專利名稱：腦血管疾病基因治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因治療或預(yù)防腦血管疾病。更具體地，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防試劑，該試劑包含HGF基因作為活性成分，還涉及包括向靶位點(diǎn)施用這種試劑的步驟的方法。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞生長因子(HGF)是作為在體外導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖的因子而被發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子(Biochem.Biophys.Res.Commun.1221450(1984)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 836489(1986)；FEBS Letters 22231(1987)；Nature 342440-443(1989)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 873200(1991))。HGF是一種纖溶酶原相關(guān)的和間充質(zhì)來源的多效(pleiotropic)生長因子，已知在各種類型的細(xì)胞中控制細(xì)胞生長和細(xì)胞運(yùn)動(Nature 342440-443(1989)；Biochem.Biophys.Res.Commun.239639-644(1997)；J.Biochem.Tokyo 119591-600(1996))。已知HGF也是一種在許多器官的再生中調(diào)控胚胎發(fā)生以及形態(tài)發(fā)生過程的重要因子(Exp.Cell Res.196114-120(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 901937-1941(1993)；Gene Therapy 7417-427(2000))。HGF不僅在體內(nèi)作為受損肝臟的修復(fù)和再生中的肝再生因子，其也一直顯示具有血管新生效應(yīng)，并且能在局部缺血或動脈疾病的治療或預(yù)防中起重要的作用(Symp.Soc.Exp.Biol.47 cell behavior 227-234(1993)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 901937-1941(1993)；Circulation 97381-390(1998))。
由于HGF顯示各種功能，包括血管新生功能，如上面所描述的，已經(jīng)進(jìn)行了其在藥物制劑中使用的各種研究(Jikken Igaku(Experimental Medicine)(supplementary volume)10(3)330-339(1992))。例如，有使用HGF作為下列試劑的報(bào)道抗癌劑(未審查的已公開的日本專利申請No.(JP-A平6-25010)；肺損傷治療劑(JP-A平6-172207)；癌癥治療副作用減輕劑(JP-A平6-340546)；
上皮細(xì)胞生長增強(qiáng)劑(JP-A平7-179356)；免疫抑制劑副作用減輕劑(JP-A平7-258111)；暴發(fā)性肝炎治療劑(JP-A平10-167982)；心肌梗塞治療劑(JP-A平11-246433)；動脈疾病治療劑(JP-A平8-295634)；肥胖治療劑(JP-A平10-279500)；擴(kuò)張性心肌病治療劑(JP-A平11-1439)；肌萎縮性側(cè)索硬化治療劑(JP-A 2002-87983)；肺纖維化預(yù)防劑(JP-A平8-268906)；軟骨病治療劑(JP-A平8-59502)；膠原降解促進(jìn)劑(JP-A平7-300426)；胃十二指腸疾病治療劑(JP-A平7-138183)；顱神經(jīng)病治療劑(JP-A平7-89869)；急性腎功能衰竭治療劑(已公開的國際公開No.2001-516358的日文譯文)；缺血性疾病/動脈疾病治療劑(WO 00/07615)；糖尿病治療劑(WO 98/32458)；毛發(fā)外用劑(JP-A平5-213721)；皮膚化妝品(JP-A平5-213733)；促毛發(fā)生長劑(JP-A平5-279230)；巨核細(xì)胞增加劑(JP-A平7-101876)；誘導(dǎo)分化劑(JP-A 2002-78482)；腎小球疾病治療劑(JP-A平9-87199)；惡病質(zhì)治療劑(JP-A平10-316584)；多臟器功能衰竭治療劑(JP-A平10-310535)；缺血性疾病治療劑(WO 96/32960)；細(xì)胞增殖和分化劑(已公開的國際公開No.平10-503923的日文譯文)；造血細(xì)胞生長和分化劑(已公開的國際公開No.平10-509951的日文譯文)；神經(jīng)疾病改善劑(JP-A平7-41429)；和低血糖和糖原病治療劑(JP-A平10-7586)。
蛋白質(zhì)制品通常是通過靜脈內(nèi)給藥。在缺血疾病模型中，HGF給藥的實(shí)例有靜脈內(nèi)給藥和動脈內(nèi)給藥(Circulation 97381-390(1998))。盡管在這種動物模型中已經(jīng)顯示靜脈內(nèi)或動脈內(nèi)給予HGF是有效的，但是一直沒有得出有關(guān)HGF對特定疾病的有效給藥方法，劑量，等等的結(jié)論。特別地，當(dāng)將HGF蛋白用作藥物制劑時(shí)，HGF在血液中的半衰期短便成了一個(gè)問題。由于HGF在血液中的半衰期是短暫的10分鐘，因此一直很難在血液中將HGF的濃度維持在HGF充分發(fā)揮功能的水平。此外，關(guān)于如何將有效量的HGF輸送到受感染部位一直是另一個(gè)挑戰(zhàn)。
