1-(4，4-dimentyl-2，6-二偶氮亞環(huán)己基)乙基(Dde)，2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)，2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)，2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)，芐氧基甲基(Bom)，t-丁氧基羰基(Boc)，環(huán)己氧基(cHxO)，t-丁氧基甲基(Bum)，t-丁氧基(tBuO)，t-丁基(tBu)，乙?；?Ac)，苯甲?；?，芐氧羰基，丙基，丁基，戊基，己基和三氟乙?；?TFA)。在某些實(shí)施方案中，該多肽含有一個(gè)與氨基末端偶聯(lián)的保護(hù)基團(tuán)，而且該氨基末端保護(hù)基團(tuán)是一種如苯甲?；?，乙?；?，丙烯基(propeonyl)，芐氧羰基，丙基，丁基，戊基，己基或3到20個(gè)碳烷基。在某些實(shí)施方案中，多肽含有與羧基末端偶聯(lián)的保護(hù)基團(tuán)，而且該羧基末端保護(hù)基團(tuán)為酰胺。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽含有一個(gè)或多個(gè)右旋“D”氨基酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽含有至少2個(gè)，優(yōu)選至少4，最優(yōu)選所有的“D”氨基酸。
在某些實(shí)施方案中，這里描述的多肽共價(jià)偶聯(lián)到磷脂上(例如溶血磷脂酰膽堿)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽偶聯(lián)到磷脂的sn-1或sn-2位置上(例如丙酰基，丁?；?，戊?；?，己酰基，庚?；?，辛?；?，壬酰基，癸?；?，十一烷酰基(undcanoyl)，月桂?；?，十三烷?；?，肉豆蔻酰基，十五烷?；?，棕櫚?；?，十七烷?；?，硬脂酰基，十九烷酰基(nonadecanoyl)，花生四烯酰，Heniecosanoyl，二十二烷?；?behenoyl)，Trucisanoyl，二十四烷酰基(lignoceroyl)，肉豆蔻腦酰基(myristoleoyl)(9-順式)，Myristelaidoyl(9-反式)，棕櫚油?；?9-順式)，Palmitelaidoyl(9-反式)等等)。
本發(fā)明的多肽可與藥理學(xué)上可接受的賦形劑制成制劑(如用于口服給藥，直腸給藥，鼻給藥，注射，等等的單位劑量)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種適于口服給藥的組合物，其能改善動(dòng)脈粥樣硬化或炎癥應(yīng)答的其它特征性疾病的癥狀。該組合物包含一種含有本文所述的兩親性螺旋(例如，G*螺旋)的多肽，其中該多肽包含一個(gè)或多個(gè)本文所述的“D”氨基酸，而且如本文所述該多肽在氨基末端和羧基末端被封閉。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物制劑(組合物)。藥物包括在藥學(xué)上可接受的賦形劑中的如本文所述的多肽。該制劑通常為單位劑量(如用于給哺乳動(dòng)物如人進(jìn)行口服，直腸，鼻或注射給藥)。
本發(fā)明也提供了一種改善哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化，或炎癥應(yīng)答的其它特征性疾病的癥狀的方法。該方法包括用本文所述的多肽或含有在多肽的極性表面具有帶電荷殘基并具有大的非極性表面的兩親性螺旋多肽的多肽多聯(lián)體對(duì)哺乳動(dòng)物(如人)給藥。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物為人(例如，診斷為患有或處于動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)中，中風(fēng)或與炎癥應(yīng)答相關(guān)的其它疾病的人)。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物為非人類的哺乳動(dòng)物(例如，犬，貓，牛，馬，豬等)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種改善炎癥應(yīng)答的特征性疾病的癥狀的方法(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，狼瘡紅斑，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，骨質(zhì)疏松癥，阿爾茨海默病和病毒性疾病如A型流感等)該方法涉及用本文所述的多肽或含有在多肽的極性表面具有帶電荷殘基并具有寬的非極性表面的兩親性螺旋多肽多肽多聯(lián)體對(duì)哺乳動(dòng)物(如人)給藥。
本發(fā)明還提供了改善動(dòng)脈粥樣硬化或炎癥應(yīng)答的其它特征性病變癥狀的試劑盒。該試劑盒典型地包括含有一種或多種本文所述的多肽的容器。該多肽能與藥學(xué)上可接受的賦形劑組合(例如在用于口服，鼻，直腸，注射給藥的單位劑量中)。該試劑盒還包括教導(dǎo)將多肽用于改善動(dòng)脈粥樣硬化或炎癥應(yīng)答的特征性病變的一種或多種癥狀的說明材料。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種減輕或預(yù)防哺乳動(dòng)物中與炎癥的急性期應(yīng)答相關(guān)的冠狀動(dòng)脈并發(fā)癥的方法，其中所述的冠狀動(dòng)脈并發(fā)癥是動(dòng)脈粥樣硬化的一種癥狀。該方法包括用本文所述的一種或多種多肽對(duì)具有急性期應(yīng)答或處于急性期應(yīng)答風(fēng)險(xiǎn)中的哺乳動(dòng)物給藥。給藥可以通過如口服給藥，鼻給藥，直腸給藥，腹膜內(nèi)注射和血管內(nèi)注射，皮下注射，經(jīng)皮膚給藥，肌肉注射等等途徑進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，多肽通過與相同多肽的全L-型組合給藥。在某些實(shí)施方案中，多肽作為在藥學(xué)上可接受的賦形劑中的單位制劑形式提供。急性期應(yīng)答可能是與復(fù)發(fā)性炎癥疾病相關(guān)的炎癥應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中，急性期應(yīng)答與包括但不局限于麻風(fēng)病，結(jié)核病，全身性紅斑狼瘡，風(fēng)濕性多肌痛，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎(polyarteritisnodosa)，硬皮病，特發(fā)性肺纖維化，慢性梗阻肺病，阿爾茨海默病和艾滋病(AIDS)，風(fēng)濕性多肌病，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，硬皮病(scleroderma)，特發(fā)性肺纖維化，慢性梗阻肺病，阿爾茨海默病，艾滋病，冠狀動(dòng)脈鈣化，鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄，骨質(zhì)疏松癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疾病相關(guān)。在某些實(shí)施方案中，急性期應(yīng)答是與如細(xì)菌感染，病毒感染，真菌感染，器官移植，傷口，種植修復(fù)體，寄生蟲感染，膿毒癥，內(nèi)毒素性休克綜合征以及生物膜形成疾病相關(guān)的炎癥應(yīng)答。
本發(fā)明還提供了一種減輕或預(yù)防哺乳動(dòng)物中與炎癥的急性期應(yīng)答相關(guān)的冠狀動(dòng)脈并發(fā)癥(coronary complication)的方法。其中冠狀動(dòng)脈并發(fā)癥為動(dòng)脈粥樣硬化癥狀。該方法包括檢測(cè)哺乳動(dòng)物(如人)中指示急性期應(yīng)答或急性期應(yīng)答顯著風(fēng)險(xiǎn)的急性期蛋白質(zhì)(APP)水平；用本文所述的多肽對(duì)顯示出指示急性期應(yīng)答的急性期蛋白質(zhì)(APP)水平的哺乳動(dòng)物進(jìn)行給藥。急性期蛋白質(zhì)(APP)可以為陽性APR如血清淀粉樣蛋白A，C-反應(yīng)性蛋白，血清淀粉樣蛋白P成分，C2補(bǔ)體蛋白，C3補(bǔ)體蛋白，C4補(bǔ)體蛋白，C5補(bǔ)體蛋白，C9補(bǔ)體蛋白，B補(bǔ)體蛋白，C1抑制劑，C4結(jié)合蛋白，纖維蛋白原，Von Willebrand因子，α1-抗胰蛋白酶，α1-抗胰凝乳蛋白酶，抗血纖維蛋白酶，肝素輔因子II，纖溶酶原活化因子抑制劑I，觸珠蛋白，血友病細(xì)菌(haemopexin)，血漿銅藍(lán)蛋白，超氧化錳歧化酶，α1-酸糖蛋白，血加氧酶，甘露糖結(jié)合蛋白，白細(xì)胞蛋白I，脂蛋白(a)以及脂多糖結(jié)合蛋白和/或陰性APR如包括白蛋白，前清蛋白，運(yùn)鐵蛋白，apoAI，apoAII，α2-HS糖蛋白，間-α胰蛋白酶(trypsin)抑制劑，富含組氨酸糖蛋白。
定義(注釋)術(shù)語“分離”，“純化”或“生物學(xué)上純化的”，當(dāng)涉及一種分離的多肽時(shí)，指基本上或本質(zhì)上沒有在其天然狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)通常帶有的成分的物質(zhì)。至于術(shù)語核苷酸和/或多肽也可指沒有在天然狀態(tài)下通常側(cè)接其的序列的核苷酸或多肽?；瘜W(xué)合成多肽是“分離的”，因?yàn)樗鼈冊(cè)谔烊粻顟B(tài)下不存在(如在血液，血清等)。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“分離的”指自然界沒有的多肽。
術(shù)語“多肽”，“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，是指氨基酸殘基的多聚體。該術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)于天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸多聚體，以及天然存在的氨基酸的多聚體。
術(shù)語“兩親性螺旋肽”指含有至少一個(gè)兩親性螺旋(兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域)的肽。本發(fā)明的某些兩親性螺旋肽可能含有兩個(gè)或多個(gè)(如3，4，5個(gè)等)兩親性螺旋。
術(shù)語“A類兩親性螺旋”指帶正電荷的殘基位于極性-非極性界面，負(fù)電荷的殘基位于極性表面的中心形成產(chǎn)生極性和非極性表面分離的α-螺旋的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(參見如Segrest et al.(1990)ProteinsStructure，F(xiàn)unction，andGenetics 8103-117)。
“載脂蛋白J”(apo J)已知有很多種名稱，包括叢生蛋白(clusterin)，TRPM2，GP80和SP40，40(Fritz(1995)Pp 112 InClusterinRole in VertebrateDevelopment，F(xiàn)unction，and Adaptation(Harmony JAK Ed.)，R.G.Landes，Georgetown，TX，)。它最初被描述為一種異二聚糖蛋白和培養(yǎng)的大鼠塞爾托利(Sertoli)細(xì)胞分泌性蛋白的組分(Kissinger et al.(1982)Biol Reprod；27233240)。翻譯產(chǎn)物為一種單鏈前體蛋白，其經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)剪切成二硫鍵(disulfide-linked)連接的34kDa的α亞基和47kDa的β亞基(Collard andGriswold(187)Biochem.，263297-3303)。它與細(xì)胞損傷，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，編程性細(xì)胞死亡有關(guān)，而且它可能也涉及由于細(xì)胞損傷或死亡而導(dǎo)致的細(xì)胞殘骸的清除。叢生蛋白已經(jīng)顯示能與多種高親和性分子包括脂質(zhì)，肽和蛋白質(zhì)和疏水探針1-苯胺基-8-萘磺酸鹽結(jié)合(Bailey et al.(2001)Bioc7lem.，4011828-11840)。
由于G類兩親性螺旋是在球狀蛋白中發(fā)現(xiàn)的，因此稱為G類。該類兩親性螺旋的特征是，它的正電荷和負(fù)電荷殘基隨機(jī)分布于帶有狹窄的非極性表面的極性表面。由于該狹窄的非極性表面，這類兩親性螺旋不能很容易地與磷脂結(jié)合(見Segrest et al.(1990)ProteinsStructure，F(xiàn)unction，andGenetics.8103-117；also see Erratum(199 )ProteinsStructure，F(xiàn)unction andGenetics，979)。幾種可交換載脂蛋白的特性與G兩親性螺旋相似但不完全相同。與G類兩親性螺旋相似的是，其它類的正和負(fù)電荷殘基隨機(jī)分別于極性表面。但是，相較于G類兩親性螺旋有一個(gè)狹窄的非極性表面，這類有一個(gè)大的非極性表面使其能容易地與磷脂結(jié)合，而且該類稱為G*以區(qū)分于G類兩親性螺旋(見Segrest etal.(1992)J.Lipid Res.，33141-166；also seeAnantharamaiah et al.(1993)Pp.109-142 InThe Amphipatlzic Helix，Epand，R.M.Ed CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida)。Jones等已經(jīng)描述了用于鑒定和對(duì)兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分類的計(jì)算機(jī)程序((1992)J.Lipid Res.33287-296)，其包括但不限于螺旋輪(wheel)程序(WHEEL or WHEEL/SNORKEL)，螺旋網(wǎng)程序(HELNET，HELNET/SNORKEL，HELNET/Angle)，螺旋輪加法程序(propram for addition of helical wheel)(COMBO or COMBO/SNORKEL)，螺旋網(wǎng)加法程序(COMNET，COMNET/SNORKEL，COMBO/SELECT，COMBO/NET)，共同(consensus)車輪程序(CONSENSUS，CONSENSUS/SNORKEL)，等等。
術(shù)語“改善”當(dāng)用于“改善動(dòng)脈粥樣硬化的一種或多種癥狀”時(shí)，指減少，預(yù)防或消除動(dòng)脈粥樣硬化和/或相關(guān)病變特征性的一種或多種癥狀。這種減少包括，但不限于氧化磷脂的減少或消除，動(dòng)脈粥樣硬化空斑形成和破裂的減少，臨床事件如心臟病發(fā)作，心絞痛或中風(fēng)的減少，高血壓緩解，炎癥蛋白生物合成的減少，血漿膽固醇的降低，等等。
術(shù)語“對(duì)映體氨基酸”是指能以至少兩種形式存在的氨基酸，而且所述的兩種形式互為不能重疊的鏡像。大多數(shù)的氨基酸(除甘氨酸外)是對(duì)映體，而且以所謂的L-型(L-氨基酸)或D-型(D-氨基酸)存在。大多數(shù)的天然存在的氨基酸是“L”氨基酸。術(shù)語“D氨基酸”和“L氨基酸”用于指氨基酸的絕對(duì)構(gòu)型，而不是平面偏振光具體的旋轉(zhuǎn)方向。本文的用法與本領(lǐng)域技術(shù)人員的標(biāo)準(zhǔn)用法一致。這里的氨基酸命名使用標(biāo)準(zhǔn)的1-字母或3-字母密碼，如按Industrial Property Information and Documentation手冊(cè)中的標(biāo)準(zhǔn)ST.25命名。
術(shù)語“保護(hù)基團(tuán)”指一種化學(xué)基團(tuán)，當(dāng)連接到氨基酸的官能團(tuán)(如側(cè)鏈，α氨基基團(tuán)，α羧基基團(tuán)等)上時(shí)，封閉或屏蔽了該官能團(tuán)的特性。優(yōu)選的氨基末端保護(hù)基團(tuán)包括，但不限于乙?；虬被鶊F(tuán)。其它氨基末端保護(hù)基團(tuán)包括，但不限于脂肪酸中的烷基鏈，丙烯基，甲酰基及其它。優(yōu)選的羧基末端保護(hù)基團(tuán)包括，但不限于形成酰胺或酯類的基團(tuán)。
短語“保護(hù)磷脂不被氧化劑氧化”，指化合物降低磷脂與氧化劑(如過氧化氫，13-(S)-HPODE，15-(S)-HPETE，HPODE，HPETE，HODE，HETE等)接觸時(shí)的磷脂氧化速率(或產(chǎn)生的氧化磷脂的量)的能力。
術(shù)語“低密度脂蛋白”或“LDL”按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員的通常用法定義。通常，LDL指當(dāng)通過超速離心進(jìn)行分離時(shí)，其密度范圍為d＝1.019到d＝1.063的脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物。
術(shù)語“高密度脂蛋白”或“HDL”按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員的通常用法定義。通常，HDL指當(dāng)通過超速離心進(jìn)行分離時(shí)，其密度范圍為d＝1.063到d＝1.21脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物。
術(shù)語“I組HDL”指使氧化型脂類(如在低密度脂蛋白中的)還原或防止氧化型脂類被氧化劑氧化的高密度脂蛋白或其成分(如apo A-I，對(duì)氧磷酶，血小板活化因子乙?；饷傅鹊?。
術(shù)語“II組HDL”指保護(hù)脂類不被氧化或在修復(fù)(例如，還原)氧化型脂類中的活性降低或無活性的HDL。
術(shù)語“HDL成分”是指包含高密度脂蛋白(HDL)的成分(例如分子)。對(duì)能保護(hù)脂類不被氧化或被修復(fù)(例如，使氧化型脂類還原)的HDL進(jìn)行的分析也包括對(duì)表現(xiàn)所述活性的HDL成分(例如，apo A-I，對(duì)氧磷酶，血小板活化因子乙?；饷傅?進(jìn)行的分析。
術(shù)語“人apo A-I肽”是指全長人apo A-I肽或其含有A型兩親性螺旋的片段或結(jié)構(gòu)域。
本文使用的“單核細(xì)胞反應(yīng)”是指具有與動(dòng)脈粥樣硬化斑形成相關(guān)的“炎癥應(yīng)答”特征的單核細(xì)胞活性。單細(xì)胞反應(yīng)的特征在于單核細(xì)胞附著到血管壁的細(xì)胞上(例如，血管內(nèi)皮的細(xì)胞)，和/或趨化進(jìn)入內(nèi)皮下空間，和/或單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞。
