專利名稱：使用深度過濾從生物液體中捕獲、濃縮和定量異常朊病毒蛋白的制作方法
背景技術(shù)：
可傳染的海綿狀腦病(TSEs)是由在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的進(jìn)行性癡呆、共濟(jì)失調(diào)、淀粉樣斑形成和海綿狀變性表征的神經(jīng)變性疾病的集合(Prusiner，S.B.，1993，Dev.Biol.Stand.80，31-44)。如今該疾病的致病因子認(rèn)為是異常的朊病毒蛋白。TSEs的基本特征，如人類的克雅病(CJD)、牛的牛海綿狀腦病(BSE)以及綿羊的瘙癢病為正常細(xì)胞朊病毒蛋白PrPc向致病型PrPsc的轉(zhuǎn)變。朊病毒感染的動物腦中PrPsc的積累與感染性朊病毒效價的提高相關(guān)，且可用作朊病毒病的診斷標(biāo)記。由于BSE向人類的種間傳播的威脅，大量家畜必須測試腦中或其他合適的材料中PrPsc的存在。在能使PrPsc和PrPc區(qū)分的共價修飾缺乏時，利用PrPsc而不是PrPc具有部分蛋白酶抗性的事實，PrPsc在蛋白酶K(PK)處理的組織勻漿中通過蛋白質(zhì)印跡法或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)常規(guī)檢測。特別地，這些目前所用的測定法沒有利用PrPsc形成凝集物的事實。如今確信具有去污劑抗性的PrPsc凝集物的形成是PrPsc通常的生化特性，即使是對于那些PrPsc對蛋白分解消化敏感的極少的朊病毒株。凝集作用在朊病毒暴露于凝集作用輔助劑，例如包括復(fù)合劑時發(fā)生。
致死的人神經(jīng)變性疾病CJD也通過一系列途徑送原性地傳播，其暗示致病因子也可以通過血制品傳播的可能性。一種人TSE新型的鑒定，命名為“變體”CJD(vCJD)，其與牛海綿狀腦病(BSE)因子有關(guān)的證實以及在人組織中vCJD因子的分布可能與經(jīng)典的CJD不同的證據(jù)揭示了血或血制品可以傳播PrPsc的理論風(fēng)險的存在(參見Turner等.，Blood Reviews 1998；12255-68)。
許多血制品從包含正常或特殊的免疫球蛋白、凝固因子濃縮物和白蛋白溶液的人血漿供體庫中制備用于醫(yī)藥用途?，F(xiàn)在有一個值得關(guān)注的關(guān)于從人或動物來源的生物醫(yī)藥產(chǎn)品可能傳播TSEs可能性的憂慮。人血漿蛋白的腸胃外施用固有地帶有疾病傳播的風(fēng)險?，F(xiàn)有的血漿篩選和處理步驟以去除或滅活病毒的技術(shù)已經(jīng)大大提高這些產(chǎn)品的安全性，這方面參見Burnouf T，等.，Blood Reviews 2000；1494-110。然而，對異常的PrPsc合適的篩選測驗仍舊沒有得到發(fā)展，其對化學(xué)或物理的滅活方法具有極端的抗性。為確定vCJD已通過源于該血漿的產(chǎn)品傳播到病人的概率，有必要確定PrPsc在臨床相關(guān)環(huán)境中的傳播力、對血漿分離物使用的操作能從血漿產(chǎn)品中去除PrPsc的程度以及在生物制品中用有效的測定法檢測因子PrPsc的程度。
人血漿隨著大量細(xì)胞碎片的去除而從全血中獲得。最近的由血漿分離產(chǎn)業(yè)作的研究表明在人血漿產(chǎn)品制造中使用的加工步驟可減少PrPsc(參見Foster P.，Trans.Med.1999，93-14；Lee DC等.，J.Virol.Methods 2000，8477-89；Foster P.等.，Vox Sang 2000，7886-95，and Lee D.等.，輸血.2001，41449-55)。這些加工步驟包括Cohn分離、深度過濾和層析。Foster等(Vox Sang，supra.)證實深度過濾對于從免疫球蛋白和白蛋白中去除大量的異常朊病毒蛋白(PrPsc)是有效的。
因此有必要發(fā)展有效的從動物或人來源的醫(yī)藥產(chǎn)品或食品中捕獲和去除異常的感染性朊病毒而基本上沒有降低和/或去除產(chǎn)品的生物學(xué)活性或食品價值的方法。因目前異常朊病毒檢測和定量的方法的限制，在濃縮至上述檢測限以上以及隨后從樣品中檢測和精確定量異常的朊病毒蛋白(PrPsc)的能力上存在未解決的需求。
本發(fā)明是基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即包含生物制品，如生物活性蛋白的水樣液體，用一個或多個具有孔徑小于約6微米的深度過濾器的深度過濾對去除異常感染性朊病毒蛋白是非常有效的。更具體而言，本發(fā)明人做了令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即包含生物制品，如生物活性蛋白的水樣液體，在凝集作用輔助劑處理后，用一個或多個具有孔徑小于約6微米的深度過濾器的深度過濾對去除異常感染性朊病毒蛋白是非常有效的。
本發(fā)明提供了與TSEs相關(guān)的PrPsc的捕獲、去除、濃縮和隨后的精確定量的方法，而該TSEs包含于生物或食物制品中。
尤其是，本發(fā)明提供了與TSEs相關(guān)的PrPsc的捕獲、去除、濃縮和隨后的精確定量的方法，該TSEs在生物制品中，已用一種或幾種凝集作用輔助劑處理而導(dǎo)致PrPsc的凝集，使得可在過濾器中或上捕獲PrPsc。任何能導(dǎo)致凝集作用的方法可如此處考慮的凝集作用輔助劑一樣而應(yīng)用。尤其是，已發(fā)現(xiàn)溶劑如醇可被應(yīng)用。在本發(fā)明的方法中，凝集作用輔助劑如已與生物學(xué)或食物產(chǎn)品混合的液體溶劑通過過濾器，過濾器由硅藻土或類似的過濾材料浸制的纖維素基質(zhì)形成，可用陽離子樹脂包被而使過濾器的平均孔徑為約0.1微米至約6微米。一般，過濾器為一次性使用的過濾器。
尤其是，本發(fā)明提供了與TSEs相關(guān)的PrPsc的捕獲、去除、濃縮和隨后的精確定量的方法，該TSEs在生物制品中，已用一種或幾種凝集作用輔助劑如溶劑，例如醇、醇分離的免疫球蛋白溶液，其包括將含有生物或食物制品的溶劑液體通過深度過濾器，該過濾器由包含多孔材料的固體顆粒的基質(zhì)形成，且具有的孔徑能使小于約6μm的產(chǎn)生滯留。一般，過濾器為一次性使用的過濾器。用凝集作用輔助劑的處理可由一種或多種輔助劑混合使用或依次使用完成。
術(shù)語“去除”或“捕獲”理解為從含有目的蛋白的液體中PrPsc確實的物理去除。因?qū)嶋H的目的，目的蛋白從其起始生物狀態(tài)的回收應(yīng)當(dāng)基本上維持至少超過50％的水平，優(yōu)選80％，更優(yōu)選＞90％。
使用本發(fā)明的方法，異常的感染性朊病毒蛋白的去除可達(dá)到至少102.5、103、優(yōu)選104、更優(yōu)選＞105。