由于分子生物學(xué)領(lǐng)域顯著的技術(shù)進(jìn)步，包含將基因?qū)氲郊?xì)胞中的基因治療現(xiàn)在是可能的。通?？稍诟鞣N醫(yī)學(xué)治療中使用基因治療(Science 256808-813(1992)；Anal.Biochem.162156-159(1987))。選擇基因?qū)氲暮线m載體對于成功地進(jìn)行基因治療特別重要。迄今為止，在基因?qū)胫幸恢苯ㄗh使用病毒來源的載體，如腺病毒來源的載體。
然而，也一直提示病毒載體可能具有下列危險(xiǎn)與病毒感染相關(guān)的毒性；產(chǎn)生與宿主被抑制的免疫功能相關(guān)的病毒致病性；病毒的誘變或致癌本性；等等。
作為使用病毒載體方法的一種替代方法，已經(jīng)發(fā)展了使用脂質(zhì)體連同病毒外膜的體內(nèi)基因?qū)敕椒?，或HVJ(日本血凝病毒)-脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因?qū)敕椒?Science 243375-378(1989)；Anal.NY Acad.Sci.772126-139(1995))。使用這些方法已經(jīng)成功地在體內(nèi)將基因?qū)氲礁鞣N組織，這些組織包括肝臟、腎、血管壁、心臟，以及腦(Gene Therapy 7417-427(2000)；Science 243375-378(1989)；Biochem.Biophys.Res.Commun.186129-134(1992)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908474-8478(1993)；Am.J.Physiol.271(Regulatory Integrative Comp.Physiol.40)R1212-R1220(1996))。
然而，由于使用HVJ-脂質(zhì)體的方法需要不同的媒介物(vehicle)，如病毒和脂質(zhì)體，因此它們制備起來很復(fù)雜。此外，將HVJ病毒體與脂質(zhì)體融合致使所得顆粒的平均直徑是病毒顆粒直徑的1.3倍。已知這增加的直徑將細(xì)胞融合活性減少到野生型病毒的10％或更少，并且有一些組織不可能進(jìn)行基因?qū)牖蛘咴搶?dǎo)入無效。因此，發(fā)展了使用病毒包膜載體的基因?qū)敕椒ㄗ鳛橐环N允許更安全和更有效基因治療的方法(日本專利申請No.2001-026185/JP-A 2001-286282)。在這種方法中，用滅活的不能復(fù)制病毒蛋白的病毒作為病毒包膜，基因被包裹在這種病毒包膜中。該載體可用于將基因?qū)氲脚囵B(yǎng)細(xì)胞，生物組織中等等。已知使用這種病毒包膜載體能夠安全和高效地將基因?qū)氲礁闻K、骨骼肌、子宮、腦、眼、頸動脈、皮膚、血管、肺、心臟、腎、脾、癌組織、神經(jīng)、B淋巴細(xì)胞、呼吸器官組織、懸浮細(xì)胞等等。
以腦梗塞和腦出血為代表的腦血管病是也具有社會意義的重要疾病。盡管在最近數(shù)年里由于腦血管疾病導(dǎo)致的死亡率已經(jīng)下降，但是這些疾病仍然高居死亡原因的前列。受缺血性腦血管疾病后效應(yīng)影響的患者，以及正通過臨床機(jī)構(gòu)接受治療的入院病人或門診病人仍然在繼續(xù)增長。
通常，腦梗塞是由于閉塞，或者由于腦動脈或頸動脈內(nèi)的灌注壓降低，導(dǎo)致局部缺血損傷，而引起的腦組織不可逆壞死。腦梗塞可分成下列三大組(Manabe，H.，和Omae，T.Ed.“Nou-Kekkan Shogai(Cerebrovasculardisorder)”Life Science Publishing，p54-55(1992)；Imura，H.et al.Ed.，“Saishin Naikagaku Taikei Dai 66 Kan Nou-Kekkan Shogai(Integratedhandbook of internal medicine，Vol.66，Cerebrovascular disorder)”Nakayama Shoten，p28(1996))(1)腦血栓，其中由于動脈閉塞而在腦組織發(fā)生缺血壞死，其中動脈閉塞是由于血液粘稠度增加，灌輸壓降低所致，或者這種閉塞是由于腦動脈內(nèi)的硬化損傷引起的；(2)腦栓塞，其中由于心內(nèi)血栓或者，盡管非常少見，由于血栓從動脈壁脫離，而在腦動脈內(nèi)形成栓子；和(3)血液動力學(xué)梗塞，由于頭部的動脈或顱內(nèi)腦動脈的狹窄或者閉塞使得流向外周腦組織的血流量減少所致。
在腦梗塞中，在疾病發(fā)生的數(shù)個(gè)小時(shí)內(nèi)發(fā)生腦水腫，并且這種情況持續(xù)到發(fā)病后大約一周。此后，水腫逐漸減小，但是在發(fā)病后1到3個(gè)月內(nèi)固定成為梗塞區(qū)。腦水腫導(dǎo)致腦容積增加。由于腦被堅(jiān)硬的顱骨包繞，因此當(dāng)由于腦水腫導(dǎo)致腦容積超過某種限度時(shí)，就會導(dǎo)致組織壓力和顱內(nèi)壓迅速增加。因而，腦損害更加嚴(yán)重，此后，梗塞區(qū)的范圍固定(Inamura，K.，Terashi，A.“Nippon Rinsho，Dai 51 Kan，CT，MRI Jidai no No-SotchuGaku，Jo-Kan(Nippon Rinsho，Vol.51，Cerebral Apoplexy in the Age of CTand MRI，No.1)”Nippon Rinsho Sha，p231-239(1993))。當(dāng)大腦的一部分發(fā)生梗塞時(shí)，患病部分所具有的那些功能，如識別、知覺、感覺、以及記憶功能都將喪失。
