專利名稱：用于診斷和治療與創(chuàng)傷或發(fā)炎組織相關(guān)疾病的發(fā)光微生物和細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物或細(xì)胞在制備一種診斷性組合物以診斷和/或觀測創(chuàng)傷或發(fā)炎組織或與所述組織相關(guān)的疾病中的應(yīng)用，所述微生物或細(xì)胞含有一種DNA序列，其編碼一種可檢測蛋白質(zhì)或者一種能誘導(dǎo)可檢測信號的蛋白質(zhì)例如發(fā)光或熒光蛋白。本發(fā)明還涉及治療性應(yīng)用，其中所述微生物或細(xì)胞另外含有編碼適于治療的一種蛋白質(zhì)的一個可表達(dá)的DNA序列，所述蛋白質(zhì)例如是導(dǎo)致細(xì)胞死亡或者細(xì)胞碎片消化的酶。
菌血癥可以產(chǎn)生自外傷性創(chuàng)傷和外科手術(shù)程序以及生理功能，如咀嚼或刷牙。在侵入程序和生理功能之前和之后從健康人體所取的血液培養(yǎng)物示出雖然處理前血樣是無菌的，但細(xì)菌根據(jù)所述程序在血液中以不同頻率而存在。菌血癥的一個潛在結(jié)果是細(xì)菌在易感部位建群。然而，盡管發(fā)生瞬時的菌血癥，但僅有一定百分比的高?；颊邥l(fā)生細(xì)菌在潛在的易感部位建群。許多研究人員提示來自血液循環(huán)的細(xì)菌可以定居在動物模型中的炎癥部位及定居在植入材料表面。菌血癥后人體病理學(xué)改變中的不一致現(xiàn)象也可以是由于宿主免疫系統(tǒng)抗性、不同的菌血癥之后血液中細(xì)菌濃度的可變性及任何給定的細(xì)菌菌株的毒力所致。
許多研究人員著重研究植入材料作為影響細(xì)菌粘附能力的因子的性質(zhì)。如用于封閉傷口的縫合線和手術(shù)夾等的材料是細(xì)菌建群的潛在部位。這些材料的感染可以阻止傷口愈合和/或使患者處于二次感染的高危狀態(tài)。已經(jīng)生產(chǎn)了許多種與細(xì)菌具有不同親和性的傷口封閉材料。某些傷口封閉材料如麻花狀縫合線與較高的感染影響范圍相關(guān)。這種類型的縫合材料的多絲性質(zhì)使其自身對細(xì)菌建群的敏感性增加并產(chǎn)生一種“燈芯”效應(yīng)，使細(xì)菌穿透過組織。僅僅可持久植入的材料已經(jīng)表明與細(xì)菌的相似親和性。修復(fù)術(shù)中使用的心瓣膜和關(guān)節(jié)可以提高細(xì)菌建群的危險(xiǎn)性。一般確信這種較高的易感性是由細(xì)菌更易于粘附植入體表面的固有性質(zhì)所致的。另一種解釋是植入體周圍的組織中的炎癥提供了一種更適于細(xì)菌建群的環(huán)境。除了這些給出的可能性之外，可以影響一個部位對細(xì)菌建群的易感性的另一種因素可以是受影響的組織的炎癥狀態(tài)的程度。植入材料可以產(chǎn)生機(jī)體內(nèi)瞬時或慢性炎癥部位。
植入材料的存在不是細(xì)菌建群的必要條件。由于疾病所引起的天然解剖學(xué)結(jié)構(gòu)改變可以產(chǎn)生更易于細(xì)菌建群的表面。這提示就感染性心內(nèi)膜炎(IE)的發(fā)生而言，瓣膜表面必須加以改變以產(chǎn)生細(xì)菌吸附和建群的合適部位。而且，所述微生物必須到達(dá)這個部位并粘附，因?yàn)槌切陌昴け砻姹黄茐?，在注射了?xì)菌的實(shí)驗(yàn)動物中不可能產(chǎn)生IE。具有高度紊亂的損害產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)菌建群的條件，然而大面積或低流動性的損害很少發(fā)生IE。
然而迄今為止，還不能證實(shí)瞬時菌血癥真正導(dǎo)致發(fā)炎或創(chuàng)傷的組織的細(xì)菌建群，因?yàn)檫€沒有可利用的模型能夠追蹤活生物體中細(xì)菌，即能夠解釋細(xì)菌感染與疾病組織部位之間的時間和空間關(guān)系。另外令人失望地是，迄今為止發(fā)炎或創(chuàng)傷的組織或與之相關(guān)的疾病，如動脈粥樣硬化、心內(nèi)膜炎、心包炎等的早期的診斷和治療不能令人滿意。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種有效并可靠地診斷以及治療創(chuàng)傷或發(fā)炎組織或與之相關(guān)疾病的方式，其克服了目前使用的診斷和治療方法中的缺點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明，這可以通過在權(quán)利要求中限定的內(nèi)容而實(shí)現(xiàn)。在導(dǎo)致完成本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)例如植入材料附近的發(fā)炎的組織有可能細(xì)菌建群。因此，通?？梢岳萌缦滤龅谋景l(fā)明的系統(tǒng)觀測發(fā)炎的組織?？梢钥吹?，表達(dá)編碼細(xì)菌中發(fā)光蛋白的基因提供了一種遺傳學(xué)工具，使得可以追蹤活宿主中的細(xì)菌，及評價活宿主中感染程序的動力學(xué)。發(fā)光細(xì)菌的外部檢測使本發(fā)明人可以非侵入性研究感染與出現(xiàn)的疾病狀況之間的空間和時間關(guān)系。就發(fā)光細(xì)菌的增殖而言，使用細(xì)菌luxab操縱子，其編碼在存在底物癸醛的情況下催化還原型黃素單核苷酸(FMNE2)氧化的螢光素酶。然后這個反應(yīng)產(chǎn)生FMN、癸酸、水和光子。所述光子然后通過拍X光照片、照度計(jì)或通過弱光成像儀而捕獲。最近，編碼所述底物以及螢光素酶的完整的細(xì)菌luxcdabe操縱子已經(jīng)用于檢測活體動物中的細(xì)菌。