除了從生物或食物制品中去除感染性PrPsc，本發(fā)明還涉及從一種或多種過濾器上洗脫及隨后用洗脫緩沖液對捕獲的和已洗脫的PrPsc的濃縮，緩沖液可包含，例如，高滲溶液如高鹽溶液以使PrPsc可用有效的測定法精確定量。
因此，本發(fā)明提供了朊病毒的凝集以及隨后為純化生物或食物制品而進(jìn)行的過濾、朊病毒從過濾器上的洗脫及PrPsc的濃縮，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能應(yīng)用有效的測定法對生物或食物樣品中的總朊病毒和PrPsc定量。本發(fā)明還進(jìn)一步提供對大量樣品的PrPsc快速高通量的檢測。
本發(fā)明還涉及已處理的生物或食品溶液。
由于人血漿的來源為大量細(xì)胞組分去除后的全血，因此，為了模擬所期望的TSE因子在血漿中的狀態(tài)用于分離，在此使用瘙癢病感染的倉鼠腦部分作為接種物，其中完整的細(xì)胞和更大的碎片已被去除。已確信TSE疾病可通過蛋白酶K抗性、構(gòu)象異常的朊病毒蛋白(PrPsc)傳播。在此，我們公開了一種體外分析方法，用以確定作為vCJD的分布標(biāo)記的倉鼠適合的瘙癢病PrPsc的分布。
TSE因子對滅活作用有高抗性，因此任何產(chǎn)品相關(guān)風(fēng)險的降低將依賴于產(chǎn)品制造過程中感染性材料的物理去除。血漿產(chǎn)品制造中使用的加工技術(shù)包括通過沉淀和層析而使蛋白分離和通過深度和膜過濾步驟而使最終蛋白溶液得到澄清和滅菌的各自進(jìn)行。一些技術(shù)，通過用本發(fā)明的方法對其改進(jìn)，可從產(chǎn)物流中去除TSE因子。
在此PrP蛋白用對倉鼠PrP特異的單克隆抗體3F4的蛋白質(zhì)印跡法檢測。該抗體僅與人、倉鼠和貓的PrP109-112殘基反應(yīng)。與3F4抗體在0.6μg/ml濃度下至少孵育1小時，隨后過量抗體被洗去且膜用兔抗鼠的辣根過氧化物酶結(jié)合物(1∶1000稀釋)孵育至少1小時。在多次用TTBS洗滌后，膜用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光劑顯影。
在代理商制造RhoGAMRHO(D)免疫球蛋白(人)過程中，PrPsc在深度過濾步驟時被去除至檢測限，該步驟也在免疫球蛋白的制造過程中使用。
蛋白質(zhì)印跡法是用于鑒定和表征PrPsc的方法。PrPsc通過提取而分離且通過對蛋白酶K消化的部分抗性而區(qū)分。PrPRES(對蛋白酶消化具抗性的PrPsc)通過糖基化形式和片段的遷移位點而得到鑒定。該測定法的靈敏度低于感染性測定法靈敏度約3個數(shù)量級(logs)。靈敏度問題可通過離心酶消化制備物、去除上清和重懸朊病毒物質(zhì)于較小體積、形成朊病毒物質(zhì)的濃縮物而部分克服。我們已表明朊病毒可通過在用凝集作用輔助劑處理后通過過濾器而過濾，以及隨后通過洗脫而收集于小體積而很容易地濃縮。該技術(shù)可用于從產(chǎn)品流中大規(guī)模地去除朊病毒。
該操作將對免疫蛋白印跡法和事實上任何其他朊病毒檢測測定法用于測定生物基質(zhì)中PrPsc的存在產(chǎn)生主要的影響。本發(fā)明允許TSE材料得到快速定量濃縮以增強(qiáng)檢測。當(dāng)想要純化PrPsc的生物、食品或化妝品溶液時，本發(fā)明在該生物、食品或化妝品溶液易于通過大的額定孔徑過濾器而過濾方面具有優(yōu)勢。
本發(fā)明的方法在通過去除、洗脫PrPsc和進(jìn)一步定量PrPsc而對生物、食物和化妝品處理方面是有用的，所述的處理有賴于所用的凝集作用輔助劑?？山?jīng)過如此處理的生物材料為血和血液組分如，全血、血清、血漿、尿、腦脊髓液和血液來源的生物制品如抗體和免疫球蛋白。該抗體的一種為已知的單克隆的抗-D免疫球蛋白或RhoGAMRho(D)免疫球蛋白(人)。該多克隆的免疫球蛋白用于新生兒溶血疾病的預(yù)防，其中母親感染了人源的Rho(D)免疫球蛋白。該產(chǎn)品稱為RhoGAM，可從其代理商處獲得，且它通過預(yù)防未受免疫的Rho(D)陰性母體免于對紅細(xì)胞上的和從Rho(D)陽性嬰兒“接受的”Rho(D)抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答而起作用。因此，通過母體預(yù)防抗Rho(D)產(chǎn)生，該母體隨后的Rho(D)陽性嬰兒就可免于新生兒溶血疾病。該有用的產(chǎn)品目前通過Cohn醇分餾類型的方法生產(chǎn)。
RhoGAMRho(D)免疫球蛋白(人)是獲得抗體介導(dǎo)的免疫抑制的首次成功預(yù)防應(yīng)用的特異抗體。RhoGAM是一種含有每劑量300微克抗-D活性劑量的抗-Rho(D)的IgG免疫球蛋白溶液。RhoGAM可在適當(dāng)?shù)臅r間給予未受免疫的、Rho(D)陰性妊娠婦女以預(yù)防其Rho(D)陽性后代中未來的疾病。該疾病稱為新生兒溶血疾病或更特定地，Rh-胎兒成紅細(xì)胞增多病。
更小劑量的抗-Rho(D)，MICRhoGAMRho(D)免疫球蛋白(人)微-劑量(50微克抗-Rho(D))也由其代理商銷售，用于治療在12周妊娠期或更早時墮胎和流產(chǎn)的婦女。受體保護(hù)的全劑量為15ml Rho(D)陽性紅細(xì)胞，而提供保護(hù)的更小劑量為2.5ml Rho(D)陽性紅細(xì)胞。RhoGAM在26至28周妊娠期用作出生前的預(yù)防。其他適應(yīng)癥包括繼續(xù)妊娠時在妊娠任何時期的先兆流產(chǎn)、在妊娠13周或之前的流產(chǎn)或妊娠終止、腹部創(chuàng)傷或遺傳羊膜腔穿刺術(shù)、絨毛活檢(CVS)和經(jīng)皮的臍帶血活檢(PUBS)。
大部分經(jīng)FDA和生物局批準(zhǔn)應(yīng)用的可注射免疫球蛋白物質(zhì)已通過醇分餾方法而生產(chǎn)，其由哈佛的E.Cohn博士開發(fā)且在Cohn等.，J.Am.Chem.Soc.68，459(1946)中描述，在此引入作為參考。該方法與肝炎病毒、HIV，和其他血源性病原體陰性血漿的謹(jǐn)慎選擇聯(lián)合使用，該選擇通過最靈敏有效的測試來測定。由該方法生產(chǎn)的產(chǎn)品的確是安全的可很容易地由數(shù)百萬未受感染的產(chǎn)品接受者來證實。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在上述參考的Cohn方法中使用的醇足以作為一種凝集作用輔助劑，其引起足夠數(shù)量的PrPsc顆粒凝集，致使PrPsc可被去除至使用本發(fā)明的深度過濾器檢測的限度，以及PrPsc可被洗脫和濃縮至足以用于該檢測的水平。