術(shù)語“沒有改變(absence of change)”當(dāng)指氧化型磷脂的量時(shí)，是指沒有可檢測(cè)到的改變，更優(yōu)選的是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的改變(例如(至少以85％，優(yōu)選至少以90％，更優(yōu)選至少以95％，最優(yōu)選至少以98％或99％的可信度水平)。沒有可檢測(cè)到的改變也可指這樣的檢測(cè)，其中氧化磷脂水平改變，但不比缺乏本文所述的蛋白質(zhì)或參照其它陽性或陰性對(duì)照時(shí)更大。
本文使用下列縮寫PAPCL-α-1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；POVPC1-棕櫚酰-2-(5-氧代戊?；?-sn-甘油-3-磷酸膽堿；PGPC1-棕櫚酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；PEIPC1-棕櫚酰-2-(5，6-環(huán)氧前列腺烷E2)-sn-甘油-3-磷酸膽堿；ChC182膽固醇亞油酸酯；ChC182-OOH膽固醇亞油酸酯氫過氧化物；DMPC1，2-雙十四烷酰-rac-甘油-3-磷酸膽堿；PON對(duì)氧磷酶；HPF標(biāo)準(zhǔn)化高能場；PAPCL-α-1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；BL/6C57BL/6J；C3HC3H/HeJ。
術(shù)語“保守取代”用于蛋白質(zhì)或肽時(shí)，是指基本上不改變分子的活性(特異性(例如，對(duì)脂蛋白而言))或結(jié)合親和力(例如對(duì)脂類或脂蛋白而言)的氨基酸取代。典型的保守氨基酸取代涉及一個(gè)氨基酸被具有相似化學(xué)特性(例如，電荷或疏水性)的另一氨基酸取代。下面6組中每組所含氨基酸互為典型的保守取代1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
本文中涉及兩個(gè)或多個(gè)核酸或多肽序列的術(shù)語“相同”或“同一性”百分?jǐn)?shù)，是指當(dāng)使用下列一種序列比較算法或通過肉眼觀察測(cè)量進(jìn)行最大對(duì)應(yīng)的比較和排列時(shí)，兩個(gè)或多個(gè)序列或亞序列是相同的或具有特定百分?jǐn)?shù)的氨基酸殘基或核苷酸是相同的。對(duì)于本發(fā)明的肽，序列同一性在該肽的全長上測(cè)定。
對(duì)于序列比較，一般以一個(gè)序列充當(dāng)參照序列，將待測(cè)序列與它進(jìn)行比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將待測(cè)和參照序列輸入計(jì)算機(jī)，如果需要，可指定亞序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)。然后序列比較算法按照指定的程序參數(shù)計(jì)算待測(cè)序列相對(duì)于參照序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)。
通過，例如Smith & Waterman，Adv.Appl.Macla.2482(1981)的局部同源性算法，Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性序列對(duì)比算法，Pearson & Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444的相似性檢索方法，這些算法的計(jì)算機(jī)化操作(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，andTFASTA，Wisconsin遺傳性軟件包，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，WI)，或通過肉眼檢查(通?？蓞⒁夾usubel etal.，出處同上)可進(jìn)行比較時(shí)的最佳序列對(duì)比。
一個(gè)有用的算法的例子是PILEUP。PILEUP使用漸進(jìn)的，逐對(duì)的序列對(duì)比實(shí)現(xiàn)一組相關(guān)序列的多序列對(duì)比以顯示其親緣關(guān)系和序列同一性百分?jǐn)?shù)。它也繪制了顯示聚類親緣關(guān)系的樹或樹狀圖用于實(shí)現(xiàn)序列對(duì)比。PILEUP使用Feng & Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35351-360的漸進(jìn)式序列對(duì)比方法的簡化形式。所用的方法相似于Higgins & Sharp(1989)CABIOS 5151-153所述的方法。該程序可對(duì)比多達(dá)300個(gè)序列，每個(gè)序列最大長度為5,000個(gè)核苷酸或氨基酸。多序列對(duì)比方法以逐對(duì)對(duì)比兩個(gè)最相似的序列開始，產(chǎn)生兩個(gè)對(duì)比序列的簇(cluster)。然后將該簇與下一個(gè)最相關(guān)的序列或?qū)Ρ刃蛄写剡M(jìn)行對(duì)比。通過兩個(gè)單序列的逐對(duì)對(duì)比的簡單延伸而對(duì)比兩個(gè)序列簇。通過一系列漸進(jìn)式逐對(duì)的對(duì)比實(shí)現(xiàn)最終的序列對(duì)比。通過指定具體序列和其序列比較區(qū)域的氨基酸或核苷酸坐標(biāo)和通過指定程序參數(shù)進(jìn)行該程序。例如，使用下列參數(shù)默認(rèn)空位加權(quán)(default gap weight)(3.00)，默認(rèn)空位長度加權(quán)(default gap length weight)(0.10)，和加權(quán)的末端間隔可比較參照序列與其它待測(cè)序列以測(cè)定序列相同性百分?jǐn)?shù)關(guān)系。
適合于測(cè)定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法的另一個(gè)例子是BLAST算法，它在Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410中描述。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過國家生物技術(shù)信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。該算法包括通過鑒定查詢序列中的短字串長度W首先鑒定高記分序列對(duì)(HSPs)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字串進(jìn)行序列對(duì)比時(shí)，它符合或滿足一些正值的閾值得分T。T稱為鄰近字串得分閾值(Altschul等，出處同上)。這些起始的鄰近字串命中(hit)充當(dāng)起動(dòng)搜索發(fā)現(xiàn)包含它們的更長HSP的種子(seed)。然后字串命中沿各序列的兩個(gè)方向延伸到可增加累積的序列對(duì)比得分的盡可能遠(yuǎn)處。對(duì)于核苷酸序列，使用參數(shù)M(匹配殘基對(duì)的獎(jiǎng)分；通常＞0)和N(錯(cuò)配殘基的罰分；通常＜0)計(jì)算累積得分。對(duì)于氨基酸序列，使用記分矩陣計(jì)算累積得分。當(dāng)累積序列對(duì)比得分從其最大達(dá)到值下降至定量X；由于累積一個(gè)或多個(gè)記負(fù)分的殘基對(duì)比導(dǎo)致累積記分趨于零或以下；或者到達(dá)任一序列的末端時(shí)停止在各個(gè)方向上的字串命中(word hits)延伸。BLAST算法參數(shù)W，T和X決定了序列對(duì)比的靈敏度和速度。BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)使用的默認(rèn)字串長度(W)為11，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，且比較兩條鏈。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默認(rèn)字串長度(W)為3，期望值(E)為10，以及BLOSUM62記分矩陣(參見Henikoff & Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915)。
除了計(jì)算序列同一性百分?jǐn)?shù)外，BLAST算法也進(jìn)行兩個(gè)序列之間的相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見，例如，Karlin & Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873-5787)。以BLAST算法進(jìn)行的一種相似性測(cè)量是最小總概率(P(N))，它提供了概率的指標(biāo)，其中兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的匹配隨機(jī)出現(xiàn)。例如，在待測(cè)核酸與參照核酸的比較中如果最小總概率小于大約0.1，更優(yōu)選小于大約0.01，且最優(yōu)選小于大約0.001，那么認(rèn)為核酸與參照序列相似。


圖1顯示了在共同培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，D4F(Navab，etal.(2002)Circulation，105290-292)和由D氨基酸組成的apoJ肽336對(duì)防止LDL-誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化活性的影響。數(shù)據(jù)為在4份培養(yǎng)物的9個(gè)高倍視野被轉(zhuǎn)移的單核細(xì)胞的數(shù)量的平均+/-SD。(D-J336＝Ac-LLEQLNEQFNWVSRLANLTQGE-NH2，SEQID NO1)。
圖2說明了通過用D-J336與D-4F比較對(duì)動(dòng)脈壁細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理以防止LDL誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化活性。數(shù)據(jù)為在4份培養(yǎng)物的9個(gè)高倍視野被轉(zhuǎn)移的單核細(xì)胞的數(shù)量的平均+/-SD。
圖3說明了在LDL受體裸小鼠中apoJ肽模擬物對(duì)HDL保護(hù)能力的影響。數(shù)值為在4個(gè)檢測(cè)孔的每個(gè)中9個(gè)高倍視野(high power field)被轉(zhuǎn)移的單核細(xì)胞的數(shù)量的平均+/-SD。
圖4說明了通過對(duì)來自口服肽的apoE裸小鼠的HDL防止了LDL誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化活性。數(shù)值為在4個(gè)檢測(cè)孔中每個(gè)中9個(gè)高倍視野被轉(zhuǎn)移的單核細(xì)胞的數(shù)量的平均+/-SD。星號(hào)表示與沒有肽的mHDL相比差異顯著(p＜0.05)。
圖5說明口服apoA-1肽模擬物與apoJ肽對(duì)LDL對(duì)氧化的敏感性的影響。數(shù)值為在4個(gè)檢測(cè)孔的每個(gè)中9個(gè)高倍視野被轉(zhuǎn)移的單核細(xì)胞的數(shù)量的平均+/-SD。星號(hào)表示與沒有肽的LDL相比差異顯著(p＜0.05)。
圖6說明了口服apoA-1肽模擬物與apoJ肽對(duì)HDL保護(hù)能力的影響。數(shù)值為在4個(gè)檢測(cè)孔的每個(gè)中9個(gè)高倍視野被轉(zhuǎn)移的單核細(xì)胞的數(shù)量的平均+/-SD。星號(hào)表示與沒有肽的mHDL相比差異顯著(p＜0.05)。
圖7說明了口服apoA-1肽模擬物與apoJ肽對(duì)血漿對(duì)氧磷酶活性的影響。數(shù)值為來自4個(gè)血漿等份的讀數(shù)的平均+/-SD。星號(hào)表示與沒有肽的對(duì)照血漿相比差異顯著(p＜0.05)。
圖8顯示了apoE-/-小鼠口服G*肽對(duì)HDL保護(hù)能力的影響。數(shù)值為來自4個(gè)血漿等份的讀數(shù)的平均+/-SD。星號(hào)表示與沒有肽的對(duì)照血漿相比差異顯著(p＜0.05)。
圖9顯示了ApoE-/-小鼠口服G*肽，146-156對(duì)HDL保護(hù)能力的影響。
發(fā)明詳述1、動(dòng)脈粥樣硬化癥狀的減輕本發(fā)明涉及的令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，在肽的極性表面具有分散的(例如隨機(jī)分布，偶然分布等等)電荷殘基的兩親性螺旋肽類似物具有抗炎特性，而且能改善動(dòng)脈粥樣硬化或炎癥應(yīng)答的其它特征性疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，狼瘡紅斑，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，骨質(zhì)疏松癥)的癥狀。本發(fā)明肽優(yōu)選通常模擬載脂蛋白J(apo J)的兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，肽是在肽的極性表面具有分散的電荷殘基(正和/或負(fù)電荷殘基)，而且具有大的非極性表面(稱為球狀蛋白樣，G*)兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域的兩親性螺旋肽類似物。這種兩親性螺旋G*結(jié)構(gòu)域是apoJ和某些其它載脂蛋白(例如，apo AI，apo AIV，apo E，apo CII，apo CIII，等等，但不包括apo A-II或apo C-I)特征性的。本發(fā)明肽優(yōu)選長度范圍從大約10到大約100個(gè)氨基酸，更優(yōu)選長度從約10到約60或80個(gè)氨基酸，最優(yōu)選從約10，15或20個(gè)氨基酸到約40或50個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，肽的長度范圍從約10到約40個(gè)氨基酸。本發(fā)明的某些肽尤其優(yōu)選顯示與apoJ或其片斷具有大于約40％，優(yōu)選大于約50％或60％，更優(yōu)選大于約70％或80％，最優(yōu)選大于約90％或95％序列同一性(長度范圍從約10到約40個(gè)氨基酸，例如與研究的肽同樣的長度)。
本發(fā)明的一個(gè)令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是，這種肽尤其當(dāng)含有一種或多種D型氨基酸時(shí)保留了相應(yīng)的L型肽的生物學(xué)活性。此外，這些肽甚至經(jīng)過口服傳遞時(shí)仍顯示體內(nèi)活性。肽血清半壽期提高，且具有減輕或預(yù)防/抑制動(dòng)脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的能力。
我們發(fā)現(xiàn)正常的HDL抑制適度氧化的LDL形成中的3個(gè)步驟。在這些研究中(參見，例如WO 02/15923)，我們證實(shí)用apo A-I或apo A-I模擬肽(37pA)體外處理人LDL，從包括HPODE和HPETE的LDL中去掉了播種(seeding)分子。這些播種分子對(duì)于人動(dòng)脈壁細(xì)胞的共培養(yǎng)物能氧化LDL，以及對(duì)于LDL誘導(dǎo)動(dòng)脈壁細(xì)胞產(chǎn)生單核細(xì)胞趨化活性是必需的。我們也證實(shí)了將apo A-I注射進(jìn)小鼠或輸入人體后，從小鼠或人類志愿者分離的LDL對(duì)于人動(dòng)脈壁細(xì)胞的氧化有抗性且在動(dòng)脈壁細(xì)胞共培養(yǎng)物中不能誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化性活性。
沒有結(jié)合特定的理論，我們相信本發(fā)明肽的作用方式與PCT公開WO02/15923中所描述的apo A-I模擬物的活性相似。尤其，我們相信本發(fā)明是通過增強(qiáng)HDL的抗炎特性部分的起作用。尤其，我們認(rèn)為本發(fā)明的肽結(jié)合LDL中對(duì)LDL的氧化必需的播種分子，然后把播種分子運(yùn)離最終被分泌的地方。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)模擬載脂蛋白J的兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域的肽在保護(hù)LDL不被動(dòng)脈壁細(xì)胞氧化，和減少由于人動(dòng)脈壁細(xì)胞對(duì)LDL的氧化而致的LDL誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化活性方面尤其有效。Apo J具有稱為球狀蛋白樣或G*兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域的大的非極性表面。G類兩親性螺旋是在球狀蛋白中發(fā)現(xiàn)的，因此，命名為G類。該類兩親性螺旋的特征是，正或負(fù)電荷殘基隨機(jī)/偶然分布在帶有狹窄的非極性表面的極性表面。由于該狹窄的非極性表面，該類兩親性螺旋不能很容易地與磷脂結(jié)合(參見Segrest等(1990)ProteinsStructure，F(xiàn)unction，and Genetics.8103-117；還參見Erratum(1991)ProteinsStructure，F(xiàn)unction and Genetics，979)。幾種可交換載脂蛋白具有與G兩親性螺旋相似但不相同的特性。與G類兩親性螺旋類似，其它類也具有隨機(jī)分布在極性表面的正和負(fù)電荷殘基。但是，與具有狹窄非極性表面的G類兩親性螺旋相反，該類具有一個(gè)使其能容易地與磷脂結(jié)合的大的非極性表面，該類被稱為G*以使它能從G類兩親性螺旋中區(qū)別開來(參見Segrest等(1992)J.Lipid Res.，33141-166；也參見Anantharamaiah等(1993)Pp.109-142 In The Amphipathic Helix，Epand，R.M.Ed.，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida)。
本發(fā)明的一個(gè)令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是，在用動(dòng)脈壁細(xì)胞進(jìn)行的預(yù)培養(yǎng)中，使人動(dòng)脈壁細(xì)胞不能氧化LDL所需要的本發(fā)明的兩親性螺旋肽實(shí)際上低于所需要的apo A-I模擬肽如D4F。
