專(zhuān)利名稱(chēng)：治療藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及利用來(lái)自食用植物的化合物的生理作用的藥物、飲料食品等。
背景技術(shù)：
神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生成的作用、維持神經(jīng)細(xì)胞生存的作用、腦損傷時(shí)的修復(fù)作用、恢復(fù)腦神經(jīng)的機(jī)能、防止腦老化的作用等與神經(jīng)細(xì)胞的生和死緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)。因此有望對(duì)阿爾茨海默氏病、糖尿病并發(fā)癥的神經(jīng)障礙等具有預(yù)防、治療效果。但是，NGF的分子量大，無(wú)法通過(guò)血腦屏障，因此希望開(kāi)發(fā)出可通過(guò)血腦屏障的增強(qiáng)NGF的生成的物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是鑒于上述現(xiàn)狀，提供在治療或預(yù)防中需要增強(qiáng)NGF的生成的疾病用藥物，該藥物利用來(lái)自天然物、安全的NGF生成增強(qiáng)物質(zhì)；以及富含該化合物的飲料食品等。
概述本發(fā)明，本發(fā)明的第1、第2、第3和第4發(fā)明涉及下述通式(I)所示的新型化合物或其鹽；含有該化合物作為有效成份、對(duì)該化合物顯示敏感性的疾病的治療藥或預(yù)防藥；神經(jīng)生長(zhǎng)因子生成增強(qiáng)劑；用于增強(qiáng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生成的食品、飲料或飼料。

(式中，當(dāng)虛線(xiàn)表示的結(jié)合單元中的A表示雙鍵，B表示單鍵時(shí)，R1表示-O-GlcUA-Gal-Glc，R2表示-O-Ara-2-AcXyl、-O-Ara-3-AcXyl、-O-Ara-4-AcXyl、-O-Ara-2，3-二AcXyl、-O-Ara-2，4-二AcXyl、-O-Ara-3，4-二AcXyl或-O-Ara-3，4，6-三AcGlc，且R3表示-OH。當(dāng)A表示單鍵，B表示雙鍵時(shí)，R1表示-OH，R2表示-OH，且R3表示-H。GlcUA是指葡糖醛酸殘基，Gal是指半乳糖殘基，Glc是指葡萄糖殘基，Ara是指阿糖殘基，AcXyl是指乙?；咎菤埢?，AcGlc是指乙?；咸烟菤埢?。)本發(fā)明的第5、第6和第7發(fā)明涉及在治療或預(yù)防中需要增強(qiáng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生成的疾病的治療藥或預(yù)防藥、神經(jīng)生長(zhǎng)因子生成增強(qiáng)劑、和用于增強(qiáng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生成的食品、飲料或飼料，其特征在于含有選自大豆皂草苷類(lèi)化合物、大豆皂草配基類(lèi)化合物、甘草皂草苷(glycyrrhizin)以及它們的藥理學(xué)上可接受的鹽的化合物作為有效成分。
在本發(fā)明的第5、第6和第7發(fā)明的實(shí)施方案中，大豆皂草苷類(lèi)化合物、大豆皂草配基類(lèi)化合物例如有下述通式(II)所示的化合物。
(式中，虛線(xiàn)所示的結(jié)合單元表示單鍵或雙鍵，R4表示-OH或-O-糖殘基，R5表示-OH、＝O或-O-糖殘基，R6表示-OH或-H。)附圖簡(jiǎn)述

圖1表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分7的質(zhì)譜。
圖2表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分7的1H-NMR譜。
圖3表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分7的13C-NMR譜。
圖4表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分9的質(zhì)譜。
圖5表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分9的1H-NMR譜。
圖6表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分9的13C-NMR譜。
圖7表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分10的質(zhì)譜。
圖8表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分10的1H-NMR譜。
圖9表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分10的13C-NMR譜。
圖10表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分12的質(zhì)譜。
圖11表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分12的1H-NMR譜。
圖12表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分12的13C-NMR譜。
圖13表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分13的質(zhì)譜。
圖14表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分13的1H-NMR譜。
圖15表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分13的13C-NMR譜。
圖16表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分15的質(zhì)譜。
圖17表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分15的1H-NMR譜。
圖18表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分15的13C-NMR譜。
圖19表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分16的質(zhì)譜。
圖20表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分16的1H-NMR譜。
圖21表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分16的13C-NMR譜。
圖22表示來(lái)自大豆胚芽·酸水解產(chǎn)物的組分a的質(zhì)譜。
圖23表示來(lái)自大豆胚芽·酸水解產(chǎn)物的組分a的1H-NMR譜。
圖24表示來(lái)自大豆胚芽·酸水解產(chǎn)物的組分a的13C-NMR譜。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)作為來(lái)自食用植物的增強(qiáng)NGF生成的物質(zhì)，特定的皂草苷類(lèi)化合物、皂草配基類(lèi)化合物和/或它們的鹽是有用的，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明可提供含有這些皂草苷類(lèi)化合物、皂草配基類(lèi)化合物和/或它們的藥理學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的藥物；富含該皂草苷類(lèi)化合物、皂草配基類(lèi)化合物和/或它們的鹽的飲料食品、飼料等。
本說(shuō)明書(shū)中，“NGF生成增強(qiáng)的作用”和“NGF生成增強(qiáng)活性”分別指導(dǎo)致NGF生成的增強(qiáng)和使NGF生成得到增強(qiáng)的功能，但它們?cè)谠撘饬x上并沒(méi)有特別嚴(yán)格的區(qū)別?！霸鰪?qiáng)”包括與本發(fā)明涉及的有效成分作用前相比，作用后目標(biāo)物質(zhì)的量增加的情況；同時(shí)通過(guò)使本發(fā)明涉及的有效成分作用，生成了目標(biāo)物質(zhì)的情況(誘導(dǎo))。另外在本說(shuō)明書(shū)中，可作為有效成分的的任何物質(zhì)都可以單獨(dú)或者將2種或以上混合應(yīng)用于本發(fā)明中。
本發(fā)明中作為有效成分使用的皂草苷類(lèi)化合物、皂草配基類(lèi)化合物和/或它們的鹽(以下可稱(chēng)為本發(fā)明的化合物)只要具有NGF生成增強(qiáng)的作用即可，可以來(lái)自天然物，也可以是合成品、半合成品。天然物優(yōu)選來(lái)自食用植物，來(lái)自食用植物的有來(lái)自大豆等豆類(lèi)的大豆皂草苷類(lèi)化合物或大豆皂草配基類(lèi)化合物。另外還有已知的來(lái)自甘草的皂草苷——甘草皂草苷。
大豆含有在化學(xué)結(jié)構(gòu)上為A、B、E和DDMP皂草苷的4組皂草苷，A組皂草苷是以齊墩果-12-烯-3β、21β、22β、24-四醇(大豆皂草精醇A)為糖苷配基的皂草苷，B組皂草苷是以齊墩果-12-烯-3β、22β、24-三醇(大豆皂草精醇B)為糖苷配基的皂草苷，E組皂草苷是以齊墩果-12-烯-3β、24-二醇-2-酮(大豆皂草精醇E)為糖苷配基的皂草苷，DDMP皂草苷是以B組皂草苷為糖苷配基、在C-22位上結(jié)合有2，3-二氫-2，5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮的皂草苷(食品和開(kāi)發(fā)、vol 34，No.7第8-11頁(yè)，(1999))。即本發(fā)明中，大豆皂草苷類(lèi)化合物特別優(yōu)選使用A、B、E組和DDMP皂草苷。另外，本發(fā)明的化合物有上述通式(II)所示的化合物，特別優(yōu)選下述通式(III)所示的化合物a-n。
(式中，虛線(xiàn)表示的結(jié)合單元C、D以及R7、R8、R9如表1所示。)
表1

此外，上述化合物a-g和n，即上述通式(I)所表示的化合物是首次由本發(fā)明得到的化合物，已確認(rèn)具有NGF生成增強(qiáng)的作用。本發(fā)明也提供該化合物，以及以該化合物作為有效成分、對(duì)該化合物顯示敏感性的疾病的治療藥或預(yù)防藥。
另外，本發(fā)明的化合物優(yōu)選來(lái)自大豆或甘草，即使不來(lái)自大豆，只要是大豆皂草苷類(lèi)化合物、大豆皂草配基類(lèi)化合物或甘草皂草苷，例如上述通式(II)所示的化合物，對(duì)其來(lái)源并沒(méi)有特別限定。此外，本說(shuō)明書(shū)中，AcXyl表示乙?；哪咎菤埢cGlc表示乙?；钠咸烟菤埢?。Rham表示鼠李糖殘基。大豆皂草配基類(lèi)化合物是指大豆皂草苷類(lèi)化合物中沒(méi)有糖殘基的糖苷配基或其異構(gòu)體。
構(gòu)成糖殘基的糖可以是單糖也可以是糖鏈，還可以含有1種或2種以上的糖。例如由葡萄糖、葡糖醛酸、木糖、鼠李糖、半乳糖、蘇阿糖、核糖、芹菜糖、阿洛糖、阿糖、阿拉伯吡喃糖、核酮糖、甘露糖、塔羅糖、巖藻糖、果糖、半乳糖醛酸及它們的糖構(gòu)成的糖鏈。糖鏈中糖的數(shù)量并沒(méi)有特別限定，從表達(dá)本發(fā)明所希望的效果的角度考慮，特別優(yōu)選2-5。另外這些糖可以經(jīng)乙酰化、酯化等修飾。
更進(jìn)一步，本發(fā)明的化合物例如可以形成酯等在體內(nèi)容易水解、發(fā)揮希望效果的衍生物(前體藥物)。所述前體藥物的制備可按照公知的方法進(jìn)行。所述衍生物可以是它們的鹽。
本發(fā)明的化合物中，鹽優(yōu)選藥理學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明中使用的鹽例如有堿金屬鹽、堿土類(lèi)金屬鹽、與有機(jī)堿形成的鹽等。此外，本發(fā)明中使用的藥理學(xué)上可接受的鹽是指對(duì)生物實(shí)際無(wú)毒，且具有NGF生成增強(qiáng)的作用的化合物的鹽。作為本發(fā)明的有效成分的化合物的鹽例如有與鈉、鉀、鈣、鎂、銨或質(zhì)子化的芐星青霉素(ベンザチン)(N，N’-二-芐基乙烯二胺)、膽堿、乙醇胺、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡胺)、苯乙芐胺(N-芐基苯乙胺)、哌嗪或氨丁三醇(2-氨基-2-羥基甲基-1，3-丙烷二醇)形成的鹽。