所用的溶劑組合物對IgG顆粒只有極小的影響，但足以凝集PrPsc至其可被去除至低于用有效的測定法所能測定的水平。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供使用朊病毒凝集作用輔助劑和膜或深度過濾器從生物或食物制品中去除PrPsc和如果需要，PrPc的方法。深度過濾器優(yōu)選使用。
本發(fā)明的另一個目的是在沒有對蛋白的自然或生物學(xué)活性產(chǎn)生不可接受的影響下，從含有蛋白的，尤其是那些來源于人血漿的液體中去除PrPsc和如果需要，PrPc的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是使用此處公開的方法從任何生物液體中捕獲、濃縮和精確定量檢測PrPsc。
本發(fā)明的一個目的是提供用于注射的異常感染性朊病毒清除的，純的免疫球蛋白。該基本上純的產(chǎn)品用本發(fā)明的方法生產(chǎn)。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供從異常的感染性朊病毒中純化免疫球蛋白的制造方法，其適于即時的、令人滿意速度和蛋白產(chǎn)量的需求。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供深度過濾器，其可為單次使用的過濾器，在從方法流程中去除PrPsc后可被拋棄。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是通過從深度過濾器和過濾器洗滌物中洗脫所述朊病毒而提供濃縮的PrPsc溶液。
本發(fā)明另一更進(jìn)一步的目的是提供一種快速測定法用于評估在包含生物液體和人血和血漿來源的產(chǎn)品的不同生物樣品中的PrPsc。該測定法的使用，如，蛋白質(zhì)印跡法，需要在未朊病毒凝集、未過濾的生物溶液中不能利用的朊病毒達(dá)到足夠的水平。該方法提供了一種捕獲、洗脫和濃縮朊病毒以使其可用目前有效的測定法檢測的實用方法。這些新的捕獲和洗脫方法的使用提高了約3個數(shù)量級靈敏度，使得能夠降低所需體積而實施該檢測測定法。
發(fā)明概述本發(fā)明的方法用于生產(chǎn)基本上純化的異常朊病毒蛋白的免疫球蛋白(優(yōu)選單克隆的)?；旧霞兓拿庖咔虻鞍诪槔鐔慰寺』蚨嗫寺】?D免疫球蛋白，如RhoGAM或MICRhoGAM。該免疫球蛋白制劑包含約4.0％至6.0％重量比的免疫球蛋白，和從約80至200ppm的聚山梨酯80，更優(yōu)選約5.0％重量比的免疫球蛋白和約130ppm的聚山梨酯80。
上述引用的免疫球蛋白制劑通常通過使用凝集作用輔助劑如醇分餾人血漿的步驟制得，其中分餾包含過濾步驟；重懸所得到的沉淀物II；用含有賦形劑的高離子強(qiáng)度緩沖液與重懸的沉淀物II混合；和對免疫球蛋白進(jìn)行毫微過濾。
醇可優(yōu)選甲醇且在分餾過程中對上清液III實施過濾步驟，可用深度過濾器如Cuno Zeta Plus 90S深度過濾器。
該方法公開了對異常朊病毒蛋白基本上純的抗-D抗體的制造方法，包括在凝集作用輔助劑如醇存在時分餾人血漿，其中分餾包含過濾步驟。該過濾步驟可使用深度過濾器如Cuno Zeta Plus 90S深度過濾器，其孔徑值為約0.6至6微米。得到的上清液，在分餾過程中作為“上清液III”提及，經(jīng)處理形成沉淀物(在方法中稱“沉淀物II”)，其隨后重懸且與處理輔助劑混合，之后立即對得到的抗-D抗體實施毫微過濾。該處理輔助劑包括高離子強(qiáng)度緩沖液和非離子賦形劑，例如150mM Nacl-甘氨酸緩沖液和聚山梨酯80。
在此進(jìn)一步公開了對異常朊病毒蛋白基本上凈化了的生物制品的制造方法，其通過將生物制品與凝集作用輔助劑如足以形成凝集的異?；蛘ｋ貌《镜鞍椎娜軇┗旌?；以及用深度過濾器過濾由此得到的混合物而進(jìn)行。該生物制品為血或血制品、腦脊液或尿。當(dāng)制品為血時，血液首先經(jīng)臨床離心，在與凝集作用輔助劑混合前紅細(xì)胞和血小板從血液中去除。在過濾步驟后，紅細(xì)胞和血小板加回血液中。深度過濾器可包括例如Cuno Zeta Plus 90S深度過濾器。凝集作用輔助劑可以是醇，如濃度為約2％至約100％的乙醇或甲醇。
另外在此進(jìn)一步公開了在生物溶液中定量異常朊病毒的方法。該方法包括將生物溶液與凝集作用輔助劑如足以凝集異常朊病毒蛋白的溶劑混合、用深度過濾器過濾混合物、通過用洗脫緩沖液沖洗過濾器而將異常朊病毒蛋白從深度過濾器上洗脫、任選地通過諸如離心的方法濃縮洗脫物和對洗脫緩沖液實施異常朊病毒蛋白的測定。生物溶液可以是血或血制品(例如免疫球蛋白)、腦脊液或尿。
附圖簡述

圖1為顯示分餾人血漿以獲得抗-Rh球蛋白過程的流程圖。在分餾過程中材料經(jīng)過濾以捕獲朊病毒蛋白。
發(fā)明詳述本發(fā)明使用一種或多種凝集作用輔助劑以在液體中凝集朊病毒，致使朊病毒(正常和/或異常)可被洗脫、捕獲、濃縮和檢測。一類凝集作用輔助劑可在液體，如生物液體中凝集異常感染性朊病毒(PrPsc)和正常朊病毒，朊病毒凝集物可隨后被去除、洗脫、濃縮，以及異常、正?；騼煞N類型的朊病毒可用本發(fā)明的方法精確定量。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及其為復(fù)合劑的凝集作用輔助劑的用途，該制劑凝集正常或異常朊病毒依賴于該配位劑的特性。所述配位劑包括金屬離子如例如Cu2+、Ni、Zn和Ag。
本發(fā)明提供了過濾器例如用于包含球狀蛋白質(zhì)分子如免疫球蛋白或抗體的生物液體的深度過濾器，期間沒有可察覺的產(chǎn)量損失和免疫球蛋白亞類、免疫球蛋白凝集水平或免疫球蛋白穩(wěn)定性的顯著變化。
本發(fā)明的方法生產(chǎn)出基本上無異常感染性朊病毒(PrPsc)和如果需要，正常朊病毒(PrPc)的生物液體。當(dāng)凝集作用輔助劑選擇適當(dāng)時，本發(fā)明的凝集和過濾方法事實上可以確保所有分類學(xué)上可能的朊病毒，不管正常還是異常，從制品中去除。
該方法尤其適用于全血、血液組分(如，血清、血漿)、尿、CSF或任何生物材料如含有白蛋白、免疫球蛋白(例如IgG)和其片段的液體、凝血因子如因子IX、凝血酶、纖連蛋白、纖維蛋白原、因子VIII、因子II、VII、IX和X以及其他來源于血漿的蛋白的處理。其也適用于血漿、因子XI、因子XIII、血紅素、α-2-巨球蛋白、半抗原球蛋白(haptogobin)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、載脂蛋白、蛋白C、蛋白S、C1-酯酶抑制劑、酶(例如鏈激酶)、間(inter)-α-胰蛋白酶抑制劑、生長激素和馮·威利布蘭德因子的處理。上述天然存在的和重組類似物可得到處理。另外，本發(fā)明適用于其他天然制品包括食物、飲料、化妝品的處理。其還適用于其他非血漿動物來源制品，如肝素和激素的處理。