我們證實(shí)，由D氨基酸合成的apo A-I模擬肽的口服給藥，極大的降低了小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化，獨(dú)立于血漿或HDL膽固醇濃度的改變。與apoA-I模擬物的作用相似，我們認(rèn)為模擬了由D氨基酸合成的apo J的兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域的合成肽，能通過口服或其它途徑包括注射給藥，而且將改善動(dòng)脈粥樣硬化和其它慢性炎癥疾病狀況。
本發(fā)明的肽可能包括所有的L型氨基酸。但是，發(fā)明者認(rèn)為含有一種或多種D型氨基酸，優(yōu)選所有的D型氨基酸(所有的對(duì)映體氨基酸都是D型的)的肽，通過口服給藥能提供更有效的傳遞，而且在循環(huán)中更穩(wěn)定。肽尤其優(yōu)選在一個(gè)或兩個(gè)末端被封閉(例如，用N-末端乙?；虲-末端酰胺化)。
本發(fā)明肽的保護(hù)功能在實(shí)施例1中舉例說明。對(duì)防止由于人動(dòng)脈壁細(xì)胞導(dǎo)致的LDL誘導(dǎo)的單核趨化活性所必需的該新類型肽的體外濃度比apoA-I模擬物(D4F)所需要的濃度低10到25倍(圖1中比較了DJ336與D4F)。類似地，在預(yù)培養(yǎng)中本發(fā)明的肽在由動(dòng)脈壁細(xì)胞抑制LDL氧化效力方面高10-25倍(圖2中比較DJ336與D4F)。如圖3所示，當(dāng)DJ335通過口腔給予LDL受體裸小鼠時(shí)，在給予HIL更多的保護(hù)以防止LDL誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化活性上DJ335與D4F基本上同樣有效。
圖4證實(shí)了當(dāng)被添加到飲用水中時(shí)，本發(fā)明的肽(DJ336)在增強(qiáng)apo E裸小鼠中的HDL保護(hù)能力上與D4F同樣有效。圖5證實(shí)了，當(dāng)添加到飲用水中時(shí)，通過誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化性活性測(cè)定，本發(fā)明的肽DJ336在給予來自apo E裸小鼠的LDL對(duì)被人動(dòng)脈壁細(xì)胞氧化的抗性方面比D4F稍更有效。圖6證實(shí)了，當(dāng)添加到飲用水中時(shí)，通過單核細(xì)胞趨化性活性的產(chǎn)生測(cè)定，在導(dǎo)致HDL抑制磷脂PAPC被人體動(dòng)脈壁細(xì)胞共培養(yǎng)物中的氧化HPODE所氧化方面，DJ336和D4F一樣有效(see Navab et al.(2001)J.LipidRes.421308-1317 for an explanation of the test system)。圖7證實(shí)了，當(dāng)添加到飲用水中時(shí)，在增強(qiáng)apo E裸小鼠的對(duì)氧磷酶活性上，DJ336至少與D4F同樣有效。
由于已經(jīng)懷疑許多炎癥疾病至少部分是由氧化脂類介導(dǎo)的，我們認(rèn)為本發(fā)明在改善已知或懷疑是由于氧化脂類的形成而致的疾病中也是有效的。這些疾病包括，但不局限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，狼瘡紅斑，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，骨質(zhì)疏松癥。
沒有結(jié)合特定的理論，我們認(rèn)為用本發(fā)明的一種或多種肽給藥(如注射)將改善A型流感的體征和癥狀。此外，該肽將顯著降低巨噬細(xì)胞流入到動(dòng)脈壁中。這在降低流感和其它病毒感染之后心臟病發(fā)作和中風(fēng)的高發(fā)生率中是很有用的。因此，本發(fā)明的肽能用于改善流感和多種其它的病毒疾病的體征和癥狀，并能降低經(jīng)常在這些病毒疾病之后的心臟病發(fā)作和中風(fēng)的發(fā)病率。
考慮到上述的問題，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了改善和/或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和/或與炎癥應(yīng)答有關(guān)的(特征性的)病變的一種或多種癥狀的方法。該方法典型的包括用本發(fā)明的一種或多種肽(或該肽的模擬物)對(duì)生物體，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人類給藥。該肽可按如本文所述，按照包括，但不限于注射，栓劑，鼻腔噴霧，定時(shí)釋放移植物，皮服貼劑，等等的很多標(biāo)準(zhǔn)方法中的任何一種給藥。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽通過口服給藥(例如，作為糖漿，膠囊或片劑)。
該方法包括用本發(fā)明的單個(gè)多肽給藥，或兩個(gè)或多個(gè)不同的多肽給藥。多肽可以單體或二聚體，寡聚體或多聚體的形式提供。在某些實(shí)施方式中，多聚體形式包括締合的單體(例如，通過離子鍵或疏水鍵連接)，而某些其它的多聚體形式包括共價(jià)連接的單體(直接連接或通過接頭連接)。
盡管本發(fā)明對(duì)于在人體中的用途進(jìn)行了描述，但是它也適用于動(dòng)物，例如獸醫(yī)用途。因此，優(yōu)選的生物體包括，但不限于人類，非人類的靈長類，犬，馬，貓，豬，有蹄類動(dòng)物，largomorph，等等。
本發(fā)明的方法不局限于表現(xiàn)出動(dòng)脈粥樣硬化(例如，高血壓，空斑形成和破裂，減少臨床事件如心臟病發(fā)作，心絞痛，或中風(fēng)，高水平的血漿膽固醇，高水平的低密度脂蛋白，高水平的極低密度脂蛋白，或炎癥蛋白，等等)的一種或多種癥狀的人類或非人類的動(dòng)物，而且可用于預(yù)防性情況。因此，可用本發(fā)明的肽(或其模擬物)對(duì)生物體給藥以預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的發(fā)生/形成。在這種情況下尤其優(yōu)選的受試者是表現(xiàn)出動(dòng)脈粥樣硬化的一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因素(如家族病史，高血壓，肥胖癥，高酒精消耗，吸煙，高血膽固醇，高血甘油酸三酯，提高的血LDL，VLDL，IDL或低HDL，糖尿病，或糖尿病的家族病史，高血脂，心臟病，心絞痛或中風(fēng)等)的受試者。
除了本發(fā)明的抑制肽動(dòng)脈粥樣硬化的肽的使用方法之外，本發(fā)明還提供了肽本身，配制成特別是用于口服傳遞的藥品的肽，以及用于治療和/或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的試劑盒。
II.與極性類癥應(yīng)答相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化癥狀的減輕本發(fā)明的抑制動(dòng)脈粥樣硬化的肽也用于許多其它情況。具體地說，我們觀察到心血管并發(fā)癥(例如，動(dòng)脈粥樣硬化，中風(fēng)等等)經(jīng)常與急性期炎癥應(yīng)答相伴或在其之后。該急性狀態(tài)的炎癥應(yīng)答經(jīng)常與復(fù)發(fā)性炎癥疾病(例如，麻風(fēng)病，肺結(jié)核，全身性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，病毒感染(例如，流感)，細(xì)菌感染，真菌感染，器官移植，傷口或其它外傷，移植修復(fù)，生物膜等等相關(guān)。
本發(fā)明的令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是用本文所述的一種或多種肽給藥，可減少或防止在急性期反應(yīng)期間或之后氧化磷脂的形成，從而減輕或消除與該狀況相關(guān)的心血管并發(fā)癥。
因此，例如，我們證實(shí)了流感感染的后果是HDL中對(duì)氧磷酶和血小板活化的乙酰水解酶活性減少。沒有結(jié)合特定的理論，我們相信，作為這些HDL酶活性損失的結(jié)果以及作為急性期反應(yīng)期間前體氧化劑蛋白與HDL的締合結(jié)果，HDL不再能夠預(yù)防LDL氧化且不再能夠防止LDL-誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞的單核細(xì)胞趨化性活性。
我們觀察到在用A型流感病毒感染后，每天注射低劑量的本發(fā)明多肽(例如，給小鼠20微克)的受試者中，對(duì)氧磷酶水平不但沒有下降，而且不產(chǎn)生超過背景的有生物學(xué)活性的氧化磷脂(參見，WO 02/15923，PCT/US01/26497)。
令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是，本文中所述類型的肽在哺乳動(dòng)物中與WO 02/15923中所述的apo-I模擬物所起的作用相似。考慮到這個(gè)發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為可用本發(fā)明的肽對(duì)在流感感染和可產(chǎn)生急性期炎癥應(yīng)答的其它事件(例如，由于病毒感染，細(xì)菌感染，外傷，移植，多種自身免疫疾病等等)期間已知具有冠狀動(dòng)脈疾病的患者給藥(例如，口服或注射)，因此，我們可以通過短期處理防止與產(chǎn)生這種炎癥狀況的病變相關(guān)的心臟病和中風(fēng)的發(fā)病率增加。
因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包含用本發(fā)明的一種或多種肽對(duì)處于急性炎癥應(yīng)答風(fēng)險(xiǎn)中或正經(jīng)受急性炎癥應(yīng)答，和/或處于動(dòng)脈粥樣硬化的癥狀的風(fēng)險(xiǎn)中或正經(jīng)受動(dòng)脈粥樣硬化的癥狀的受試者給藥。
例如，可用本發(fā)明的多肽對(duì)具有冠狀動(dòng)脈疾病或處于該疾病風(fēng)險(xiǎn)中的人在流感季節(jié)預(yù)防性給藥。患有復(fù)發(fā)性炎癥疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，各種自身免疫疾病等的人(或動(dòng)物)可用本發(fā)明的多肽進(jìn)行治療以減輕或防止動(dòng)脈粥樣硬化或中風(fēng)的形成?；加型鈧?，例如，急性損傷，組織移植等的人(或動(dòng)物)可用本發(fā)明的多肽進(jìn)行治療以減輕動(dòng)脈粥樣硬化或中風(fēng)的形成。
在某些情況下，該方法需要診斷急性炎癥應(yīng)答的發(fā)生或其風(fēng)險(xiǎn)。急性炎癥應(yīng)答一般涉及肝臟中代謝和基因調(diào)控的改變。它是一個(gè)動(dòng)態(tài)的體內(nèi)平衡過程，除了免疫，心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，它涉及身體的所有主要系統(tǒng)。正常情況下，急性期反應(yīng)僅持續(xù)幾天；然而，在慢性或復(fù)發(fā)性炎癥的情況中，急性期反應(yīng)的一些癥狀異常持續(xù)可引起與該疾病相伴的潛在(underlying)組織損傷，且也可導(dǎo)致其它并發(fā)癥，例如心血管疾病或蛋白質(zhì)沉積疾病如淀粉樣變性。
急性期反應(yīng)的一個(gè)重要方面是肝臟生物合成模式的根本性改變。在正常情況下，肝臟以穩(wěn)定狀態(tài)的濃度合成特征性范圍的血漿蛋白。這些蛋白質(zhì)中許多具有重要功能，且在炎癥刺激后在急性期反應(yīng)期間需要更高血漿水平的這些急性期反應(yīng)物(APRs)或急性期蛋白(APPs)。盡管大多數(shù)APRs通過肝細(xì)胞合成，但是有些通過包括單核細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的其它細(xì)胞類型產(chǎn)生。大多數(shù)APRs被誘導(dǎo)到超過正常水平的50％和幾倍之間。相反，主要APRs可增加到超過正常水平的1000-倍。這組蛋白包括血清淀粉樣蛋白A(SAA)和任一種人體C-反應(yīng)性蛋白(CPR)或其在小鼠中的同系物，血清淀粉樣蛋白P成分(SAP)。所謂的陰性APRs在急性期反應(yīng)期間的血漿濃度減少以便允許肝臟合成誘導(dǎo)型APRs的能力增加。
在某些實(shí)施方案中，急性期反應(yīng)，或其風(fēng)險(xiǎn)通過測(cè)量一種或多種APRs來評(píng)估。測(cè)量該標(biāo)志物是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，且存在提供該測(cè)量的商業(yè)公司(例如，Cardiotech Services，Louisville，KY可測(cè)量AGP)。
III.與冠狀動(dòng)脈鈣化和骨質(zhì)疏松相關(guān)的癥狀和狀況的減輕我們還鑒定了氧化脂類是冠狀動(dòng)脈鈣化和骨質(zhì)疏松癥的原因。而且，沒有結(jié)合具體的理論，我們認(rèn)為在鈣化性動(dòng)脈狹窄的發(fā)病機(jī)理中涉及相同的機(jī)制。
因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包含使用本發(fā)明所述肽以抑制或預(yù)防諸如風(fēng)濕性多肌痛，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，硬皮病，自發(fā)性肺纖維變性，慢性阻塞性肺疾病，阿爾茨海默氏病，AIDS，冠狀動(dòng)脈鈣化，鈣化性主動(dòng)脈狹窄，骨質(zhì)疏松癥等疾病的癥狀。
IV.優(yōu)選的肽及其制備優(yōu)選的肽本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是，模擬apo J的兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域的肽能減輕動(dòng)脈粥樣硬化和/或炎癥應(yīng)答的其它特征性病變的一種或多種癥狀。載脂蛋白J具有稱為球狀蛋白樣或G*兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域的大的非極性表面。G類兩親性螺旋是在球狀蛋白中發(fā)現(xiàn)的，因此命名為G類。該類兩親性螺旋的特征在于正電荷殘基和負(fù)電荷殘基隨機(jī)分布在帶有狹窄的非極性表面的極性表面。由于該狹窄非極性表面，使這類兩親性螺旋不容易與磷脂結(jié)合。G*類兩親性螺旋具有與G類兩親性螺旋相似但不完全相同的特征。與G類兩親性螺旋類似，G*類肽具有隨機(jī)分布于極性表面的正和負(fù)電荷殘基。但是，與具有狹窄的非極性表面的G類兩親性螺旋相反的是，G*類具有使該類能容易的結(jié)合磷脂的大的非極性表面，而且該類稱為G*以使其從G類兩親性螺旋中區(qū)分開來。
本發(fā)明的與apo J的G*兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域相關(guān)的各種合適的肽如表1所示。
表1.優(yōu)選用于本發(fā)明的與apo J的g*兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域相關(guān)的肽

但是本發(fā)明的肽并不限于apo J的G*變異體。一般來講，基本上來自任何其它蛋白優(yōu)選apo蛋白的G*結(jié)構(gòu)域也是合適的。這種蛋白具體的適合性可以使用保護(hù)活性(例如保護(hù)LDL不被氧化，等等)檢測(cè)很容易地測(cè)定，如在實(shí)施方案中所述的。一些尤其優(yōu)選的蛋白包括包括但不局限于apo AI，apo AIV，apo E，apoCII，apo CIII等蛋白的G*兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域或其變異體(例如保守性取代等等)。
某些優(yōu)選的與除apo J外的載脂蛋白的G*兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域相關(guān)的肽如表2所示。
表2.用于本發(fā)明的與除apo J外的載脂蛋白的G*兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域相關(guān)的肽

雖然表1和表2中所列的各種肽沒有保護(hù)基團(tuán)，但是在某些實(shí)施方案中(例如尤其是通過口服給藥的)，它們帶有一個(gè)或兩個(gè)保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選末端保護(hù)基團(tuán)。因此，例如，在某些實(shí)施方案中，本文所述的任何一種肽可以帶有，例如，一個(gè)保護(hù)氨基末端的乙?；?或一個(gè)保護(hù)羧基末端的酰胺基。這種“雙重保護(hù)肽”的一個(gè)例子是Ac-L-L-E-Q-L-N-E-Q-F-N-W-V-S-R-L-A-N-L-T-Q-G-E-NH2(SEQ ID NO1帶有封閉基團(tuán))，這些保護(hù)基團(tuán)中的任何一個(gè)或者兩個(gè)可以被消除和/或被本文中所述的另一個(gè)保護(hù)基團(tuán)取代。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽包含一個(gè)或多個(gè)本文中所述的D-型氨基酸(右旋優(yōu)于左旋)。在某些實(shí)施方案中，至少兩個(gè)對(duì)映體氨基酸，更優(yōu)選至少4個(gè)對(duì)映體氨基酸，最優(yōu)選至少8或10個(gè)對(duì)映體氨基酸是“D”型氨基酸。在某些實(shí)施方案中，本文中所述肽的每個(gè)氨基酸(例如每個(gè)對(duì)映體氨基酸)都是D-型氨基酸。
還應(yīng)該注意到表1和2中所列的肽并非完全包括的。使用本文提供的教導(dǎo)，可按常規(guī)產(chǎn)生其它的合適的肽(例如，通過保守的或半保守的取代(例如D被E取代)，延長，缺失等等)。因此，例如，一個(gè)實(shí)施方案利用SEQ IDNos1-29鑒定的肽中的任意一個(gè)或多個(gè)的截短形式。
更長的肽也是合適的。這種更長的肽可全部形成G或G*類兩親性螺旋，或者G類兩親性螺旋(或helix)能形成肽的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域。另外，本發(fā)明包含肽的多聚體形式。因此，例如表1或2中所示的肽可偶聯(lián)在一起(用一個(gè)或多個(gè)插入的氨基酸直接或者通過接頭(例如，碳接頭，或一個(gè)或多個(gè)氨基酸)偶聯(lián))。合適的接頭包括，但不局限于脯氨酸(-Pro-)，Gly4Ser3(SEQ IDNO30)，等等。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)舉例性的多聚體肽為(D-J336)-p-(D-J336)(也即Ac-L-L-E-Q-L-N-E-Q-F-N-W-V-S-R-L-A-N-L-T-Q-G-E-P-L-L-E-Q-L-N-E-Q-F-N-W-V-S-R-L-A-N-L-T-Q-G-E-NH2，SEQ ID NO31)。
