專利名稱：基于節(jié)桿菌細胞的抗鮭魚立克次氏體敗血病疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用節(jié)桿菌屬活菌株制備用于治療或預(yù)防鮭魚立克次氏體敗血癥(SRS)的藥物，以及基于這些細菌的疫苗。
背景技術(shù)：
鮭魚立克次氏體(Piscirickettsia salmonis)是一種革蘭氏陰性專性細胞內(nèi)細菌，其導致鮭魚(salmonid fish)的系統(tǒng)性敗血癥(鮭魚立克次氏體綜合癥(salmonid rickettsial syndrome)，SRS，或魚類立克次氏體病(piscirickettsiosis))。目前越來越頻繁地在來自世界各地的淡水到海水的其它多種魚類中意識到魚類立克次氏體樣細菌。
魚類立克次氏體病及魚類立克次氏體病樣疾病已經(jīng)影響到水產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)力、收益、與商業(yè)養(yǎng)殖相容的物種、和魚從一個地方向另一個地方的運輸。僅智利水產(chǎn)業(yè)每年就因鮭魚立克次氏體病損失$1.5億。在智利，這種綜合癥已經(jīng)致使人們從具有商業(yè)上更期望的銀大馬哈魚(coho salmon)轉(zhuǎn)向商業(yè)上較不期望的但具有更高魚立克次氏體病抗性的鮭(Atlantic salmon)作為主要養(yǎng)殖種類。
在SRS的治療上已經(jīng)測試了抗微生物劑，但未獲得一致的成功。其它提出的措施包括通過降低放養(yǎng)密度和毫不遲延地從魚塘中移走死魚來減輕魚的壓力。對付SRS流行病最實際的解決方法將是首先找到預(yù)防這種病的有效疫苗。源于鮭魚立克次氏體的滅活菌苗制品已經(jīng)被證實具有一定的保護作用，并且對于多價油制品中共同給藥而言，該制品可能是僅有的適宜選擇，但商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)這種制品相對昂貴?；趤碜怎q魚立克次氏體的重組抗原的疫苗仍未進入市場。
因此，迫切需要獲得能夠顯著降低由魚類立克次氏體病導致的魚死亡率的疫苗。我們發(fā)現(xiàn)一種現(xiàn)有的商業(yè)疫苗產(chǎn)品可顯著有效預(yù)防這種疾病，本發(fā)明就是基于這種驚人的發(fā)現(xiàn)。這種疫苗的商品名為RenogenTM，其包含活的無毒節(jié)桿菌屬細菌菌株。當前，該疫苗用于預(yù)防大馬哈魚(salmon)及其它養(yǎng)殖魚類的細菌性腎病(BKD)。這種菌株的特征在WO 98/33884中公開，在此將此文獻并入作為參考。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面，提供節(jié)桿菌活細胞在制備用于魚中治療或預(yù)防魚類立克次氏體病的藥物中的用途。此藥物的優(yōu)選目標是暴露于SRS感染危險的鮭魚。優(yōu)選節(jié)桿菌細胞來自保藏號為ATCC 59921的菌株或等價菌株。
在本發(fā)明的第二方面，提供包含節(jié)桿菌活細胞和死(killed)細菌免疫刺激劑及藥用可接受載體的疫苗組合物。本發(fā)明的另外一個方面，提供包含死節(jié)桿菌細胞物質(zhì)的疫苗組合物，以及節(jié)桿菌死細胞物質(zhì)作為免疫刺激劑的用途。這種節(jié)桿菌死細胞物質(zhì)優(yōu)選來源于保藏號為ATCC 59921的菌株或等價菌株。
本發(fā)明的另一個方面提供疫苗組合物，其含有節(jié)桿菌活細胞和滅活的鮭魚立克次氏體抗原，由此，疫苗可以任選地以試劑盒的形式提供，在該試劑盒中包括凍干的節(jié)桿菌活細胞培養(yǎng)物和含有滅活的鮭魚立克次氏體抗原的無菌稀釋劑。