另外，本發(fā)明的化合物的光學(xué)異構(gòu)體、酮-烯醇互變異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體等各種異構(gòu)體、各異構(gòu)體分離的化合物只要具有NGF生成增強(qiáng)的作用，都可在本發(fā)明中使用。因此，本發(fā)明的化合物只要可獲得本發(fā)明所希望的效果，也包括其衍生物、異構(gòu)體以及它們的鹽。
本發(fā)明的化合物如果有市售，也可以利用該化合物。另外也可以制備，其方法例如有按照常規(guī)方法從植物中提取、純化而獲得的方法。
由天然物制備本發(fā)明的化合物，可以將公知的制備方法組合進(jìn)行。例如對(duì)于大豆皂草苷類(lèi)化合物、大豆皂草配基類(lèi)化合物或它們的鹽，例如可以由大豆等植物中提取并純化該化合物。另外，使用大豆時(shí)，優(yōu)選使用大豆的胚芽、子葉作為原料。提取溶劑例如可以將水、氯仿、乙醇、甲醇、異丙醇等醇類(lèi)，丙酮、甲乙酮等酮類(lèi)，乙酸甲酯、乙酸乙酯等親水性或親油性溶劑單獨(dú)或作為混合液使用。提取溫度、時(shí)間可根據(jù)需要適當(dāng)設(shè)定，提取操作可根據(jù)需要重復(fù)多次。純化方法可采用化學(xué)方法、物理方法等公知的純化方法，將凝膠過(guò)濾法、用分子量分級(jí)膜進(jìn)行的分級(jí)法、溶劑提取法、使用離子交換樹(shù)脂等的各種層析法等傳統(tǒng)公知的純化方法組合，對(duì)希望作為有效成分使用的化合物進(jìn)行濃縮、分離等。不使用分離的化合物，使用化合物的濃縮物也可以制備后述的本發(fā)明的藥物等。
本發(fā)明中使用的甘草皂草苷并沒(méi)有特別限定，例如可以由市售的化合物或由甘草提取、純化獲得。甘草皂草苷的提取、純化可按照上述大豆皂草苷類(lèi)化合物等的方法進(jìn)行。另外本發(fā)明中可以使用甘草皂草苷的衍生物。
本發(fā)明中，將作為有效成分使用的化合物以合成品或半合成品的形式獲得時(shí)，例如可以按照公知的方法合成所需要的化合物。
例如可以如后述實(shí)施例所述，用質(zhì)譜分析法、核磁共振法等確定結(jié)構(gòu)，以此來(lái)確認(rèn)是否獲得了所需要的化合物。
本發(fā)明提供含有以上本發(fā)明化合物作為有效成分、在治療或預(yù)防中需要增強(qiáng)NGF的生成的疾病的治療藥或預(yù)防藥。
NGF是維持神經(jīng)細(xì)胞的生存、功能，使神經(jīng)細(xì)胞根據(jù)NGF的濃度梯度延伸的內(nèi)因性生長(zhǎng)因子，通過(guò)增強(qiáng)NGF的生成，可以進(jìn)行阿爾茨海默氏病等老年癡呆癥、末梢神經(jīng)障礙、腦血管疾病、腦腫瘤、腦顳骨巖部頂發(fā)炎、頭部外傷變性病、麻醉藥物中毒等引起的需要修復(fù)、再生神經(jīng)機(jī)能的疾病的治療或預(yù)防。另外，對(duì)于肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、藥物障礙性末梢神經(jīng)障礙、糖尿病性末梢神經(jīng)障礙、帕金森癥、感覺(jué)神經(jīng)障礙、色素性視網(wǎng)膜癥、黃斑變性癥等的治療或預(yù)防也有效。即，通過(guò)給予、攝取本發(fā)明的藥物、后述的飲料食品、飼料，可以治療或預(yù)防上述疾病。
本發(fā)明的藥物含有對(duì)在本發(fā)明中首次得到的化合物顯示敏感性的疾病的治療藥或預(yù)防藥，其中所述化合物的特征是含有通式(I)所示的化合物和/或藥理學(xué)上可接受的鹽作為有效成分。
上述本發(fā)明的治療藥或預(yù)防藥以本發(fā)明的化合物例如大豆皂草苷類(lèi)化合物、大豆皂草配基類(lèi)化合物、甘草皂草苷或它們的藥理學(xué)上可接受的鹽為有效成分，其制備可通過(guò)將其與公知的藥物用載體組合制成制劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的藥物中有效成份的含量根據(jù)要成為治療等的對(duì)象的疾病、使用方式等而不同，不能一概而論，通常為0.01-50重量％，優(yōu)選0.1-10重量％左右。
通常，將本發(fā)明的化合物與藥理學(xué)上可接受的液體或固體載體混合，且根據(jù)需要加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、賦型劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑等，可制成片劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等固體制劑，通常的溶液劑、混懸劑、乳劑等液體制劑。另外可制成干燥品，在使用前添加適當(dāng)?shù)妮d體，再使其成為液狀。
本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑可以通過(guò)口服制劑或注射劑、輸液劑等非口服制劑等任意方式給藥。
本發(fā)明的治療藥或預(yù)防藥的給藥量根據(jù)其制劑形式、給藥方法、使用目的以及用藥患者的年齡、體重、癥狀而適當(dāng)設(shè)定，并不是一成不變，但通常制劑中含有的有效成分的量是通常人每天1μg-1g/kg體重，優(yōu)選10μg-200mg/kg體重左右。當(dāng)然，給藥量因各種條件而變化，有給藥量比上述給藥量少就足夠的情況，也有的情況下需要超過(guò)范圍。給藥時(shí)間并沒(méi)有特別限定。本發(fā)明的藥物除直接口服給藥之外，還可以添加到任意的飲料食品中進(jìn)行日常攝取。
本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的化合物作為有效成分的NGF生成增強(qiáng)劑。該增強(qiáng)劑可以直接是上述有效成分，還可以是含有上述有效成分的組合物。本發(fā)明的方案中，作為有效成分的鹽優(yōu)選藥理學(xué)上可接受的鹽。NGF生成增強(qiáng)劑例如可以將上述有效成分和可在與該有效成分相同的用途中使用的其它成分等混合，按照上述治療藥或預(yù)防藥的制造方法制造成通常使用的試藥的形式。關(guān)于所述增強(qiáng)劑中上述有效成分的含量，只要是考慮該增強(qiáng)劑的給藥方法、使用目的等，可使本發(fā)明所需要的效果得以表達(dá)的量即可，并沒(méi)有特別限定。NGF生成增強(qiáng)劑中本發(fā)明的有效成分的含量通常為0.01-50重量％，優(yōu)選0.1-10重量％左右。對(duì)于該增強(qiáng)劑的用量，只要使本發(fā)明所希望的效果得以表達(dá)即可，并沒(méi)有特別限定。特別是給予生物體使用時(shí)，其可給予的有效成分的劑量?jī)?yōu)選在上述治療藥或預(yù)防藥中的有效成分的給藥量范圍。NGF生成增強(qiáng)劑對(duì)需要增強(qiáng)NGF的生成的疾病中該生長(zhǎng)因子的增強(qiáng)有效。另外，該增強(qiáng)劑也可用于NGF相關(guān)疾病藥物的篩選。該增強(qiáng)劑還可用于與NGF或神經(jīng)細(xì)胞的物理性變化相關(guān)的機(jī)能研究。
下面，對(duì)含有上述有效成分的本發(fā)明的食品、飲料(以下可稱(chēng)為飲料食品)或飼料進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明的飲料食品或飼料中，含有是指含有、添加或稀釋的含義，本發(fā)明的飲料食品或飼料是含有、添加和/或稀釋本發(fā)明的化合物而成的飲料、食品或飼料。該飲料食品等通過(guò)其N(xiāo)GF生成增強(qiáng)的作用，對(duì)于在治療或預(yù)防中需要增強(qiáng)NGF的生成的疾病的癥狀改善、預(yù)防極為有效。另外對(duì)于保持機(jī)體恒定性也有效。作為有效成分使用的化合物的鹽優(yōu)選藥理學(xué)上可接受的鹽。
此外，本發(fā)明的飲料食品或飼料中所述“含有”是指飲料食品等中含有本發(fā)明所使用的有效成分的形式；添加是指向飲料食品等原料中加入本發(fā)明所使用的有效成分的形式；稀釋是指向本發(fā)明所使用的有效成分中加入飲料食品等原料的形式。
本發(fā)明的食品、飲料或飼料的制造方法并沒(méi)有特別限定，可采用通常使用的食品、飲料或飼料的制造方法，本發(fā)明的化合物作為有效成份，可以在所制造的飲料食品或飼料中富含，也可以比通常的飲料食品、飼料中富含。即，本發(fā)明的飲料食品或飼料通?？赏ㄟ^(guò)將本發(fā)明的有效成分從其原料中濃縮或分離，再將其混合到公知的飲料食品或飼料中來(lái)制造。在濃縮或分離中包括合成有效成分。另外，如果可以對(duì)原料進(jìn)行處理，使其中含有的有效成分為富含，則只要該原料可供人食用，就可將所得處理物直接作為本發(fā)明的飲料食品。例如，該處理物可列舉的有濃縮果汁、蔬菜汁等。此外，這里，富含是指本發(fā)明的食品、飲料或飼料的單位重量中的本發(fā)明化合物重量比本發(fā)明的有效成分的原料例如大豆單位重量中的本發(fā)明的化合物重量多。另外，重量是指固體部分重量。
本發(fā)明的食品或飲料并沒(méi)有特別限定，例如有谷物加工制品(例如小麥粉加工制品、淀粉類(lèi)加工制品、預(yù)混加工制品、面類(lèi)、通心粉類(lèi)、面包類(lèi)、豆餡包類(lèi)、蕎麥面類(lèi)、麥麩、米粉、粉絲、包裝糯米糕點(diǎn)等)、油脂加工制品(例如塑性油脂、炸油、色拉油、蛋黃醬、調(diào)味醬等)、大豆加工制品(例如豆腐類(lèi)、豆醬、納豆等)、食用肉類(lèi)加工制品(例如火腿、臘肉、壓制火腿、紅腸等)、水產(chǎn)制品(例如冷凍碎魚(yú)肉、魚(yú)糕、圓筒狀魚(yú)糕、魚(yú)糕片、炸胡蘿卜魚(yú)肉片、氽魚(yú)丸、筋、魚(yú)肉火腿、香腸、鰹魚(yú)刨花、魚(yú)子加工制品、水產(chǎn)罐頭、甜烹海味等)、乳制品(例如原料乳、奶油、酸乳酪、黃油、干酪、練乳、奶粉、冰激凌等)、蔬菜·果實(shí)加工制品(例如糊類(lèi)、果醬類(lèi)、咸菜類(lèi)、果實(shí)飲料、蔬菜飲料、混合飲料等)、糕點(diǎn)類(lèi)(例如巧克力、餅干類(lèi)、糕點(diǎn)面包類(lèi)、蛋糕、糯米糕點(diǎn)(日本式)類(lèi)、糯米餅干類(lèi)等)、酒精類(lèi)(例如日本酒、中國(guó)酒、葡萄酒、威士忌、燒酒、伏特加、白蘭地、杜松子酒、朗姆酒、啤酒、清涼酒精飲料、果酒、利D酒等)、嗜好飲料(例如綠茶、紅茶、烏龍茶、咖啡、清涼飲料、乳酸飲料等)、調(diào)料(例如醬油、醬汁、醋、甜料酒等)、罐裝·瓶裝·袋裝食品(例如牛肉飯、蓋澆飯、紅豆飯、咖哩、其它各種加工食品等)、半干燥或濃縮食品(例如肝醬、其它調(diào)味醬、蕎面·面條汁、濃縮湯類(lèi)等)、干燥食品(例如快餐面類(lèi)、快餐咖哩、速溶咖啡、果汁粉、湯粉末、快餐醬湯、加工食品、加工飲料、加工湯等)、冷凍食品(例如雞素?zé)⒄綦u蛋羹、烤鰻魚(yú)、漢堡牛排、燒麥、餃子、各種濃肉湯、果汁雞尾酒等)、固態(tài)食品、液體食品(例如湯等)、香辛料類(lèi)等農(nóng)產(chǎn)·林產(chǎn)加工制品、畜產(chǎn)加工制品、水產(chǎn)加工制品等。
本發(fā)明的飲料食品中有效成分的含量并沒(méi)有特別限定，通常為0.01-50重量％，優(yōu)選0.1-10重量％左右。
本發(fā)明的飼料例如是家畜、養(yǎng)殖魚(yú)、家禽、寵物用飼料，是指含有本發(fā)明的化合物的、除人以外的生物的人工食物或飲料。飲料有家畜等的飲用水。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供含有本發(fā)明的有效成分的增強(qiáng)NGF生成的飼料添加劑。該添加劑例如可加入到常規(guī)飼料中，或生物生活的水中(養(yǎng)殖養(yǎng)殖魚(yú)的水中等)使用。
本發(fā)明的飼料中有效成分的含量并沒(méi)有特別限定，通常為0.01-50重量％，優(yōu)選0.1-10重量％左右。上述添加劑中有效成分的含量并沒(méi)有特別限定，可根據(jù)其用途適當(dāng)調(diào)節(jié)，以獲得希望的效果。
本發(fā)明的飼料(包括上述添加劑)的形式?jīng)]有特別限定，可以是粉末狀、液體或固體。作為有效成分使用的化合物的鹽優(yōu)選藥理學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明中，本發(fā)明的化合物在藥物、飲料食品、飼料中的含量如上所述，只要是通過(guò)該給藥、攝取等，使得生物體內(nèi)NGF的生成得到增強(qiáng)的量即可，可以以高于通常的飲料食品中的大豆皂草苷類(lèi)化合物、大豆皂草配基類(lèi)化合物以及甘草皂草苷含量富含。
本發(fā)明的有效成分化合物未見(jiàn)毒性。例如將本發(fā)明中使用的皂草苷類(lèi)化合物、甘草皂草苷或它們的鹽口服給藥(1000mg/kg)小鼠(雄性、6周齡)時(shí)未見(jiàn)毒性。