本發(fā)明還包括使用包含一個(gè)或多個(gè)G或G*類兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域與一個(gè)或多個(gè)A類兩親性螺旋的“雜合”肽。合適的A類兩親性螺旋肽如PCT公開WO 02/15923所述。因此，舉例，一種“雜合”肽為(D-J336)-Pro-(4F)(即Ac-L-L-E-Q-L-N-E-Q-F-N-W-V-S-R-L-A-N-L-T-Q-G-E-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2，SEQ ID NO32)，等等。如上面所指出的，本發(fā)明的多肽優(yōu)選包括一個(gè)或多個(gè)D氨基酸，更優(yōu)選每個(gè)氨基酸都是本文所述的D氨基酸，和/或一個(gè)或兩個(gè)末端都被保護(hù)。優(yōu)選至少50％的對(duì)映體氨基酸是“D”型的，更優(yōu)選至少80％的對(duì)映體氨基酸是“D”型的，最優(yōu)選至少90％或甚至所有的對(duì)映體氨基酸都是“D”型氨基酸。
本發(fā)明的一個(gè)令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是，當(dāng)本發(fā)明的兩親性螺旋肽(例如，如圖3，4，5，6，7，8和9所示)摻入D氨基酸時(shí)，甚至當(dāng)口服給藥時(shí)它們?nèi)员Ａ羝浠钚?。另外，這種口服給藥導(dǎo)致相當(dāng)有效的吸收和顯著的血清半壽期，從而提供了減輕動(dòng)脈粥樣硬化和/或炎癥應(yīng)答的其它特征性病變的一種或多種癥狀的有效方法。
使用本文提供的教導(dǎo)，技術(shù)人員可按常規(guī)修飾所示的兩親性螺旋肽以產(chǎn)生本發(fā)明的其它合適的apo J變異體和/或兩親性G螺旋肽。例如，可對(duì)已有的氨基酸做出常規(guī)保守的或半保守的取代(例如，E取代D)。使用Palgunachari et al.(1996)Arteriosclerosis，Thrombosis，& Vascular Biology 16328-338所述的計(jì)算方法可推測(cè)各種取代對(duì)所得肽的脂親和力的影響。在保留該類螺旋結(jié)構(gòu)的前提下，該肽可被加長或縮短。另外，可進(jìn)行取代使所得的肽更類似于受試者物種內(nèi)源性產(chǎn)生的肽。
可使用計(jì)算方法進(jìn)行設(shè)計(jì)和/或評(píng)估新的肽。鑒定和對(duì)兩親性螺旋進(jìn)行分類的計(jì)算機(jī)程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，而且Jones et al.(1992)J.LipidRes.33287-296)也描述了很多。這種程序包括，但不限于螺旋輪程序(WHEEL或WHEEL/SNORKEL)，螺旋網(wǎng)程序(HELNET，HELNET/SNORKEL，HELNET/Angle)，螺旋車輪加法程序(COMBO或COMBO/SNORKEL)，螺旋網(wǎng)加法程序(COMNET，COMNET/SNORKEL，COMBO/SELECT，COMBO/NET)，共同車輪程序(CONSENSUS，CONSENSUS/SNORKEL)，等等。
但是，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽利用天然存在的氨基酸或天然存在的氨基酸的D型形式，但是也包括用非天然存在的氨基酸(例如，甲硫氨酸亞砜，甲硫氨酸甲基锍，正亮氨酸，ε-氨基己酸，4-氨基丁酸，四氫異喹啉-3-羧酸，8-氨基辛酸，4-氨基丁酸，Lys(N(ε)-三氟乙酰)，α-氨基異丁酸，等等)取代。
除了本文所述的G*類兩親性螺旋肽外，本文還包括肽模擬物。肽類似物在制藥工業(yè)中常用作具有類似于模板肽的特性的非肽類藥品。這些類型的非肽類化合物稱為“肽模擬物”或“模擬肽”(Fauchere(1986)Adv.Drug Res.1529；Veber and Freidinger(1985)TINS p.392；and Evans et al.(1987)J.Med.Chem.301229)，而且通常借助于計(jì)算機(jī)化的分子模擬形成。可使用結(jié)構(gòu)上相似于治療上有用的肽的肽模擬物產(chǎn)生相當(dāng)?shù)闹委熁蝾A(yù)防效果。
一般來說，肽模擬物在結(jié)構(gòu)上相似于示例多肽(例如，表1所示的SEQID NO1)，但具有一個(gè)或多個(gè)肽鍵被選自由-CH2NH-，-CH2S-，-CH2-CH2-，-CH＝CH-(順式或反式)，-COCH2-，-CH(OH)CH2-，-CH2SO-等組成的組中鍵按本領(lǐng)域已知的方法取代，該方法在下列參考文獻(xiàn)中進(jìn)一步描述Spatola(1983)p.267 in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，andProteins，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，；Spatola(1983)VegaData 1(3)Peptide Backbone Modifications.(general review)；Morley(1980)Trends Pharm Sci pp.463-468(general review)；Hudson et al.(1979)Int J PeptProt Res 14177-185(-CH2NH-，CH2CH2-)；Spatola et al.(1986)Life Sci 381243-1249(-CH2-S)；Hann，(1982)J Chem Soc PerkinTrans 1307-314(-CH-CH-，順式和反式)；Almquist etal.(1980)J Med Chem.231392-1398(-COCH2-)；Jennings-White et al.(1982)Tetrahedron Lett.232533(-COCH2-)；Szelke et al.，European Appln.EP 45665(1982)CA9739405(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladay et al.(1983)Tetrahedron Lett 244401-4404(-C(OH)CH2-)；和Hruby(1982)Life Sci.，31189-199(-CH2-S-))。
特別優(yōu)選的非肽鍵是-CH2NH-。該肽模擬物相對(duì)于多肽的實(shí)施方案具有明顯的優(yōu)勢(shì)，包括，例如生產(chǎn)更經(jīng)濟(jì)，化學(xué)穩(wěn)定性更高，藥理學(xué)特性增強(qiáng)(半壽期，吸收，效力，功效，等)，抗原性降低等。
另外，通過本領(lǐng)域已知的方法(Rizo and Gieraseh(1992)Ann.Rev.Biochem.61387)；例如，通過添加能形成分子內(nèi)二硫鍵以環(huán)化該肽的內(nèi)部半胱氨酸殘基可產(chǎn)生包含共有序列或基本上相同的共有序列變異的本文所述肽的循環(huán)取代或束縛肽(包括環(huán)化肽)。
肽的制備本發(fā)明中所用的肽使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)合成技術(shù)化學(xué)合成，特別是如果肽不包含“D”氨基酸殘基，則通過重組表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，甚至含有“D”氨基酸殘基的肽也通過重組表達(dá)。如果多肽是重組表達(dá)的，可在給生物體以唯一D型形式提供一種或多種氨基酸的環(huán)境中培養(yǎng)宿主生物(例如，細(xì)菌，植物，真菌細(xì)胞，等)。然后在該系統(tǒng)中重組表達(dá)的肽摻入到那些D氨基酸中。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以任意的本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的許多液相或固相肽合成技術(shù)化學(xué)合成該肽。固相合成是化學(xué)合成本發(fā)明的多肽的優(yōu)選方法，其中序列的C-末端氨基酸附著到不溶性支持物上，隨后在序列上依次添加剩下的氨基酸。固相合成技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的且其描述參見，例如，Barany and Merrifield(1963)Solid-Phase Peptide Synthesis；pp.3-284 in The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology.Vol.2Special Methods inPeptide Synthesis，Part A.；Merrifield et al.(1963)J.Am.Chem.Soc.，852149-2156，and Stewart et al.(1984)Solid Phase Peptide synthesis，第二版，Pierce Chem.Co.，Rockford，Ill。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用二苯甲基胺樹脂(benzhyderylamine resin)(Beckman Bioproducts，0.59mmol NH2/g樹脂)作為固相支持物通過固相肽合成程序合成該肽。COOH末端氨基酸(例如t-丁基羰基-Phe)通過4-(甲氧基)苯乙?；街焦滔嘀С治锷?。它是比常規(guī)的苯甲基酯鍵更穩(wěn)定的鍵，但是仍然可通過氫化作用完成的肽。使用甲酸作為氫供體的傳遞氫化可用于該目的。用于肽合成和合成肽的分析的詳細(xì)方案在附上Anantharamaiah等(1985)J.Biol.Chem.，260(16)10248-10255的小型增刊中描述。
應(yīng)注意到在肽的化學(xué)合成中，特別是包含D氨基酸的肽，合成通常產(chǎn)生除了所需全長產(chǎn)物外的許多截短的肽。純化過程(例如，HPLC)一般導(dǎo)致?lián)p失大量的全長產(chǎn)物。
本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是，在D型肽(例如D-4)的合成中，為了防止在純化最長形式中的損失，可以透析并使用混合物，從而消除了最后的HPLC純化。該混合物損失大約50％效價(jià)的高純度產(chǎn)物(例如，每份重量的蛋白質(zhì)產(chǎn)物)，但是該混合物含有大約6倍以上的肽且因此有更大的總活性。
D-型氨基酸通過在化學(xué)合成中簡單地使用D-型衍生氨基酸殘基在肽的一個(gè)或多個(gè)位置摻入D-氨基酸。用于固相肽合成的D型殘基可從許多供應(yīng)商(參見，例如，Advanced Chem Tech，Louisville；Nova Biochem，San Diego；Sigma，StLouis；Bachem California Inc.，Torrance，等)以商業(yè)途徑獲得。D-型氨基酸可在所需肽的任何位置摻入。因此，例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，肽可包含單個(gè)D-氨基酸，而在其它實(shí)施方案中，肽包含至少2個(gè)，一般至少3個(gè)，更常見至少4個(gè)，最常見至少5個(gè)，優(yōu)選至少6個(gè)，更優(yōu)選至少7個(gè)，最優(yōu)選至少8個(gè)D氨基酸。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，基本上每隔(對(duì)映體)一個(gè)氨基酸是D-型氨基酸。在某些實(shí)施方案中，至少90％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％的對(duì)映體氨基酸是D-型氨基酸。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，基本上每個(gè)對(duì)映體氨基酸都是D-氨基酸。
保護(hù)基團(tuán)在某些實(shí)施方案中，組成型氨基酸合/或末端氨基酸上的一個(gè)或多個(gè)R-基團(tuán)用保護(hù)基團(tuán)封閉。沒有結(jié)合具體的理論，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是本發(fā)明的試驗(yàn)肽的封閉，特別是氨基和/或羧基末端的封閉極大地改進(jìn)了口服傳遞且顯著提高了血清半壽期。
許多保護(hù)基團(tuán)適用于該目的。該基團(tuán)包括，但不局限于乙?；０坊?，和具有乙?；耐榛?，而且烷基尤其優(yōu)選用于N-末端保護(hù)，酰胺基優(yōu)選用于羧基末端保護(hù)。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，保護(hù)基團(tuán)包括，但不限于諸如在脂肪酸中的烷基鏈，丙烯基，甲?；?，等等。特別優(yōu)選的羧基保護(hù)基團(tuán)包括酰胺，酯和醚形成的保護(hù)基團(tuán)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，乙?；糜诒Ｗo(hù)氨基末端，酰胺基用于保護(hù)羧基末端。這些封閉基團(tuán)增強(qiáng)了肽形成螺旋的傾向。某些特別優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)包括各種長度的烷基基團(tuán)，例如，具有通式CH3-(CH2)n-CO-的基團(tuán)，其中n范圍是從大約1到大約20，優(yōu)選從大約1到大約16或18，更優(yōu)選從大約3到大約13，最優(yōu)選從大約3到大約10。
在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，保護(hù)基團(tuán)包括，但不限于諸如在脂肪酸中的烷基鏈，丙烯基，甲?；?，等等。特別優(yōu)選的羧基保護(hù)基團(tuán)包括酰胺，酯，和醚形成的保護(hù)基團(tuán)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，乙?；糜诒Ｗo(hù)氨基末端，酰胺基用于保護(hù)羧基末端。這些封閉基團(tuán)增強(qiáng)了肽形成螺旋的傾向。某些特別優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)包括各種長度的烷基基團(tuán)，例如，具有通式CH3-(CH2)n-CO-的基團(tuán)，其中n范圍是從大約3到大約20，優(yōu)選從大約3到大約16，更優(yōu)選從大約3到大約13，最優(yōu)選從約3到約10。
其它保護(hù)基團(tuán)包括，但不限于Fmoc，t-丁氧基羰基(t-BOC)，9-芴乙?；?fluoreneacetyl)，1-芴羧基(fluorenecarboxylic)，9-芴羧基，9-芴酮-1-羧基，芐氧羰基，呫噸基(Xan)，三苯甲基(Trt)，4-甲基三苯甲基(Mtt)，4-甲氧基三苯甲基(Mmt)，4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰(Mtr)，1，3，5-三甲基苯-2-磺酰(Mts)，4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)，甲苯磺?；?Tos)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰(Pmc)，4-甲芐基(MeBzl)，4-甲氧基芐基(MeOBzl)，芐氧基(BzlO)，芐基(Bzl)，苯甲酰基(Bz)，3-硝基-2-吡啶磺酰基(Npys)，1-(4，4-二甲基(dimentyl)-2，6-二偶氮亞環(huán)己基)乙基(Dde)，2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)，2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)，2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)，芐氧基甲基(Bom)，環(huán)己氧基(cHxO)，t-丁氧基甲基(Bum)，t-丁氧基(tBuO)，t-丁基(tBu)，乙?；?Ac)，和三氟乙?；?TFA)。
保護(hù)/封閉基團(tuán)是技術(shù)人員所熟知的，類似于將該基團(tuán)偶聯(lián)到包含本發(fā)明的肽合適殘基上的方法(參見，例如Greene et al.，(1991)Protective Groupsin Organic Synthesis，第二版，John Wiley & Sons，Inc.Somerset，N.J.)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，例如，合成期間當(dāng)肽在樹脂上使用醋酸酐實(shí)現(xiàn)乙?；Ｍㄟ^選擇合適的合成樹脂可實(shí)現(xiàn)酰胺保護(hù)。在該實(shí)施方案中本文所述肽合成期間，使用rihk酰胺樹脂。合成完成后，在諸如Asp和Glu的酸性雙官能氨基酸和堿性氨基酸Lys上的半永久性保護(hù)基團(tuán)和Tyr的羥基都同時(shí)被去掉。使用酸處理從該樹脂釋放的肽表現(xiàn)出n-末端被乙?；Ｗo(hù)，羧基被NH2保護(hù)，同時(shí)去掉了所有其它保護(hù)基團(tuán)。
V.增強(qiáng)肽吸收本發(fā)明令人驚奇的發(fā)現(xiàn)還有，當(dāng)所有L氨基酸肽(例如具有本發(fā)明的肽的序列的不同形式)與D-型(即本發(fā)明的肽)結(jié)合給藥時(shí)，D-型肽的吸收增加。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包含在本發(fā)明的方法中使用D-型和L-型肽的組合。D-型肽和L-型肽可具有不同的氨基酸序列，但是，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，它們都具有本文所述肽的氨基酸序列，在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，它們具有相同的氨基酸序列。
本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)還有，本發(fā)明的A兩親性螺旋肽的多聯(lián)體在減輕動(dòng)脈粥樣硬化的一種或多種癥狀中也是有效的。包含多聯(lián)體的單體可直接偶聯(lián)在一起或由接頭連接。在某些實(shí)施方案中，接頭是氨基酸接頭(例如，脯氨酸)，或肽接頭(例如Gly4Ser3，SEQ ID NO30)。在某些實(shí)施方案中，多聯(lián)體是2聚體，更優(yōu)選3聚體，甚至更優(yōu)選4聚體，最優(yōu)選5聚體，8聚體或10聚體。如上面所顯示的，多聚體可包含與PCT公開號(hào)WO 02/15923中所述的apoA-I變體締合的本文所述的G*相關(guān)兩親性螺旋。