本發(fā)明的再一個方面提供在魚中預(yù)防或治療魚類立克次氏體病的方法，包括給需要此類治療的魚施用包含節(jié)桿菌活細胞的疫苗。
發(fā)明詳述RenogenTM疫苗已有一段時間被用于對抗鮭魚的細菌性腎病(BKD)。該疫苗是獨特的，因為其是第一個被許可在水產(chǎn)業(yè)中使用的活培養(yǎng)物。該疫苗包含保藏號為ATCC 55921的節(jié)桿菌屬新種(Arthrobacter sp.nov.)的活培養(yǎng)物(該菌株在1996年12月20日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(10801 Boulevard大學，馬納薩斯，VA 20110-2209))。節(jié)桿菌屬細菌不會使魚致病，并且也不是BKD的病原體(該病原體為Renibacteriumsalmoninarum)。
于田間的一個地點觀察到，在有感染BKD危險的鮭魚群體中使用RenogenTM，導致與未經(jīng)處理的魚相比死亡率戲劇性的下降。在RenogenTM處理組中，平均體重增加比未處理組高18％。由于SRS在此地也是常見的，這致使本發(fā)明人推測RenogenTM可能賦予了對抗BKD以及SRS的潛在防護作用。
為了驗證該設(shè)想，用RenogenTM對池塘養(yǎng)殖的魚進行免疫，隨后用鮭魚立克次氏體攻擊這些魚，見實施例2所述。在陰性對照組(用生理鹽水進行注射)中，幾乎所有的魚均死于SRS。接受疫苗RenogenTM的試驗組，在471dd(度天)后表現(xiàn)出極低的死亡率，折合88-100的相對百分存活(relative percent survival，RPS)。甚至在1441dd(相當于在海水中1年)后，試驗組的RPS仍在69到85％之間，而在滅活的鮭魚立克次氏體“金標準”組中僅為48.6％。
有關(guān)RenogenTM接種的潛力的進一步證據(jù)，由使用兔抗節(jié)桿菌多克隆抗體作為探針探測時鮭魚立克次氏體抗原的交叉反應(yīng)性證實(實施例1)。
我們已經(jīng)證實，RenogenTM比任何其它已知疫苗能夠更有效地防止SRS。已知節(jié)桿菌屬活細菌能夠進入細胞并在有限時間內(nèi)進行復制。本發(fā)明人認為這使得與鮭魚立克次氏體的T-細胞表位有足夠同源性的糖和蛋白質(zhì)抗原可以被加工，從而針對強致病性鮭魚立克次氏體的直接攻擊提供了高水平的保護作用。
因此，本發(fā)明提供節(jié)桿菌屬細菌細胞在制備治療或預(yù)防魚中的魚類立克次氏體病的藥物中的用途，其中所述魚特別是鮭魚，包括大馬哈魚和鱒魚類，特定是銀大馬哈魚(Oncorhyncus kisutch)，大鱗大馬哈魚(Oncorhynchus tshawytscha)，馬蘇大馬哈魚(Oncorhyncus masou)，細鱗大馬哈魚(Oncorhynchus gorbuscha)，虹鱒(Oncorhynchus mykiss)，及鮭(Salmo salar)。但對于任何易感染魚類立克次氏體病或類似疾病的其它魚類可能也是有益的，例如羅非魚(Tilapia sp.)，Black seabass(Dicentrarchus sp.)，White seabass(Atractoscion nobilis)，石斑魚(grouperfish)、麗魚科(cichlids)魚類等。