這個系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是不需要外源性加入底物，這使其就體內(nèi)研究而言是理想的。在本發(fā)明的研究中，可以證明由最初存在于循環(huán)血液中的細(xì)菌在創(chuàng)傷或發(fā)炎組織建群，而且可以示出由植入的材料如縫合線、傷口封閉夾和修復(fù)裝置刺激的組織對菌血癥后的細(xì)菌建群更易感。取自用減毒的S.typhimurium進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)示出在靜脈內(nèi)注射之后，細(xì)菌布散于活動物體全身。因此，有理由提示細(xì)菌通過循環(huán)到達(dá)創(chuàng)傷或發(fā)炎的部位。在以下實(shí)施例中詳細(xì)描述的這些發(fā)現(xiàn)打開了以下途徑(a)設(shè)計(jì)基于如光發(fā)射信號或者可以通過MRI觀測到的信號用于檢測創(chuàng)傷或發(fā)炎組織的多功能病毒載體及(b)研發(fā)基于細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞的創(chuàng)傷或發(fā)炎組織定向系統(tǒng)組合治療性基因構(gòu)建體以治療與創(chuàng)傷或發(fā)炎組織相關(guān)疾病，如動脈粥樣硬化。這些系統(tǒng)具有如下優(yōu)點(diǎn)(a)它們特異定向于創(chuàng)傷或發(fā)炎組織而不影響正常組織；(b)治療性基因構(gòu)建體的表達(dá)和分泌優(yōu)選是在一個誘導(dǎo)型啟動子控制下，使得能夠控制分泌的開始或停止；(c)傳輸系統(tǒng)在組織內(nèi)部的定位可以通過在激活基因表達(dá)和蛋白質(zhì)輸送之前直接觀測而核實(shí)。最后，有許多可以由本發(fā)明的診斷方法增強(qiáng)或代替的診斷方法。例如，常規(guī)的血管造影術(shù)和MRA技術(shù)均通過一個導(dǎo)管的內(nèi)腔而使血液流動成像以顯現(xiàn)射線斑(plaque)，而不是直接成像所述射線斑。MRA對由該斑導(dǎo)致的紊亂特別敏感，并因此經(jīng)常是不準(zhǔn)確的。這些缺點(diǎn)可以通過本發(fā)明的診斷方法而克服。
因此，本發(fā)明涉及含有一種DNA序列的微生物或細(xì)胞在制備一種診斷組合物以診斷和/或觀測創(chuàng)傷或發(fā)炎組織或者與之相關(guān)的疾病中的應(yīng)用，所述DNA序列編碼一種可檢測蛋白質(zhì)或者一種能誘導(dǎo)可檢測信號的蛋白質(zhì)。另外，所述微生物還用于治療，可以例如在創(chuàng)傷或發(fā)炎組織顯現(xiàn)后，通過如局部施用適合治療的如下化合物，例如來自Scrophularia(玄參)nodosa的?；h(huán)烯醚萜苷、皮質(zhì)醇、皮質(zhì)類固醇類似物、秋水仙堿、氨甲喋呤、非類固醇抗炎藥物(NSAID)、來氟米特(leflunomide)、依那西普(etanercept)、二甲胺四環(huán)素、環(huán)孢霉素、反應(yīng)停(thalidomide)、一種胞毒劑、6巰基嘌呤、硝基咪唑硫嘌呤、抗生素或一種或多種如下列出的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及含有一種DNA序列的微生物或細(xì)胞在制備一種藥物組合物以治療創(chuàng)傷或發(fā)炎組織或者與之相關(guān)的疾病中的應(yīng)用，所述DNA序列編碼一種可檢測蛋白質(zhì)或者一種能誘導(dǎo)可檢測信號的蛋白質(zhì)，其中所述微生物或細(xì)胞另外含有一或多個可表達(dá)的DNA序列，該序列編碼適于治療創(chuàng)傷或發(fā)炎組織或者與之相關(guān)的疾病的一或多種蛋白質(zhì)。
適于治療創(chuàng)傷或發(fā)炎組織或者與之相關(guān)的疾病的蛋白質(zhì)包括轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-α)、血小板衍生生長因子(PDG-F)、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)、IL-4、IL-8、內(nèi)皮縮血管肽-1(ET-1)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、TNF-α、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、環(huán)加氧酶、環(huán)加氧酶-2抑制劑、因福利美(infliximab)(一種嵌合的抗TNF-α單克隆抗體)、IL-10、脂肪酶、蛋白酶、溶菌酶、促細(xì)胞凋亡(proapoptotic)因子、過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR)激動劑等。