如此處所述，可用本發(fā)明的方法處理的生物液體包括血和血液組分如全血和其組分，包括血清和血漿、尿、腦脊液，和任何生物制品如抗體和免疫球蛋白。本發(fā)明中處理和過濾的人血漿可通過Cohn等(“Cohn方法”)的分餾方法，上述作為參考，由批樣或柱交換層析，或通過親和層析而獲得。在生產(chǎn)免疫球蛋白，特別是抗-D免疫球蛋白如RhoGAM Rho(D)免疫球蛋白(人)的方法中，普通轉(zhuǎn)讓的美國專利No.6,096,872(2000年8月1日授予Van Holten等專利權(quán))在此作為參考，其內(nèi)容引入作為參考。
Cohn(美國專利No.2,390,074，其內(nèi)容在此引入作為參考)公開了分餾血的方法，通過其制得γ球蛋白。由Cohn方法制得的γ球蛋白包含19S球蛋白、纖連蛋白原和脂類。雖然γ球蛋白非常適于預(yù)防諸如麻疹和破傷風(fēng)疾病，19S球蛋白、纖連蛋白原和脂類的存在卻是非必要的污染物，且會降低其在預(yù)防免疫法中對胎兒紅細(xì)胞Rh-因子的效力。
由本發(fā)明有效的方法制造的基本上純的抗-Rh球蛋白從人血漿中制得，該血漿包含白蛋白、纖連蛋白原、α、β、γ球蛋白和各種脂類。特定地，本發(fā)明的抗Rh-球蛋白為γ球蛋白。
為獲得抗-Rh球蛋白的人血漿分餾依照上述Cohn等，以及普通轉(zhuǎn)讓于Pollack等的美國專利No.3,449,314的方法進(jìn)行，該專利的教導(dǎo)在此引入作為參考。關(guān)于所附的流程1，分餾人血漿的能力依賴于血漿中各種組分的溶解度。在分餾的每個時期，分餾組分的分離和抗-Rh球蛋白中不需要的那些組分的最終去除通過pH、溫度、沉淀物的濃縮和系統(tǒng)離子強(qiáng)度的嚴(yán)格控制而確定。
各種凝集作用輔助劑可用于在本發(fā)明生物液體中駐留的朊病毒的凝集作用。有許多類的凝集作用輔助劑可使用，其發(fā)揮作用的原理為不發(fā)生凝集作用而改變朊病毒的特性(如，大小)或反之影響包含朊病毒的環(huán)境。
值得高興的是一些凝集作用輔助劑可凝集異常和正常的朊病毒。此類凝集作用輔助劑包括低介電常數(shù)的有機(jī)溶劑，如丙酮和醇，其被熟知用于沉淀蛋白且已用于血漿分餾。更特別地，本發(fā)明方法中使用的有機(jī)溶劑包括各種醇類，其為徹底的水易溶的，以及不與蛋白反應(yīng)的，如乙醇、甲醇、異丙基、異丙醇、n-丙醇、異丙醚、酮、醛等，和丙酮，優(yōu)選甲醇。本類中可使用的其他類似凝集作用輔助劑，某種程度上能與受處理的生物材料共處，其包括硫酸胺、辛酸和化學(xué)制劑三氯乙酸(TCA)、雙醛、雜多酸和乳酸鹽單水合物C18H21N3O4H2O。
更令人高興的是，某些凝集作用輔助劑可凝集異常朊病毒因而使其能被去除，而使正常朊病毒保留其原狀態(tài)，反之亦然，該類凝集作用輔助劑為配位劑。這些配位劑與朊病毒結(jié)合，且包括雜多鉬酸鹽、雜多鎢酸鹽、磷酸鎢酸鈉(NaPTA)(所有只凝集異常朊病毒)，和生物制劑如抗體(單克隆或多克隆)，抗體的作用基于其特性，酶如纖連蛋白原(其只凝集異常朊病毒)和多肽，多肽的選擇性作用基于其構(gòu)成。更進(jìn)一步的凝集作用輔助劑其為配位劑包括金屬離子Cu2+，其凝集正常朊病毒。其他類似的金屬離子可包括Ni、Zn和Ag。這些制劑在結(jié)合在基底時可用作朊病毒捕獲裝置。在一實施方案中，涉及配位劑可系列使用，比方說，離子Cu2+可與生物溶液混合，通過過濾將正常朊病毒去除，隨后將所得的生物溶液過濾物和NaPTA混合以復(fù)合異常朊病毒，其可隨后用已知的測定方法捕獲、洗脫和濃縮以及檢測。
凝集作用輔助劑甲醇因其相對于其他有機(jī)溶劑較低的毒性和操作安全性(如，爆炸危險)而首選用于去除免疫球蛋白溶液中的朊病毒。當(dāng)使用此溶劑時，一般以與生物液體約2％至約100％的體積比濃度存在于與生物液體的混合物中。溶劑濃度通過最小的凝集朊病毒所需濃度來指示較低的范圍，以及通過生物材料和過濾介質(zhì)的完整性來指示較高的范圍。
發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的用諸如上述凝集作用輔助劑的處理導(dǎo)致朊病毒(PrPsc和PrPc之一或兩者，基于應(yīng)用時所用的凝集作用輔助劑和方法)蛋白的凝集，以及使用本發(fā)明方法時，所述凝集物可用過濾去除。然后，使用本發(fā)明的方法，包括過濾和隨后從過濾器洗脫和過濾器洗滌，和如果需要，濃縮洗脫物，PrPsc可以以足以能精確定量的濃度獲得。使用本發(fā)明的方法，已發(fā)現(xiàn)所述處理足以從免疫球蛋白制劑中去除PrPsc至低于其檢測限。用于檢測所述朊病毒的測定法的靈敏度提高了約3個數(shù)量級，使得體積減少以及因此提高了樣品中朊病毒的濃度。
為了本發(fā)明PrPsc凝集作用方面，可使用的凝集作用輔助劑為任何已發(fā)現(xiàn)可沉淀異常感染性朊病毒蛋白原纖維的試劑，其能與受處理的生物材料相容，以及與所用的濾器相容。
本發(fā)明的過濾可在任何適合被過濾的生物材料的溫度下進(jìn)行，事實上過濾的環(huán)境由經(jīng)過濾器的生物、食品或化妝品制品確定，而不是捕獲朊病毒物質(zhì)所需的環(huán)境。為防止分餾和過濾中蛋白變性，應(yīng)用的分餾和過濾可優(yōu)選在低溫下進(jìn)行。由于蛋白溶解度是溫度依賴性的，分餾的每個步驟溫度的選擇必須是最低可能的，其允許所需分離和/或過濾進(jìn)行以防止變性。pH環(huán)境應(yīng)當(dāng)由受純化的生物制品的易感性確定。
本發(fā)明實際使用的深度過濾器為那些帶電荷或不帶電荷的深度過濾器。所使用的深度過濾器的實施例包括Celite(World Minerals，Lompoc，CA)、Millipore過濾器75DE和SA(Millipore公司，Bedford，MA)，和Cuno 35P和Cuno Zeta Plus 90SP(Cuno公司，Meriden，CT)。
最優(yōu)選在本發(fā)明中使用的為47mm Cuno Zeta Plus 90SP深度過濾器，帶有適當(dāng)?shù)牟讳P鋼過濾套，用于小規(guī)模過濾作業(yè)，以及在制造過程中使用的16平房英尺的筒。本發(fā)明實際使用的過濾器優(yōu)選深度過濾器，然而非-深度過濾器也可用于去除凝集的PrPsc，只要過濾物經(jīng)過濾器時沒有導(dǎo)致濾器的堵塞。所述替代濾器例如有薄膜濾器，帶電荷或不帶電荷。所述濾器包括例如，一次性注射器濾器Swinex或Millex 25mm PVDF注射器驅(qū)動的過濾單元、0.22微米Opticap和Optiseal筒(Millipore公司，Bedford MA)。