RenogenTM基于一種特定的節(jié)桿菌屬保藏菌株(ATCC 59921)。在實施本發(fā)明時，可使用該菌株或等價的節(jié)桿菌屬菌株。等價的節(jié)桿菌屬菌株具有節(jié)桿菌ATCC 59921的鑒別特征(identifying characteristics)。它們展示出相似的對抗SRS的保護能力。與ATCC 59921菌株有相同的16S rDNA序列或是16S rDNA序列與ATCC 59921菌株的序列分歧小于3％的的節(jié)桿菌屬物種被認為是等價的。此16S rDNA序列已在Genbank上登記，登記號為AF099202。另外一種確定等價菌株的方法是根據(jù)Griffiths，SG等(1998)魚及貝免疫學(Fish & Shellfish Immunology)8607-619所述，通過RAPD方法，采用引物F12-373(5′-ACGGTACCAG-3′)進行分析。當在節(jié)桿菌ATCC 59921及等價菌株上實施該分析試驗時，產(chǎn)生約373bp的區(qū)別性片段。在此出版物中描述了另一種RAPD方法，其采用引物Rsxll-67f(5′-CTGTGCTTGCACGGGGGATTA-3′)和Rsxll-284r(5′-GTGGCCGGTCAC CCTCTCAG-3′)，當用于節(jié)桿菌ATCC 59921或等價菌株時產(chǎn)生260bp的片段。
在各種各樣的生境，包括海洋環(huán)境中，節(jié)桿菌屬物種數(shù)目眾多并且豐富。許多節(jié)桿菌屬菌株可從商業(yè)保藏機構(gòu)獲得。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，基于所述鑒別特征和/或此處鑒定的SRS免疫原性，對已知菌株或新分離的菌株進行篩選并不會構(gòu)成過度繁重的工作。SRS免疫原性性質(zhì)的鑒定可以通過前段中的篩選試驗進行，和/或通過實施例1和2所述的實驗方法進行。
優(yōu)選的疫苗給藥途徑是通過腹膜腔注射，但也可采用其它的給藥途徑，包括口服喂飼、皮內(nèi)注射或肌內(nèi)注射，或是在海水或淡水中浸浴。在給魚注射疫苗前，通常將魚麻醉。對于通過腹膜腔注射施用本發(fā)明疫苗，推薦魚體重等于或大于10克。對于浸浴給藥或口服給藥，優(yōu)選體重至少為2克。
疫苗的有效劑量可隨對象的大小和物種及給藥模式而變。獸醫(yī)或水產(chǎn)專家可通過反復試驗確定最適劑量。適宜劑量范圍可以在大約102到109cfu每單位劑量，優(yōu)選約104到107cfu每單位劑量，更優(yōu)約105到106cfu每單位劑量，最優(yōu)約105cfu每單位劑量。然而，更高或更低的劑量可能也是有效的。優(yōu)選向待治療的魚給予單一劑量單位。較小的魚可以得益于約104到107cfu/ml劑量的浸漬(藥浴)給藥，接觸時間為例如約60秒。對于藥浴給藥方式來說，也可將疫苗稀釋在1到10體積的水中，之后加入魚池或魚箱內(nèi)。
優(yōu)選的注射劑量體積為大約0.05-0.5ml，優(yōu)選0.075-0.25ml，更優(yōu)選0.1-0.2ml，可選地大約0.1ml。
由于免疫形成依賴于水溫，因此，用本發(fā)明節(jié)桿菌疫苗對魚進行接種后，優(yōu)選在至少400度天(度天＝天數(shù)×水平均溫度℃)前，不讓魚暴露于SRS感染。
在本發(fā)明的一個實施方式中，將節(jié)桿菌活細胞與可藥用載體或賦形藥在藥物組合物中組合。合適的載體/賦形藥包括常規(guī)的賦形劑，并且可以是例如溶劑如水、油或鹽水、葡萄糖、甘油、潤濕劑或乳化劑、疏松劑、包衣、粘合劑、填充劑、崩解劑、稀釋劑、潤滑劑、pH緩沖劑、或常規(guī)佐劑例如胞壁酰二肽，阿夫立定，氫氧化鋁，油類(如礦物油)，皂苷，嵌段共聚物及本領(lǐng)域已知的其它物質(zhì)。優(yōu)選的藥物組合物含有鹽水稀釋劑。
典型地，將疫苗制成液體溶液或懸浮液用于注射或用于在水中遞送。也可以制成適于在給藥前溶解或懸浮于液體賦形藥中或與固體食物混合的固體形式(如粉末)。