另外，本發(fā)明還提供具有NGF生成增強(qiáng)的作用的、上述通式(I)所示的新型大豆皂草苷類(lèi)化合物和大豆皂草配基類(lèi)化合物。其制備方法如上所述，通過(guò)以下實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明。本發(fā)明的新型化合物可以以該實(shí)施例為參考制備，但并不限于此。
實(shí)施例以下，根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)闡述本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的任何限定。
實(shí)施例1來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分的分離(1)向9.6kg干燥的大豆胚芽中加入25升蒸餾水，浸泡1小時(shí)，然后用混合器進(jìn)行破碎。接著加入40升蒸餾水，攪拌2小時(shí)，然后用5000g離心分離7分鐘，得到沉淀1和上清1(54升)。向沉淀1中加入40升蒸餾水，攪拌2小時(shí)，然后用5000g離心分離7分鐘，得到沉淀2(19.7kg)和上清2(36升)。將上清1和上清2混合，得到90L大豆胚芽提取液。
(2)向90L實(shí)施例1-(1)中得到的大豆胚芽水提取液中加入39升乙醇，攪拌后用5000g離心分離7分鐘，得到沉淀3和上清3(90升)。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上清3濃縮至18升，加入等量的乙醇，攪拌，然后用5000g離心分離7分鐘，得到沉淀4和上清4(15升)。濃縮上清4，得到1.7升大豆胚芽水提取濃縮液。
(3)向110mL實(shí)施例1-(2)中得到的大豆胚芽水提取濃縮液中加入500mL蒸餾水，用反相柱層析對(duì)其進(jìn)行組分分離。樹(shù)脂采用COSMOSIL 140 C18-OPN(nacalui-tesqùe公司制造樹(shù)脂量300mL)。展開(kāi)溶劑分別使用1500mL蒸餾水、30％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、100％乙醇，按照該順序洗脫，進(jìn)行組分分離，制備各種來(lái)自大豆胚芽水提取物的COSMOSIL洗脫組分。
(4)將實(shí)施例1-(3)所得來(lái)自大豆胚芽水提取物的COSMOSIL 30％乙醇洗脫組分減壓濃縮，然后加入3倍量的丙酮，攪拌，用5000g離心分離7分鐘，得到沉淀5和上清5。
(5)將實(shí)施例1-(4)所得上清5濃縮干燥固化，然后溶解于乙酸乙酯∶乙酸∶水(容量比；以下均相同)＝8∶3∶2(10mL)，用硅膠柱層析進(jìn)行組分分離。以下表示該條件。硅膠使用BW-300SP(富士シリシァ化學(xué)公司制造樹(shù)脂量300mL)。展開(kāi)溶劑使用乙酸乙酯∶乙酸∶水＝8∶3∶2(1000mL)、乙醇∶水＝5∶1(500mL)，按照該順序進(jìn)行洗脫，按照組分0(300mL)、組分1(200mL)、組分2(200mL)、組分3(100mL)、組分4(150mL)、組分5(200mL)、組分6(120mL)的順序得到洗脫組分。將各洗脫液減壓濃縮，得到來(lái)自各大豆胚芽水提取物的硅膠柱組分0-6。
(6)將實(shí)施例1-(5)所得的來(lái)自大豆胚芽水提取物的硅膠柱組分5溶解于60mL蒸餾水，接著用反相層柱析進(jìn)行組分分離。以下說(shuō)明其條件。層析柱使用TSK gel ODS-80Ts(21.5mm×30cm東ソ-公司制造)。關(guān)于溶劑A(將蒸餾水和乙腈以容量比3∶1混合所得)和溶劑B(將蒸餾水和乙腈以容量比1∶3混合所得)的洗脫比例，0-10分鐘之內(nèi)溶劑A比保持100％，10-25分鐘之內(nèi)溶劑B比為線(xiàn)性的0-30％，接著在25-40分鐘之內(nèi)溶劑B比為線(xiàn)性的30-100％，接下來(lái)的15分鐘溶劑B比保持100％。洗脫速度為5mL/分鐘，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm進(jìn)行。以洗脫液的紫外線(xiàn)吸收為指標(biāo)，分離來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分1-21。
實(shí)施例23-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[2-o-乙酰基-β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A的NGF生成增強(qiáng)活性(1)通過(guò)質(zhì)譜分析儀(DX302日本電子公司制造)，通過(guò)FAB-MS的手段測(cè)定實(shí)施例1-(6)中分離的來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分7(包含保留時(shí)間32.4分鐘的檢測(cè)峰的組分)的質(zhì)譜(MS)?；|(zhì)使用三乙醇胺。結(jié)果檢測(cè)出m/z 1279(M-H)-的峰。圖1表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分7的質(zhì)譜。圖1中，橫軸表示m/z值，縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度。
另外，用核磁共振(NMR)譜裝置(AVANCE600型ブルカ·バィォスピン公司制造)，對(duì)來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分7進(jìn)行各種NMR譜的測(cè)定，分析其結(jié)構(gòu)。以下給出NMR的所屬信號(hào)。
1H-NMR皂草精醇部分；δ3.28(1H，m，3-H)，5.15(1H，br-s，12-H)，3.45(1H，m，21-H)，3.23(1H，br-s，22-H)，3.14(1H，m，24-H)，3.85(1H，m，24-H)3-o-β-D-吡喃葡糖醛酸基部分；δ4.45(1H，d，J＝7.2Hz，1’-H)，3.44(1H，m，2’-H)，3.57(1H，m，3’-H)，3.32(1H，m，4’-H)，3.65(1H，m，5’-H)
2’-o-β-D-吡喃半乳糖基部分；δ4.81(1H，d，J＝6.6Hz，1”-H)，3.51(1H，m，2”-H)，3.51(1H，m，3”-H)，3.65(1H，m，4”-H)，3.38(1H，m，5”-H)，3.50(2H，m，6”-H)2”-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ4.38(1H，d，J＝7.8Hz，1-H)，3.02(1H，m，2-H)，3.17(1H，m，3-H)，3.08(1H，m，4-H)，3.14(1H，m，5-H)，3.46(1H，m，6-H)，3.73(1H，m，6-H)22-o-α-L-阿拉伯吡喃糖基部分；δ4.13(1H，m，1””-H)，3.42(1H，m，2””-H)，3.42(1H，m，3””-H)，3.69(1H，m，4””-H)，3.35(1H，m，5””-H)，3.62(1H，m，5””-H)3””-o-β-D-吡喃木糖基部分；δ 4.57(1H，d，J＝7.8Hz，1”-H)，4.52(1H，m，2”-H)，3.29(1H，m，3”-H)，3.37(1H，m，4”-H)，3.09(1H，m，5”-H)，3.72(1H，m，5”-H)，2.00(3H，s，2”-CH3)1H-NMR中，樣品溶解于氘代二甲亞砜中，氘代二甲亞砜的殘余質(zhì)子的化學(xué)位移值表示為2.51ppm。圖2表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分7的1H-NMR譜。圖2中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
13C-NMR皂草精醇部分；δ90.3(3-C)，122.5(12-C)，144.4(13-C)，74.7(21-C)，92.0(22-C)，63.0(24-C)3-o-β-D-吡喃葡糖醛酸基部分；
δ104.1(1’-C)，79.0(2’-C)，76.6(3’-C)，71.9(4’-C)，76.2(5’-C)，171.0(6’-C)2’-o-β-D-吡喃半乳糖基部分；δ101.6(1”-C)，82.7(2”-C)，73.4(3”-C)，69.0(4”-C)，75.5(5”-C)，60.9(6”-C)2”-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ105.3(1-C)，75.5(2-C)，76.7(3-C)，70.6(4-C)，78.1(5-C)，61.8(6-C)22-o-α-L-阿拉伯吡喃糖基部分；δ108.0(1””-C)，71.9(2””-C)，83.0(3””-C)，68.5(4””-C)，67.0(5””-C)3””-o-β-D-吡喃木糖基部分；δ103.3(1”-C)，74.6(2”-C)，74.7(3”-C)，70.2(4”-C)，65.3(5”-C)，170.5(2”-C＝O)，21.8(2”-CH3)13C-NMR中，樣品溶解于氘代二甲亞砜中，氘代二甲亞砜的化學(xué)位移值表示為40.2ppm。圖3表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分7的13C-NMR譜。圖3中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
將來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分7與1N H2SO4(二噁烷與水的容量比為1∶3的溶液)混合，在80°加溫4小時(shí)，產(chǎn)生糖成分和非糖成分。對(duì)非糖部進(jìn)行薄層層析(Merck公司制造的硅膠60 F254、展開(kāi)溶劑A氯仿與甲醇按照10∶1混合)，結(jié)果檢測(cè)出具有與大豆皂草精醇A相同Rf值斑點(diǎn)。對(duì)糖部分進(jìn)行薄層層析(展開(kāi)溶劑水與乙腈按照3∶17混合)，結(jié)果檢測(cè)出阿糖、葡萄糖、木糖、半乳糖。
以上，通過(guò)對(duì)來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分7進(jìn)行質(zhì)譜、NMR譜分析、以及酸解后的非糖成分和糖成分的分析，確定了來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分7為3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[2-o-乙酰基-β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A(分子量1280)。該化合物是上表1中的化合物a。
(2)測(cè)定化合物a的NGF生成增強(qiáng)活性。將小鼠成纖維細(xì)胞L-M細(xì)胞(ATCC CCL-1.2)在含有0.5％bakuto蛋白胨(ギブコ公司制造)的M199培養(yǎng)基(バィォゥィタカ公司制造)中以1.5×105細(xì)胞/mL懸浮，在96孔板上每孔鋪0.1mL，進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，除去培養(yǎng)基，置換為含有0.5％牛血清白蛋白(シグマ公司制造)的M199培養(yǎng)基。向其中加入化合物a，培養(yǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)酶聯(lián)免疫測(cè)定法(NGF Emax免疫測(cè)定系統(tǒng)プロメガ公司制造)測(cè)定培養(yǎng)液中的NGF的濃度。關(guān)于添加量，使終濃度如表2所示。試驗(yàn)進(jìn)行2次，取其平均值。結(jié)果表明化合物a具有NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果在表2中表示。作為對(duì)照的NGF生成量為0.739ng/mL。對(duì)照除不添加化合物a之外，同樣地測(cè)定培養(yǎng)液中的濃度。以下的對(duì)照也同樣。