VI.藥物制劑為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，可用本發(fā)明的一種或多種肽或肽模擬物對(duì)，例如，診斷為具有動(dòng)脈粥樣硬化的一種或多種癥狀，或處于動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體進(jìn)行給藥。肽或肽模擬物可以“天然”形式，或者如果需要，以鹽，酯，酰胺，前藥，衍生物等的形式給藥，前提是該鹽，酯，酰胺，前藥或衍生物是藥理學(xué)上合適的，即在該方法中有效。活性試劑的鹽，酯，酰胺，前藥和其它衍生物可使用合成有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備，該方法由，例如March(1992)Advanced Organic Chemistry；Reactions，Mechanisms and Structure，4th Ed.N.Y.Wiley-Interscience描述。
例如，使用一般涉及合適的酸反應(yīng)的常規(guī)方法從游離堿制備酸加成鹽。一般來說，該藥品的堿性形式溶于諸如甲醇或乙醇的極性有機(jī)溶劑中并向其中加入酸。所得的鹽可沉淀或者可通過加入極性較低的溶劑從溶液中制備出來。制備酸加成鹽的合適的酸包括有機(jī)酸，例如乙酸，丙酸，乙醇酸，丙酮酸，草酸，蘋果酸，丙二酸，琥珀酸，馬來酸，延胡索酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，肉桂酸，杏仁酸(mandelic acid)，甲磺酸，乙磺酸，對(duì)-甲苯磺酸，水楊酸等，以及無機(jī)酸，例如，鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等。通過用合適的堿處理可將酸加成鹽轉(zhuǎn)變成游離堿。特別優(yōu)選的本文的活性試劑的酸加成鹽是鹵化鹽，例如可使用鹽酸或氫溴酸制備的鹵化鹽。相反，肽或模擬物的堿性鹽的制備可使用諸如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化銨，氫氧化鈣，三甲銨等的藥學(xué)上可接受的堿以相似的方式制備。特別優(yōu)選的堿性鹽包括諸如鈉鹽的堿金屬鹽，和銅鹽。
酯的制備一般涉及可能存在于藥品分子結(jié)構(gòu)內(nèi)的羥基和/或羧基基團(tuán)的功能的發(fā)揮。酯一般是游離醇基團(tuán)的酰基取代衍生物，即來自通式為RCOOH的羧酸的半分子，其中R是烷基，優(yōu)選是低級(jí)烷基。如果需要，通過使用常規(guī)氫解或水解程序可將酯恢復(fù)成游離酸。
使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的或在相關(guān)文獻(xiàn)中所述的技術(shù)也可制備酰胺和前藥。例如，使用合適的胺反應(yīng)物可從酯制備酰胺，或者它們可通過與氨水或低級(jí)烷基胺反應(yīng)從酸酐或?；戎苽洹Ｇ八幰话阃ㄟ^半分子的共價(jià)連接制備，該連接產(chǎn)生在被個(gè)體的代謝系統(tǒng)修飾前無治療活性的化合物。
本文鑒定的肽或模擬物可用于腸胃外，體表，口服，鼻(或者吸入形式)，直腸，或局部給藥，例如通過氣溶膠或者經(jīng)過皮膚給藥，用于預(yù)防和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化和/或其癥狀。藥用組合物可根據(jù)給藥方法以各種單位劑量形式給藥。合適的單位劑量形式包括，但不局限于粉劑，片劑，丸劑，膠囊，錠劑，栓劑，貼劑，鼻腔噴霧劑，注射劑，植入的持久釋放劑，脂復(fù)合物等。
本發(fā)明的肽和/或肽模擬物一般與藥學(xué)上可接受的載體(賦形劑)組合以形成藥物學(xué)組合物。藥學(xué)上可接受的載體可含有用于例如，穩(wěn)定該組合物或增加或減少活性試劑的吸收的一種或多種生理學(xué)上可接受的化合物。生理學(xué)上可接受的化合物包括，例如碳水化合物，諸如葡萄糖，蔗糖，或葡聚糖，諸如抗壞血酸或谷胱甘肽的抗氧化劑，鰲合劑，低分子量蛋白，諸如脂類的保護(hù)和吸收增強(qiáng)劑，減少活性試劑清除或水解的成分，或賦形劑或其它穩(wěn)定劑和/或緩沖液。
其它生理學(xué)上可接受的化合物包括濕潤劑，乳化劑，分散劑或?qū)τ诜乐刮⑸锷L或作用特別有用的保存劑。各種保存劑(preservative)是熟知的，包括例如，苯酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可預(yù)料到包括生理學(xué)上可接受的化合物的藥學(xué)上可接受載體的選擇取決于，例如，活性試劑的給藥途徑和活性試劑的具體生理-生化特性。
賦形劑優(yōu)選是無菌的，而且一般不含不期望的雜質(zhì)。這些組合物可通過常規(guī)的熟知滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌。
在治療應(yīng)用中，將本發(fā)明的組合物以足以治愈或至少部分防止或阻止該疾病和/或其并發(fā)癥的量，對(duì)患有動(dòng)脈粥樣硬化的一種和多種癥狀或有動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的患者給藥。足以實(shí)現(xiàn)該目的的量定義為“治療有效量”。對(duì)該用途有效的量取決于該疾病的嚴(yán)重性和患者的總體健康狀態(tài)。組合物的單次或多次給藥可依賴于患者需要和耐受的劑量和頻率進(jìn)行給藥。在任何情況中，組合物應(yīng)提供足夠量的本發(fā)明的制劑的活性劑以有效治療患者(改善一種或多種癥狀)。
肽或模擬物的濃度可大范圍變化，且可以主要根據(jù)液體體積，粘度，體重等按選定的和患者需要的具體給藥方式作出選擇。然而，選定的濃度一般提供范圍從大約0.1或1mg/kg/天到大約50mg/kg/天且有時(shí)更高。典型的劑量范圍從大約3mg/kg/天到大約3.5mg/kg/天，優(yōu)選從大約3.5mg/kg/天到大約7.2mg/kg/天，更優(yōu)選從大約7.2mg/kg/天到大約11.0mg/kg/天，且最優(yōu)選從大約11.0mg/kg/天到大約15.0mg/kg/天。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，劑量范圍從大約10mg/kg/天到大約50mg/kg/天。在某些實(shí)施方案中，劑量范圍從大約20mg到大約50mg，每天口服兩次?？深A(yù)料到該劑量可變化以優(yōu)化對(duì)特定受試者和受試者群體的治療方案。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽或肽模擬物可按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法口服，(例如，經(jīng)過片劑)或者作為注射劑給藥。在其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，該肽也可以使用常規(guī)經(jīng)皮膚的藥物傳遞系統(tǒng)，即經(jīng)皮膚的“貼劑”通過皮膚傳遞，其中活性劑一般包含在用作藥物傳遞裝置以固定在皮膚上的層狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。在該結(jié)構(gòu)中，藥物組合物一般包含在上面襯背層(backing layer)下面的一層，或“儲(chǔ)存庫(reservoir)”中?？深A(yù)料到本文中的術(shù)語“儲(chǔ)存庫”是指最終可傳遞到皮膚表面的“活性成分”的總量。因此，例如，“儲(chǔ)存庫”可包括粘連在貼劑襯背層上，或者在本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任一種不同的基質(zhì)制劑上的活性成分。貼劑可含有單個(gè)儲(chǔ)存庫，或者可含有多個(gè)儲(chǔ)存庫。
在一個(gè)實(shí)施方案中，儲(chǔ)存庫包含用于在藥物傳遞期間將系統(tǒng)粘貼到皮膚上的可藥用接觸粘連材料的聚合體基質(zhì)。合適的皮膚接觸粘連材料的例子包括，但不局限于，聚乙烯，聚硅氧烷，聚異丁烯，聚丙烯酸酯，聚氨酯等。另外，包含藥物的儲(chǔ)存庫與皮膚接觸粘合劑作為分開的不同層存在，且粘合劑在儲(chǔ)存庫下面，在這種情況下，儲(chǔ)存庫可以是上述的聚合體基質(zhì)，或者可以是液態(tài)或水凝膠儲(chǔ)存庫，或者可采用一些其它形式。用作該裝置的上表面的這些層中的襯背層優(yōu)選用作“貼劑”的主要結(jié)構(gòu)元件且賦予該裝置更大的彈性。選擇用于襯背層的材料優(yōu)選對(duì)于活性劑和存在的任意其它物質(zhì)基本上不滲透。
用于體表藥物傳遞的其它優(yōu)選的制劑包括，但不局限于，軟膏和乳膏。軟膏是半固態(tài)制品，一般以凡士林(petroleum)或其它石油衍生物為基礎(chǔ)。含有選定活性劑的乳膏一般是粘性液體或半固態(tài)乳劑，通常是水包油或油包水型。乳膏基質(zhì)一般是可水洗的且含有油相，乳化劑和水相。油相有時(shí)也稱為“內(nèi)部”相，一般由凡士林和諸如鯨蠟基或硬脂?；嫉闹敬冀M成；盡管不是必然的，但水相通常在體積上超過油相，且一般含有濕潤劑。乳膏制劑中的乳化劑一般是非離子的，陰離子的，陽離子的或兩性表面活性劑。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員可預(yù)料到的，使用的特定軟膏或乳膏是提供最佳藥物傳遞的基質(zhì)。與其它載體或媒介物一樣，軟膏基質(zhì)應(yīng)是惰性的，穩(wěn)定的，無刺激的和不致敏的。
不同于一般的肽制劑，含有D-型氨基酸的本發(fā)明的肽甚至可以通過口服給藥，不需防止被胃酸等蛋白水解，盡管如此，在某些實(shí)施方案中，通過使用保護(hù)性賦形劑可增強(qiáng)肽傳遞。通過用導(dǎo)致其抗酸性和酶水解的成分絡(luò)合該多肽，或者通過在諸如脂質(zhì)體的適當(dāng)抗性載體中包裝該多肽一般可實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)。保護(hù)用于口服傳遞的多肽的方法是本領(lǐng)域熟知的(參見，例如，美國專利5,391,377描述的用于口服傳遞治療劑的脂類組合物)。
通過使用持續(xù)釋放蛋白質(zhì)的“包裝”系統(tǒng)可維持血清半壽期的升高。這種持續(xù)釋放系統(tǒng)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于蛋白質(zhì)和肽的ProLease可生物降解的微球體傳遞系統(tǒng)(Tracy(1998)Bioteclmol.Prog.14108；Johnson等(1996)，Nature Med.2795；Herbert et al.(1998)，Pharmaceut.Res.15，357)，是由在聚合體基質(zhì)中含有蛋白質(zhì)的可生物降解的聚合體微球體組成的干粉，它可作為含有或不含其它試劑的干燥制劑混合。
ProLease微球體的構(gòu)建方法被特別設(shè)計(jì)成達(dá)到較高的蛋白包裝效率，同時(shí)維持蛋白質(zhì)的完整性。該方法由下列步驟組成(i)通過噴霧凍干含穩(wěn)定賦形劑藥品溶液從大量蛋白質(zhì)制備凍干的蛋白質(zhì)顆粒，(ii)制備藥物聚合體懸液隨后通過超聲波處理或勻漿減少藥品顆粒大小，(iii)通過霧化進(jìn)液氮產(chǎn)生冷凍的藥物聚合體微球體，(iv)用乙醇提取聚合體溶劑，和(v)過濾并真空干燥以產(chǎn)生最終的干粉產(chǎn)物。所得的粉末含有固體形式的蛋白質(zhì)，它是均勻的且穩(wěn)固分散在多孔聚合體顆粒內(nèi)。該方法中最常用的聚合體，即poly(lactide-co-glycolide)(PLG)，是生物相容性的和可生物降解的。
包裝可在低溫(例如，-40℃)下完成。包裝期間，蛋白質(zhì)維持不含水的固態(tài)，從而最小化水誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，防止包含水作為反應(yīng)物的蛋白質(zhì)降解反應(yīng)，避免出現(xiàn)使蛋白質(zhì)遭受變性的有機(jī)-水界面。一個(gè)優(yōu)選的方法使用的溶劑對(duì)于大多數(shù)蛋白質(zhì)是不溶的，因此產(chǎn)生較高的包裝效率(例如，大于95％)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，溶液中的一種或多種成分作為“濃縮液”供應(yīng)，例如在易于稀釋的貯存容器(例如，預(yù)定的容積)中，或在易于加入一定體積水的可溶性膠囊中。
上述制劑和給藥方法是說明性的而不是限制性的?？深A(yù)料到使用本文提供的教導(dǎo)可容易地設(shè)計(jì)其它合適的制劑和給藥方式。
VII.基于脂類的制劑在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽與一種和多種脂類結(jié)合給藥。脂類可作為防止和/或增強(qiáng)肽的運(yùn)輸/吸收的賦形劑進(jìn)行配制或者它們可分開給藥。
沒有結(jié)合具體理論，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是用某些磷脂給藥(例如，口服給藥)可顯著增加HDL/LDL比率。另外，相信某些中等長度的磷脂通過不同于在一般脂類運(yùn)輸中涉及的方法進(jìn)行運(yùn)輸。因此，某些中等長度的磷脂與本發(fā)明的肽共同給藥提供了許多優(yōu)勢(shì)它們防止磷脂消化或水解，它們?cè)鰪?qiáng)了肽的吸收，且它們提高了HDL/LDL比率。
脂類可形成包裝本發(fā)明的多肽的脂質(zhì)體和/或它們可與該多肽絡(luò)合/混合和/或它們可與本發(fā)明的多肽共價(jià)連接。制備脂質(zhì)體和包裝試劑的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Martin and Papahadjopoulos(1982)J.Biol.Chem.，257286-288；Papahadjopoulos等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8811460-11464；Huang et al.(1992)Cancer Res.，526774-6781；Lasic等(1992)FEBS Lett.，312255-258.，等等)。
用于這些方法的優(yōu)選磷脂具有在sn-1和sn-2位置有從大約4個(gè)碳到大約24個(gè)碳范圍的脂肪酸。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酸是飽和的。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酸可以是不飽和的。表3中列出了各種優(yōu)選的脂肪酸。
表3.用于D多肽給藥的優(yōu)選磷脂的sn-1和sn-2位置中優(yōu)選的脂肪酸


在這些位置中的脂肪酸可以相同或不同。特別優(yōu)選的磷脂在sn-3位置具有磷脂膽堿。
VIII.其它藥理學(xué)活性劑其它藥理學(xué)活性劑可與基本活性劑，例如本發(fā)明的肽一起傳遞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑包括，但不局限于減小動(dòng)脈粥樣硬化事件和/或其并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)的試劑。該試劑包括，但不局限于β阻斷劑，β阻斷劑與thiazide利尿劑的組合，抑制素，阿司匹林，ace抑制劑，ace受體抑制劑(ARBs)，等等。
合適的β阻斷劑包括，但不局限于心臟選擇性(選擇性β1阻斷劑)，例如，醋丁洛爾(alebutolol)(SectralTM)，氨酰心安(atenolol)(TenorminTM)，倍他洛爾(betaxolol)(KerloneTM)，比索洛爾(bisoprolol)(ZebetaTM)，美托洛爾(metoprolol)(LopressorTM)，等等。合適的非選擇性阻斷劑(同等地阻斷β1和β2)包括，但不局限于卡替洛爾(carteolol)(CartrolTM)，納多洛爾(nadolol)(CorgardTM)，噴布洛爾(penbutolol)(LevatolTM)，吲哚洛爾(pindolol)(ViskenTM)，普萘洛爾(propranolol)(InderalTM)，噻嗎洛爾(timolol)(BlockadrenTM)，拉貝洛爾(labetalol)(NormodyneTM，TrandateTM)，等等。
合適的β阻斷劑thiazide利尿劑組合包括，但不局限于Lopressor HCT，ZIAC，Tenoretic，Corzide，Timolide，Inderal LA 40/25，Inderide，Normozide，等等。
合適的抑制素包括，但不局限于pravastatin(Pravachol/Bristol-MyersSquibb)，simvastatin(Zocor/Merck)，lovastatin(Mevacor/Merck)，等等。
合適的ace抑制劑包括，但不局限于captopril(例如，CapotentTMbySquibb)，benazepril(例如，LotensinTMby Novartis)，enalapril(例如，VasotecTMby Merck)，fosinopril(例如，MonoprilTMby Bristol-Myers)，lisinopril(例如，PrinivilTMby Merck or ZestrilTMby Astra-Zeneca)，quinapril(例如，AccuprilTMby Parke-Davis)，ramipril(例如，AltaceTMby Hoechst MarionRoussel，King Pharmaceuticals)，imidapril，perindopril erbumine(例如，AconTMby Rhone-Polenc Rorer)，trandolapril(例如，MavikTMby KnollPharmaceutical)，等等。合適的ARBS(Ace受體阻斷劑)包括但不局限于losartan(例如，CozaarTMby Merck)，irbesartan(例如，AvaproTMby Sanofi)，candesartan(例如，AtacandTMby Astra Merck)，valsartan(例如，DiovanTMbyNovartis)，等等。
IX.改善動(dòng)脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的試劑盒在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于改善動(dòng)脈粥樣硬化的一種或多種癥狀或用于預(yù)防性治療具有動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的受試者(人或動(dòng)物)的試劑盒。該試劑盒優(yōu)選包括含有本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)肽或肽模擬物的容器。肽或肽模擬物可以單位劑量制劑(例如，栓劑，片劑，膠囊，貼劑，等)供應(yīng)和/或任選與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑組合。