優(yōu)選疫苗是凍干的培養(yǎng)物。該種形式的疫苗適于用無菌稀釋劑復原(reconstitution)。例如凍干細胞可以在0.9％鹽水(任選地作為包裝的疫苗產(chǎn)品的一部分提供)中復原。本發(fā)明的疫苗藥物組合物可以以立即釋放或長期釋放的形式給藥。
在一個實施方式中，本發(fā)明節(jié)桿菌疫苗包含免疫刺激劑。該免疫刺激劑可以是任何已知的免疫刺激劑，但是優(yōu)選為死細菌制品。優(yōu)選地，免疫刺激劑是節(jié)桿菌死細胞物質(zhì)，其任何地是熱滅活的并可以任選地來自節(jié)桿菌ATCC 59921的培養(yǎng)物。死細菌制品的適宜例子包括″Peptimune″(加熱滅活的節(jié)桿菌ATCC 59921培養(yǎng)物)和″Ultracorn″(超聲破碎的Corynebacterium cutis裂解物)。死細菌免疫刺激劑的最佳劑量(按每個疫苗單位劑量計)為1到100μg的細胞物質(zhì)，優(yōu)選5到50μg，更優(yōu)10到20μg，任選地12μg左右。死細菌免疫刺激劑任選地溶解或懸浮在無菌稀釋劑(如鹽水)中，用于與凍干的節(jié)桿菌活細胞混合。
一方面，本發(fā)明提供疫苗組合物，其包含節(jié)桿菌活細胞，還包含至少一種其它的免疫原(在此，“免疫原”被定義為一種能夠引起魚的特異免疫應(yīng)答的分子，如抗原)。免疫原任選地選自由鮭魚立克次氏體(P.salmonis)制備的滅活抗原；重組鮭魚立克次氏體抗原；及攜帶可表達的鮭魚立克次氏體抗原的核酸載體。在一些情況下，可能期望將本發(fā)明的RenogenTM疫苗與常規(guī)的SRS疫苗(鮭魚立克次氏體菌苗或重組抗原疫苗或核酸疫苗)組合在包含此兩種成分的試劑盒中，用于單獨、相繼或同時給藥治療或預(yù)防SRS。
在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及包含節(jié)桿菌活細胞和滅活的鮭魚立克次氏體抗原，以及任選地節(jié)桿菌死細胞物質(zhì)(作為免疫刺激劑)的疫苗。鮭魚立克次氏體抗原可以通過使用任何已知的滅活劑滅活來制備，但優(yōu)選通過福爾馬林滅活的方式制備。鮭魚立克次氏體抗原可以從任何細菌分離物制備。任選地，使用保藏號ATCC VR-1361的菌株LF-89或來源其的菌株，制備滅活抗原。
用于滅活鮭魚立克次氏體抗原的一種適宜方法是從鮭魚立克次氏體感染的CHSE-14細胞培養(yǎng)物收獲上清液，加入福爾馬林(37％甲醛溶液)至終濃度0.125％(v/v)。將培養(yǎng)物液體/福爾馬林混合物攪拌至均質(zhì)，然后保持在4±2℃，持續(xù)攪動最少72小時。滅活的收獲物可以通過無菌超濾濃縮。按照酶免疫試驗(EIA)比例(表示為抗原的OD405/OD490/標準OD405/OD490)的定義，適宜的鮭魚立克次氏體抗原制品的終濃度為1.5±0.2單位。
節(jié)桿菌和鮭魚立克次氏體成分在單一疫苗中的組合導致與單獨的節(jié)桿菌活細胞疫苗相比顯著提高的抗SRS保護作用。在類似于實施例2中所述的SRS攻擊試驗中，證實與單價活節(jié)桿菌疫苗相比，二價疫苗經(jīng)過一個長時期(1400度天后)增加20個以上RPS(相對百分存活)點。
優(yōu)選地，疫苗以試劑盒的形式生產(chǎn)和出售，試劑盒中包含凍干的活節(jié)桿菌細胞培養(yǎng)物以及其中溶解或懸浮有滅活的鮭魚立克次氏體抗原(及任選地死細菌免疫刺激劑)的無菌稀釋劑如鹽水。例如，按上述制備的鮭魚立克次氏體抗原可以以大約10-大約150ml/升、優(yōu)選大約20-大約100ml/升、最優(yōu)選75ml/升的濃度，與稀釋劑混和。