實(shí)施例3 3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[3-o-乙?；?β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A的NGF生成增強(qiáng)活性(1)按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定實(shí)施例1-(6)中分離的來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分9(包含保留時(shí)間34.2分鐘的檢測(cè)峰的組分)的質(zhì)譜?；|(zhì)使用三乙醇胺。通過(guò)質(zhì)譜分析檢測(cè)出m/z 1279(M-H)-的峰。圖4表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分9的質(zhì)譜。圖4中，橫軸表示m/z值，縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度。
按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分9的NMR譜。以下給出NMR的所屬信號(hào)。
1H-NMR皂草精醇部分；
δ3.27(1H，m，3-H)，5.14(1H，br-s，12-H)，3.39(1H，m，21-H)，3.24(1H，br-s，22-H)，3.14(1H，m，24-H)，3.86(1H，m，24-H)3-o-β-D-吡喃葡糖醛酸基部分；δ4.45(1H，m，1’-H)，3.43(1H，m，2’-H)，3.57(1H，m，3’-H)，3.33(1H，t，J＝9.7Hz，4’-H)，3.65(1H，m，5’-H)2’-o-β-D-吡喃半乳糖基部分；δ4.80(1H，d，J＝6.6Hz，1”-H)，3.51(1H，m，2”-H)，3.51(1H，m，3”-H)，3.65(1H，m，4”-H)，3.38(1H，m，5”-H)，3.50(2H，m，6”-H)2”-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ4.37(1H，d，J＝7.8Hz，1-H)，3.03(1H，dd，J＝7.8，9.0Hz，2-H)，3.17(1H，t，J＝9.0Hz，3-H)，3.07(1H，t，J＝9.0Hz，4-H)，3.15(1H，m，5-H)，3.47(1H，m，6-H)，3.73(1H，m，6-H)22-o-α-L-阿拉伯吡喃糖基部分；δ4.22(1H，d，J＝7.8Hz，1””-H)，3.55(1H，m，2””-H)，3.51(1H，m，3””-H)，3.75(1H，m，4””-H)，3.40(1H，m，5””-H)，3.63(1H，m，5””-H)3””-o-β-D-吡喃木糖基部分；δ4.47(1H，m，1”-H)，3.23(1H，m，2”-H)，4.72(1H，t，J＝9.3Hz，3”-H)，3.48(1H，m，4”-H)，3.18(1H，m，5”-H)，3.74(1H，m，5”-H)，2.03(3H，s，3”-CH3)1H-NMR中，樣品溶解于氘代二甲亞砜中，氘代二甲亞砜的殘余質(zhì)子的化學(xué)位移值表示為2.51ppm。圖5表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分9的1H-NMR譜。圖5中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
13C-NMR皂草精醇部分；δ90.4(3-C)，122.5(12-C)，144.4(13-C)，75.0(21-C)，92.3(22-C)，63.0(24-C)3-o-β-D-吡喃葡糖醛酸基部分；δ104.1(1’-C)，78.9(2’-C)，76.7(3’-C)，72.0(4’-C)，76.1(5’-C)，171.0(6’-C)2’-o-β-D-吡喃半乳糖基部分；δ101.6(1”-C)，82.7(2”-C)，73.4(3”-C)，69.0(4”-C)，75.7(5”-C)，61.0(6”-C)2”-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ105.3(1-C)，75.5(2-C)，76.8(3-C)，70.6(4-C)，78.1(5-C)，61.8(6-C)22-o-α-L-阿拉伯吡喃糖基部分；δ107.4(1””-C)，71.9(2””-C)，83.7(3””-C)，68.5(4””-C)，67.0(5””-C)3””-o-β-D-吡喃木糖基部分；δ105.6(1”-C)，72.2(2”-C)，77.8(3”-C)，68.1(4”-C)，66.3(5”-C)，170.8(3”-C＝O)，21.9(3”-CH3)13C-NMR中，樣品溶解于氘代二甲亞砜中，氘代二甲亞砜的化學(xué)位移值表示為40.2ppm。圖6表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分9的13C-NMR譜。圖6中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
將來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分9按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法進(jìn)行水解處理，生成糖成分和非糖成分。對(duì)非糖部進(jìn)行薄層層析(展開(kāi)溶劑A)，檢測(cè)出具有與大豆皂草精醇A相同Rf值的斑點(diǎn)。對(duì)糖成分進(jìn)行薄層層析(展開(kāi)溶劑B)，結(jié)果檢測(cè)出阿糖、葡萄糖、木糖、半乳糖。
由以上結(jié)果確定了來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分9為3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[3-o-乙酰基-β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A(分子量1280)。該化合物是上表1中的化合物b。
(2)按照與實(shí)施例2-(2)同樣的方法測(cè)定化合物b的NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果表明化合物b具有NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果在表2中表示。對(duì)照的NGF生成量為0.739ng/mL。
實(shí)施例4 3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[4-o-乙?；?β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A的NGF生成增強(qiáng)活性(1)按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定實(shí)施例1-(6)中分離的來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分10(包含保留時(shí)間35.6分鐘的檢測(cè)峰的組分)的質(zhì)譜?；|(zhì)使用三乙醇胺。通過(guò)質(zhì)譜分析檢測(cè)出m/z 1279(M-H)-的峰。圖7表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分10的質(zhì)譜。圖7中，橫軸表示m/z值，縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度。
按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分10的NMR譜。以下給出NMR的所屬信號(hào)。
1H-NMR皂草精醇部分；δ3.26(1H，m，3-H)，5.15(1H，br-s，12-H)，3.39(1H，m，21-H)，3.23(1H，br-s，22-H)，3.15(1H，m，24-H)，3.86(1H，m，24-H)3-o-β-D-吡喃葡糖醛酸基部分；
δ4.46(1H，d，J＝7.2Hz，1’-H)，3.43(1H，m，2’-H)，3.56(1H，m，3’-H)，3.33(1H，m，4’-H)，3.65(1H，m，5’-H)2’-o-β-D-吡喃半乳糖基部分；δ4.81(1H，d，J＝7.2Hz，1”-H)，3.51(1H，m，2”-H)，3.51(1H，m，3”-H)，3.65(1H，m，4”-H)，3.38(1H，m，5”-H)，3.50(2H，m，6”-H)2”-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ4.38(1H，d，J＝7.8Hz，1-H)，3.02(1H，m，2-H)，3.16(1H，m，3-H)，3.08(1H，m，4-H)，3.15(1H，m，5-H)，3.47(1H，m，6-H)，3.73(1H，m，6-H)22-o-α-L-阿拉伯吡喃糖基部分；δ4.22(1H，d，J＝7.2Hz，1””-H)，3.57(1H，m，2””-H)，3.46(1H，m，3””-H)，3.74(1H，m，4””-H)，3.39(1H，m，5””-H)，■62(1H，m，5””-H)3””-o-β-D-吡喃木糖基部分；δ4.43(1H，d，J＝7.2Hz，1”-H)，3.39(1H，m，2”-H)，3.18(1H，m，3”-H)，4.53(1H，m，4”-H)，3.17(1H，m，5”-H)，3.78(1H，m，5”-H)，2.01(3H，s，4”-CH3)1H-NMR中，樣品溶解于氘代二甲亞砜中，氘代二甲亞砜的殘余質(zhì)子的化學(xué)位移值表示為2.51ppm。圖8表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分10的1H-NMR譜。圖8中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
13C-NMR皂草精醇部分；
δ90.3(3-C)，122.5(12-C)，144.4(13-C)，75.0(21-C)，92.4(22-C)，63.0(24-C)3-o-β-D-吡喃葡糖醛酸基部分；δ104.1(1’-C)，78.8(2’-C)，76.5(3’-C)，71.9(4’-C)，76.2(5’-C)，171.0(6’-C)2’-o-β-D-吡喃半乳糖基部分；δ101.5(1”-C)，82.7(2”-C)，73.3(3”-C)，69.0(4”-C)，75.7(5”-C)，60.9(6”-C)2”-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ105.3(1-C)，75.5(2-C)，76.8(3-C)，70.6(4-C)，78.1(5-C)，61.8(6-C)22-o-α-L-阿拉伯吡喃糖基部分；δ107.5(1””-C)，71.8(2””-C)，83.9(3””-C)，68.4(4””-C)，67.0(5””-C)3””-o-β-D-吡喃木糖基部分；δ105.9(1”-C)，73.3(2”-C)，74.5(3”-C)，72.3(4”-C)，62.8(5”-C)，171.0(4”-C＝O)，21.7(4”-CH3)13C-NMR中，樣品溶解于氘代二甲亞砜中，氘代二甲亞砜的化學(xué)位移值表示為40.2ppm。圖9表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分10的13C-NMR譜。圖9中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
將來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分10按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法進(jìn)行水解處理，生成糖成分和非糖成分。對(duì)非糖部進(jìn)行薄層層析(展開(kāi)溶劑A)，結(jié)果檢測(cè)出具有與大豆皂草精醇A相同Rf值的斑點(diǎn)。對(duì)糖成分進(jìn)行薄層層析(展開(kāi)溶劑B)的結(jié)果，檢測(cè)出阿糖、葡萄糖、木糖、半乳糖。
由以上結(jié)果確定了來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分10為3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[4-o-乙酰基-β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A(分子量1280)。該化合物是上表1中的化合物c。
(2)按照與實(shí)施例2-(2)同樣的方法測(cè)定化合物c的NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果表明化合物c具有NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果在表2中表示。對(duì)照的NGF生成量為0.739ng/mL。