在實際去除和捕獲本發(fā)明的PrPsc凝集物中使用濾器的孔徑相對不重要，然而孔徑可影響過濾的生物制品的回收。過濾基質(zhì)的孔徑優(yōu)選在0.2至6微米的范圍，特別是0.6至1.5微米?？讖揭云渖蠝纛w粒的顆粒大小的方式來定義。一般已定義大小的顆粒如右旋糖酐或微生物用于校準(zhǔn)目的。
在本發(fā)明基本上純的、無異常感染性朊病毒免疫球蛋白制品的生產(chǎn)中應(yīng)用的過濾單元的孔徑小于約6μm，最優(yōu)選小于約0.6μm。然而任何具有足以從蛋白質(zhì)溶液中降低或消除異常感染性朊病毒的截留率濾器都可在本發(fā)明的處理方法中應(yīng)用。例如，作為深度過濾器，CunoZeta Plus 90S濾墊(Cuno公司，Meriden，Conn.)可被應(yīng)用，所述單元具有0.1至5微米范圍的分子量孔徑。
同樣地，濾器組合物應(yīng)當(dāng)只對濾器捕獲凝集的PrPsc的能力具有很小的影響，然而，朊病毒物質(zhì)從所述濾器的回收將需要諸如高鹽溶液或表面活性劑的洗脫緩沖液。
濾器材料可包含深度過濾器，其通常包含自身結(jié)合的纖維素基質(zhì)，以及固體多孔微粒材料如Kieselguhr、珍珠巖或硅藻土。
深度過濾器通常具有1-10mm范圍的厚度，尤其是2-5mm。深度過濾器所用的材料應(yīng)當(dāng)對涉及的所需蛋白只有很小的或沒有影響。合適的深度過濾器包括孔徑為0.6-1.5μm的Seitz KS80、Seitz K200P、Cuno Delipid Del 1小筒，有效過濾范圍為27cm3、Millipore濾器，尤其是Millipore CP20，還包括常規(guī)的超過濾器，如Millipore PTHK聚醚砜膜、AMICON ym-100再生的纖維素超濾膜(Millipore公司，Bedford Mass.)、PALL Filtron Omega VR、Pall UltraporeVFDV50(Pall公司，East Hills，NY)，和其他筒過濾器，如AsahiPlanova再生纖維素筒過濾器(Asahi，Tokyo Japan)。其他可使用的過濾器為帶電荷的深度過濾器如E.Begerow GmbH&Co.，Langenlonsheim，德國。然而，在此最優(yōu)選的實施方案應(yīng)用Cuno ZetaPlus 90S濾墊，47mm過濾器。
生物材料通過濾器的流速為那些適于確保生物材料適當(dāng)過濾而不損害濾器完整性的流速，或，對于包含大量球狀蛋白質(zhì)的生物材料，為不損害蛋白結(jié)構(gòu)而使得制備物無法用于其接下來的目的的流速。例如在免疫球蛋白制劑的深度過濾中，過濾速率范圍從約0.01至約20ml/min，更優(yōu)選約10ml/min，更優(yōu)選約1ml/min。
該方法可在pH范圍4-10，優(yōu)選5-9，更優(yōu)選6-8中進(jìn)行。然而pH范圍由保持受處理生物材料完整性所需的pH和所用的濾器來確定，而不受凝集或過濾操作本身的任何限制。
加熱的應(yīng)用是不必要的，該方法可在基本上室溫或更低溫度下進(jìn)行，尤其是-5至20℃的溫度，其適于維持生物材料和過濾介質(zhì)的完整性。
如上所述，本發(fā)明的一個方面是用凝集作用輔助劑對生物材料的處理，該輔助劑為如足以凝集其中所含朊病毒而使其能通過過濾捕獲和洗脫至用已知的方法如蛋白質(zhì)印跡足以檢測的濃度的溶劑。一些生物液體如此處理將作為其制品的一個參數(shù)，例如，Cohn方法中用醇處理的免疫球蛋白。當(dāng)生物液體未經(jīng)過如此處理，它將用如上面所述的適當(dāng)?shù)哪饔幂o助劑來處理，以凝集其中所含的朊病毒。所述生物液體為上面所列舉的，以及可包括血液及其組分、尿、腦脊液，以及免疫球蛋白。
隨著用凝集作用輔助劑處理生物材料，濾墊從套中除去以及朊病毒從其中洗脫，如果需要，用諸如離心的方法濃縮，且用有效的測定法定量，全部依照本發(fā)明的其他方面，所有的在此得到描述。
在感染朊病毒病的動物和人尿中存在一種蛋白酶抗性的朊病毒蛋白異構(gòu)體。Shaked等(2001，J.Biol.Chem.276(34)31479-31482)詳述了從尿中分離朊病毒的步驟。Shaked等描述的方法需要2-15ml尿樣品在3000rpm沉淀5分鐘，隨后在纖維素膜管中透析過夜。隨后尿樣品以高速(100,000×g)在4℃離心1小時。
Shaked等的方法是費時的，且受易于濃縮的樣品數(shù)量的限制。在此公開的為從生物液體如尿中精確定量朊病毒的方法，其可在幾分鐘內(nèi)完成且不受體積的限制。在用本發(fā)明的方法從尿過濾和洗脫朊病毒時，尿體積達(dá)到1升都可用47mmCuno濾器過濾。相對于現(xiàn)有技術(shù)而言，體積的不同使得該方法在濃縮容量上有數(shù)量級上的提高。參見此處實施例9。
本發(fā)明中當(dāng)全血用作生物液體時，其一定數(shù)量，例如1升，可首先在適于分離細(xì)胞各組分的條件下離心。所得到的血漿與凝集作用輔助劑如一定量的甲醇，按照如約5份血漿和1份甲醇的比率混合以凝集朊病毒物質(zhì)?；旌衔镉眯D(zhuǎn)振蕩器輕輕混合一段時間，足以凝集所在朊病毒，例如約1(1)分鐘。隨后混合物流經(jīng)濾器如47mm Cuno ZetaPlus 90S濾器。隨后該物質(zhì)用此處所述洗脫緩沖液從濾器上洗脫，且用任何適當(dāng)?shù)臏y定法定量朊病毒，如蛋白質(zhì)印跡測定法。如果需要，該檢測限可進(jìn)一步由包括PrPsc沉淀的步驟來改進(jìn)。樣品被稀釋且用蛋白酶-K(PK)處理，隨后用AEBSF(4-(2-氨乙基)苯磺酰氟化物)抑制蛋白酶活性。隨著PK的處理，樣品在4℃，20,000×g離心1小時。沉淀物制備用于SDS Page。
當(dāng)用朊病毒凝集作用輔助劑處理的生物物質(zhì)為免疫球蛋白時，該物質(zhì)將在血漿分餾過程中達(dá)到如此的處理。關(guān)于此處的圖1和實施例1，將血漿單元混合，然后在特定條件下離心以及相關(guān)部分保留用凝集作用輔助劑作進(jìn)一步處理，在這種情況下，優(yōu)選甲醇。在獲得上清液III的分餾時，上清液III用膜或深度過濾器過濾，其過濾去除其中可能含有的凝集朊病毒。因此獲得的凝集朊病毒可從濾器洗脫以及用已知測定法檢測和定量。
本發(fā)明的捕獲和洗脫操作導(dǎo)致測定的檢測限提高超過100倍，目前達(dá)到傳染性測定法的檢測限。用現(xiàn)有技術(shù)中已有的方法，傳染性測定法依賴于所研究的種類需要數(shù)月才得到結(jié)果，相比較，使用本發(fā)明方法數(shù)小時產(chǎn)生結(jié)果。