本發(fā)明范圍內(nèi)也包括制備包含活節(jié)桿菌細胞和來自非鮭魚立克次氏體的病原體的抗原的多價疫苗。
包含節(jié)桿菌活細胞的所有本發(fā)明疫苗不僅提供對抗SRS的保護作用，也導致對魚的抗BKD感染的保護作用。
實施例實施例1鮭魚立克次氏體抗原和抗節(jié)桿菌多克隆抗體的交叉反應(yīng)性將從CHSE-214細胞培養(yǎng)物中收集的約25μg鮭魚立克次氏體細菌細胞進行三次洗滌后，與100μl Laemmli緩沖液混合，于95℃加熱3分鐘。在9％丙烯酰胺膠中加入10μl樣品，150伏電泳1小時分離蛋白。用半干印跡轉(zhuǎn)移器(semi-dry transblotter，BIORAD)將蛋白轉(zhuǎn)移到100％硝酸纖維素膜上。于20伏轉(zhuǎn)移蛋白，50分鐘。
將印跡與20μl兔抗節(jié)桿菌多克隆抗體在15ml 1％酪蛋白Tris-硼酸鹽水(cTBS)中孵育45分鐘。之后使印跡暴露于5μl山羊抗兔免疫球蛋白堿性磷酸酶(GAR-AP)并顯色。印跡上顯示出幾種蛋白，表明抗節(jié)桿菌蛋白抗體與某些鮭魚立克次氏體蛋白具有強烈的親和性。在二維Wester印跡中也驗證了此結(jié)果。
本實驗證明，某些鮭魚立克次氏體和節(jié)桿菌蛋白具交叉反應(yīng)性，說明這些節(jié)桿菌蛋白能夠引發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有潛在識別和抵抗鮭魚立克次氏體強致病性細菌能力的抗體。
實施例2節(jié)桿菌疫苗抗SRS的保護作用根據(jù)標準操作方法，將銀大馬哈魚(每個處理組n＝110條，平均體重為10克)于12℃在常規(guī)飼養(yǎng)條件下維持在池水中。在一周的環(huán)境適應(yīng)后，分別給第1、2、和3組腹膜內(nèi)接種0.1ml 105、106和107cfu/劑在鹽水稀釋劑中復原的凍干節(jié)桿菌屬新種細胞(RenogenTM)。第4和5組采用與第1組相同的方式處理，但每劑分別加入12.2μg和50μg于鹽水稀釋劑中的″Peptimune″。Peptimune是在液體培養(yǎng)基(MTSB肉湯)中生長到細胞密度大于1XE9的節(jié)桿菌的熱滅活制品，通過蛋白分析試驗標準化以便每劑給藥12μg和50μg。第6和7組為陽性對照，用鮭魚立克次氏體菌苗進行接種。此菌苗從鮭魚立克次氏體菌株LF-89感染的CHSE-14細胞培養(yǎng)物上清，通過在4℃用0.125％福爾馬林處理至少72小時而制備。使用U/F濃縮，將濃縮的上清用于每0.1ml劑量摻入8μg(蛋白)。此菌苗疫苗與Ultracorn(Virbac，法國)一起按每條魚20μg(組6)和100μg(組7)遞送。Ultracorn是一種基于超聲的Corynebacterium cutis裂解物的免疫刺激劑。這些抗原在注射前用等體積礦物油佐劑乳化。陰性對照組(組8)用鹽水注射。
表1處理組匯總(對于20ml的劑量體積(每條魚0.1ml))
攻擊方法在接種后471和1441dd(度天)時，每個處理2個重復組，各25條魚，通過腹膜內(nèi)注射用致病性鮭魚立克次氏體進行攻擊。致病性鮭魚立克次氏體在CHSE-14細胞上至少培養(yǎng)2-3周。培養(yǎng)上清至少達到50％CPE時用于腹膜內(nèi)注射。致病性立克次氏體以10-2稀釋度或更高稀釋度按每條魚0.1ml進行注射(n＝25)。受攻擊的魚維持在12℃。
在攻擊1結(jié)束前，從第1組、7組和8組(在該組中僅有8條魚存活)的存活群體中取10條魚處死，并取0.5g的脾腎組織樣品，勻漿，稀釋在10ml組織培養(yǎng)基中。在含有匯合的CHSE-214細胞的96孔板上檢測TCID50。