到目前為止，臨床上神經(jīng)細(xì)胞被一直公認(rèn)為易受缺血損傷。當(dāng)置于缺血條件下僅數(shù)分鐘，一些類型的神經(jīng)細(xì)胞就會受到損傷，并且這些細(xì)胞隨后就會死亡。缺血時(shí)，在海馬結(jié)構(gòu)和錐體細(xì)胞中與去極化相關(guān)的顯著神經(jīng)興奮之后，就會發(fā)生傳導(dǎo)阻斷。隨后，由于細(xì)胞外谷氨酸、細(xì)胞內(nèi)鈣離子、自由基等水平的增加所導(dǎo)致的細(xì)胞毒性使得細(xì)胞喪失功能，細(xì)胞最終死亡。如果由于缺血所導(dǎo)致的不可逆性改變在急性期能夠得到適當(dāng)?shù)刂委?，那么?jù)認(rèn)為能夠改善死亡率，并且也會減輕病后效應(yīng)。目前對腦梗塞的治療包括給予抗血小板試劑、改善腦循環(huán)和代謝的試劑等等。在這些抗血小板試劑中，存在對治療急性期腦血栓有效的藥物試劑。然而，由于這些試劑在患有腦出血或產(chǎn)生與腦血栓相似癥狀的腦梗塞患者中促進(jìn)出血性腦梗塞，因此禁忌它們在這些患者中使用，當(dāng)使用這些試劑時(shí)必需要仔細(xì)診斷該疾病的類型。
在急性期期間，使用那些在腦梗塞發(fā)病后大約一個(gè)月的慢性期期間才給予的改善腦循環(huán)的試劑被認(rèn)為是有害的(Kameyama，M.Ed.“Nou-sotchuChiryou Manyuaru(Treatment Manual of Cerebral Apoplexy)”Igaku-Shoin，p172-173(1991))。為了重建流向細(xì)胞仍然沒有死亡的區(qū)域的血流，在超急性期內(nèi)可使用再灌注治療如溶栓治療、旁路手術(shù)(bypasss surgery)、血栓內(nèi)膜切除術(shù)、以及栓塞摘除術(shù)用作替代療法。然而，當(dāng)腦組織由于腦梗塞已經(jīng)不可逆性地被損害時(shí)，由于會加重組織損傷，如增加出血性梗塞和腦水腫，因此隨后的血流重建會有很多問題(Okada，Y.，“Shinkei Kenkyu noShinpo(Progress in Neurologic Research)”Vol.40，No.4，p.655-665，Igaku-Shoin，(1996)；Takahasi，A.“medicina”Vol.32，No.11，p.2261-2263，Igaku-Shoin，(1991))。
現(xiàn)在，在腦梗塞的急性期使用藥劑是危險(xiǎn)的，因?yàn)樗鼈兛赡軐?dǎo)致出血性梗塞和缺血/再灌注損傷。此外，由于其它問題如所針對的致病情況有限，以及給藥后達(dá)到治療效果所需時(shí)間的限制，因此這些試劑并不完全令人滿意。
發(fā)明公開本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可降低與腦血流中斷后再灌注相關(guān)的腦缺血/再灌注損傷所導(dǎo)致的腦損傷程度的藥劑。HGF基因不同于其它血管新生因子，如VEGF，因?yàn)樗惶岣咝律艿耐ㄍ感浴Ｌ貏e是在腦血管病中，血管通透性增大將增加由于腦水腫和腦內(nèi)壓增大導(dǎo)致腦組織損傷的風(fēng)險(xiǎn)。因此，與使用其它血管新生因子的方法相比，使用不提高血管通透性的HGF的治療和預(yù)防方法是有益的。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供使用HGF基因抗腦血管病的治療或預(yù)防試劑，以及提供使用這些藥物試劑治療和預(yù)防腦血管病的方法。更具體地，本發(fā)明總結(jié)如下(1)治療或預(yù)防腦血管病的試劑，其中該試劑包含HGF基因。
(2)(1)的試劑，其中腦血管病是腦梗塞。
(3)(1)或(2)的試劑，其中該試劑是片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、軟膏、糖漿劑(syrup)、膏劑(slurry)、或懸浮液的形式。
(4)(1)到(3)中任意一種試劑，其中該試劑通過下列方法將基因?qū)氲郊?xì)胞中使用病毒包膜載體、內(nèi)在型脂質(zhì)體、靜電型脂質(zhì)體(electrostaticliposome)、HVJ脂質(zhì)體、或改進(jìn)的HVJ-脂質(zhì)體的方法，受體介導(dǎo)的基因?qū)敕椒?，通過使用基因槍將核酸分子連同載體導(dǎo)入到細(xì)胞中的方法，使用裸DNA的直接導(dǎo)入法，或者使用陽離子聚合物的導(dǎo)入法。
(5)(1)到(3)中任意一種試劑，其中該試劑通過使用HVJ-包膜將基因?qū)氲郊?xì)胞中。
(6)治療或預(yù)防腦血管病的方法，其中該方法包括將HGF基因?qū)氲讲溉閯游镏械牟襟E。
(7)(6)的方法，其中該腦血管病是腦梗塞。
(8)(6)或(7)的方法，其中該方法包括通過使用HVJ-包膜經(jīng)兩到三次將HGF基因?qū)氲讲溉閯游镏械牟襟E。
(9)HGF基因用于生產(chǎn)治療或預(yù)防腦血管病的試劑的用途。