隨著駐留于生物液體的朊病毒的凝集，無論是通過溶劑還是其他方法，接下來的步驟為朊病毒(例如，PrPsc)的洗脫和回收。在這些步驟中濾器或濾墊被除去且用洗脫液洗滌。一種方法就是將墊放置在容器如培養(yǎng)皿、燒杯或類似合適的容器中，合適體積例如約15ml至約100ml的洗脫緩沖液加入其中，然后容器在室溫下置于旋轉(zhuǎn)振蕩器上約25分鐘。濾器結(jié)合的PrPsc因此通過用洗脫緩沖液溫和的洗滌從中洗脫。合適的洗脫緩沖液包括任何水樣緩沖液，如，高滲的鹽溶液例如1.0-2.0M的Nacl緩沖液、濃度為1.0M至約2.0M的醋酸鈉-甲醇緩沖液。
如果需要，凝集的朊病毒可由離心或現(xiàn)有技術(shù)中任何已知的方法進(jìn)一步濃縮以獲得更高的濃度。
考慮到血制品朊病毒污染的理論可能性，因此闡明深度過濾的有效性以及從免疫球蛋白制品RhoGAMUltra-Filtered Rho(D)免疫球蛋白(人)的中間產(chǎn)物中去除朊病毒的機(jī)制就尤為重要。為完成該目標(biāo)，發(fā)明人使用瘙癢病-感染的倉鼠來源的瘙癢病腦組織勻漿(SBH)，作為PrPsc的來源。為實現(xiàn)該研究，PrPsc“活性種”首先用洗滌劑處理以溶解，隨后超聲波處理以裂解原纖維。該活性種得到處理以使得PrPsc小至能通過過濾系統(tǒng)。超聲波處理的SBH隨后用0.45、0.22和0.1微米的膜過濾，以便在摻加示蹤劑之前更好地確定PrPsc活性種的大小。早先的研究(Van Holten R，等.，輸血(提交公開))表明該處理不會對PrPsc有不利影響，且另外確保深度過濾將要去除的顆粒和感染相關(guān)的單體原纖維大小更相近。深度過濾后PrPsc的減少表明朊病毒的去除歸因于原纖維吸附在正電荷濾膜上，而不是機(jī)械過濾。將活性種加入到稀釋在磷酸緩沖液/甲醇混合物中的IgG中導(dǎo)致形成絮狀物質(zhì)沉淀，其產(chǎn)生渾濁現(xiàn)象。
Cuno Zeta Plus SP帶電的深度過濾器用于過濾摻加入SBH的RhoGAMRho(D)免疫球蛋白(人)。在經(jīng)過Zeta Plus SP濾器過濾時，渾濁物被去除。一層白色沉淀可在過濾后的濾器上觀察到。用蛋白質(zhì)印跡法檢測PrPRES，過濾的物質(zhì)沒有瘙癢病病毒。用2.0M鹽洗滌液將朊病毒物質(zhì)從濾器上回收。蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果在此顯示在表1中。
同時進(jìn)行兩個對照組。第一個對照組中，PrPsc摻入的免疫球蛋白中間產(chǎn)物首先通過0.22μm濾器過濾以確保PrPsc沒有凝集成大的顆粒而通過機(jī)械過濾由深度過濾器去除。第二組中，超聲波處理和過濾的SBH摻入Tris緩沖液生理鹽水而非免疫球蛋白中間產(chǎn)物中，隨后經(jīng)過深度過濾。
深度過濾器從免疫球蛋白過濾液中去除超過4個數(shù)量級的PrPsc。PrPsc的大部分可通過用高濃度Nacl溶液洗脫從免疫球蛋白過濾液中回收。有摻入的上清液III在深度過濾前的0.22μm的預(yù)過濾去除了所有可檢測的PrPsc。小于1 log的PrPsc通過深度過濾從緩沖液對照中去除。參見實施例6和7。
因此發(fā)現(xiàn)深度過濾從免疫球蛋白中去除PrPsc是通過機(jī)械過濾而不是通過吸附到過濾基質(zhì)。免疫球蛋白制備物引起PrPsc從＜0.1μm的顆粒凝集為＞0.22μm的顆粒，可能是因為免疫球蛋白制備物中存在甲醇的緣故。深度過濾未能從緩沖液對照組樣品中去除PrPsc。
在此處實施例3中，在摻入SBH的上清液III(“SupIII”)深度過濾前進(jìn)行超聲波處理的SBH的膜過濾，以確保進(jìn)行深度過濾的顆粒大小不大于0.1微米。這對深度過濾將提出最大的挑戰(zhàn)且可以對PrPsc的去除機(jī)制進(jìn)行表征。SBH首先經(jīng)超聲波處理打碎PrPsc凝集物而促進(jìn)膜過濾。盡管有超聲波處理，還是有必要系列通過漸小的過濾器(0.45和0.22微米)過濾SBH而將0.1微米濾器的堵塞減到最小。
Cuno Zeta Plus 90SP深度過濾器利用兩種機(jī)制去除顆粒。超過約0.1微米額定孔徑的顆粒通過機(jī)械過濾大都滯留。小于0.1微米的，帶負(fù)電荷的顆粒通過電動吸附至帶正電荷的過濾基質(zhì)(美國專利No.4,859,340)而滯留。因大于0.1微米的顆粒已在加入到上清液III和隨后的深度過濾前從SBH中去除，這表明通過深度過濾的PrPsc的滯留是由于暴露于甲醇而引起的顆粒大小的增加。然而，去除朊病毒的電荷捕獲機(jī)制在非處于其等電點的朊病毒被捕獲時是有效的。
在摻入SBH的SupIII過濾后以及用1.0M和2.0MNacl溶液洗脫前的深度過濾器的檢查顯示少量物質(zhì)存在于深度過濾器表面。其被認(rèn)為是當(dāng)SBH加入SupIII時形成的沉淀物，由SupIII中存在的甲醇引起。為確定沉淀物是否包含PrPsc，執(zhí)行第二組操作，其中SBH摻入的SupIII在深度過濾前首先通過0.22微米濾器的預(yù)過濾。預(yù)過濾去除PrPsc至不可檢測的水平，表明在前組中PrPsc是通過沉淀和機(jī)械過濾去除的，而不是通過靜電吸附到深度濾器上。Prusiner等.(Biochemistry 1980；194883-91)表明乙醇容易沉淀PrPsc，所以分餾方法中使用的甲醇的存在具有同樣的效果是不令人奇怪的。
為確定在沉淀醇缺乏時深度過濾是否去除了PrPsc，設(shè)計對照(參見實施例4)，其中PrPsc摻入到水樣緩沖液且隨后被深度過濾。緩沖液對照中PrPsc去除的缺乏表明深度過濾沒有通過機(jī)械過濾的方法(因為PrPsc之前已通過0.1微米濾器)或靜電吸附保留蛋白。
這些研究表明深度過濾去除PrPsc有效性的先前報道可能是誤導(dǎo)的。事實上，深度過濾確實去除PrPsc，不是通過通常與深度過濾相關(guān)的吸附機(jī)制，而是通過沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)械過濾。本研究結(jié)果表明單獨的深度過濾在去除PrPsc方面是無效的。然而，當(dāng)與在前的沉淀步驟聯(lián)合使用時，深度過濾或膜過濾對于從血漿分餾物中去除異常朊病毒蛋白是有效的機(jī)制。
任何合適的檢測朊病毒的測定法都可用于本發(fā)明的定量方面。測定法中有ELISA、SDS-Page、蛋白質(zhì)印跡法、EG&G Wallac、DELFIA、Prionics測定法、Enfer ELC ELISA、CEA ELISA、構(gòu)象依賴的測定法、DELFIA和毛細(xì)管電泳，上面只提到一部分，所有這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