結(jié)果與討論表128天安全檢驗期的死亡率，在整個安全期和攻擊前期維持在9-12℃。
在此安全研究中，觀測到，接近28天安全期結(jié)束時，組3的魚有一些損失(6.3％)。實驗室研究人員對該群體的所有魚進行了3天福爾馬林處理用于治療細菌性鰓病。在最初的3天pv記錄到組5中的死亡率(3.6％)，表明以稀釋劑的40％包括Peptimune是稍有毒性的。在安全期未從這些損失，針對活疫苗菌株或任何偶發(fā)的細菌培養(yǎng)物，進行陽性板培養(yǎng)。
表2在用節(jié)桿菌屬新種細胞(1-5組)、滅活SRS疫苗或鹽水接種后471dd，用強致病性鮭魚立克次氏體通過腹膜內(nèi)注射(TCID503×102.9/魚)攻擊，銀大馬哈魚(平均體重為10克)在12℃的累積死亡率和相對百分存活率。
在接種后471dd時，組1中魚的相對百分存活率(RPS)為97.6，即32天對抗鮭魚立克次氏體直接感染的高水平保護作用，而此時鹽水對照組的死亡率為84％。這有利地與用標準滅活疫苗接種(組6和組7)獲得的保護形成對比，它們的RPS值分別為50％和69％。
TCID50分析組1、組7和組8中的存活魚。
來自此471dd攻擊(感染后32天)的存活魚(n＝7-10)的組織樣中SRS的感染水平
取自RenogenTM組的魚樣品的TCID50值低于滅活疫苗組，并且這兩組都低于鹽水對照組。這無明顯臨床相關(guān)性，因為當進行平均時，高效價組的貢獻抵消較低的感染劑量。但是RenogenTM組確實有最低的百分陽性(＜20％)，因為低于102的樣本被認為未臨床感染SRS。這與取自鹽水對照組的相同樣品形成了比較(鹽水對照組中50％的魚為SRS陽性)，并有利地與滅活疫苗組(44％的魚SRS陽性)形成了比較。
表3用節(jié)桿菌屬新種細胞(1-5組)、滅活SRS疫苗或鹽水接種后1441dd，以致病性鮭魚立克次氏體通過腹膜內(nèi)注射(TCID 3×102.9/魚)進行攻擊，銀大馬哈魚(平均體重為10克)在12℃的累積死亡率和相對百分存活率。
注旨在用于進行長期效力研究的第6組備用魚由于該魚池(17)意外的水流切斷而損失。
經(jīng)過1140dd時間后，對較早試驗期(471dd)觀察到的保護作用進行了持續(xù)應(yīng)答的評價。這第二次攻擊的結(jié)果(此時，鹽水對照組中觀察到72％的死亡率)，說明在RenogenTM處理的魚中仍然有高水平的保護(RPS值為69.4％)，同時在某種程度上說明高劑量可促進長期保護(106和107cfu/劑量分別產(chǎn)生85.8和81.7的RPS)。在稀釋劑中加入12μg和15μg的免疫刺激劑Peptimune提高了產(chǎn)物的給藥效力(分別為76.1和79.7％)。標準參考疫苗(第6組)的意外損失使得僅與組7進行了比較，而組7的RPS為48.6％。
結(jié)論在接種后471dd和1441dd，對于鮭魚立克次氏體的直接攻擊，RenogenTM均提供了顯著的防護作用。這種疫苗比標準油疫苗提供了更優(yōu)的保護作用。我們能夠證明在RenogenTM組中更少的存活魚被鮭魚立克次氏體臨床感染。本研究說明節(jié)桿菌屬新種活疫苗提供了高度的抗鮭魚立克次氏體感染的保護作用，并且這種保護效果被證實是長期的。在疫苗中包括死節(jié)桿菌制品具有免疫刺激效應(yīng)，從而導致提高的存活率。
權(quán)利要求