(10)(9)的HGF基因的用途，其中腦血管病是腦梗塞。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“HGF基因”指能夠表達(dá)HGF(HGF蛋白)的核酸分子。在這里，術(shù)語“核酸分子”指如DNAs、RNAs、cDNAs和mRNAs等分子。具體地，例如在Nature 342440(1989)，日本專利No.2777678，和Biochem.Biophys.Res.Commun.163967(1989)中描述了編碼HGF的cDNAs。編碼HGF的cDNAs的核苷酸序列描述在上述文獻(xiàn)中，也登記在如GenBank等數(shù)據(jù)庫中?；谶@個(gè)序列信息，可通過使用適當(dāng)?shù)男蛄衅巫鳛镻CR引物，并且使用例如，來自肝臟或白細(xì)胞的mRNAs，通過進(jìn)行RT-PCR，來克隆HGF的cDNAs。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過下列基礎(chǔ)教科書，如分子克隆第二版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)(1989)很容易地完成這樣的克隆。此外，通過篩選基因組DNA文庫，可分離基因組DNAs。
本發(fā)明的HGF基因不限于這些cDNAs和基因組DNAs。只要所述基因編碼的蛋白與HGF具有實(shí)際上相同的功能，那么該基因可被用作本發(fā)明的HGF基因。更具體地是，可在本發(fā)明中使用的HGF基因包括1)在嚴(yán)緊條件下與上述cDNA雜交的核酸，或2)編碼包含由上述cDNA所編碼蛋白的氨基酸序列的蛋白的核酸，其中缺失、取代、添加、和/或插入一個(gè)或更多(優(yōu)選數(shù)個(gè))氨基酸，只要這種核酸編碼的蛋白具有HGF的功能。上述1)和2)的核酸可以很容易地通過下列方法獲得，如定點(diǎn)突變、PCR方法(見，CurrentProtocols in Molecular Biology edit.Ausubel等(1987)John Wiley & Sons，Sections 6.1-6.4)，或者常規(guī)的雜交方法(見，Current Protocols in MolecularBiology edit.Ausubel等(1987)John Wiley & Sons，Sections 6.3-6.4)。
更具體地，通過使用HGF基因的已知序列，或其部分作為探針；或者通過使用與該DNA序列特異性雜交的寡核苷酸作為引物，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠分離與該DNA序列雜交的核酸。獲得編碼與已知HGF功能相同的蛋白的核酸的嚴(yán)緊雜交條件通常是“37℃，1XSSC”等，更嚴(yán)緊地“42℃，0.5XSSC和0.1％SDS”等，甚至更嚴(yán)緊地“65℃，0.1XSSC和0.1％SDS”等。當(dāng)使用更嚴(yán)緊的雜交條件時(shí)，可分離包含與探針序列更同源的序列的核酸。然而，這里列舉的SSC、SDS和溫度條件僅僅是舉例。通過考慮上述條件和決定雜交嚴(yán)緊性的其它條件，如探針濃度、探針長度以及反應(yīng)時(shí)間，本領(lǐng)域技術(shù)人員能很容易地確定構(gòu)成與上述相同嚴(yán)緊程度的條件。
由通過上述雜交方法或PCR方法分離獲得的核酸所編碼的蛋白的氨基酸序列通常顯示與常規(guī)已知的HGF蛋白高度同源。術(shù)語“高度同源”指至少50％或更高的序列同源性，更優(yōu)選地70％或更高，甚至更優(yōu)選地90％或更高(例如，95％或更高)?？墒褂肒arlin and Altschul’s BLAST算法確定氨基酸序列和核苷酸序列的序列一致性(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877(1993))?；谶@種算法已經(jīng)發(fā)展了如BLASTN和BLASTX這樣的程序(Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990))。當(dāng)使用BLASTN分析核苷酸序列時(shí)，基于BLAST，將參數(shù)設(shè)置為，例如，分值為100和字長為12。當(dāng)使用BLASTX分析氨基酸序列時(shí)，基于BLAST，將參數(shù)設(shè)置為，例如，分值為50和字長為3。當(dāng)使用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，使用各自程序的默認(rèn)參數(shù)。這些分析方法的具體技術(shù)是公知的(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
如上面描述的，本發(fā)明中使用的HGF基因可以是天然存在的或人工合成的核酸，只要這些基因編碼的蛋白包含HGF活性。HGF具有體外促進(jìn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖的活性。因此，可以通過例如，研究這些蛋白在體外對肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，來確定由上述雜交方法等所得核酸所編碼的蛋白，或者由經(jīng)過修飾的天然HGF基因的核酸所編碼的蛋白是否具有HGF活性。
下面描述本發(fā)明基因治療中所使用的基因?qū)敕椒?、?dǎo)入方式、導(dǎo)入量等。