該試劑盒任選還包含用于治療心臟病和/或動(dòng)脈粥樣硬化的一種或多種其它試劑。該試劑包括，但不局限于，β阻斷劑，血管舒張劑，阿司匹林，抑制素，ace抑制劑或ace受體抑制劑(ARBs)等，例如，如上所述。
另外，該試劑盒任選包括為實(shí)施該方法或使用本發(fā)明的“治療劑”或“預(yù)防劑”提供指導(dǎo)(即，方案)的標(biāo)簽和/或說明性材料。優(yōu)選的說明性材料可描述本發(fā)明的一種或多種多肽減輕動(dòng)脈粥樣硬化的一種或多種癥狀和/或在有動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中防止一種或多種該癥狀的發(fā)作或增強(qiáng)的用途。說明性材料也可任選教導(dǎo)優(yōu)選的劑量/治療方案，計(jì)數(shù)指示等。
盡管說明性材料一般包含書面的或打印的材料，但是它們不限于這些。本發(fā)明還包含能儲(chǔ)存這些說明并將它們傳達(dá)給最終用戶的任何介質(zhì)。該介質(zhì)包括，但不限于電子儲(chǔ)存媒體(例如，磁盤，磁帶，盒式貯存器，芯片)，光學(xué)媒體(例如，CD ROM)，等等。該媒體可包括提供該說明性材料的因特網(wǎng)網(wǎng)址。
實(shí)施例下面的實(shí)施例用于舉例說明，但不是用于限制所要求保護(hù)的發(fā)明。
實(shí)施例1使用Apo J相關(guān)肽減輕動(dòng)脈粥樣硬化的癥狀防止LDL誘導(dǎo)的單核細(xì)胞的趨化活性圖1舉例比較了D-4F(circulation 2002；105290-292)與由D氨基酸(D-J336，Ac-L-L-E-Q-L-N-E-Q-F-N-W-V-S-R-L-A-N-L-T-Q-G-E-NH2，SEQ IDNO1)組成的apo J肽在體外的共培養(yǎng)中防止LDL誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化活性的作用。只用培養(yǎng)基(無添加物)培養(yǎng)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，用對(duì)照人LDL(200μg蛋白質(zhì)/ml)或?qū)φ杖薒DL+對(duì)照人HDL(350μg蛋白質(zhì)/ml)培養(yǎng)。D-J336或D-4F以指定的濃度范圍加上對(duì)照人LDL(200μg蛋白質(zhì)/ml)被添加到其它培養(yǎng)孔中。隨后進(jìn)行過夜培養(yǎng)，上清液用于檢測(cè)單核細(xì)胞的趨化活性。如圖1所示，防止由于人動(dòng)脈壁細(xì)胞而致的LDL-誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化活性的apo-J變異體肽的體外濃度比D-4F肽所要求的濃度低10到25倍。
用D-J336預(yù)處理動(dòng)脈壁細(xì)胞來防止LDL-誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化活性圖2舉例比較了在預(yù)培養(yǎng)中，D-4F與D-J336防止LDL誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化活性的作用。人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞用D-J336或D-4F以D-J336濃度為4，2和1μg/ml或D-4F濃度為100，50，25和12.5μg/ml預(yù)培養(yǎng)6小時(shí)。沖洗培養(yǎng)物并用培養(yǎng)基單獨(dú)培養(yǎng)(無添加物)，或用對(duì)照人LDL(200μg蛋白質(zhì)/ml)，或與對(duì)照人LDL+對(duì)照人HDL(350μg蛋白質(zhì)/ml)培養(yǎng)作為檢測(cè)對(duì)照。用肽預(yù)處理的孔接受200μg蛋白質(zhì)/ml的對(duì)照人LDL。接著進(jìn)行過夜培養(yǎng)，上清液用于檢測(cè)單核細(xì)胞的趨化活性。
如圖2所示，Apo J變異體肽在體外防止LDL被動(dòng)脈壁細(xì)胞氧化的效力要高10-25倍。
Apo J肽模擬物對(duì)裸小鼠中LDL受體HDL保護(hù)能力的作用D-4F命名為F，或由D氨基酸組成的apo J肽(D-J336，命名為J)以每ml飲用水0.25或0.5mg被添加到LDL受體裸小鼠(每組4個(gè))的飲用水中。24-或48-hrs后，收集小鼠的血液，分離它們的HDL，并檢測(cè)其防止LDL誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化活性的能力。檢測(cè)對(duì)照包括，沒有接受脂蛋白(沒有添加)的培養(yǎng)孔，或只有對(duì)照人LDL(命名為LDL，200μg膽固醇/ml)，或?qū)φ誏DL+對(duì)照人HDL(命名為+HDL，350μg膽固醇)。為了測(cè)試小鼠的HDL，對(duì)照LDL與小鼠HDL(+F HDL或+J HDL)一起添加到動(dòng)脈壁細(xì)胞培養(yǎng)物中。小鼠HDL分別以100μg膽固醇/ml添加。在用D-4F或D-J336處理之后，100μg/ml的小鼠HDL與350μg/ml的對(duì)照人HDL，在防止對(duì)照LDL誘導(dǎo)動(dòng)脈壁細(xì)胞產(chǎn)生單核細(xì)胞趨化活性上的作用是相同的。D-J336肽相對(duì)于D-4F在體外和體內(nèi)所要求的相對(duì)劑量之間的這種差異的原因可能是與這兩個(gè)肽在水中的溶解度，我們認(rèn)為當(dāng)測(cè)定要達(dá)到同等的溶解度時(shí)，D-J肽在體內(nèi)的活性比在體外要高得多。
來自口服肽的apoE裸小鼠的HDL防止LDL-誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化活性圖4說明了口服apo A-1肽模擬物和apoJ肽對(duì)HDL保護(hù)能力的影響。對(duì)ApoE裸小鼠(每組4只)給予每ml引用水中50，30，20，10，5μg的D-4F(命名為F)或每ml飲用水中50，30或20μg的apoJ肽(命名為J)。24hrs后收集血液，通過FPLC對(duì)血漿進(jìn)行分級(jí)分離，分別收集含LDL的級(jí)分(命名為mLDL或鼠LDL)和含有HDL的級(jí)分(命名為mHDL)，并通過檢測(cè)LDL-誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化活性測(cè)定了HDL防止LDL氧化的保護(hù)能力。為了檢測(cè)對(duì)照，培養(yǎng)孔不添加脂蛋白(不添加)，只有mLDL(濃度為200μg膽固醇/ml)，或mLDL+標(biāo)準(zhǔn)的正常人HDL(命名為Cont.h HDL，濃度為350μg HDL膽固醇/ml)。
為了檢測(cè)鼠HDL，mLDL與鼠HDL一起(+F mHDL或+J mHDL)被添加到動(dòng)脈壁細(xì)胞培養(yǎng)物中。來自在其飲用水中沒有添加任何肽的小鼠的HDL被命名為無肽mHDL。鼠HDL以100μg膽固醇/ml的濃度使用。在接受D-4F或D-J336后，100μg/ml的鼠HDL與350μg/ml的正常人HDL活性相當(dāng)。如圖4所示，當(dāng)添加到飲用水中時(shí)，D-J肽與D-4F在增強(qiáng)apo E裸小鼠的HDL保護(hù)能力方面同樣有效。
獲自口服肽的apoE裸(null)小鼠的LDL誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化活性的能力圖5說明了口服apo A-1肽模擬物和apoJ肽對(duì)LDL對(duì)氧化的易感性的影響。在ApoE裸小鼠(每組4只)的飲用水中給予了每ml飲用水中50，30，20，10，5μg D-4F(命名為F)或每ml飲用水中50，30或20μg apo J肽(D-J336由D氨基酸組成，命名為J)。24hrs后收集圖4所示的小鼠的血液，通過FPLC對(duì)血漿進(jìn)行分級(jí)分離，收集含LDL的級(jí)分(對(duì)于鼠LDL命名為mLDL)，并通過檢測(cè)誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化活性測(cè)定了LDL對(duì)氧化的敏感性。為了檢測(cè)對(duì)照，培養(yǎng)孔不添加脂蛋白(不添加)，只有mLDL(濃度為200μg膽固醇/ml)，或mLDL+標(biāo)準(zhǔn)的正常人HDL(命名為Cont.h HDL，濃度為350μg HDL/ml)。
來自接受D-4F(F mLDL)的小鼠或那些接受apoJ肽(J mLDL)的小鼠的鼠LDL，mLDL被添加到動(dòng)脈壁細(xì)胞培養(yǎng)物中。來自在它們的飲用水中沒有添加肽的小鼠的LDL被命名為無肽LDL。
如圖5所示，當(dāng)添加到飲用水中時(shí)，通過測(cè)定誘導(dǎo)的單核細(xì)胞的趨化活性，在給予來自apoE裸小鼠的LDL對(duì)被人動(dòng)脈壁細(xì)胞氧化的抗性方面，D-J336稍微比D-4F更加有效。
防止磷脂氧化和獲自口服apoE裸小鼠的HDL誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化活性圖6說明了，口服apoA-1肽模擬物和apoJ肽對(duì)HDL保護(hù)能力的影響。對(duì)ApoE裸小鼠(每組4只)給予每ml引用水中50，30，20，10，5μg的D-4F(命名為F)或每ml飲用水中50，30或20μg的apoJ肽(D-J336由D氨基酸組成，命名為J)。24hrs后收集血液，通過FPLC對(duì)血漿進(jìn)行分級(jí)分離，收集含HDL的級(jí)分(命名為mHDL)，并通過檢測(cè)誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化活性測(cè)定了HDL防止PAPC氧化的保護(hù)能力。為了檢測(cè)對(duì)照，培養(yǎng)孔不添加脂蛋白(不添加)，20μg/ml的磷脂PAPC+HPODE，1.0μg/ml，或PAPC+HPODE加上標(biāo)準(zhǔn)的正常人HDL(濃度為350μg HDL/ml，并命名為+Cont.h HDL)。
為了檢測(cè)鼠HDL，PAPC+HPODE與鼠HDL一起(+F mHDL或+J mHDL)被添加到動(dòng)脈壁細(xì)胞培養(yǎng)物中。來自在其飲用水中沒有添加任何肽的小鼠的HDL被命名為“無肽mHDL”。鼠HDL的使用濃度為100μg膽固醇/ml。
如圖6所示的數(shù)據(jù)表明，當(dāng)添加到飲用水中時(shí)，通過測(cè)定單核細(xì)胞趨化活性的產(chǎn)生，在引起HDL抑制磷脂PAPC被人動(dòng)脈壁細(xì)胞共培養(yǎng)物中的氧化型HPODE氧化方面，D-J336與D-4F同樣有效。
口服apo A-1肽模擬物和apoJ肽對(duì)小鼠中血槳對(duì)氧磷酶活性的作用圖7顯示了，口服apo A-1肽模擬物和apoJ肽對(duì)小鼠中血漿對(duì)氧磷酶活性的影響。對(duì)ApoE裸小鼠(每組4只)給予每ml引用水中50，10，5或0μg的D-4F(命名為F)或每ml飲用水中50，10或5μg的apoJ肽(D-J336由D氨基酸組成，命名為J)。24hrs后收集血液，并檢測(cè)血漿的PON1活性。這些數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)添加到飲用水中時(shí)，在增強(qiáng)apoE裸小鼠的對(duì)氧磷酶活性上，D-J336至少與D-4F同樣有效。
實(shí)施例2口服G*肽增強(qiáng)ApoE缺陷小鼠的HDL保護(hù)能力用具有以下氨基酸序列的G*肽處理雌性的4個(gè)月apoE缺陷小鼠肽113-122＝Ac-L V GRQLEEFL-NH2(SEQ ID NO.9)，肽336-357＝Ac-L L EQ L N E Q F N W V S R L A N L T Q G E-NH2(SEQ ID NO.17)，以及肽377-390＝Ac-P S G V T E V V V K L F D S-NH2(SEQ ID NO.19)。
每只小鼠通過胃管接受200μg肽。4小時(shí)后獲得血液，分離血漿，對(duì)脂蛋白進(jìn)行分級(jí)分離，并檢測(cè)HDL(濃度為25μg/ml)防止人動(dòng)脈壁細(xì)胞培養(yǎng)物中LDL被氧化的保護(hù)能力。數(shù)據(jù)顯示于圖8，在小鼠中肽提供了顯著的HDL保護(hù)能力。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用序列為Ac-QQ T H M L D V M Q D-NH2.(SEQ IDNO11)的11個(gè)氨基酸的G*肽146-156處理雌性的4個(gè)月apoE缺陷小鼠(每組n＝4)。小鼠在其飲用水中以指定濃度接受肽(見圖9)。18個(gè)小時(shí)后，收集血液，分離血漿，對(duì)脂蛋白進(jìn)行分級(jí)分離，并檢測(cè)HDL(濃度為50μg膽固醇/ml)防止人動(dòng)脈壁細(xì)胞培養(yǎng)物中的PAPC(濃度為25μg/ml)+HPODE(濃度為1.0μg/ml)被氧化的保護(hù)能力。檢測(cè)對(duì)照包括不添加，PAPC+HPODE和PAPC+HPODE加上對(duì)照HDL(命名為+HDL)。數(shù)據(jù)為在3份培養(yǎng)物的9個(gè)高倍視野被轉(zhuǎn)移的單核細(xì)胞的數(shù)量的平均+/-SD。星號(hào)表示在p＜0.05對(duì)于對(duì)照水的水平(0μg/ml)上顯著性。
可以理解的是，本文中所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于說明的目的，在其教導(dǎo)下本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以提出各種修改和改變，它們應(yīng)包含在本申請(qǐng)實(shí)質(zhì)精神和范圍以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文引證的所用出版物，專利和專利申請(qǐng)以其整體作為參考文獻(xiàn)在此引用以用于所有目的。
序列表<110>加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)(THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA)<120>用于改善動(dòng)脈粥樣硬化的G類多肽<130>407T-301100PC<140>PCT/US03/09988<141>2003-04-01<150>US 10/120,508<151>2002-04-05<160>32<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>22<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>1Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe Asn Trp Val Ser Arg Leu Ala1 5 10 15Asn Leu Thr G1u Gly Glu20<210>2<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>2Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe Asn Trp Val Ser Arg Leu Ala1 5 10 15Asn Leu<210>3<211>25<212>PRT
<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>3Asn Glu Leu Gln Glu Met Ser Asn Gln Gly Ser Lys Tyr Val Asn Lys1 5 10 15Glu Ile Gln Asn Ala Val Asn Gly Val20 25<210>4<211>21<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>4Ile Gln Asn Ala Val Asn Gly Val Lys Gln Ile Lys Thr Leu Ile Glu1 5 10 15Lys Thr Asn Glu Glu20<210>5<211>32<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>5Arg Lys Thr Leu Leu Ser Asn Leu Glu Glu Ala Lys Lys Lys Lys Glu1 5 10 15Asp Ala Leu Asn Glu Thr Arg Glu Ser Glu Thr Lys Leu Lys Glu Leu20 25 30<210>6<211>16<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>6Pro Gly Val Cys Asn Glu Thr Met Met Ala Leu Trp Glu Glu Cys Lys1 5 10 15<210>7<211>16<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>7Pro Cys Leu Lys Gln Thr Cys Met Lys Phe Tyr Ala Arg Val Cys Arg1 5 10 15<210>8<211>19<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>8Glu Cys Lys Pro Cys Leu Lys Gln Thr Cys Met Lys Phe Tyr Ala Arg1 5 10 15Val Cys Arg<210>9<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>9Leu Val Gly Arg Gln Leu Glu Glu Phe Leu1 5 10<210>10<211>12<212>PRT
<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>10Met Asn Gly Asp Arg Ile Asp Ser Leu Leu Glu Asn1 5 10<210>11<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>11Gln Gln Thr His Met Leu Asp Val Met Gln Asp1 5 10<210>12<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>12Phe Ser Arg Ala Ser Ser Ile Ile Asp Glu Leu Phe Gln Asp1 5 10<210>13<211>15<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>13Pro Phe Leu Glu Met Ile His Glu Ala Gln Gln Ala Met Asp Ile1 5 10 15<210>14<211>11<212>PRT<213>人工的
<220>
<223>合成的D肽.