實(shí)施例5 3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[2，3-二-o-乙?；?β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A的NGF生成增強(qiáng)活性(1)按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定實(shí)施例1-(6)中分離的來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分12(包含保留時(shí)間38.2分鐘的檢測(cè)峰的組分)的質(zhì)譜。基質(zhì)使用間硝基芐基醇。通過(guò)質(zhì)譜分析檢測(cè)出m/z 1321(M-H)-的峰。圖10表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分12的質(zhì)譜。圖10中，橫軸表示m/z值，縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度。
按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分12的NMR譜。以下給出NMR的所屬信號(hào)。
1H-NMR皂草精醇部分；δ3.26(1H，m，3-H)，5.14(1H，br-s，12-H)，3.43(1H，m，21-H)，3.23(1H，br-s，22-H)，3.15(1H，m，24-H)，3.86(1H，m，24-H)3-o-β-D-吡喃葡糖醛酸基部分；δ4.46(1H，d，J＝7.8Hz，1’-H)，3.44(1H，m，2’-H)，3.56(1H，m，3’-H)，3.33(1H，m，4’-H)，3.65(1H，m，5’-H)2’-o-β-D-吡喃半乳糖基部分；
δ4.80(1H，d，J＝6.6Hz，1”-H)，3.50(1H，m，2”-H)，3.51(1H，m，3”-H)，3.65(1H，m，4”-H)，3.38(1H，m，5”-H)，3.50(2H，m，6”-H)2”-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ4.37(1H，d，J＝7.8Hz，1-H)，3.03(1H，m，2-H)，3.17(1H，m，3-H)，3.08(1H，m，4-H)，3.14(1H，m，5-H)，3.47(1H，m，6-H)，3.73(1H，m，6-H)22-o-α-L-阿拉伯吡喃糖基部分；δ4.15(1H，d，J＝6.6Hz，1””-H)，3.42(1H，m，2””-H)，3.45(1H，m，3””-H)，3.71(1H，m，4””-H)，3.35(1H，m，5””-H)，3.62(1H，m，5””-H)3””-o-β-D-吡喃木糖基部分；δ4.74(1H，d，J＝7.2Hz，1”-H)，4.65(1H，m，2”-H)，4.83(1H，t，J＝7.2Hz，3”-H)，3.60(1H，m，4”-H)，3.82(1H，m，5”-H)，3.24(1H，m，5”-H)，1.95(3H，s，2”-CH3)，1.98(3H，s，3”-CH3)但是在1H-NMR中，樣品溶解于氘代二甲亞砜中，氘代二甲亞砜的殘余質(zhì)子的化學(xué)位移值表示為2.51ppm。圖11表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分12的1H-NMR譜。圖11中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
13C-NMR皂草精醇部分；δ90.3(3-C)，122.5(12-C)，144.4(13-C)，74.8(21-C)，91.8(22-C).63.0(24-C)3-o-β-D-吡喃葡糖醛酸基部分；
δ104.1(1’-C)，79.0(2’-C)，76.6(3’-C)，71.9(4’-C)，76.1(5’-C)，171.0(6’-C)2’-o-β-D-吡喃半乳糖基部分；δ101.5(1”-C)，82.7(2”-C)，73.3(3”-C)，69.0(4”-C)，75.8(5”-C)，60.9(6”-C)2”-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ105.3(1-C)，75.5(2-C)，76.7(3-C)，70.6(4-C)，78.1(5-C)，61.8(6-C)22-o-α-L-阿拉伯吡喃糖基部分；δ107.9(1”-C)，72.0(2”-C)，83.5(3”-C)，68.4(4”-C)，67.0(5”-C)3””-o-β-D-吡喃木糖基部分；δ102.8(1”-C)，72.4(2”-C)，76.0(3”-C)，68.0(4”-C)，66.0(5”-C)，170.4(2”-C＝O)，21.5(2”-CH3)，170.7(3”-C＝O)，21.5(3”-CH3)13C-NMR中，樣品溶解于氘代二甲亞砜中，氘代二甲亞砜的化學(xué)位移值表示為40.2ppm。圖12表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分12的13C-NMR譜。圖12中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
將來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分12按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法進(jìn)行水解處理，生成糖成分和非糖成分。對(duì)非糖部進(jìn)行薄層層析(展開(kāi)溶劑A)，結(jié)果檢測(cè)出具有與大豆皂草精醇A相同Rf值的斑點(diǎn)。對(duì)糖成分進(jìn)行薄層層析(展開(kāi)溶劑B)的結(jié)果，檢測(cè)出阿糖、葡萄糖、木糖、半乳糖。
由以上結(jié)果確定了來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分12為3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[2，3-二-o-乙酰基-β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A(分子量1322)。該化合物是上表1中的化合物d。
(2)按照與實(shí)施例2-(2)同樣的方法測(cè)定化合物d的NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果表明化合物d具有NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果在表2中表示。對(duì)照的NGF生成量為0.739ng/mL。
實(shí)施例6 3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[2，4-二-o-乙?；?β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A的NGF生成增強(qiáng)活性(1)按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定實(shí)施例1-(6)中分離的來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分13(包含保留時(shí)間38.9分鐘的檢測(cè)峰的組分)的質(zhì)譜?；|(zhì)使用間硝基芐基醇。通過(guò)質(zhì)譜分析檢測(cè)出m/z 1321(M-H)-的峰。圖13表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分13的質(zhì)譜。圖13中，橫軸表示m/z值，縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度。
按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分13的NMR譜。以下給出NMR的所屬信號(hào)。
1H-NMR皂草精醇部分；δ3.27(1H，m，3-H)，5.14(1H，br-s，12-H)，3.45(1H，m，21-H)，3.22(1H，br-s，22-H)，3.12(1H，m，24-H)，3.85(1H，m，24-H)3-o-β-D-吡喃葡糖醛酸基部分；δ4.46(1H，d，J＝7.2Hz，1’-H)，3.43(1H，m，2’-H)，3.57(1H，m，3’-H)，3.33(1H，m，4’-H)，3.64(1H，m，5’-H)2’-o-β-D-吡喃半乳糖基部分；
δ4.81(1H，d，J＝6.6Hz，1”-H)，3.51(1H，m，2”-H)，3.51(1H，m，3”-H)，3.64(1H，m，4”-H)，3.38(1H，m，5”-H)，3.50(2H，m，6”-H)2”-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ4.38(1H，d，J＝7.8Hz，1-H)，3.02(1H，m，2-H)，3.17(1H，m，3-H)，3.08(1H，m，4-H)，3.14(1H，m，5-H)，3.47(1H，m，6-H)，3.72(1H，m，6-H)22-o-α-L-阿拉伯吡喃糖基部分；δ4.15(1H，d，1””-H)，3.44(1H，m，2””-H)，3.43(1H，m，3””-H)，3.69(1H，m，4””-H)，3.35(1H，m，5””-H)，3.60(1H，m，5””-H)3””-o-β-D-吡喃木糖基部分；δ4.70(1H，d，J＝7.2Hz，1”-H)，4.62(1H，m，2”-H)，3.60(1H，m，3”-H)，4.59(1H，m，4”-H)，3.27(1H，m，5”-H)，3.90(1H，m，5”-H)，2.02(3H，s，2”-CH3)，2.02(3H，s，4”-CH3)1H-NMR中，樣品溶解于氘代二甲亞砜中，氘代二甲亞砜的殘余質(zhì)子的化學(xué)位移值表示為2.51ppm。圖14表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分13的1H-NMR譜。圖14中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
13C-NMR皂草精醇部分；δ90.3(3-C)，122.5(12-C)，144.4(13-C)，74.8(21-C)，91.8(22-C)，63.0(24-C)3-o-β-D-吡喃葡糖醛酸基部分；
δ104.1(1’-C)，78.7(2’-C)，76.6(3’-C)，71.9(4’-C)，76.1(5’-C)，171.0(6’-C)2’-o-β-D-吡喃半乳糖基部分；δ101.5(1”-C)，82.7(2”-C)，73.3(3”-C)，69.0(4”-C)，75.5(5”-C)，60.9(6”-C)2”-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ105.3(1-C)，75.5(2-C)，76.7(3-C)，70.6(4-C)，78.1(5-C)，61.8(6-C)22-o-α-L-阿拉伯吡喃糖基部分；δ108.0(1””-C)，71.9(2””-C)，83.0(3””-C)，68.2(4””-C)，67.0(5””-C)3””-o-β-D-吡喃木糖基部分；δ102.6(1”-C)，73.7(2”-C)，70.6(3”-C)，71.6(4”-C)，62.0(5”-C)，170.4，170.9(2”和4”-C＝O)，21.6，21.8(2”和4”-CH3)13C-NMR中，樣品溶解于氘代二甲亞砜中，氘代二甲亞砜的化學(xué)位移值表示為40.2ppm。圖15表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分13的13C-NMR譜。圖15中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
將來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分13按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法進(jìn)行水解處理，生成糖成分和非糖成分。對(duì)非糖部進(jìn)行薄層層析(展開(kāi)溶劑A)，結(jié)果檢測(cè)出具有與大豆皂草精醇A相同Rf值的斑點(diǎn)。對(duì)糖成分進(jìn)行薄層層析(展開(kāi)溶劑B)的結(jié)果，檢測(cè)出阿糖、葡萄糖、木糖、半乳糖。
由以上結(jié)果確定了來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分13為3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[2，3-二-o-乙?；?β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A(分子量1322)。該化合物是上表1中的化合物e。