可將給予含有HGF基因作為活性成分的基因治療劑的方法分成兩類使用非病毒載體的方法；以及使用病毒載體的方法。在實(shí)驗(yàn)指南中詳細(xì)描述了這些載體的制備方法、給藥方法等等(Jikken Igaku(ExperimentalMedicine)Supplementary Volume，“Idenshichiryo no Kisogijyutsu(Fundamental Techniques for Gene Therapy)”，Yodosha，1996；Jikken Igaku(Experimental Medicine)Supplementary Volume，“Idenshidonyu &Hatsugenkaiseki Jikkenho(Experimental Methods for Gene Transfer &Expression Analysis)”，Yodosha，1997；“Idenshi-chiryo Kaihatsu KenkyuHandbook(Handbook of Gene Therapy Research and Development)”，NihonIdenshichiryo Gakkai(The Japan Society of Gene Therapy)Edition，NTS，1999)。下面具體描述這些載體和方法。
可使用這樣的重組載體，其已將靶基因插到非病毒的常規(guī)基因表達(dá)載體中，通過下面顯示的方法將靶基因?qū)氲郊?xì)胞和組織中。
將基因?qū)氲郊?xì)胞中的方法的實(shí)例是脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、鈣-磷酸鹽共沉淀法、DEAE-右旋糖酐法、使用玻璃毛細(xì)管的DNA直接注入法，等等。將基因?qū)氲浇M織的方法包括使用病毒包膜載體、內(nèi)在型脂質(zhì)體、靜電型脂質(zhì)體、HVJ脂質(zhì)體、改進(jìn)的HVJ-脂質(zhì)體(HVJ-AVE脂質(zhì)體)的方法，受體介導(dǎo)的基因?qū)敕椒?，使用基因槍將載體(如金屬顆粒)連同DNAs一同導(dǎo)入的方法，直接導(dǎo)入裸DNAs的方法，使用陽離子聚合物的導(dǎo)入法，等等。
通過將DNA摻入由脂質(zhì)雙分子層形成的脂質(zhì)體中，可構(gòu)建上述HVJ-脂質(zhì)體，然后將這種脂質(zhì)體與滅活的仙臺病毒(日本血凝病毒；HVJ)融合。與常規(guī)的脂質(zhì)體方法相比，使用HVJ-脂質(zhì)體具有極高水平的細(xì)胞膜融合，是特別優(yōu)選的導(dǎo)入方式之一。制備HVJ-脂質(zhì)體的方法在下列文獻(xiàn)中有詳細(xì)的描述，例如Experimental Medicine Supplementary Volume，“Idenshichiryo no Kisogijyutsu(Fundamental Techniques of Gene Therapy)”，Yodosha，1996；Experimental Medicine Supplementary Volume，“Idenshidonyu & Hatsugenkaiseki Jikkenho(Experimental Methods for GeneTransfer & Expression Analysis)”，Yodosha(1997)；J.Clin.Invest.931458-1464(1994)；Am.J.Physiol.271R1212-1220(1996)。使用HVJ-脂質(zhì)體的方法描述在下列文獻(xiàn)中，例如，Molecular Medicine 301440-1448(1993)；Jikken Igaku(Experimental Medicine)，121822-1826(1994)；和Tanpakushitsu Kakusan Kouso(Protein，Nucleic Acid，and Enzyme)，42，1806-1813(1997)；以及優(yōu)選地描述于Circulation 92(Suppl.II)479-482(1995)。
此外，使用病毒包膜的方法是給予本發(fā)明HGF基因的特別優(yōu)選的方法?？赏ㄟ^在有表面活性劑的情況下將純化的病毒與感興趣的表達(dá)載體混合，或者通過將病毒和表達(dá)載體的混合物凍融來制備病毒包膜(日本專利申請No.2001-026185/JP-A 2001-286282)。
可在使用病毒包膜的方法中使用的病毒是那些屬于如逆轉(zhuǎn)錄病毒、披膜病毒、冠狀病毒、黃病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亞病毒、彈狀病毒、痘病毒、皰疹病毒、桿狀病毒，以及嗜肝DNA病毒科的病毒，特別優(yōu)選的是HVJs。在這里，這些病毒可以是野生型病毒或重組病毒。特別地，Hasan，M.K.等報(bào)道的重組HVJ(J.General Virol.782813-2820(1997))，Yonemitsu，Y.等(Nature Biotech.18970-973(2000))，或這類病毒可用作HVJ。
盡管在使用HVJ-脂質(zhì)體或HVJ包膜的方法中通常優(yōu)選使用HVJ的Z株(可從ATCC中獲得)，但是本質(zhì)上，也可以使用其它HVJ株(例如，ATCCVR-907和ATCC VR-105)。在制備病毒包膜的方法中，可通過UV照射等方法將純化的病毒滅活，然后將其與所需表達(dá)載體混合?？捎糜诨旌喜《竞捅磉_(dá)載體的表面活性劑是，例如，辛基葡糖苷、Triton X-100、CHAPS，以及NP-40?？赏ㄟ^注射或這類方法，將以這種方式制備的病毒包膜載體導(dǎo)入到治療或疾病預(yù)防所針對的靶組織中。此外，通過在-20℃冷凍，可將病毒包膜載體貯藏至少兩到三個(gè)月。