任何微生物或細(xì)胞均可用于本發(fā)明的診斷和治療應(yīng)用中，只要其在生物體內(nèi)復(fù)制，對生物體無病原性，例如是減毒的，及由生物體的免疫系統(tǒng)識別等即可。術(shù)語“微生物”和“細(xì)胞”在此是指這樣的微生物和細(xì)胞，其本質(zhì)上非定向于創(chuàng)傷或發(fā)炎組織(即它們不能區(qū)分創(chuàng)傷或發(fā)炎組織與未創(chuàng)傷的或未發(fā)炎的相對應(yīng)的組織)，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示出微生物和細(xì)胞在創(chuàng)傷或發(fā)炎組織中積聚是由于在這種環(huán)境中它們未暴露于宿主免疫系統(tǒng)的攻擊這個事實(shí)所致。只要血管形成/淋巴系統(tǒng)未恢復(fù)，則所述微生物和細(xì)胞會積聚一段特定時間，例如3-5天。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物或細(xì)胞含有一個編碼發(fā)光和/或熒光蛋白的DNA序列。正如文中所使用的，術(shù)語“編碼發(fā)光或熒光蛋白的DNA序列”還包含編碼一種發(fā)光和熒光蛋白的融合蛋白的DNA序列。
在本發(fā)明的應(yīng)用的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物或細(xì)胞含有編碼能誘導(dǎo)可通過磁共振成像(MRI)檢測的信號的蛋白質(zhì)一個DNA序列，例如金屬結(jié)合蛋白。而且，所述蛋白質(zhì)可以結(jié)合一種照影劑，生色團(tuán)或者組織觀察所需要的化合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知分析發(fā)光和/或熒光蛋白在組織中的位置或分布的合適設(shè)備，這些設(shè)備在上文引用的文獻(xiàn)及下文的實(shí)施例中進(jìn)一步描述。
優(yōu)選地，為轉(zhuǎn)染細(xì)胞，編碼一種可檢測蛋白質(zhì)或者一種誘導(dǎo)可檢測信號的蛋白質(zhì)例如發(fā)光或熒光蛋白的DNA序列存在于一種載體或表達(dá)載體中。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些這些載體的實(shí)例。所述DNA序列也可以包含于一種重組病毒中，該重組病毒含有合適的表達(dá)盒?？梢允褂玫暮线m病毒包括桿狀病毒、痘苗病毒、新培斯病毒、仙臺病毒、腺病毒、AAV病毒或細(xì)小病毒如MVM或H-1。所述載體也可以是反錄病毒如MoMULV、MoMuLV、HaMuSV、MuMTV、RSV或GaLV。為在哺乳動物中表達(dá)，合適的啟動子是例如人巨細(xì)胞病毒“立即早期啟動子”(pCMV)。另外，組織和/或器官特異性啟動子是有用的。優(yōu)選地，編碼一種可檢測蛋白質(zhì)或者一種能誘導(dǎo)可檢測信號的蛋白質(zhì)的DNA序列可操縱地與允許高表達(dá)的啟動子連接。這種啟動子例如誘導(dǎo)型啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
為產(chǎn)生上述DNA序列及為構(gòu)建含有所述DNA序列的表達(dá)載體或病毒，可以使用本領(lǐng)域已知的普通方法。這些方法包括體外重組技術(shù)、合成方法及體內(nèi)重組方法，參見如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，第二版(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約。轉(zhuǎn)染細(xì)胞、按表型選擇轉(zhuǎn)染子及使用上述載體表達(dá)DNA序列的方法是本領(lǐng)域已知的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知編碼可用于進(jìn)行本發(fā)明的發(fā)光或熒光蛋白的DNA序列。在過去的十年期間，已經(jīng)描述了編碼如下蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的鑒別和分離，使得可以基于光發(fā)射追蹤細(xì)菌或病毒，所述蛋白質(zhì)是來自哈氏弧菌(Vibrio harveyi)(Belas et al.，Science218(1982)，791-793)和Vibrio fischerii(Foran and Brown，Nucleic acidsRes.16(1988)，177)的細(xì)菌螢光素酶的發(fā)光蛋白，來自螢火蟲螢光素酶(de Wet et al.，Mol.Cell.Biol.7(1987)，725-737)的發(fā)光蛋白，來自Aequorea Victoria的水母發(fā)光蛋白(Prasher et al.，Biochem.26(1987)，1326-1332)，來自Renilla reniformis(Lorenz et al.，PNAS USA88(1991)，4438-4442)的海腎(Renilla)螢光素酶及來自的Aequoreavictoria(Prasher et al.，Gene111(1987)，229-233)綠色熒光蛋白。這些基因在細(xì)菌中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)使得可以借助于弱光成像照相機(jī)檢測細(xì)菌菌落或者在熒光顯微鏡下檢測單個細(xì)菌(Engebrecht et al.，Science227(1985)，1345-1347；Legocki et al.，PNAS83(1986)，9080-9084；Chalfie et al.，Science263(1994)，802-805)。