(2)按照與實(shí)施例2-(2)同樣的方法測(cè)定化合物e的NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果表明化合物e具有NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果在表2中表示。對(duì)照的NGF生成量為0.578ng/mL。
實(shí)施例7 3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[3，4-二-o-乙?；?β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A的NGF生成增強(qiáng)活性(1)按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定實(shí)施例1-(6)中分離的來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分15(包含保留時(shí)間40.3分鐘的檢測(cè)峰的組分)的質(zhì)譜?；|(zhì)使用間硝基芐基醇。通過(guò)質(zhì)譜分析檢測(cè)出m/z 1321(M-H)-的峰。圖16表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分15的質(zhì)譜。圖16中，橫軸表示m/z值，縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度。
按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分15的NMR譜。以下給出NMR的所屬信號(hào)。
1H-NMR皂草精醇部分；δ3.27(1H，m，3-H)，5.14(1H，br-s，12-H)，3.39(1H，m，21-H)，3.24(1H，br-s，22-H)，3.14(1H，m，24-H)，3.85(1H，m，24-H)3-o-β-D-吡喃葡糖醛酸基部分；δ4.45(1H，d，J＝7.8Hz，1’-H)，3.43(1H，m，2’-H)，3.56(1H，t，J＝8.9Hz，3’-H)，3.34(1H，t，J＝8.9Hz，4’-H)，3.66(1H，m，5’-H)2’-o-β-D-吡喃半乳糖基部分；
δ4.80(1H，d，J＝6.6Hz，1”-H)，3.51(1H，m，2”-H)，3.51(1H，m，3”-H)，3.65(1H，m，4”-H)，3.38(1H，m，5”-H)，3.50(2H，m，6”-H)2”-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ4.37(1H，d，J＝7.8Hz，1-H)，3.02(1H，dd，J＝7.8，9.0Hz，2-H)，3.17(1H，t，J＝9.0Hz，3-H)，3.08(1H，t，J＝9.0Hz，4-H)，3.15(1H，m，5-H)，3.47(1H，m，6-H)，3.72(1H，m，6-H)22-o-α-L-阿拉伯吡喃糖基部分；δ4.22(1H，d，J＝4.8Hz，1””-H)，3.46(1H，m，2””-H)，3.42(1H，m，3””-H)，3.74(1H， m，4””-H)，3.39(1H，m，5””-H)，3.63(1 H， m，5””-H)3””-o-β-D-吡喃木糖基部分；δ4.58(1H，d，J＝7.2Hz，1”-H)，3.38(1H，m，2”-H)，4.97(1H，t，J＝9.3Hz，3”-H)，4.72(1H，m，4”-H)，3.88(1H，m，5”-H)，3.36(1H，m，5”-H)，2.01，1.96(3H，s，3”和4”-CH3)1H-NMR中，樣品溶解于氘代二甲基亞砜中，氘代二甲基亞砜的殘余質(zhì)子的化學(xué)位移值表示為2.51ppm。圖17表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分15的1H-NMR譜。圖17中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
13C-NMRδ皂草精醇部分；δ90.3(3-C)，122.5(12-C)，144.4(13-C)，75.0(21-C)，92.3(22-C)，62.6(24-C)3-o-β-D-吡喃葡糖醛酸基部分；
δ1 04.1(1’-C)，78.8(2’-C)，76.5(3’-C)，72.0(4’-C)，76.1(5’-C)，171.0(6’-C)2’-o-β-D-吡喃半乳糖基部分；δ101.5(1”-C)，82.7(2”-C)，73.4(3”-C)，69.0(4”-C)，75.5(5”-C)，60.9(6”-C)2”-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ105.3(1-C)，75.5(2-C)，76.5(3-C)，70.6(4-C)，78.1(5-C)，61.8(6-C)22-o-α-L-阿拉伯吡喃糖基部分；δ107.4(1””-C)，72.0(2””-C)，83.7(3””-C)，68.3(4””-C)，67.0(5””-C)3””-o-β-D-吡喃木糖基部分；δ105.3(1”-C)，72.0(2”-C)，74.2(3”-C)，69.9(4”-C)，62.6(5”-C)，171.0，170.7(3”和4”-C＝O)，21.3，21.5(3”和4”-CH3)13C-NMR中，樣品溶解于氘代二甲亞砜中，氘代二甲基亞砜的化學(xué)位移值表示為40.2ppm。圖18表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分15的13C-NMR譜。圖18中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
將來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分15按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法進(jìn)行水解處理，生成糖成分和非糖成分。對(duì)非糖部進(jìn)行薄層層析(展開(kāi)溶劑A)，結(jié)果檢測(cè)出具有與大豆皂草精醇A相同Rf值的斑點(diǎn)。對(duì)糖成分進(jìn)行薄層層析(展開(kāi)溶劑B)的結(jié)果，檢測(cè)出阿糖、葡萄糖、木糖、半乳糖。
由以上結(jié)果確定了來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分15為3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[3，4-二-o-乙?；?β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A(分子量1322)。該化合物是上表1中的化合物f。
(2)按照與實(shí)施例2-(2)同樣的方法測(cè)定化合物f的NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果表明化合物f具有NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果在表2中表示。對(duì)照的NGF生成量為0.578ng/mL。
實(shí)施例8 3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[3，4，6-三-o-乙?；?β-D-吡喃葡糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A的NGF生成增強(qiáng)活性(1)按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定實(shí)施例1-(6)中分離的來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分16(包含保留時(shí)間41.0分鐘的檢測(cè)峰的組分)的質(zhì)譜?；|(zhì)使用間硝基芐基醇。通過(guò)質(zhì)譜分析檢測(cè)出m/z 1393(M-H)-的峰。圖19表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分16的質(zhì)譜。圖19中，橫軸表示m/z值，縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度。
按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分16的NMR譜。以下給出NMR的所屬信號(hào)。
1H-NMR皂草精醇部分；δ3.28(1H，m，3-H)，5.15(1H，br-s，12-H)，3.40(1H，m，21-H)，3.25(1H，br-s，22-H)，3.15(1H，m，24-H)，3.87(1H，m，24-H)3-o-β-D-吡喃葡糖醛酸基部分；δ4.45(1H，d，1’-H)，3.44(1H，m，2’-H)，3.57(1H，m，3’-H)，3.32(1H，m，4’-H)，3.62(1H，m，5’-H)2’-o-β-D-吡喃半乳糖基部分；
δ4.82(1H，d，1”-H)，3.51(1H，m，2”-H)，3.51(1H，m，3”-H)，3.65(1H，m，4”-H)，3.38(1H，m，5”-H)，3.50(2H，m，6”-H)2”-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ4.38(1H，d，J＝7.8Hz，1-H)，3.02(1H，m，2-H)，3.17(1H，m，3-H)，3.09(1H，m，4-H)，3.14(1H，m，5-H)，3.47(1H，m，6-H)，3.72(1H，m，6-H)22-o-α-L-阿拉伯吡喃糖基部分；δ4.25(1H，d，1””-H)，3.59(1H，m，2””-H)，3.52(1H，m，3””-H)，3.78(1H，m，4””-H)，3.42(1H，m，5””-H)，3.66(1H，m，5””-H)3””-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ4.67(1H，d，J＝7.8Hz，1”-H)，3.41(1H，dd，J＝7.8，9.3Hz，2”-H)，5.03(1H，t，J＝9.3Hz，3”-H)，4.77(1H，t，J＝9.3Hz，4”-H)，3.87(1H，m，5”-H)3.97(1H，m，6”-H)，4.17(1H，m，6”-H)，1.96，1.99(3H和6H，s，3”，4”和6”-CH3)但是，在1H-NMR中，樣品溶解于氘代二甲亞砜中，氘二甲亞砜的殘余質(zhì)子的化學(xué)位移值表示為2.51ppm。圖20表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分16的1H-NMR譜。圖20中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
13C-NMR皂草精醇部分；δ90.3(3-C)，122.5(12-C)，144.4(13-C)，75.0(21-C)，92.4(22-C)，63.0(24-C)3-o-β-D-吡喃葡糖醛酸基部分；
δ104.1(1’-C)，78.8(2’-C)，76.6(3’-C)，72.0(4’-C)，76.0(5’-C)，171.0(6’-C)2’-o-β-D-吡喃半乳糖基部分；δ101.5(1”-C)，82.8(2”-C)，73.2(3”-C)，69.0(4”-C)，75.7(5”-C)，60.9(6”-C)2”-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ105.3(1-C)，75.5(2-C)，76.7(3-C)，70.6(4-C)，78.1(5-C)，61.8(6-C)22-o-α-L-阿拉伯吡喃糖基部分；δ107.4(1””-C)，71.6(2””-C)，84.4(3””-C)，68.3(4””-C)，67.0(5””-C)3””-o-β-D-吡喃葡糖基部分；δ105.3(1”-C)，72.0(2”-C)，74.2(3”-C)，69.9(4”-C)，62.6(5”-C)，171.0，170.7(3”和4”-C＝O)，21.3，21.5(3”和4”-CH3)13C-NMR中，樣品溶解于氘代二甲亞砜中，氘二甲亞砜的化學(xué)位移值表示為40.2ppm。圖21表示來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分16的13C-NMR譜。圖21中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
將來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分16按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法進(jìn)行水解處理，生成糖成分和非糖成分。對(duì)非糖部進(jìn)行薄層層析(展開(kāi)溶劑A)，結(jié)果檢測(cè)出具有與大豆皂草精醇A相同Rf值的斑點(diǎn)。對(duì)糖成分進(jìn)行薄層層析(展開(kāi)溶劑B)的結(jié)果，檢測(cè)出阿糖、葡萄糖、半乳糖。