在此發(fā)明人應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法來從已過濾和洗脫的生物液體樣品中檢測朊病毒。蛋白質(zhì)印跡是一種用來鑒定和表征PrPsc的方法。PrPsc通過提取而分離而且通過對蛋白酶K消化的部分抗性而區(qū)分。PrPRES(抗蛋白酶消化的PrPsc)通過糖基化形式及其片段的遷移位點而鑒定。該測定法的靈敏度低于傳染性測定法靈敏度約3個數(shù)量級。靈敏度問題可通過離心制備物、去除上清和重懸朊病毒物質(zhì)于較小體積、形成朊病毒物質(zhì)的濃縮物而部分克服。然而，為替代旋轉(zhuǎn)離心大體積生物液體例如體液，發(fā)明人已表明可通過用凝集作用輔助劑處理含有朊病毒的生物液體而捕獲朊病毒，隨后可通過過濾器過濾而濃縮，以及隨后通過洗脫而收集于小體積。該技術(shù)可用于大規(guī)模的從產(chǎn)品流中去除朊病毒。
該方法將對免疫蛋白印跡法用于測定生物基質(zhì)中PrPsc的存在產(chǎn)生主要的影響。本發(fā)明允許TSE材料得到快速定量濃縮以增強(qiáng)檢測。當(dāng)想要純化生物或食品溶液的PrPsc時，本發(fā)明在使生物或食品溶液和物質(zhì)易于通過大額定孔徑過濾器而過濾方面具有優(yōu)勢。
用于確定特異朊病毒捕獲的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)印跡測定法依賴于首先用蛋白酶K處理捕獲的物質(zhì)，蛋白酶水消化所有正常朊病毒(PrPc)但不明顯消化異常朊病毒(PrPsc或PrPres)。消化依照Lee等.，J VirolMethods 2000，8477-89的方法，在SDS凝膠上以及轉(zhuǎn)印跡到硝酸纖維素或PVDF(聚偏乙烯氟化物)膜進(jìn)行。分離的PrPres條帶用3F4或6H4顯影。通常用PBS聚山梨酯20-5％脫脂奶粉緩沖液將3F4(貯液1mg/ml)稀釋為1∶2000或?qū)?H4(貯液2.5mg/ml)稀釋為1∶5000，總體積10mL?？贵w用羊抗鼠IgG-HRP結(jié)合物(同樣的緩沖液中1∶50,000)檢測。條帶用通常為化學(xué)發(fā)光的HRP底物檢測，且在暴露于x-射線膠片后顯影。參見上述Lee等。
特異的PrPsc單抗如16A18可在磁珠(Dynal甲苯磺酰活化的，Dynal Biotech，Oslo，挪威)上特異性地結(jié)合PrPsc，該抗體可用于檢測PrPsc的存在，好于蛋白質(zhì)印跡法。該家族大部分抗體能捕獲PrPsc但是檢測就依賴于上述蛋白質(zhì)印跡方式中的3F4或6H4。
其他檢測PrPsc的方法包括ELISA和SDS-Page和上述公開的其他通常采取的檢測方法。
在PrPsc物質(zhì)在濾器例如滅菌濾器上捕獲的情況下，其中濾器例如用朊病毒特異的抗體特異性地結(jié)合朊病毒，蛋白質(zhì)印跡法就不需要用于檢測PrPsc了。更好地，朊病毒特異的抗體例如單克隆抗體可用于檢測和定量朊病毒。這樣的抗體包括普通的朊病毒抗體6H4或3F4，其識別正常(PrPc)和異常(PrPsc和PrPres)朊病毒。如果膜結(jié)合所有形式的朊病毒，PrPsc的相對數(shù)量將很低(例如約少于存在朊病毒的1％)。異常朊病毒的特異單克隆抗體，例如16A18或12A5，可用于在膜結(jié)合所有形式(正常和異常)朊病毒的情況下檢測PrPsc。如果信號可被放大，使用所述單克隆抗體將有可能檢測PrPsc，如果需要，可使用化學(xué)發(fā)光底物或聚HRP結(jié)合物。
在此公開的本發(fā)明方法導(dǎo)致測定法的檢測限提高超過100倍，目前達(dá)到傳染性測定法的檢測限。用現(xiàn)有技術(shù)中已有的方法，傳染性測定法依賴于所研究的種類需要數(shù)月才得到結(jié)果。本發(fā)明人還表明測定法可通過不需要洗脫而檢測膜上異常朊病毒的存在來簡化。
在免疫球蛋白中PrPsc凝集和去除的本發(fā)明方法的使用中，以及尤其在抗-D免疫球蛋白，特別是RhoGAM Rho(D)免疫球蛋白(人)的制備中，參考圖1的流程圖和Cohn等，J.Am.Chem.Soc.，Vol.68，pages 459-475的方法，分餾從人全血漿進(jìn)行。血漿冷卻至約1℃然后從上清液中離心分離冷的未溶解的沉淀物。上清液進(jìn)一步分餾產(chǎn)生沉淀物I和上清液I。棄去主要由纖維蛋白原組成的沉淀物I。上清液I進(jìn)一步分餾產(chǎn)生上清液II+III和沉淀物II+III。上清液II+III(被棄去)含有α和β球蛋白和脂類。沉淀物II+III主要由β和γ球蛋白和同種凝集素組成，但也包含凝血酶原、纖連蛋白原、膽固醇和其他脂類。沉淀物II+III，經(jīng)進(jìn)一步分餾產(chǎn)生上清液II+IIIW和沉淀物II+IIIW。β球蛋白、膽固醇和其他脂類在棄去的上清液II+IIIW中被大量去除。沉淀物II+IIIW主要由γ球蛋白、同種凝集素、纖連蛋白原和凝血酶原以及一些β球蛋白、膽固醇和其他脂類組成。經(jīng)進(jìn)一步分餾，沉淀物II+IIIW產(chǎn)生上清液III+沉淀物III。沉淀物III(被棄去)含有同種凝集素、纖連蛋白原和凝血酶原。上清液III主要由γ球蛋白和少量纖維蛋白原和脂類組成。分餾的最后一個步驟產(chǎn)生沉淀物II，其為基本純凈的γG球蛋白。由本發(fā)明方法制備的沉淀物II為抗Rhγ球蛋白。
在本發(fā)明優(yōu)選方法中，用于重懸的免疫球蛋白起始材料為從改進(jìn)的Cohn方法得來的沉淀物II糊狀物。若蛋白在賦形劑存在下凍干，則凍干的沉淀物II糊狀物也可使用，賦形劑為如美國專利No.6,096,872所涉及的那些。在這種情形下本發(fā)明捕獲朊病毒的過濾步驟優(yōu)選在沉淀物II的分餾中進(jìn)行；參考上面所述以及圖1，導(dǎo)致朊病毒捕獲的免疫球蛋白的分餾在沉淀物II獲得前、獲得上清液III后，或最優(yōu)選在上清液III和已過濾的上清液III之間進(jìn)行，如所示。所述用凝集作用輔助劑甲醇處理材料，以及以約4∶1的MeOH∶上清液III比率，在上清液III中凝集朊病毒，其凝集物隨后可用本發(fā)明進(jìn)一步的方法去除。本發(fā)明的捕獲朊病毒的過濾步驟也可在制成的免疫球蛋白制品中進(jìn)行。然而，用凝集作用輔助劑處理和過濾也可作為制品處理的最后階段進(jìn)行，只要該階段的處理和過濾沒有影響生物學(xué)活性或另外損害終產(chǎn)物。
本發(fā)明制備物的施用模式將確定生物體中化合物遞送的部位和/或細(xì)胞。通過本發(fā)明方法純化的化合物能單獨施用但通常與藥用載體或稀釋劑一起以混合物形式施用，載體或稀釋劑按照施用的預(yù)期途徑和標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)實踐選擇。制備物可經(jīng)胃腸外注射，例如，動脈內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。制備物也可通過口服、皮下或肌肉途徑遞送。對于胃腸外施用，它們可以以，例如，滅菌的、水溶液形式使用，其可含有其他溶劑，例如，足夠的鹽或葡萄糖以使溶液等滲。