已經(jīng)將螢光素酶基因在各種生物體中表達(dá)。使用與固氮酶啟動子融合的luxAB，基于光發(fā)射的啟動子活化，通過弱光成像表明Rhizobia存在于感染的根節(jié)結(jié)的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(Legocki et al.，PNAS 83(1986)，9080-9084；O′Kane et al.，J.Plant Mol.Biol.10(1988)，387-399)。lux A與lux B基因的融合產(chǎn)生具有充足功能的螢光素酶蛋白(Escher et al.，PNAS86(1989)，6528-6532)。將這個融合基因(Fab2)導(dǎo)入枯草桿菌(Bacillus subtilis)和巨大芽胞桿菌(Bacillus megatherium)中并處于木糖啟動子的控制下，然后以此喂養(yǎng)昆蟲幼體并注入蠕蟲的血淋巴中。使用弱光攝影機(jī)對光發(fā)射進(jìn)行成像。病原菌在攜帶病原體激活的PAL啟動子-細(xì)菌螢光素酶融合基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因擬南芥(arabidopsis)植物以及番茄植物和馬鈴薯堆中的運(yùn)動和定位，通過在弱光成像儀下定位假單胞菌(Pseudomonas)或Ervinia spp.感染而證明(Giacomin and Szalay，Plant Sci.116(1996)，59-72)。
因此，在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述微生物或細(xì)胞中存在的發(fā)光或熒光蛋白是螢光素酶、RFP或GFP。
在細(xì)菌中表達(dá)的所有螢光素酶均需要外源性加入底物如癸醛或coelenterazine進(jìn)行光發(fā)射。相反，觀測GFP熒光不需要底物，需要的是激發(fā)光源。最近，編碼細(xì)菌螢光素酶和在細(xì)胞內(nèi)提供癸醛的蛋白質(zhì)的基因簇，包括luxCDABE，從Xenorhabdus luminescens(Meighenand Szittner，J.Bacteriol.174(1992)，5371-5381)和Photobacteriumleiognathi(Lee et al.，Eur.J.Biochem.201(1991)，161-167)中分離并轉(zhuǎn)染入細(xì)菌中，產(chǎn)生不依賴于外源加入的底物的持續(xù)的發(fā)光(Fernandez-Pinas and Wolk，Gene150(1994)，169-174)。當(dāng)腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射時，含有完整的lux操縱子序列的細(xì)菌使得可以觀測并定位活的小鼠中的細(xì)菌，表明螢光素酶光發(fā)射可以穿透組織并可以外部檢測(Contag et al.，Mol.Microbiol.18(1995)，593-603)。
因此，在更優(yōu)選的一個實(shí)施方案中，含有編碼螢光素酶的一個DNA序列的微生物或細(xì)胞還含有編碼螢光素酶底物的基因。
優(yōu)選地，所述微生物是細(xì)菌。特別優(yōu)選的是減毒的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella thyphimurium)、減毒的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、減毒的單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)或大腸桿菌。
或者，本發(fā)明的診斷和治療性應(yīng)用中也可以使用病毒如痘苗病毒、AAV、反錄病毒等。優(yōu)選地，所述病毒是痘苗病毒。
優(yōu)選地，本發(fā)明使用的細(xì)胞是一種哺乳動物細(xì)胞如就所述生物體而言是自身或異源的干細(xì)胞。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的微生物或細(xì)胞含有一個ruc-gfp表達(dá)盒，其含有在合成的強(qiáng)早期/晚期(PE/L)啟動子控制下的Renilla螢光素酶(ruc)和Aequorea gfp cDNA序列，或者所述微生物或細(xì)胞含有l(wèi)uxCDABE表達(dá)盒。
在上述微生物和細(xì)胞的一個優(yōu)選的應(yīng)用中，適于治療與創(chuàng)傷或發(fā)炎組織相關(guān)的疾病如動脈粥樣硬化的蛋白質(zhì)是一種導(dǎo)致細(xì)胞死亡的酶，或者是導(dǎo)致細(xì)胞碎片消化的一種酶，例如在動脈粥樣硬化斑的內(nèi)部使所述斑在腔內(nèi)血壓的壓力下而崩潰。合適的酶包括脂肪酶、蛋白酶、溶菌酶、促細(xì)胞凋亡因子、PPAR-激動劑等。如果動脈粥樣硬化癥的炎癥成分應(yīng)加以治療，則合適的化合物是皮質(zhì)醇、皮質(zhì)類固醇類似物、環(huán)加氧酶及環(huán)加氧酶-2抑制劑、秋水仙堿、氨甲喋呤、NSAID、來氟米特、依那西普、二甲胺四環(huán)素、環(huán)孢霉素、反應(yīng)停、因福利美、IL-10、6-巰基嘌呤、硝基咪唑硫嘌呤或胞毒劑。這些化合物有一些可以是前體藥物形式。
因此，由本發(fā)明的微生物表達(dá)的蛋白質(zhì)可以是一種酶，其將給予生物體的一種失活的物質(zhì)(前體藥物)轉(zhuǎn)化為活性物質(zhì)。
優(yōu)選地，編碼上述酶的基因是由一種誘導(dǎo)型啟動子指導(dǎo)，另外又保證例如前體藥物轉(zhuǎn)化為活性物質(zhì)僅發(fā)生在靶組織內(nèi)，所述啟動子例如IPTG-、抗生素-、心-、pH-、光-、金屬-、需氧-、宿主細(xì)胞-、藥物-、細(xì)胞周期-或組織特異性誘導(dǎo)型啟動子。另外，本發(fā)明的輸送系統(tǒng)甚至可以應(yīng)用這樣的化合物，由于當(dāng)其全身性應(yīng)用而具有高毒性或者由于其不能例如以足夠高的劑量靜脈內(nèi)施用以達(dá)到例如竇內(nèi)、膿腫內(nèi)或透過血腦屏障的水平的事實(shí)迄今為止未用于治療。這種化合物包括反應(yīng)停、胞毒性藥物、抗生素等。