由以上結(jié)果確定了來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分16為3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[3，4，6-三-o-乙酰基-β-D-吡喃萄糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A(分子量1394)。該化合物是上表1中的化合物g。
(2)按照與實(shí)施例2-(2)同樣的方法測(cè)定化合物g的NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果表明化合物g具有NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果在表2中表示。對(duì)照的NGF生成量為0.739ng/mL。
實(shí)施例9 3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[2，3，4，6-四-o-乙?；?β-D-吡喃葡糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A的NGF生成增強(qiáng)活性(1)按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定實(shí)施例1-(6)中分離的來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分18(包含保留時(shí)間42.7分鐘的檢測(cè)峰的組分)的質(zhì)譜、NMR譜、糖部和非糖部的薄層層析。結(jié)果確定了來(lái)自大豆胚芽水提取物的組分18為3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[2，3，4，6-四-o-乙?；?β-D-吡喃葡糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A(分子量1436)。該化合物是上表1中的化合物h。
(2)按照與實(shí)施例2-(2)同樣的方法測(cè)定化合物h的NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果表明化合物h具有NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果在表2中表示。對(duì)照的NGF生成量為0.898ng/mL。
實(shí)施例10來(lái)自大豆胚芽的70％乙醇提取物組分的分離(1)向?qū)嵤├?-(1)中得到的沉淀2(5.6kg)中加入8.4升乙醇，在室溫下攪拌1小時(shí)，然后用5000g離心分離10分鐘，得到沉淀6和上清6。在沉淀6中加入10升70％乙醇，攪拌1小時(shí)，然后用5000g離心分離10分鐘，得到沉淀7和上清7。將上清6和上清7混合，減壓濃縮，得到大豆胚芽的70％乙醇提取濃縮物。
(2)將實(shí)施例10-(1)所得大豆胚芽70％乙醇提取濃縮物溶解于500Ml 70％乙醇中，然后用5000g離心分離10分鐘，得到沉淀8和上清8。將上清8減壓濃縮，然后混懸于1000mL的蒸餾水中，將過(guò)濾后的殘余物作為來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的水不溶性組分。
(3)將0.4容量(容)的實(shí)施例10-(2)所得來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的水不溶性組分溶解于含有2mL甲醇、10mL氯仿的溶劑中，用硅膠柱進(jìn)行組分分離。以下表示該條件。硅膠使用BW-300SP(樹(shù)脂量300mL)。展開(kāi)溶劑使用氯仿∶甲醇∶乙酸＝100∶20∶1(400mL)、氯仿∶甲醇＝2∶1(400mL)、乙醇∶水＝10∶1(200mL)，按照該順序洗脫，回收組分1-10，每組分回收100mL。將各洗脫組分減壓濃縮，得到來(lái)自70％乙醇提取物的硅膠柱組分1-10。
(4)將實(shí)施例10-(3)所得的來(lái)自70％乙醇提取物的硅膠柱組分4、5合并，濃縮，然后溶解于12mL乙醇，接著用反相層析分離。以下說(shuō)明其條件。層析柱使用TSK gel ODS-80Ts(21.5mm×30cm)。關(guān)于溶劑A(將蒸餾水和乙腈以容量比3∶1混合所得)和溶劑B(將蒸餾水和乙腈以容量比1∶3混合所得)的洗脫比，0-25分鐘之內(nèi)使溶劑B比為線(xiàn)性的40-70％，接下來(lái)的25-26分鐘之內(nèi)使溶劑B比為線(xiàn)性的70-100％，接下來(lái)的5分鐘使溶劑B比保持100％。洗脫速度為5mL/分鐘，檢測(cè)以215nm進(jìn)行。以洗脫液的紫外線(xiàn)吸收為指標(biāo)，分離來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的組分1-10。
實(shí)施例11 3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-大豆皂草精醇B的NGF生成增強(qiáng)活性(1)按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定實(shí)施例10-(4)中分離的來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的組分6(包含保留時(shí)間24.8分鐘的檢測(cè)峰的組分)的質(zhì)譜、NMR譜。另外，將來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的組分6與2M三氟乙酸∶2N HCl(1∶1)的混合液混合，在氣相下、100℃下加熱4小時(shí)，生成糖成分和非糖成分。對(duì)非糖部進(jìn)行薄層層析(展開(kāi)溶劑A)，結(jié)果檢測(cè)出具有與大豆皂草精醇B相同的Rf值的斑點(diǎn)。對(duì)糖部進(jìn)行薄層層析(展開(kāi)溶劑B)，結(jié)果檢測(cè)出葡萄糖、半乳糖。結(jié)果確定了來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的組分6為3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-大豆皂草精醇B(分子量958)。該化合物是上表1中的化合物i。
(2)按照與實(shí)施例2-(2)同樣的方法測(cè)定化合物i的NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果表明化合物i具有NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果在表2中表示。對(duì)照的NGF生成量為0.948ng/mL。
實(shí)施例12 3-o-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-大豆皂草精醇B的NGF生成增強(qiáng)活性(1)按照與實(shí)施例11-(1)同樣的方法測(cè)定實(shí)施例10-(4)中分離的來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的組分7(包含保留時(shí)間27.4分鐘的檢測(cè)峰的組分)的質(zhì)譜、NMR譜、糖部和非糖部的薄層層析。結(jié)果確定了來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的組分7為3-o-[a-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-大豆皂草精醇B(分子量942)。該化合物是上表1中的化合物j。
(2)按照與實(shí)施例2-(2)同樣的方法測(cè)定化合物j的NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果表明化合物j具有NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果在表2中表示。對(duì)照的NGF生成量為0.948ng/mL。
實(shí)施例13 3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-大豆皂草精醇E的NGF生成增強(qiáng)活性(1)按照與實(shí)施例11-(1)同樣的方法測(cè)定實(shí)施例10-(4)中分離的來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的組分8(包含保留時(shí)間29.3分鐘的檢測(cè)峰的組分)的質(zhì)譜、NMR譜、糖部和非糖部的薄層層析。結(jié)果確定了來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的組分8為3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-大豆皂草精醇E(分子量956)。該化合物是上表1中的化合物k。
(2)按照與實(shí)施例2-(2)同樣的方法測(cè)定化合物k的NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果表明化合物k具有NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果在表2中表示。對(duì)照的NGF生成量為0.924ng/mL。
實(shí)施例14 3-o-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-大豆皂草精醇E的NGF生成增強(qiáng)活性(1)按照與實(shí)施例11-(1)同樣的方法測(cè)定實(shí)施例10-(4)中分離的來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的組分9(包含保留時(shí)間31.7分鐘的檢測(cè)峰的組分)的質(zhì)譜、NMR譜、糖部和非糖部的薄層層析。結(jié)果確定了來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的組分為3-o-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-大豆皂草精醇E(分子量940)。該化合物是上表1中的化合物l。
(2)按照與實(shí)施例2-(2)同樣的方法測(cè)定化合物l的NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果表明化合物l具有NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果在表2中表示。對(duì)照的NGF生成量為0.924ng/mL。
實(shí)施例15 3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[2，3，4-三-o-乙?；?β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A的NGF生成增強(qiáng)活性(1)將實(shí)施例10-(3)所得的來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的硅膠柱組分3溶解于5mL乙醇，接著用反相層析分離。以下說(shuō)明其條件。層析柱使用TSK gel ODS-80Ts(21.5mm×30cm)。關(guān)于溶劑A(將蒸餾水和乙腈以容量比3∶1混合所得)和溶劑B(將蒸餾水和乙腈以容量比1∶3混合所得)的洗脫比，0-15分鐘之內(nèi)使溶劑B比為線(xiàn)性的40-45％，接著在15-20分鐘之內(nèi)使溶劑B比為線(xiàn)性的45-100％，接下來(lái)的5分鐘使溶劑B比保持100％。洗脫速度為5mL/分鐘，檢測(cè)以215nm進(jìn)行。以洗脫液的紫外線(xiàn)吸收為指標(biāo)，分離組分。
(2)按照與實(shí)施例11-(1)同樣的方法測(cè)定實(shí)施例15-(1)中分離來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的硅膠柱組分3得到的來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的組分A(包含保留時(shí)間19.5分鐘的檢測(cè)峰的組分)的質(zhì)譜、NMR譜、糖部和非糖部的薄層層析。結(jié)果確定了來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的組分A為3-o-[β-D-吡喃葡糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]-22-o-[2，3，4-三-o-乙?；?β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-阿拉伯吡喃糖基]大豆皂草精醇A(分子量1364)。該化合物是上表1中的化合物m。