可在這里使用的表達(dá)載體可以是任何表達(dá)載體，只要它們能夠在體內(nèi)表達(dá)目的基因。這些表達(dá)載體的實(shí)例是pCAGGS(Gene 108193-200(1991))、pBK-CMV、pcDNA3.1、以及pZeoSV(Invitrogen，Stratagene)。
使用病毒載體進(jìn)行基因?qū)氲牡湫偷姆椒ㄊ悄切┦褂貌《据d體，如重組腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法。更具體地，可通過下列步驟將受試基因?qū)氲郊?xì)胞中將基因?qū)氲紻NA或RNA病毒中，這些病毒如脫毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、慢病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、新培斯病毒(sindbis viruses)、仙臺病毒、SV40、或人類免疫缺陷病毒(HIV)(見Pharmacol.Ther.8035-47(1998)；Front.Biosci.4E26-33(1999)；J.Recep.Signal.Transduct.Res.19673-686)；然后用得到的重組病毒感染細(xì)胞。
腺病毒載體的感染效率遠(yuǎn)高于其它上述病毒載體。因此，從這個(gè)觀點(diǎn)看，優(yōu)選使用腺病毒載體系統(tǒng)。
在基因治療期間導(dǎo)入本發(fā)明試劑的方法包括在體內(nèi)將基因治療劑直接導(dǎo)入到機(jī)體；以及體外(ex vivo)將基因治療劑導(dǎo)入到從機(jī)體獲得的細(xì)胞中，隨后將經(jīng)過修飾的細(xì)胞再次導(dǎo)入到機(jī)體中(Nikkei Science，April 1994，20-45；Gekkann Yakuji 36(1)，23-48，1994；Jikken Igaku(ExperimentalMedicine)Supplementary Volume，12(15)，1994；“Idenshi-chiryo KaihatsuKenkyu Handbook(Handbook of Gene Therapy Research and Development)”，Nihon Idenshichiryo Gakkai eds.(The Japan Society of Gene Therapy)Edition，NTS，1999)。在本發(fā)明中特別優(yōu)選體內(nèi)方法。
可采用適合上述每一種給藥方法的各種配制劑，(例如，液體制劑)，作為制劑的形式。例如，可通過常規(guī)方法制備包含基因作為有效活性成分的注射劑，該方法可包括將基因溶于適當(dāng)?shù)娜軇?例如，緩沖液，如PBS、生理鹽水、以及無菌水)中，當(dāng)需要時(shí)通過過濾除菌，然后裝入無菌容器中?？筛鶕?jù)需要將常規(guī)載體或這類物質(zhì)添加到注射劑中?；蛘撸蓪⒅|(zhì)體制劑，如包含HVJ-脂質(zhì)體的制劑，制成懸浮液，冷凍劑，或者離心濃縮的冷凍劑。
在本發(fā)明的治療或預(yù)防劑中，HGF基因可用作單一活性成分，也可與其它已知具有血管生成功能的因子一起使用。例如，已經(jīng)報(bào)道了因子如VEGF和EGF具有血管生成功能，因而可同時(shí)應(yīng)用編碼這些因子的基因。此外，由于已經(jīng)報(bào)道生長因子如EGF能夠修復(fù)各種組織中的細(xì)胞損害，因此當(dāng)需要時(shí)可以同時(shí)使用編碼各種生長因子的基因。從本發(fā)明的描述中，本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚，在本發(fā)明的治療或預(yù)防試劑中可根據(jù)需要將下列試劑與HGF基因結(jié)合使用對于治療或預(yù)防的腦血管病具有治療或預(yù)防效果的其它藥物試劑；以及穩(wěn)定或提高HGF活性的物質(zhì)(如，肝素樣物質(zhì)(JP-A平10-158190)和寡聚糖(JP-A平5-301824))。如果這些添加的藥劑和物質(zhì)是由基因編碼的，那么可以在本發(fā)明的治療或預(yù)防試劑中將編碼它們的基因與HGF基因一起施用。
對于本發(fā)明治療和預(yù)防試劑，可根據(jù)治療疾病的種類、癥狀等選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方法和給藥部位。特別優(yōu)選腸胃外給藥。枕大池和腰椎是特別優(yōu)選的給藥部位。可刺穿枕大池或腰椎進(jìn)入腦脊膜，然后收集適當(dāng)量的脊髓液以確定穿刺部位，并且防止提高顱內(nèi)壓。然后給予治療或預(yù)防劑。例如，可應(yīng)用Hayashi，K.等報(bào)道的使用套管給予HVJ-脂質(zhì)體復(fù)合物的方法(Gene Therapy 81167-73(2001))，將本發(fā)明的治療或預(yù)防劑施用到枕大池內(nèi)。
本發(fā)明的治療或預(yù)防劑的效果被認(rèn)為是，由于給予HGF基因，在腦梗塞灶周圍所謂“半影(penumbra)”區(qū)內(nèi)抑制凋亡，從而維持神經(jīng)細(xì)胞。因此，本發(fā)明中“治療”意味著在腦部發(fā)生血流障礙后減少其影響的療法。
更具體地，本發(fā)明的藥劑或方法的治療效果是指，與沒有給藥相比，發(fā)生腦血管病后，施用本發(fā)明藥劑或應(yīng)用本發(fā)明方法可減少由于腦血管病所致的腦組織損傷。因此，本發(fā)明中“治療”不僅包括從損害中完全恢復(fù)，也包括減少損害的程度。