另外，本發(fā)明的微生物或細(xì)胞可以含有一種編碼一個特異性途徑例如傷口愈合途徑的幾種或全部蛋白質(zhì)的BAC(細(xì)菌人工染色體)或者M(jìn)AC(哺乳動物人工染色體)，如TNF-α、COX-2、CTGF等。另外，所述細(xì)胞可以是一種cyber細(xì)胞或者編碼這些蛋白的cyber病毒。
就施用而言，上述微生物或細(xì)胞優(yōu)選與合適的藥物載體組合。本領(lǐng)域熟知合適的藥物載體，包括磷酸鹽緩沖鹽溶液、水、乳狀液如油/水乳狀液、各種類型的增濕劑、無菌溶液等。這種載體可以透過常規(guī)方法配制并可以以合適的劑量施用患者。微生物或細(xì)胞的施用可以通過不同方式實(shí)現(xiàn)，例如通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、局部或皮內(nèi)施用。優(yōu)選的施用途徑是靜脈內(nèi)注射。當(dāng)然，施用途徑依賴于組織的性質(zhì)及藥物組合物中包含的微生物或細(xì)胞的種類。劑量方案通過主治醫(yī)生及其它臨床因素確定。正如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的，任一項(xiàng)患者的劑量依賴于許多因素，包括患者大小、體表面積、年齡、性別、施用的特殊化合物、施用時間和途徑、組織的性質(zhì)和定位、一般健康狀態(tài)及同時施用的其它藥物。
一種優(yōu)選的治療性應(yīng)用是制備一種藥物組合物以治療心內(nèi)膜炎、心包炎、炎癥性腸道疾病(例如克羅恩氏(Crohn′s)病或潰瘍結(jié)腸炎)、下背痛(herniated nucleus pulposis)、顳動脈炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎或關(guān)節(jié)炎。
在過去的幾年中，有許多報(bào)道示出動脈粥樣硬化斑內(nèi)部肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、Heliobacterpylori、CMV、HSV及其它感染性因子的跡象。動脈粥樣硬化斑內(nèi)存在這些感染性因子提示所述斑的內(nèi)部是一個允許復(fù)制的保護(hù)環(huán)境，否則這些感染性因子將被免疫系統(tǒng)清除。另外，有這樣一個值得注意的跡象，即在動脈粥樣硬化斑的內(nèi)部存在炎癥過程。因此，有理由設(shè)想這種疾病可以通過靜脈內(nèi)注射本發(fā)明的微生物或細(xì)胞之后加以診斷和治療，所述微生物或細(xì)胞將進(jìn)入其開始復(fù)制的動脈粥樣硬化斑。在適當(dāng)?shù)囊欢螘r間之后，所述斑可以使用例如光敏感照相機(jī)或者合適的MRI設(shè)備成像。另外，所述微生物或細(xì)胞可以另外產(chǎn)生一種酶，例如上述提及的酶，使該斑消除。因此，一個進(jìn)一步優(yōu)選的應(yīng)用是診斷和治療動脈粥樣硬化疾病。
一個另外優(yōu)選的應(yīng)用是診斷和治療冠心病、周圍血管疾病或腦動脈疾病。根據(jù)本發(fā)明的治療性處理可以代替如球囊血管成形術(shù)、支架植入(stent placement)、冠狀動脈搭橋術(shù)、頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)、主動脈-股動脈搭橋術(shù)及其它侵入性方法。另外，難以達(dá)到區(qū)域中的斑如基底動脈和大腦中動脈可以使用本發(fā)明的治療方法治療。
就治療創(chuàng)傷、骨折、手術(shù)切口和燒傷而言，本發(fā)明的微生物優(yōu)選與蛋白質(zhì)組合，所述蛋白質(zhì)如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-α)、血小板衍生生長因子(PDG-F)、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)、IL-4、IL-8、內(nèi)皮縮血管肽-1(ET-1)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、TNF-α、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、環(huán)加氧酶、環(huán)加氧酶-2抑制劑、因福利美(一種嵌合的抗TNF-α單克隆抗體)、IL-10、脂肪酶、蛋白酶、溶菌酶、促細(xì)胞凋亡因子、過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR)激動劑(或者含有編碼所述蛋白質(zhì)的可表達(dá)的DNA序列)。就治療感染性疾病而言，本發(fā)明的微生物優(yōu)選與抗生素組合應(yīng)用。就治療自身免疫系統(tǒng)疾病及炎癥疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸道疾病和多發(fā)性硬化而言，本發(fā)明的微生物優(yōu)選與皮質(zhì)醇、皮質(zhì)類固醇類似物、環(huán)加氧酶和環(huán)加氧酶-2抑制劑、秋水仙堿，氨甲喋呤，NSAID、來氟米特、依那西普、二甲胺四環(huán)素、環(huán)孢霉素，反應(yīng)停，因福利美、IL-10、6-巰基嘌呤、硝基咪唑硫嘌呤、或一種胞毒劑組合應(yīng)用。就治療如動脈硬化癥而言，本發(fā)明的微生物優(yōu)選與脂肪酶、溶菌酶、促細(xì)胞凋亡因子、PPAR-激動劑(或相應(yīng)的DNA序列)或者關(guān)于治療炎癥性疾病列出的上述制劑組合應(yīng)用。就治療阿爾茨海默氏病而言，本發(fā)明的微生物優(yōu)選與關(guān)于自身免疫系統(tǒng)或炎癥性疾病列出的上述一或多種制劑組合應(yīng)用。