<400>14Pro Thr Glu Phe Ile Arg Glu Gly Asp Asp Asp1 5 10<210>15<211>15<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>15Arg Met Lys Asp Gln Cys Asp Lys Cys Arg Glu Ile Leu Ser Val1 5 10 15<210>16<211>32<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>16Pro Ser Gln Ala Lys Leu Arg Arg Glu Leu Asp Glu Ser Leu Gln Val1 5 10 15Ala Glu Arg Leu Thr Arg Lys Tyr Asn Glu Leu Leu Lys Ser Tyr Gln20 25 30<210>17<211>22<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>17Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe Asn Trp Val Ser Arg Leu Ala1 5 10 15Asn Leu Thr Gln Gly Glu
20<210>18<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>18Asp Gln Tyr Tyr Leu Arg Val Thr Thr Val Ala1 5 10<210>19<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>19Pro Ser Gly Val Thr Glu Val Val Val Lys Leu Phe Asp Ser1 5 10<210>20<211>21<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>20Pro Lys Phe Met Glu Thr Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Glu Tyr Arg1 5 10 15Lys Lys His Arg Glu20<210>21<211>26<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>21Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys1 5 10 15Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe20 25<210>22<211>25<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>22Val Ala Thr Val Met Trp Asp Tyr Phe Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ala1 5 10 15Lys Glu Ala Val Glu His Leu Gln Lys20 25<210>23<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>23Arg Trp Glu Leu A1a Leu Gly Arg Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val1 5 10 15Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln Glu Glu Leu20 25<210>24<211>35<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>24Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met Asp Glu Thr
1 5 10 15Met Lys Glu Leu Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu20 25 30Gln Leu Thr35<210>25<211>26<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>25Ala Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala1 5 10 15Asp Met Glu Asp Val Cys Gly Arg Leu Val20 25<210>26<211>26<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>26Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg1 5 10 15Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala20 25<210>27<211>19<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>27
Pro Leu Val Glu Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys1 5 10 15Val Gln Ala<210>28<211>17<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>28Met Ser Thr Tyr Thr Gly Ile Phe Thr Asp Gln Val Leu Ser Val Leu1 5 10 15Lys<210>29<211>22<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<400>29Leu Leu Ser Phe Met Gln Gly Tyr Met Lys His Ala Thr Lys Thr Ala1 5 10 15Lys Asp Ala Leu Ser Ser20<210>30<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的肽接頭<400>30Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser1 5
<210>31<211>45<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽<220>
<221>misc_feature<223>氨基末端被?；?，羧基末端被酰胺化<400>31Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe Asn Trp Val Ser Arg Leu Ala1 5 10 15Asn Leu Thr Glu Gly Glu Pro Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe20 25 30Asn Trp Val Ser Arg Leu Ala Asn Leu Thr Glu Gly Glu35 40 45<210>32<211>41<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的D肽.
<220>
<221>misc_feature<223>氨基末端被?；然┒吮货０坊?amp;lt;400>32Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe Asn Trp Val Ser Arg Leu Ala1 5 10 15Asn Leu Thr Glu Gly Glu Pro Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys20 25 30Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu Ala Phe35 40
權(quán)利要求
1.一種改善動(dòng)脈粥樣硬化或與炎癥應(yīng)答相關(guān)的其它疾病癥狀的分離的多肽，所述的多肽含有在肽的極性表面具有帶電荷殘基并具有寬的非極性表面的兩親性螺旋多肽。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述肽的長度至少為10個(gè)氨基酸。
3.權(quán)利要求2的多肽，其中所述肽的長度為大約40個(gè)或更少的肽。
4.權(quán)利要求2的多肽，其中所述肽包含G*兩親性螺旋。
5.權(quán)利要求4的多肽，其中所述肽顯示與apoJ有大于約50％的序列同一性。
6.權(quán)利要求2的多肽，其中所述肽保護(hù)磷脂以防止被氧化劑所氧化。
7.權(quán)利要求2的多肽，其中所述肽包含選自下列序列的氨基酸LLEQLNEQFNWVSRLANLTQGE，(SEQ ID NO1)，LLEQLNEQFNWVSRLANL，(SEQ ID NO2)，NELQEMSNQGSKYVNKEIQNAVNGV，(SEQ ID NO3)，IQNAVNGVKQIKTLIEKTNEE，(SEQ ID NO4)，RKTLLSNLEEAKKKKEDALNETRESETKLKEL，(SEQ ID NO5)，PGVCNETMMALWEECK，(SEQ ID NO6)，PCLKQTCMKFYARVCR，(SEQID NO7)，ECKPCLKQTCMKFYARVCR，(SEQ ID NO8)，LVGRQLEEFL，(SEQ ID NO9)，MNGDRIDSLLEN，(SEQ ID NO10)，QQTHMLDVMQD，(SEQ ID NO11)，F(xiàn)SRASSIIDELFQD，(SEQ ID NO12)，PFLEMIHEAQQAMDI，(SEQ ID NO13)，PTEFIREGDDD，(SEQ ID NO14)，RMKDQCDKCREILSV，(SEQ ID NO15)，PSQAKLRRELDESLQVAERLTRKYNELLKSYQ，(SEQ ID NO16)，LLEQLNEQFNWVSRLANLTEGE(SEQ ID NO17)，DQYYLRVTTVA，(SEQID NO18)，PSGVTEVVVKLFDS，(SEQ ID NO19)，PKFMETVAEKALQEYRKKHRE，(SEQ ID NO20)，WDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQF(SEQ ID NO21)，VATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQK(SEQ ID NO22)，RWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEEL(SEQID NO23)，LSSQVTQELRALMDETMKELKELKAYKSELEEQLT(SEQ ID NO24)，ARLSKELQAAQARLGADMEDVCGRLV(SEQ ID NO25)，VRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLA(SEQID NO26)，PLVEDMQRQWAGLVEKVQA(SEQ ID NO27)，MSTYTGIFTDQVLSVLK(SEQ ID NO28)，或LLSFMQGYMKHATKTAKDALSS(SEQ ID NO29)。
8.權(quán)利要求7的肽，其中所述肽是兩個(gè)或更多個(gè)所述氨基酸序列的多聯(lián)體。
9.權(quán)利要求2的多肽，其中所述肽還含有保護(hù)基團(tuán)。
10.權(quán)利要求2的多肽，其中所述肽還包含偶聯(lián)到氨基或羧基末端的保護(hù)基團(tuán)。
11.權(quán)利要求9的多肽，其中所述的保護(hù)基團(tuán)是選自下面的基團(tuán)乙?；?，酰胺，3到20個(gè)碳原子的烷基，F(xiàn)moc，t-boc，9-芴乙?；?，1-芴羧基，9-芴羧基，9-芴酮-1-羧基，芐氧羰基，呫噸基(Xan)，三苯甲基(Trt)，4-甲基三苯甲基(Mtt)，4-甲氧基三苯甲基(Mmt)，4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰(Mtr)，1，3，5-三甲基苯-2-磺酰(Mts)，4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)，甲苯磺?；?Tos)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰(Pmc)，4-甲芐基(MeBzl)，4-甲氧基芐基(MeOBzl)，芐氧基(BzlO)，芐基(Bzl)，苯甲?；?Bz)，3-硝基-2-吡啶磺?；?Npys)，1-(4，4-dimentyl-2，6-二偶氮亞環(huán)己基)乙基(Dde)，2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)，2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)，2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)，芐氧基甲基(Bom)，t-丁氧基羰基(Boc)，環(huán)己氧基(cHxO)，t-丁氧基甲基(Bum)，t-丁氧基(tBuO)，t-丁基(tBu)，乙?；?Ac)，苯甲?；?，芐酯基，丙基，丁基，戊基，己基或三氟乙酰基(TFA)。
12.權(quán)利要求9的多肽，其中所述肽包含偶聯(lián)到氨基末端的保護(hù)基團(tuán)，而且所述的氨基末端保護(hù)基團(tuán)是選自苯甲?；阴；┗?，芐酯基，丙基，丁基，戊基，己基或3到20個(gè)碳原子的烷基的保護(hù)基團(tuán)。
13.權(quán)利要求9的多肽，其中所述肽包含偶聯(lián)到羧基末端的保護(hù)基團(tuán)，而且所述的羧基末端保護(hù)基團(tuán)為酰胺基。
14.權(quán)利要求9的多肽，其中所述肽還包含偶聯(lián)到氨基末端的第一保護(hù)基團(tuán)，其中所述的保護(hù)基團(tuán)是選自苯甲酰基，乙?；?，丙烯基，芐酯基，丙基，丁基，戊基，己基或3到20個(gè)碳原子的烷基的保護(hù)基團(tuán)；和偶聯(lián)到羧基末端的第二保護(hù)基團(tuán)，其中所述的羧基保護(hù)基團(tuán)是酰胺基。
15.權(quán)利要求2的多肽，其中所述肽包含偶聯(lián)到氨基末端的第一保護(hù)基團(tuán)和偶聯(lián)到羧基末端的第二保護(hù)基團(tuán)。
16.權(quán)利要求2的多肽，其中所述肽包含位于氨基末端的Ac基團(tuán)。
17.權(quán)利要求2的多肽，其中所述肽包含位于羧基末端的-NH2基團(tuán)。
18.權(quán)利要求2的多肽，其中所述肽包含位于氨基末端的Ac基團(tuán)和位于羧基末端的-NH2基團(tuán)。
19.權(quán)利要求7的多肽，其中所述肽包含位于氨基末端的Ac基團(tuán)。
20.權(quán)利要求7的多肽，其中所述肽包含位于羧基末端的-NH2基團(tuán)。
21.權(quán)利要求7的多肽，其中所述肽包含位于氨基末端的Ac基團(tuán)和位于羧基末端的-NH2基團(tuán)。
22.權(quán)利要求2的多肽，其中所述肽包含“D”氨基酸。
23.權(quán)利要求2的多肽，其中所述肽包含多數(shù)的“D”氨基酸。
24.權(quán)利要求2的多肽，其中含有所述肽的所有對(duì)映體氨基酸都是“D”氨基酸。
25.權(quán)利要求2的多肽，其中所述肽與藥學(xué)上可接受的賦形劑混合。
26.權(quán)利要求2的多肽，其中所述肽與適于口服給藥哺乳動(dòng)物的藥學(xué)上可接受的賦形劑混合。
27.權(quán)利要求6的多肽，其中所述的氧化劑選自過氧化氫，13(S)-HPODE，15(S)-HPETE，HPODE，HPETE，HODE或HETE。
28.權(quán)利要求6的多肽，其中所述的磷脂選自1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(PAPC)，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(SAPC)，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(SAPE)。
29.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽與磷脂偶聯(lián)。
30.權(quán)利要求29的多肽，其中所述多肽與磷脂共價(jià)偶聯(lián)。
31.權(quán)利要求29的多肽，其中所述多肽與含有溶血磷脂酰膽堿的磷脂共價(jià)偶聯(lián)。
32.權(quán)利要求29的多肽，其中所述多肽與選自丙?；□；祯；乎；?，庚酰基，辛酰基，壬酰基，癸酰基，十一烷?；?，月桂?；轷；?，肉豆蔻酰基，十五烷酰基，棕櫚?；咄轷；?，硬脂酰基，十九烷酰基，花生四烯酰，Heniecosanoyl，二十二烷酰基，Trucisanoyl，二十四烷?；舛罐⒛X?；?9-順式)，Myristelaidoyl(9-反式)，棕櫚油?；?9-順式)，Palmitelaidoyl(9-反式)的磷脂共價(jià)偶聯(lián)。
33.權(quán)利要求32的多肽，其中所述的多肽共價(jià)偶聯(lián)到所述磷脂的sn-1或sn-2位置。
34.一種適合于口服給藥改善動(dòng)脈粥樣硬化癥狀的組合物，其中所述的組合物包含的肽在該肽的極性表面具有帶電荷殘基而且具有寬的非極性表面的兩親性螺旋，其中所述肽含有D氨基酸，而且所述肽在氨基末端和羧基末端被封閉。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中所述肽長度至少為10個(gè)氨基酸。
36.權(quán)利要求35的組合物，其中所述肽的長度為大約40個(gè)或更少的肽。
37.權(quán)利要求35的組合物，其中所述肽含有G*兩親性螺旋。
38.權(quán)利要求37的組合物，其中所述肽與apoJ顯示大于約50％的序列同一性。
39.權(quán)利要求35的組合物，其中所述肽保護(hù)磷脂以防止被氧化劑所氧化。
40.權(quán)利要求35的組合物，其中所述肽包含選自下列的氨基酸序列LLEQLNEQFNWVSRLANLTQGE，(SEQ ID NO1)，LLEQLNEQFNWVSRLANL，(SEQ ID NO2)，NELQEMSNQGSKYVNKEIQNAVNGV，(SEQ ID NO3)，IQNAVNGVKQIKTLIEKTNEE，(SEQ ID NO4)，RKTLLSNLEEAKKKKEDALNETRESETKLKEL，(SEQ ID NO5)，PGVCNETMMALWEECK，(SEQ ID NO6)，PCLKQTCMKFYARVCR，(SEQID NO7)，ECKPCLKQTCMKFYARVCR，(SEQ ID NO8)，LVGRQLEEFL，(SEQ ID NO9)，MNGDRIDSLLEN，(SEQ ID NO10)，QQTHMLDVMQD，(SEQ ID NO11)，F(xiàn)SRASSIIDELFQD，(SEQ ID NO12)，PFLEMIHEAQQAMDI，(SEQ ID NO13)，PTEFIREGDDD，(SEQ ID NO14)，RMKDQCDKCREILSV，(SEQ ID NO15)，PSQAKLRRELDESLQVAERLTRKYNELLKSYQ，(SEQ ID NO16)，LLEQLNEQFNWVSRLANLTEGE(SEQ ID NO17)，DQYYLRVTTVA，(SEQID NO18)，PSGVTEVVVKLFDS，(SEQ ID NO19)，PKFMETVAEKALQEYRKKHRE，(SEQ ID NO20)，WDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQF(SEQ ID NO21)，VATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQK(SEQ ID NO22)，RWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEEL(SEQ ID NO23)，LSSQVTQELRALMDETMKELKELKAYKSELEEQLT(SEQ ID NO24)，ARLSKELQAAQARLGADMEDVCGRLV(SEQ ID NO25)，VRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLA(SEQID NO26)，PLVEDMQRQWAGLVEKVQA(SEQ ID NO27)，MSTYTGIFTDQVLSVLK(SEQ ID NO28)，或LLSFMQGYMKHATKTAKDALSS(SEQ ID NO29)。