(3)按照與實(shí)施例2-(2)同樣的方法測(cè)定化合物m的NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果表明化合物m具有NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果在表2中表示。對(duì)照的NGF生成量為0.898ng/mL。
表2

以無(wú)添加試樣(對(duì)照)的NGF生成量為100％，用％表示添加試樣區(qū)的NGF生成量N.T.表示未進(jìn)行試驗(yàn)實(shí)施例16 13(18)-齊墩果烯-3，22，24-三醇的NGF生成增強(qiáng)活性(1)將0.04容量實(shí)施例10-(2)中所得來(lái)自大豆胚芽70％乙醇提取物的水不溶性組分在50％甲醇、2N鹽酸、80℃的條件下加熱3小時(shí)。接著用與反應(yīng)液等量的二乙醚共萃取3次，將得到的醚層減壓濃縮，得到白色粉末。將所得白色粉末用己烷洗滌，得到大豆胚芽·酸水解產(chǎn)物。
(2)將實(shí)施例16-(1)所得大豆胚芽·酸水解產(chǎn)物溶解于氯仿，用硅膠層析進(jìn)行組分分離。以下表示其條件。硅膠使用BW-300SP(樹(shù)脂量100mL)。展開(kāi)溶劑使用氯仿∶甲醇＝100∶1進(jìn)行洗脫，按照來(lái)自大豆胚芽·酸解產(chǎn)物的硅膠柱組分1(550mL)、組分2(300mL)、組分3(250mL)的順序得到洗脫組分。
(3)將實(shí)施例16-(2)所得的來(lái)自大豆胚芽·酸水解產(chǎn)物的硅膠柱組分2溶解于4mL乙醇，用反相層析進(jìn)行組分分離。以下說(shuō)明其條件。層析柱使用TSK gel ODS-80Ts(21.5mm×30cm)。溶劑使用水和乙腈以容量比1∶9混合所得。洗脫速度為5mL/分鐘，檢測(cè)以215nm進(jìn)行。以洗脫液的紫外線(xiàn)吸收為指標(biāo)，分離來(lái)自大豆胚芽·酸水解產(chǎn)物的組分。
(4)按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定實(shí)施例16-(3)中分離的來(lái)自大豆胚芽·酸解產(chǎn)物的組分a(包含洗脫時(shí)間37.5分鐘的峰的組分)的質(zhì)譜。基質(zhì)使用三乙醇胺。通過(guò)質(zhì)譜分析檢測(cè)出m/z 457(M-H)-的峰。圖22表示來(lái)自大豆胚芽·酸水解產(chǎn)物的組分a的質(zhì)譜。圖22中，橫軸表示m/z值，縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度。
按照與實(shí)施例2-(1)同樣的方法測(cè)定來(lái)自大豆胚芽·酸水解產(chǎn)物的組分a的NMR譜。以下給出NMR的所屬信號(hào)。
1H-NMRδ0.70，0.92(3H，s，29和30-CH3)，0.77(1H，m，5-H)，0.79(3H，s，26-CH3)，0.81(3H，s，25-CH3)，0.88(3H，s，28-CH3)，0.96(1H，m，1-H)，1.07(1H，m，15-H)，1.08(3H，s，23-CH3)，1.12(3H，s，27-CH3)，1.16(1H，dd，J＝4.8，13.8Hz，11-H)，1.25(1H，m，16-H)，1.27(1H，m，21-H)，1.32(1H，m，6-H)，1.34(1H，m，21-H)，1.34(1H，m，7-H)，1.37(1H，m，7-H)，1.43(1H，m，9-H)，1.45(1H，m，11-H)，1.55(1H，m，6-H)，1.56(1H，m，2-H)，1.61(1H，m，15-H)，1.62(1H，m，19-H)，1.64(1H，m，2-H)，1.65(1H，m，1-H)，1.68(1H，m，16-H)，1.80(1H，m，12-H)，2.24(1H，d，J＝13.8Hz，19-H)，2.61(1H，br-d，J＝12.6Hz，12-H)，3.12(1H，m，22-H)，3.19(1H，m，3-H)，3.26(1H，dd，J＝7.8，10.8Hz，24-H)，3.80(1H，dd，J＝2.4，10.8Hz，24-H)，4.06(1H，dd，J＝2.4，7.8Hz，24-OH))，4.26(1H，d，J＝4.8Hz，22-OH)，4.95(1H，d，J＝4.2Hz，3-OH)1H-NMR中，樣品溶解于氘代二甲亞砜中，氘二甲亞砜的殘余質(zhì)子的化學(xué)位移值表示為2.51ppm。圖23表示來(lái)自大豆胚芽·酸水解產(chǎn)物的組分a的1H-NMR譜。圖23中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
13C-NMRδ17.3(25-C)，17.4(28-C)，18.1(26-C)，19.6(6-C)，22.1(27-C)，22.4(11-C)，23.8(23-C)，25.8，33.1(29和30-C)，26.1(12-C)，26.6(15-C)，28.2(2-C)，32.7(20-C)，34.0(16-C)，35.8(7-C)，37.5(10-C)，38.6(19-C)，39.3(1-C)，40.9(17-C)，41.5(8-C)，43.1(4-C)，44.7(14-C)，44.8(21-C)，51.0(9-C)，56.3(5-C)，63.8(24-C)，76.6(22-C)，79.5(3-C)，133.0(18-C)，136.9(13-C)13C-NMR中，樣品溶解于氘代二甲亞砜中，氘代二甲亞砜的化學(xué)位移值表示為40.2ppm。圖24表示來(lái)自大豆胚芽·酸水解產(chǎn)物的組分a的13C-NMR譜。圖24中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
以上對(duì)來(lái)自大豆胚芽·酸水解產(chǎn)物的組分a進(jìn)行的MS譜、NMR譜分析的結(jié)果確定了來(lái)自大豆胚芽·酸水解產(chǎn)物的組分a為13(18)-齊墩果烯-3，22，24-三醇(分子量458)。該化合物是上表1中的化合物n。
(5)按照與實(shí)施例2-(2)同樣的方法測(cè)定化合物n的NGF生成增強(qiáng)活性。對(duì)培養(yǎng)基的添加量，使其終濃度如表3所示。結(jié)果表明化合物n具有NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果在表3中表示。對(duì)照的NGF生成量為0.372ng/mL。
表3

以無(wú)添加試樣(對(duì)照)的NGF生成量為100％，用％表示添加試樣區(qū)的NGF生成量實(shí)施例17甘草皂草苷的NGF生成增強(qiáng)活性按照與實(shí)施例2-(2)同樣的方法測(cè)定甘草皂草苷(和光純藥工業(yè)公司制造)。對(duì)培養(yǎng)基的添加量，使其終濃度如表4所示。結(jié)果表明甘草皂草苷具有NGF生成增強(qiáng)活性。結(jié)果在表4中表示。對(duì)照的NGF生成量為0.484ng/mL。
表4

以無(wú)添加試樣(對(duì)照)的NGF生成量為100％，用％表示添加試樣區(qū)的NGF生成量產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供來(lái)自食用植物、安全、富含皂草苷類(lèi)化合物、皂草苷配基類(lèi)化合物或它們的鹽的藥物、飲料食品、飼料。它們通過(guò)其N(xiāo)GF生成增強(qiáng)的作用，對(duì)于腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療、預(yù)防、癥狀改善有效。特別是飲料食品使得在日常攝取一定量的皂草苷類(lèi)化合物等成為可能，作為保持機(jī)體恒定性的飲料食品、NGF生成增強(qiáng)的飲料食品是極有效的。
權(quán)利要求
1.下述通式(I)表示的化合物或其鹽 式中，當(dāng)虛線(xiàn)表示的結(jié)合單元中的A表示為雙鍵，B表示為單鍵時(shí)，R1表示-O-GlcUA-Gal-Glc，R2表示-O-Ara-2-AcXyl、-O-Ara-3-AcXyl、-O-Ara-4-AcXyl、-0-Ara-2，3-二AcXyl、-O-Ara-2，4-二AcXyl、-O-Ara-3，4-二AcXyl或-O-Ara-3，4，6-三AcGlc，且R3表示-OH；當(dāng)A表示為單鍵，B表示為雙鍵時(shí)，R1表示-OH，R2表示-OH，且R3表示-H；其中GlcUA是指葡糖醛酸殘基，Gal是指半乳糖殘基，Glc是指葡萄糖殘基，Ara是指阿糖殘基，AcXyl是指乙?；咎菤埢?，AcGlc是指乙酰化葡萄糖殘基。
2.對(duì)權(quán)利要求1的化合物顯示敏感性的疾病的治療藥或預(yù)防藥，其特征在于含有權(quán)利要求1的化合物和/或藥理學(xué)上可接受的鹽作為有效成分。
3.神經(jīng)生長(zhǎng)因子生成增強(qiáng)劑，其特征在于含有權(quán)利要求1的化合物和/或其鹽作為有效成分。
4.食品、飲料或飼料，其特征在于含有權(quán)利要求1的化合物和/或其鹽作為有效成分。
5.權(quán)利要求4的食品、飲料或飼料，該食品、飲料或飼料用于增強(qiáng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生成。
6.在治療或預(yù)防中需要增強(qiáng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生成的疾病治療藥或預(yù)防藥，其特征在于含有選自大豆皂草苷類(lèi)化合物、大豆皂草配基類(lèi)化合物、甘草皂草苷以及它們的藥理學(xué)上可接受的鹽的化合物作為有效成分。
7.權(quán)利要求6的治療藥或預(yù)防藥，其中所述大豆皂草苷類(lèi)化合物和大豆皂草配基類(lèi)化合物由下述通式(II)表示 式中，虛線(xiàn)所示的結(jié)合單元表示單鍵或雙鍵，R4表示-OH或-O-糖殘基，R5表示-OH、＝O或-O-糖殘基，R6表示-OH或-H。
8.神經(jīng)生長(zhǎng)因子生成增強(qiáng)劑，其特征在于含有選自大豆皂草苷類(lèi)化合物、大豆皂草配基類(lèi)化合物、甘草皂草苷以及它們的鹽的化合物作為有效成分。
9.權(quán)利要求8的神經(jīng)生長(zhǎng)因子生成增強(qiáng)劑，其中所述大豆皂草苷類(lèi)化合物和大豆皂草配基類(lèi)化合物是權(quán)利要求7的通式(II)表示的大豆皂草苷類(lèi)化合物和大豆皂草配基類(lèi)化合物。
10.用于增強(qiáng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生成的食品、飲料或飼料，其特征在于含有選自大豆皂草苷類(lèi)化合物、大豆皂草配基類(lèi)化合物、甘草皂草苷以及它們的鹽的化合物作為有效成分。
11.權(quán)利要求10的用于增強(qiáng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生成的食品、飲料或飼料，其中所述大豆皂草苷類(lèi)化合物和大豆皂草配基類(lèi)化合物是權(quán)利要求7的通式(II)表示的大豆皂草苷類(lèi)化合物和大豆皂草配基類(lèi)化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有選自大豆皂草苷類(lèi)化合物、大豆皂草配基類(lèi)化合物、甘草皂草苷以及它們的鹽的化合物作為有效成分的、在治療或預(yù)防中需要增強(qiáng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的生成的疾病的治療藥或預(yù)防藥、NGF生成增強(qiáng)劑、以及用于增強(qiáng)NGF的生成的食品、飲料或飼料。本發(fā)明還涉及具有NGF生成增強(qiáng)的作用的新型的大豆皂草苷類(lèi)化合物和大豆皂草配基類(lèi)化合物。
文檔編號(hào)A61K31/56GK1668561SQ03817080
公開(kāi)日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2003年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月18日
發(fā)明者大野木宏, 杉山勝美, 佐川裕章, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶生物工程株式會(huì)社