最后，上述微生物和細(xì)胞用于(a)監(jiān)測抗生素療法的效力，優(yōu)選基于光發(fā)射進(jìn)行或者(b)對比各種縫合線和可植入的材料對細(xì)菌建群的抗性。
附圖簡述

圖1經(jīng)靜脈內(nèi)將細(xì)菌注射入裸鼠的觀測結(jié)果。為裸鼠注射1×107個減毒的鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)(A)或者1×107個減毒的霍亂弧菌(Vibrio cholera)(B)。這兩個菌株均用攜帶lux操縱子的pLITE201轉(zhuǎn)化。在注射細(xì)菌20分鐘后，每分鐘收集一次光子。
圖2在相同的動物中5天觀察期的觀測結(jié)果。為裸鼠注射1×107個減毒的鼠傷寒沙門氏桿菌。
在最初的觀察期間，細(xì)菌遍布于動物的全身(A)。兩天后，細(xì)菌從動物體中清除，除了用箭頭所示的切口和耳部標(biāo)簽部位之外(B)。在第5天，動物已經(jīng)能從創(chuàng)傷的部位清除該生物體(C)。
圖3在相同的動物中注射霍亂弧菌的8天觀察期的觀測結(jié)果。為裸鼠注射1×107個減毒的霍亂弧菌。在最初的觀察期間，在動物的肝臟部位觀察到細(xì)菌(A)。5天后，細(xì)菌被從動物體中全部清除，除了用箭頭所示的切口部位之外(B)。在第8天，動物已經(jīng)能將該生物體從傷口部位清除(C)。
圖4在免疫活性的C57小鼠中注射霍亂弧菌的觀測結(jié)果。將1×107個減毒的霍亂弧菌經(jīng)靜脈內(nèi)注射入動物體內(nèi)。在注射細(xì)菌之后第4天，發(fā)光細(xì)菌在耳部標(biāo)簽部位建群(用白色箭頭標(biāo)示)。
圖5在大鼠肝臟中發(fā)光細(xì)菌的觀測結(jié)果。為Sprague Dawley大鼠經(jīng)靜脈內(nèi)注射1×108個減毒的大腸桿菌，該大腸桿菌用攜帶luxcdabe操縱子得自質(zhì)粒DNA pLITE201轉(zhuǎn)化。在注射之后立即每分鐘在弱光成像儀(Night Owl)下收集一次光子。在全部活的動物的肝臟中觀測到發(fā)光細(xì)菌。
圖6發(fā)光細(xì)菌在大鼠心臟的建群。為大鼠靜脈內(nèi)注射1×108個用攜帶luxedabe操縱子的質(zhì)粒pLITE201轉(zhuǎn)化的減毒的大腸桿菌不導(dǎo)致在已經(jīng)插入導(dǎo)管的對照動物的心臟中建群(A)。在透過右頸動脈插入導(dǎo)管的大鼠中相似地誘導(dǎo)的菌血癥引起發(fā)光細(xì)菌在心臟建群(B)。
圖7大鼠器官中剩余細(xì)菌的檢測。在為大鼠經(jīng)靜脈內(nèi)注射1×108個減毒的大腸桿菌之后3天，切下心、肝和脾并培養(yǎng)過夜。在弱光成像儀(Hamamatsu)下在來自插入導(dǎo)管的大鼠的所有樣品中觀測到發(fā)光細(xì)菌(A-C)，而在對照動物中，在肝(A)和脾(B)中檢測到細(xì)菌，但在心(C)中未檢測到。
本發(fā)明通過以下實(shí)施例加以解釋。
實(shí)施例1材料和方法(A)細(xì)菌菌株所用的菌株是非病原性的實(shí)驗(yàn)室菌株大腸桿菌、DH5α、減毒的鼠傷寒沙門氏桿菌(SL7207 hisG46，DEL407[aroA544::TnlO1]和減毒的霍亂弧菌(Bengal 2 Serotyp 0139，M010DattRSI)。
(B)質(zhì)粒構(gòu)建含有l(wèi)uxcdabe基因盒的質(zhì)粒DNA pLITE201從Dr.F.Marines得到(Voisey and Marines，Biotech.24(1998)56-58)。
(C)受體動物5-6周齡的雄性BALB/c nu/nu小鼠(體重25-30g)和Sprague Dawley大鼠(體重300-325g)購自Harlan(Frederick，MD，USA)。CS7BL/6J小鼠得自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME，USA)。所有動物實(shí)驗(yàn)均根據(jù)Lorna Linda大學(xué)動物研究委員會認(rèn)可的方案進(jìn)行。含有重組DNA物質(zhì)和減毒的病原體的動物在生物研究安全性2的水平保持在Loma Linda大學(xué)動物看護(hù)部(animal carefacility)。
(D)發(fā)光檢測。在即將成像之前，將動物經(jīng)腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉麻醉(NembutalSodium solution，Abbot Laboratories，NorthChicago，IL；60mg/kg體重)。將動物置于黑暗的箱子內(nèi)以計(jì)數(shù)光子和記錄斷層圖像(ARGUS 100 Low Light Imaging System，Hamamatsu，Hamamatsu，Japan和Night Owl，Berthold Technologies，GmbH and Co.KG，Bad Wildbad，Germany)。每分鐘從動物的腹部和背部收集光子。然后記錄照相圖像并將所述照相圖像斷層為弱光圖像以表明活性發(fā)光的位置。