在另一方面，本發(fā)明中“預(yù)防”是指在發(fā)生腦血流障礙前，通過預(yù)防性地給予HGF基因，減少血流障礙的影響。更具體地，施用HGF基因據(jù)說具有預(yù)防效應(yīng)，與沒有給藥相比，當(dāng)在腦血管病如腦梗塞發(fā)作前給予HGF基因，能夠減少由給藥后發(fā)生的腦血管病所致的腦組織損害。因此，本發(fā)明中“預(yù)防”不僅包括從損害中完全恢復(fù)，也包括減少損害的程度。
本發(fā)明使用的術(shù)語“治療劑”和“預(yù)防劑”意思是包含上述功能的藥物組合物。本發(fā)明的治療和預(yù)防方法是包括給予包含上述效果的藥物組合物的方法。
在另一方面，本發(fā)明的腦血管病是指腦血流被抑制的疾病。導(dǎo)致腦血流抑制的疾病是，例如，腦梗塞和腦出血。血流被抑制并不限于疾病所致。例如，手術(shù)治療中人工封閉血管以及由于創(chuàng)傷導(dǎo)致血管損傷所造成的血流量減少的情況，包括在本發(fā)明的腦血管疾病中。本發(fā)明的腦血管病包括，例如，導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)中缺血或梗塞性病變的腦血管病，如腦梗塞(腦血栓、腦栓塞，等等)、腦出血、蛛網(wǎng)膜下出血、高血壓腦病、腦血管性癡呆、以及阿爾茨海默型(Alzheimer-type)癡呆。
本發(fā)明的治療或預(yù)防劑包含足以完成藥劑預(yù)期目的量的HGF基因。換句話說，本發(fā)明的試劑包括“治療有效量”或“藥理學(xué)有效量”的HGF基因。術(shù)語“治療有效量”和“藥理學(xué)有效量”是藥劑產(chǎn)生預(yù)期藥理學(xué)結(jié)果的有效量，以及足以緩解受治患者癥狀的量?？捎糜诖_定具體應(yīng)用的有效量的試驗(yàn)是，例如，測定從靶疾病中恢復(fù)程度的方法。實(shí)際施用的量視受治患者的年齡、體重和癥狀，以及給藥方法等情況而變，優(yōu)選達(dá)到期望效果而沒有顯著副作用的最佳量。
可通過細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，或者任選地，通過使用適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ痛_定治療有效量、藥理學(xué)有效量、以及毒性。這類動物可用于確定藥劑的所需濃度范圍和給藥途徑?；谶@些動物模型，本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定施用給人的有效量。治療效應(yīng)與毒性效應(yīng)的比率稱為“治療指數(shù)”，這種比率可表述為ED50/LD50。優(yōu)選具有高治療指數(shù)的藥物組合物。根據(jù)劑型、患者的敏感度、年齡、和其它情況，以及疾病的類型和嚴(yán)重度選擇適當(dāng)?shù)膭┝?。盡管本發(fā)明治療劑的劑量根據(jù)患者的情況而不同，但是HGF基因的成人劑量是在大約1μg到大約50mg的范圍內(nèi)，優(yōu)選在大約10μg到大約5mg的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在大約50μg到大約5mg的范圍內(nèi)。特別地，由于可通過HVJ包膜法反復(fù)地施用HGF基因，因此不僅可以一次給予HGF基因，而且可以多次給藥，如兩次或三次，以便獲得更好的治療或預(yù)防效果。這種使用HVJ包膜的多次給藥方式也包括在本發(fā)明的治療或預(yù)防方法中。


圖1是一組屬于生理鹽水組大鼠(6只動物中的3只)的TTC染色的冠狀切片照片。
圖2是一組屬于pVAXI組大鼠(6只動物中的3只)的TTC染色的冠狀切片照片。
圖3是一組屬于HGF組大鼠(6只動物中的3只)的TTC染色的冠狀切片照片。
圖4是生理鹽水組、pVAXI組以及HGF組中梗塞區(qū)域的比較圖。在右上方顯示大鼠腦部的圖解示圖。通過沿著所示線1到5把大腦切成薄片制備冠狀切片。圖解示圖中的數(shù)字1到5對應(yīng)于水平軸的那些數(shù)字。垂直軸表示梗塞區(qū)占總冠狀切片區(qū)的百分率(％)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式在下文中，將參考實(shí)施例具體舉例說明本發(fā)明，但是這不能被解釋是為對本發(fā)明的限定。
(1)制備HGF基因表達(dá)載體在pVAX1載體(Invitrogen)的BamHI和NotI位點(diǎn)之間插入人HGFcDNA(2.2kb)。
(2)制備HVJ-包膜純化的仙臺病毒(HVJ)(Z株)在即將使用前用UV輻射(99mJ/cm2)滅活。接著，在4℃用0.3％Triton X-100溶液將滅活的HVJ(15,000血細(xì)胞凝集單位(HAU))和在(1)中制備的載體，或不含有HGF cDNA的表達(dá)載體混合。這種混合物在4℃離心15分鐘。移去上清液后，將緩沖鹽溶液加到殘余物中，然后在4℃再離心15分鐘。移去上清液后，將沉淀懸浮于100μl磷酸緩沖鹽中，并用于研究對腦梗塞的效應(yīng)。