1.活節(jié)桿菌細胞在制備用于魚中治療或預(yù)防魚類立克次氏體病的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中魚是鮭魚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中魚類立克次氏體病是鮭魚立克次氏體敗血病(SRS)。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的用途，其中節(jié)桿菌細胞來自保藏號為ATCC 55921的菌株，或等價菌株。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的用途，其中魚是銀大馬哈魚(Oncorhyncus kisutch)。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的用途，其中藥物還含有鮭魚立克次氏體(Piscirickettsia salmonis)抗原。
7.疫苗組合物，其包含活節(jié)桿菌細胞和免疫刺激劑以及藥用可接受載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的疫苗組合物，其中所述免疫刺激劑包括死細菌細胞物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的疫苗組合物，其中所述細胞物質(zhì)來源于死節(jié)桿菌細胞。
10.含有死節(jié)桿菌細胞物質(zhì)的疫苗組合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的疫苗組合物，其中節(jié)桿菌細胞物質(zhì)是熱滅活的。
12.根據(jù)權(quán)利要求7-11之任一項的疫苗組合物，其中節(jié)桿菌細胞和/或死節(jié)桿菌細胞物質(zhì)來源于保藏號為ATCC 55921的菌株。
13.根據(jù)權(quán)利要求7-12之任一項的疫苗組合物，其是凍干的或是鹽水懸浮液的形式。
14.疫苗組合物，其含有活節(jié)桿菌細胞并還含有至少一種其它的免疫原。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的疫苗組合物，其中所述免疫原選自由鮭魚立克次氏體制備的滅活抗原；重組鮭魚立克次氏體抗原；和攜帶可表達的鮭魚立克次氏體抗原的核酸載體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的疫苗組合物，其包含活節(jié)桿菌細胞和通過福爾馬林滅活的鮭魚立克次氏體抗原。
17.試劑盒，其包含用于分開地、相繼地或同時地向魚施用的第一疫苗和第二疫苗，其中，第一疫苗包含活節(jié)桿菌細胞，第二疫苗包含選自如下的免疫原由鮭魚立克次氏體制備的滅活抗原；重組鮭魚立克次氏體抗原；和攜帶可表達的鮭魚立克次氏體抗原的核酸載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的試劑盒，其包含凍干的活節(jié)桿菌細胞；和含有滅活的鮭魚立克次氏體抗原的無菌稀釋劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的疫苗組合物或根據(jù)權(quán)利要求18的試劑盒作為藥物的用途，用于向魚提供抗SRS和BKD感染的保護作用。
20.治療或預(yù)防魚類立克次氏體病的方法，包括向魚施用根據(jù)權(quán)利要求7-16之任一項的疫苗組合物。
21.死節(jié)桿菌細胞物質(zhì)作為用于魚的免疫刺激劑的用途。
全文摘要
基于節(jié)桿菌活細胞的疫苗可以用于預(yù)防魚的魚類立克次氏體病。
文檔編號A61K9/10GK1668328SQ03816688
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月15日
發(fā)明者K·薩洛紐斯, S·G·格里菲斯 申請人:諾瓦提斯公司