實(shí)施例2在活的動物體經(jīng)靜脈內(nèi)注射的發(fā)光細(xì)菌的皮膚傷口建群為確定動物體內(nèi)經(jīng)靜脈內(nèi)注射的發(fā)光細(xì)菌的結(jié)局，將1×107個攜帶于50μl中的pLITE201質(zhì)粒DNA的細(xì)菌注入在麻醉下的裸鼠的左側(cè)股靜脈。為暴露股靜脈，用手術(shù)刀作一個1cm的切口。在用6-0縫合線縫合切口后，在弱光成像儀下監(jiān)測小鼠并每分鐘收集一次發(fā)射光子。在各種時間間隔對每只動物重復(fù)成像以研究發(fā)光細(xì)菌在動物全身的傳播。發(fā)現(xiàn)在將細(xì)菌經(jīng)靜脈內(nèi)注射入小鼠之后的光發(fā)射分布模式是細(xì)菌-菌株依賴性的。注射減毒的鼠傷寒沙門氏桿菌導(dǎo)致該細(xì)菌廣泛傳播于動物全身(圖A)。這種分布模式在注射細(xì)菌后5分鐘內(nèi)可觀測到并在1小時的觀測期間可持續(xù)檢測到。然而將減毒的霍亂弧菌注入血流中產(chǎn)生光發(fā)射，其在注射細(xì)菌后5分鐘內(nèi)位于肝臟，并在1小時的觀測期間在肝臟內(nèi)可持續(xù)觀測到(圖1B)。
細(xì)菌分布模式中的不同提示這些菌株與曾經(jīng)在動物內(nèi)宿主的相互作用中的不同。在注射細(xì)菌后第48小時對相同的動物成像示出在早期的所有可檢測的光發(fā)射已經(jīng)減少而且完全從經(jīng)注射的動物體內(nèi)消除，但發(fā)炎的創(chuàng)傷的組織如切口和耳部標(biāo)簽部位除外。這些組織中的炎癥通過其紅腫的表現(xiàn)而確定。光發(fā)射在切口和/或發(fā)炎的耳部標(biāo)簽部位直至注射后5-8天仍檢測到，這通過延長光子收集時間而證實(shí)，即10分鐘(圖2A-C和圖3A-C)。沒有光發(fā)射不是由于細(xì)菌中缺少質(zhì)粒DNA或者基因表達(dá)沉默所致。在其它實(shí)驗(yàn)中，動物體內(nèi)的光發(fā)射可以持續(xù)檢測直至50天。在免疫活性的C57BU6J小鼠中獲得相似的數(shù)據(jù)(圖4)，示出這些觀測結(jié)果非限于免疫系統(tǒng)改變了的動物。對來自感染的動物各個切下的器官以及血液樣品進(jìn)行仔細(xì)檢測證實(shí)這些正常的未損傷的組織中不存在發(fā)光。
另外，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明損傷的組織建群在小鼠中是普遍發(fā)生的。小鼠中29處傷口中有24處(82.8％)即29處耳部標(biāo)簽中有12處(41.4％)由經(jīng)靜脈內(nèi)注射的細(xì)菌建群。在以低的如1×105個細(xì)菌細(xì)胞的濃度注射霍亂弧菌后發(fā)生經(jīng)靜脈內(nèi)注射的細(xì)菌在傷口建群。
實(shí)施例3在經(jīng)股靜脈注射發(fā)光細(xì)菌之后，細(xì)菌在插入導(dǎo)管的小鼠心臟建群根據(jù)先前所述程序產(chǎn)生外科心臟缺損(Santoro and Levison，Infect.Immun.19(3)(1978)，915-918；Overholser et al.，T.Infect.J.Infect.Dis.155(1)(1987)，107-112)。簡而言之，將動物用戊巴比妥鈉(60mg/kg i.p.)麻醉。作頸正中切口以暴露頸動脈。插入一個聚丙烯導(dǎo)管并前置直至出現(xiàn)抵抗，表明插入到主動脈水平。然后將該導(dǎo)管使用10-0縫合線(AROSurgical Instrument Corporation，Japan)穩(wěn)固并使用4-0絲質(zhì)縫合線(American Cyanamide Company，Wayne，NewJersey)縫合切口。導(dǎo)管的放置導(dǎo)致疼痛及隨后的主動脈炎癥(Santoro and Levison，1978)。對照動物不進(jìn)行插管程序。通過股靜脈注射1×108個大腸桿菌的發(fā)光細(xì)菌細(xì)胞誘導(dǎo)菌血癥。當(dāng)感染后立即在弱光成像儀下進(jìn)行觀測，在肝臟觀測到細(xì)菌建群(圖5)。3天后，插管的動物始終表明心臟有發(fā)光細(xì)菌建群，而對照動物示出心臟無光發(fā)射跡象(圖6)。為確定所述組織中是否存在低的及不可檢測水平的細(xì)菌，從每只動物中切下心臟、肝和脾并培養(yǎng)過夜。大鼠的肝和脾是直接參與細(xì)菌清除的器官，在兩個組中均示出存在發(fā)光細(xì)菌。與完全沒有光發(fā)射的對照心臟相反，在插管的心臟中檢測到強(qiáng)光發(fā)射(圖7)。在培養(yǎng)的導(dǎo)管上未檢測到細(xì)菌。
這些發(fā)現(xiàn)表明在無免疫應(yīng)答的和具有免疫活性的動物中，通過股靜脈注入血流中的發(fā)光細(xì)菌從正常的組織、損傷的或發(fā)炎的組織中清除時，還有持續(xù)保留細(xì)菌額外一段時間的部位。
權(quán)利要求
1.一種微生物或細(xì)胞在制備一種診斷和/或觀測創(chuàng)傷或發(fā)炎組織或與之相關(guān)的疾病的診斷性組合物中的應(yīng)用，所述微生物和細(xì)胞含有編碼一種可檢測蛋白或者能誘導(dǎo)一種可檢測信號的蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.一種微生物或細(xì)胞在制備一種治療創(chuàng)傷或發(fā)炎組織或與之相關(guān)的疾病的藥物組合物中的應(yīng)用，所述微生物和細(xì)胞含有編碼一種可檢測蛋白或者能誘導(dǎo)一種可檢測信號的蛋白質(zhì)的DNA序列，其中所述微生物或細(xì)胞進(jìn)一步含有一個或多個可表達(dá)的DNA序列，該序列編碼適于治療創(chuàng)傷或發(fā)炎組織或與之相關(guān)疾病的一或多種蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中所述能誘導(dǎo)一種可檢測的信號的蛋白質(zhì)是一種發(fā)光或熒光蛋白。