41.權(quán)利要求35的組合物，其中所述的第一保護(hù)基團(tuán)和第二保護(hù)基團(tuán)獨(dú)立的選自下列基團(tuán)乙?；０?，3到20個(gè)碳原子的烷基，F(xiàn)moc，t-boc，9-芴乙酰基，1-芴羧基，9-芴羧基，9-芴酮-1-羧基，芐氧羰基，呫噸基(Xan)，三苯甲基(Trt)，4-甲基三苯甲基(Mtt)，4-甲氧基三苯甲基(Mmt)，4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰(Mtr)，1，3，5-三甲基苯-2-磺酰(Mts)，4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)，甲苯磺?；?Tos)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰(Pmc)，4-甲芐基(MeBzl)，4-甲氧基芐基(MeOBzl)，芐氧基(BzlO)，芐基(Bzl)，苯甲?；?Bz)，3-硝基-2-吡啶磺?；?Npys)，1-(4，4-dimentyl-2，6-二偶氮亞環(huán)己基)乙基(Dde)，2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)，2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)，2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)，芐氧基甲基(Bom)，t-丁氧基羰基(Boc)，環(huán)己氧基(cHxO)，t-丁氧基甲基(Bum)，t-丁氧基(tBuO)，t-丁基(tBu)，乙酰基(Ac)，苯甲酰基，芐酯基，丙基，丁基，戊基，己基或三氟乙酰基(TFA)。
42.權(quán)利要求35的組合物，其中所述的第一保護(hù)基團(tuán)是乙酰基。
43.權(quán)利要求35的組合物，其中所述的第二保護(hù)基團(tuán)是酰胺。
44.權(quán)利要求35的組合物，其中含有所述肽的對(duì)映體氨基酸超過一半是D氨基酸。
45.權(quán)利要求35的組合物，其中含有所述肽的所有對(duì)映體氨基酸都是D氨基酸。
46.權(quán)利要求35的組合物，其中所述組合物還含有藥學(xué)上可接受的賦形劑。
47.權(quán)利要求46的組合物，其中所述的賦形劑是適合于口服給藥的賦形劑。
48.權(quán)利要求46的組合物，其中所述的賦形劑是適合于注射的賦形劑。
49.一種藥物組合物，所述的組合物含有包含于藥學(xué)上可接受的賦形劑中的權(quán)利要求1的多肽。
50.權(quán)利要求49的組合物，其中所述的組合物含有單位劑量制劑。
51.權(quán)利要求35的組合物，其中所述的多肽與磷脂偶聯(lián)。
52.權(quán)利要求51的組合物，其中所述多肽與磷脂共價(jià)偶聯(lián)。
53.權(quán)利要求51的組合物，其中所述多肽與含有溶血磷脂酰膽堿的磷脂共價(jià)偶聯(lián)。
54.權(quán)利要求51的組合物，其中所述的多肽與選自丙酰基，丁?；祯；乎；?，庚酰基，辛?；?，壬酰基，癸酰基，十一烷?；鹿瘐；轷；舛罐Ⅴ；?，十五烷酰基，棕櫚酰基，十七烷?；?，硬脂酰基，十九烷酰基，花生四烯酰，Heniecosanoyl，二十二烷酰基，Trucisanoyl，二十四烷?；?，肉豆蔻腦酰基(9-順式)，Myristelaidoyl(9-反式)，棕櫚油?；?9-順式)，Palmitelaidoyl(9-反式)的磷脂共價(jià)偶聯(lián)。
55.一種改善哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化的癥狀的方法，所述方法包括用肽或含有在肽的極性表面上具有帶電荷殘基和具有大的非極性表面的兩親性螺旋的肽的多聯(lián)體對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述肽長度至少為10個(gè)氨基酸。
57.權(quán)利要求56的組合物，其中所述肽的長度為大約40個(gè)或更少的肽。
58.權(quán)利要求56的組合物，其中所述肽含有G*兩親性螺旋。
59.權(quán)利要求58的組合物，其中所述肽與apoJ顯示大于約50％的序列同一性。
60.權(quán)利要求56的組合物，其中所述肽保護(hù)磷脂以防止被氧化劑所氧化。
61.權(quán)利要求56的組合物，其中所述肽包含選自下列的氨基酸序列LLEQLNEQFNWVSRLANLTQGE，(SEQ ID NO1)，LLEQLNEQFNWVSRLANL，(SEQ ID NO2)，NELQEMSNQGSKYVNKEIQNAVNGV，(SEQ ID NO3)，IQNAVNGVKQIKTLIEKTNEE，(SEQ ID NO4)，RKTLLSNLEEAKKKKEDALNETRESETKLKEL，(SEQ ID NO5)，PGVCNETMMALWEECK，(SEQ ID NO6)，PCLKQTCMKFYARVCR，(SEQ ID NO7)，ECKPCLKQTCMKFYARVCR，(SEQ ID NO8)，LVGRQLEEFL，(SEQ ID NO9)，MNGDRIDSLLEN，(SEQ ID NO10)，QQTHMLDVMQD，(SEQ ID NO11)，F(xiàn)SRASSIIDELFQD，(SEQ ID NO12)，PFLEMIHEAQQAMDI，(SEQ ID NO13)，PTEFIREGDDD，(SEQ ID NO14)，RMKDQCDKCREILSV，(SEQ ID NO15)，PSQAKLRRELDESLQVAERLTRKYNELLKSYQ，(SEQ ID NO16)，LLEQLNEQFNWVSRLANLTEGE(SEQ ID NO17)，DQYYLRVTTVA，(SEQID NO18)，PSGVTEVVVKLFDS，(SEQ ID NO19)，PKFMETVAEKALQEYRKKHRE，(SEQ ID NO20)，WDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQF(SEQ ID NO21)，VATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQK(SEQ ID NO22)，RWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEEL(SEQ ID NO23)，LSSQVTQELRALMDETMKELKELKAYKSELEEQLT(SEQ ID NO24)，ARLSKELQAAQARLGADMEDVCGRLV(SEQ ID NO25)，VRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLA(SEQID NO26)，PLVEDMQRQWAGLVEKVQA(SEQ ID NO27)，MSTYTGIFTDQVLSVLK(SEQ ID NO28)，或LLSFMQGYMKHATKTAKDALSS(SEQ ID NO29)。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述肽是兩個(gè)或更多個(gè)所述氨基酸序列的多聯(lián)體。
63.權(quán)利要求56的方法，其中所述肽還含有保護(hù)基團(tuán)。
64.權(quán)利要求56的方法，其中所述肽還含有與氨基或羧基末端偶聯(lián)的保護(hù)基團(tuán)。
65.權(quán)利要求63的方法，其中所述的保護(hù)基團(tuán)選自下列基團(tuán)乙?；?，酰胺，3到20個(gè)碳原子的烷基，F(xiàn)moc，t-boc，9-芴乙?；?，1-芴羧基，9-芴羧基，9-芴酮-1-羧基，芐氧羰基，呫噸基(Xan)，三苯甲基(Trt)，4-甲基三苯甲基(Mtt)，4-甲氧基三苯甲基(Mmt)，4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰(Mtr)，1，3，5-三甲基苯-2-磺酰(Mts)，4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)，甲苯磺?；?Tos)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰(Pmc)，4-甲芐基(MeBzl)，4-甲氧基芐基(MeOBzl)，芐氧基(BzlO)，芐基(Bzl)，苯甲酰基(Bz)，3-硝基-2-吡啶磺?；?Npys)，1-(4，4-dimentyl-2，6-二偶氮亞環(huán)己基)乙基(Dde)，2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)，2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)，2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)，芐氧基甲基(Bom)，t-丁氧基羰基(Boc)，環(huán)己氧基(cHxO)，t-丁氧基甲基(Bum)t-丁氧基(tBuO)，t-丁基(tBu)，乙?；?Ac)，苯甲?；?，芐酯基，丙基，丁基，戊基，己基或三氟乙?；?TFA)。
66.權(quán)利要求63的方法，其中所述肽含有與氨基末端偶聯(lián)的保護(hù)基團(tuán)，而且所述的氨基末端保護(hù)基團(tuán)是選自苯甲?；阴；┗?，芐酯基，丙基，丁基，戊基，己基或3到20個(gè)碳原子的烷基的保護(hù)基團(tuán)。
67.權(quán)利要求63的方法，其中所述肽含有與羧基末端偶聯(lián)的保護(hù)基團(tuán)，而且所述的羧基末端保護(hù)基團(tuán)是酰胺基。
68.權(quán)利要求63的方法，其中所述肽還包括偶聯(lián)到氨基末端的第一保護(hù)基團(tuán)，其中所述的保護(hù)基團(tuán)是選自苯甲?；?，乙?；?，丙烯基，芐酯基，丙基，丁基，戊基，己基或3到20個(gè)碳原子的烷基的保護(hù)基團(tuán)；和偶聯(lián)到羧基末端的第二保護(hù)基團(tuán)，而且所述的羧基末端保護(hù)基團(tuán)是酰胺基。
69.權(quán)利要求56的方法，其中所述肽包含偶聯(lián)到氨基末端的第一保護(hù)基團(tuán)和偶聯(lián)到羧基末端的第二保護(hù)基團(tuán)。
70.權(quán)利要求56的方法，其中所述肽包含位于氨基末端的Ac基團(tuán)。
71.權(quán)利要求56的方法，其中所述肽含有位于羧基末端的-NH2。
72.權(quán)利要求56的方法，其中所述肽含有位于氨基末端的Ac基團(tuán)和位于羧基末端的-NH2。
73.權(quán)利要求61的方法，其中所述肽含有位于氨基末端的Ac基團(tuán)。
74.權(quán)利要求61的方法，其中所述肽含有位于羧基末端的-NH2。
75.權(quán)利要求61的方法，其中所述肽含有位于氨基末端的Ac基團(tuán)和位于羧基末端的-NH2。
76.權(quán)利要求56的方法，其中所述肽含有“D”氨基酸。
77.權(quán)利要求56的方法，其中所述肽含有多數(shù)的“D”氨基酸。
78.權(quán)利要求56的方法，其中含有所述肽的所有對(duì)映體氨基酸都是“D”氨基酸。
79.權(quán)利要求56的方法，其中所述的多肽與磷脂偶聯(lián)。
80.權(quán)利要求79的方法，其中所述的多肽與磷脂共價(jià)偶聯(lián)。
81.權(quán)利要求79的方法，其中所述的多肽與含有溶血磷脂酰膽堿的磷脂共價(jià)偶聯(lián)。
82.權(quán)利要求79的方法，其中所述的多肽與選自丙酰基，丁?；祯；?，己?；?，庚酰基，辛?；甚；?，癸酰基，十一烷?；?，月桂酰基，十三烷?；舛罐Ⅴ；逋轷；?，棕櫚酰基，十七烷?；?，硬脂?；?，十九烷?；ㄉ南?，Heniecosanoyl，二十二烷酰基，Trucisanoyl，二十四烷酰基，肉豆蔻腦?；?9-順式)，Myristelaidoyl(9-反式)，棕櫚油酰基(9-順式)，Palmitelaidoyl(9-反式)的磷脂共價(jià)偶聯(lián)。
83.權(quán)利要求56的方法，其中所述肽與藥學(xué)上可接受的賦形劑混合。
84.權(quán)利要求56的方法，其中所述肽與適合于對(duì)哺乳動(dòng)物口服給藥的藥學(xué)上可接受的賦形劑混合。
85.權(quán)利要求55的方法，其中所述給藥包括用所述肽口服給藥。
86.權(quán)利要求55的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物是診斷為具有動(dòng)脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的哺乳動(dòng)物。
87.權(quán)利要求55的方法，其中所述的生物是診斷為處于動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)中的哺乳動(dòng)物。
88.權(quán)利要求55的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物是人。
89.權(quán)利要求55的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物是非人的哺乳動(dòng)物。
90.一種改善炎癥應(yīng)答的特征性疾病的癥狀的方法，所述的方法包括用肽或含有具有位于肽的極性表面的帶電荷殘基和具有大的非極性表面的兩親性螺旋的肽的多聯(lián)體對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥。
91.權(quán)利要求90的方法，其中所述肽長度至少為10個(gè)氨基酸。
92.權(quán)利要求91的組合物，其中所述肽的長度為大約40個(gè)或更少的肽。
93.權(quán)利要求91的組合物，其中所述肽含有G*兩親性螺旋。
94.權(quán)利要求93的組合物，其中所述肽與apoJ顯示大于約50％的序列同一性。
95.權(quán)利要求91的組合物，其中所述肽保護(hù)磷脂以防止被氧化劑所氧化。
96.權(quán)利要求91的組合物，其中所述肽包含選自下列的氨基酸序列LLEQLNEQFNWVSRLANLTQGE，(SEQ ID NO1)，LLEQLNEQFNWVSRLANL，(SEQ ID NO2)，NELQEMSNQGSKYVNKEIQNAVNGV，(SEQ ID NO3)，IQNAVNGVKQIKTLIEKTNEE，(SEQ ID NO4)，RKTLLSNLEEAKKKKEDALNETRESETKLKEL，(SEQ ID NO5)，PGVCNETMMALWEECK，(SEQ ID NO6)，PCLKQTCMKFYARVCR，(SEQ ID NO7)，ECKPCLKQTCMKFYARVCR，(SEQ ID NO8)，LVGRQLEEFL，(SEQ ID NO9)，MNGDRIDSLLEN，(SEQ ID NO10)，QQTHMLDVMQD，(SEQ ID NO11)，F(xiàn)SRASSIIDELFQD，(SEQ ID NO12)，PFLEMIHEAQQAMDI，(SEQ ID NO13)，PTEFIREGDDD，(SEQ ID NO14)，RMKDQCDKCREILSV，(SEQ ID NO15)，PSQAKLRRELDESLQVAERLTRKYNELLKSYQ，(SEQ ID NO16)，LLEQLNEQFNWVSRLANLTEGE(SEQ ID NO17)，DQYYLRVTTVA，(SEQID NO18)，PSGVTEVVVKLFDS，(SEQ ID NO19)，PKFMETVAEKALQEYRKKHRE，(SEQ ID NO20)，WDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQF(SEQ ID NO21)，VATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQK(SEQ ID NO22)，RWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEEL(SEQID NO23)，LSSQVTQELRALMDETMKELKELKAYKSELEEQLT(SEQ ID NO24)，ARLSKELQAAQARLGADMEDVCGRLV(SEQ ID NO25)，VRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLA(SEQID NO26)，PLVEDMQRQWAGLVEKVQA(SEQ ID NO27)，MSTYTGIFTDQVLSVLK(SEQ ID NO28)，或LLSFMQGYMKHATKTAKDALSS(SEQ ID NO29)。
97.權(quán)利要求91的方法，其中所述生物是診斷為具有炎癥應(yīng)答的一種或多種癥狀的生物。
98.權(quán)利要求91的方法，其中所述生物是診斷為處于與炎癥應(yīng)答相關(guān)的疾病風(fēng)險(xiǎn)中的生物。
99.權(quán)利要求91的方法，其中所述的生物是人。
100.權(quán)利要求91的方法，其中所述的生物是非人的哺乳動(dòng)物。
101.一種改善動(dòng)脈粥樣硬化癥狀的試劑盒，所述的試劑盒包括含有權(quán)利要求1到28的任何一種多肽的容器。
102.權(quán)利要求101的試劑盒，其中所述肽與藥學(xué)上可接受的賦形劑組合。
103.權(quán)利要求101的試劑盒，其中所述肽與單位制量制劑中的藥學(xué)上可接受的賦形劑組合。
104.權(quán)利要求103的試劑盒，其中所述的單位劑量制劑用于口服給藥。
105.權(quán)利要求101的試劑盒，還包含教導(dǎo)使用所述肽改善動(dòng)脈粥樣硬化或炎癥應(yīng)答的特征性疾病的一種或多種癥狀的說明性材料。
106.一種在哺乳動(dòng)物中減輕或預(yù)防與炎癥的急性期應(yīng)答相關(guān)的冠狀動(dòng)脈并發(fā)癥的方法，其中所述的冠狀動(dòng)脈并發(fā)癥是動(dòng)脈粥樣硬化的癥狀，所述方法包括用權(quán)利要求1到28的任何一種多肽對(duì)具有所述急性期應(yīng)答，或者處于所述急性期應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)中的哺乳動(dòng)物給藥。
107.權(quán)利要求106的方法，其中所述的給藥是通過選自口服給藥，鼻給藥，直腸給藥，腹膜內(nèi)注射，和血管內(nèi)注射，皮下注射，經(jīng)皮給藥或肌肉注射的途徑。
108.權(quán)利要求106的方法，其中所述的多肽與相同多肽的全L-型組合給藥。
109.權(quán)利要求106的方法，其中所述的多肽作為在藥學(xué)上可接受的賦形劑中的單位制劑的形式來提供。
110.權(quán)利要求106的方法，其中所述的急性期應(yīng)答是與復(fù)發(fā)性炎癥疾病相關(guān)的炎癥應(yīng)答。
111.權(quán)利要求107的方法，其中所述的急性期應(yīng)答與選自下列疾病的疾病相關(guān)麻風(fēng)病，結(jié)核病，全身性紅斑狼瘡，風(fēng)濕性多肌痛，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，硬皮病，特發(fā)性肺纖維化，慢性梗阻肺病，阿爾茨海默病和AIDS，風(fēng)濕性多肌病，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，硬皮病，特發(fā)性肺纖維化，慢性梗阻肺病，阿爾茨海默病，AIDS，冠狀鈣化，鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄，骨質(zhì)疏松癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
112.權(quán)利要求106的方法，其中所述的急性期應(yīng)答是與選自細(xì)菌感染，病毒感染，真菌感染，器官移植，傷口，種植修復(fù)體，寄生蟲感染，膿毒癥，內(nèi)毒素性休克綜合征以及生物被膜形成疾病相關(guān)的炎癥應(yīng)答。
113.一種在哺乳動(dòng)物中減輕或防止與炎癥的急性期應(yīng)答相關(guān)的冠狀動(dòng)脈并發(fā)癥的方法，其中所述的冠狀動(dòng)脈并發(fā)癥是一種動(dòng)脈粥樣硬化癥狀，所述的方法包括檢測(cè)所述的哺乳動(dòng)物中指示急性期應(yīng)答或急性期應(yīng)答顯著風(fēng)險(xiǎn)的急性期蛋白(APP)水平；用權(quán)利要求1到28任一項(xiàng)的多肽對(duì)顯示出急性期應(yīng)答的急性期蛋白(APP)水平的哺乳動(dòng)物給藥。
114.權(quán)利要求113的方法，其中所述的急性期蛋白(APP)是選自下列的陽性APR血清淀粉樣蛋白A，C-反應(yīng)蛋白，血清淀粉樣蛋白P成分，C2補(bǔ)體蛋白，C3補(bǔ)體蛋白，C4補(bǔ)體蛋白，C5補(bǔ)體蛋白，C9補(bǔ)體蛋白，B補(bǔ)體蛋白，C1抑制劑，C4結(jié)合蛋白，纖維蛋白原，von Willebrand因子，α1-抗胰蛋白酶，α1-抗胰凝乳蛋白酶，α2抗血纖維蛋白酶，肝素輔因子II，纖溶酶原活化因子抑制劑I，觸珠蛋白，血友病細(xì)菌，血漿銅藍(lán)蛋白，超氧化錳歧化酶，α1-酸糖蛋白，血加氧酶，甘露糖結(jié)合蛋白，白細(xì)胞蛋白I，脂蛋白(a)或脂多糖結(jié)合蛋白。
115.權(quán)利要求113的方法，其中所述急性期蛋白(APP)是選自下列的陰性APR白蛋白，前清蛋白，運(yùn)鐵蛋白，apoAI，apoAII，α2-HS糖蛋白，間-α胰蛋白酶抑制劑，富含組氨酸糖蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供能改善動(dòng)脈粥樣硬化或炎癥應(yīng)答的特征性其它疾病一種或多種癥狀的新肽。在某實(shí)施方案中，該肽類似于G
文檔編號(hào)A61K38/00GK1658893SQ03812668
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2003年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月5日
發(fā)明者艾倫·M·福格爾曼, 莫哈馬德·內(nèi)瓦布 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)