(3)向大鼠右中腦動脈閉塞模型施用HVJ包膜-DNA復(fù)合物將體重250到270克的Wistar大鼠用氟烷(halothane)(初次給予4％；以1％維持)麻醉。接著使用26G針從腦池向動物給藥1)向生理鹽水組給予生理鹽水(100μl)；2)向pVAXI組給予僅包含載體的pVAXI(400μg)/HVJ-E(15,000HAU)(100μL)；以及3)向HGF給藥組給予pVAXI-HGF(400μg)/HVJ-E(15,000HAU)(100μL)。每組中使用6只動物。給藥后3天，在氟烷麻醉下將長21mm，涂有聚L-賴氨酸的4-0尼龍縫合線從右頸外動脈插入右頸內(nèi)動脈中，制造右中腦動脈閉塞模型。在這個(gè)處理期間，使用加熱墊將動物的體溫維持在37℃左右，在尾動脈測量血壓。在這種處理后1小時(shí)和24小時(shí)進(jìn)行神經(jīng)評價(jià)。根據(jù)下面顯示的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)評價(jià)，并且比較每組的總得分(在表1中表示為神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評分(NeurologicalSeverity Score)(NSS))。使用StadView 5.0J的Mann-Whitney U檢驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
1)出現(xiàn)左前腿的屈曲0 沒有屈曲0.5輕度屈曲0 完全屈曲2)抗側(cè)向壓迫的抵抗力0 對左向和右向有同樣程度的抵抗力0.5輕度減弱的抵抗力1 完全無抵抗力3)軀體姿式0 常0.5輕度向左彎曲1 完全向左彎曲4)左前腿的位置0 迅速返回到原始位置0.5返回到原始位置1 不能返回到原始位置5)右前腿的位置0 迅速返回到原始位置0.5返回到原始位置1 不能返回到原始位置表1

*使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)與生理鹽水組比較如表1所示，手術(shù)期間在生理鹽水組、pVAXI組以及HGF組之間沒有觀察到血壓和體溫的差異。HGF組的神經(jīng)評價(jià)分顯著低于其它兩個(gè)組，提示給予HGF基因能夠維持神經(jīng)功能。
24小時(shí)后處死動物，從前額端開始每隔2mm(在圖4右上角的圖解圖示中線1到5所示的位置)制備一張冠狀切片。用TTC進(jìn)行染色，并且比較梗塞區(qū)的面積(圖1到圖3)。為了比較這些面積，使用Adobe Photoshop 5.0測量梗塞區(qū)所占像素(pixel)的數(shù)量?？紤]水腫的影響，并且根據(jù)下列公式進(jìn)行評價(jià)(健康腦的外側(cè)面積-(梗塞腦的外側(cè)面積-梗塞區(qū)面積))/健康腦的外側(cè)面積×100(％)。圖4顯示結(jié)果。梗塞區(qū)與冠狀切片總面積之比用百分率表示。從圖1到4顯而易見，證實(shí)HGF基因轉(zhuǎn)染組中梗塞面積減小。
工業(yè)應(yīng)用性上述結(jié)果證實(shí)，給予HGF基因顯示有益效果，維持神經(jīng)元的功能，并且減少腦血管病如腦梗塞的早期梗塞區(qū)的大小。更具體地，顯示HGF可能在調(diào)節(jié)腦血管病中起作用。本發(fā)明提供治療包括腦梗塞在內(nèi)的腦血管病的新方法，其中該方法包括導(dǎo)入HGF基因以過度表達(dá)HGF。利用HGF基因的本發(fā)明的方法通過基因?qū)?，能夠有效地治療包括腦梗塞在內(nèi)的腦血管病。本發(fā)明的方法也能夠維持直到現(xiàn)在還沒有適當(dāng)治療方法的患者的梗塞區(qū)的神經(jīng)元功能以及抑制梗塞面積。
權(quán)利要求
1.治療或預(yù)防腦血管病的試劑，其中該試劑包含HGF基因。
2.權(quán)利要求1的試劑，其中腦血管病是腦梗塞。
3.權(quán)利要求1或2的試劑，其中該試劑是片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、軟膏、糖漿劑、膏劑、或懸浮液。
4.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的試劑，其中該試劑通過使用下列方法用于將基因?qū)氲郊?xì)胞中使用病毒包膜載體、內(nèi)在型脂質(zhì)體、靜電型脂質(zhì)體、HVJ-脂質(zhì)體、或改進(jìn)的HVJ-脂質(zhì)體的方法，受體介導(dǎo)的基因?qū)敕?，使用基因槍將核酸分子連同載體一起導(dǎo)入到細(xì)胞中的方法，使用裸DNA的直接導(dǎo)入法，或者使用陽離子聚合物的導(dǎo)入法。
5.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的試劑，其中該試劑通過使用HVJ包膜用于將基因?qū)氲郊?xì)胞中。
6.治療或預(yù)防腦血管病的方法，其中該方法包括將HGF基因?qū)氲讲溉閯游锏牟襟E。
7.權(quán)利要求6的方法，其中腦血管病是腦梗塞。
8.權(quán)利要求6或7的方法，其中該方法包括使用HVJ包膜經(jīng)兩次到三次將HGF基因?qū)氲讲溉閯游镏械牟襟E。
9.HG基因F制備治療或預(yù)防腦血管病的試劑的用途。
10.權(quán)利要求9的HGF基因的用途，其中腦血管病是腦梗塞。
全文摘要
本發(fā)明提供治療腦血管病的新方法，其中通過導(dǎo)入HGF基因過度表達(dá)HGF。本發(fā)明使用HGF基因的方法通過基因?qū)肽軌蛴行е委熌X血管病，如腦梗塞，并且能夠維持直到現(xiàn)在還沒有適當(dāng)治療方法的患者梗塞區(qū)的神經(jīng)功能以及抑制梗塞區(qū)。
文檔編號A61P9/00GK1668337SQ0381699
公開日2005年9月14日 申請日期2003年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月6日
發(fā)明者森下竜一, 島村宗尚 申請人:安增子摩祺株式會社