4.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述發(fā)光或熒光蛋白是螢光素酶、RFP或GFP。
5.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述微生物或細(xì)胞另外含有一個編碼螢光素酶底物的基因。
6.權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中所述能誘導(dǎo)一種可檢測的信號的蛋白質(zhì)是一種能誘導(dǎo)可通過磁共振成像(MRI)檢測的一種信號或者能與觀測組織所需的一種造影劑、生色團(tuán)或配體結(jié)合的蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述微生物是一種細(xì)菌或病毒。
8.權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中所述病毒是痘苗病毒(Vacciniavirus)。
9.權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中所述細(xì)菌是減毒的鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella thyphimurium)，減毒的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)，減毒的單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)或者大腸桿菌(E.coli)。
10.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞是一種哺乳動物細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述哺乳動物細(xì)胞是一種自身或異源干細(xì)胞。
12.權(quán)利要求2-11任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述適于治療創(chuàng)傷或發(fā)炎組織或與之相關(guān)的疾病的蛋白質(zhì)是一種導(dǎo)致細(xì)胞死亡的酶或者是一種導(dǎo)致細(xì)胞碎片消化的酶。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述疾病是心內(nèi)膜炎、心包炎、炎癥性腸病、下背痛(herniated nucleus pulposis)、顳動脈炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎或者關(guān)節(jié)炎。
14.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述疾病是一種動脈粥樣硬化性疾病。
15.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述疾病是冠狀動脈病變、周圍血管病變或腦動脈病變。
16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述診斷和/或觀測通過MRI進(jìn)行。
17.權(quán)利要求2-16任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述可表達(dá)的DNA序列存在于BAC、MAC、cyber細(xì)胞或cyber病毒上。
18.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中至少一個所述DNA序列在一種誘導(dǎo)型啟動子的控制下。
19.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所定義的一種微生物或細(xì)胞在監(jiān)測抗生素治療的效力或者在評價一種縫合線或可植入材料對細(xì)菌建群的抗性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種微生物或細(xì)胞在制備一種診斷組合物以診斷和/或觀測創(chuàng)傷或發(fā)炎組織或與所述組織相關(guān)的疾病中的應(yīng)用，所述微生物或細(xì)胞含有編碼一種可檢測蛋白質(zhì)或者一種能誘導(dǎo)可檢測信號的蛋白質(zhì)如發(fā)光或熒光蛋白的DNA序列。另外，本發(fā)明描述了治療性應(yīng)用，其中所述微生物或細(xì)胞另外含有一種可表達(dá)的DNA序列，該序列編碼適于治療的一種蛋白質(zhì)，例如導(dǎo)致細(xì)胞死亡或者細(xì)胞碎片消化的酶。
文檔編號A61K38/43GK1668758SQ03812787
公開日2005年9月14日 申請日期2003年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月5日
發(fā)明者阿拉達(dá)爾·A.·紹洛伊, 沙赫洛克·沙巴漢, 勇·A.·于 申請人:吉恩勒克斯公司