對于口服施用，本發(fā)明純化的組合物能以片劑、膠囊、錠劑、粉劑、糖漿劑、酏劑、水溶液和懸浮液等等形式使用。在片劑情形中，可用的載體包括乳糖、檸檬酸鈉和磷酸鹽。各種崩解劑如淀粉，和潤滑劑如硬脂酸鎂通常在片劑中使用。對于膠囊形式的施用，有用的稀釋劑為乳糖和高分子量聚乙二醇。當(dāng)水溶液需要口服使用時，可加入一些甜味料和/或調(diào)味劑。
本發(fā)明基本上純化的制備物可施用于受試者如哺乳動物，包括人。對于疾患處理中的施用，處方醫(yī)師或獸醫(yī)將最終確定所給人或動物受試者的合適劑量，且這可根據(jù)體重、年齡和個體的應(yīng)答以及個體癥狀的性狀或嚴(yán)重性而不同。
在本發(fā)明基本上純化的抗-D免疫球蛋白的情形下，每劑劑量可在約300μg RhoGAM和約50μg MICRhoGAM的范圍，每種都按照指導(dǎo)和上述討論的目的以及各自的產(chǎn)品說明書施用。上述提及的每種制品也可以是多劑量的，總體施用由治療醫(yī)師確定。
本發(fā)明無朊病毒的制備物可包括生物物質(zhì)、藥劑、食品和飼料，且本發(fā)明的方法可在同樣的處理過程中使用。
各種專利和文獻(xiàn)作為參考貫穿本發(fā)明始終。此處將其內(nèi)容完整引入本發(fā)明作為參考，以使得更充分地描述本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)狀態(tài)和本發(fā)明所要求保護(hù)的內(nèi)容。
下列實施例的提供僅是為了說明的目的，而不能視作對本發(fā)明范圍的限制。
實施例實施例1-用凝集作用輔助劑的Rho(D)免疫球蛋白沉淀物II的生產(chǎn)該實施例描述了對人血漿分餾的方法以獲得在Rho(D)免疫球蛋白生產(chǎn)中使用的沉淀物II。
血漿單元(抗-D)(總共約943L)在2℃至8℃貯藏4天以融解。在不銹鋼水套罐中混合收集，5℃-10℃水循環(huán)通過。的血漿在1℃-3℃攪拌30分鐘。血漿加入以1000mL/min的速率連續(xù)流動的離心器中離心。冷的未溶解上清液(離心的血漿)收集在不銹鋼套罐中且攪拌至獲得均一的混合物。此時的批樣體積為905L的上清液(澄清的血漿)。
整批樣上清液的pH用2.172 L5.0N NaOH調(diào)至pH9.45。甲醇(71％)，160.185 L在-5.3℃加入pH已調(diào)節(jié)的批樣中。pH為9.37。該批樣可在-5.2℃存放13.5小時。終體積為1067.357L。
該批樣在-5.8℃加入以1000mL/min的速率連續(xù)流動的離心器中離心。上清液I收集在不銹鋼套管罐中，充分混合。沉淀物I作為醫(yī)療廢棄物棄去。上清液I通過加入3.132L，pH4.0的濃縮醋酸鈉緩沖液和627.444L 71％的甲醇調(diào)節(jié)pH。該批樣的溫度為-5.5℃，pH6.75。該批樣可存放14小時。
該批樣在-5.5℃加入以1000mL/min的速率連續(xù)流動的離心器中離心。沉淀物II+III轉(zhuǎn)移到不銹鋼罐中；收集到40.220KG凈重；凈重沉淀物II+III在+1.1℃下重懸入兩倍體積(L)注射用水，U.S.P.(80.440L)中，且攪拌4 5分鐘至獲得均一的懸浮液。加入三倍體積(120.660L)0.0187M磷酸氫二鈉且在2.1℃下攪拌30分鐘。
在不銹鋼套罐中，19倍體積(764.180L)注射用水，U.S.P.冷卻至1.0℃。使用高容量轉(zhuǎn)移泵，該批樣與19倍體積注射用水，U.S.P.緩慢混合，且攪拌30分鐘。
71％甲醇的體積調(diào)節(jié)至等于15倍沉淀物II+III的重量。甲醇(603.300L)冷卻至-14℃，且用不銹鋼Sparger設(shè)備和計數(shù)泵將甲醇加入批樣中同時逐漸降低溫度至-5.5℃。在甲醇加入完全后將批樣攪拌1小時。pH為7.23。批樣可存放10小時20分鐘。
通過在-5.8℃以500mL/min的速率連續(xù)流動的離心器中離心批樣而形成沉淀物III。沉淀物II+IIIw從盤中轉(zhuǎn)移入不銹鋼罐；凈重為22.760kg。
沉淀物II+IIIw在+1.3℃下重懸入兩倍體積(L)(45.520L)注射用水，U.S.P.中，且攪拌45分鐘至獲得均一的懸浮液。加入兩倍體積(45.520L)0.175M醋酸鈉且在1.4℃下攪拌30分鐘。全部批樣的pH通過加入0.489L pH4.0的醋酸鈉緩沖液于22.760L注射用水，U.S.P.中(總體積137.049L)，再將兩者加入到批樣中調(diào)節(jié)，且在1.5℃攪拌1小時。pH為5.38。在不銹鋼套罐中，將13.5倍體積(307.260L)注射用水，U.S.P.攪拌冷卻至2.5℃。使用高容量轉(zhuǎn)移泵，將該批樣與該注射用水混合，總計算體積為444.309L。NaCl(6.168L，1.33M)加入22.760Kg沉淀物II+III中，攪拌30分鐘。
71％甲醇的體積調(diào)節(jié)至等于8.78倍沉淀物II+III的重量。甲醇(199.833L)冷卻至-10.5℃，且甲醇用不銹鋼Sparger設(shè)備和計數(shù)泵加入批樣中同時逐漸降低溫度至-6.6℃。在甲醇加入完全后批樣攪拌1小時。pH為5.38。批樣可在-6.3℃存放8小時30分鐘。
沉淀物III的形成如下進(jìn)行該批樣在-6.3℃以500mL/min的速率連續(xù)流動的離心器中離心。上清液III收集在不銹鋼罐中。沉淀物III作為血廢棄物棄去。
上清液III的過濾如下進(jìn)行CUNO濾器90SP套包括(4)16sq.ft.筒，按照制造商的說明裝配。醋酸鈉-甲醇緩沖液(320L)冷卻至-6.5℃，且通過濾器筒過濾55分鐘。醋酸鈉-甲醇緩沖液洗滌溶液在開始前從濾器筒中完全吹出。該批樣用Cuno濾器90SP按照良好的制造實踐和使用制造商的說明書過濾。當(dāng)全部體積的上清液III過濾時，濾器筒中的壓力釋放。過濾的上清液III的體積為622L，且在中等速度攪拌。NaCl(1.33M，23.387mL)緩慢加入上清液III，在6.5℃攪拌30分鐘。pH為5.38，用4.840L1.0M碳酸氫鈉調(diào)節(jié)至7.10且混合30分鐘。等于0.166倍上清液III體積(103.252L)的甲醇(100％)用Sparger設(shè)備和計數(shù)泵加入到上清液III中且強(qiáng)力攪拌。PH為7.3。
沉淀物II的分餾如下進(jìn)行該批樣在-6.3℃以500mL/min的速率連續(xù)流動的離心器中離心且棄去上清液。干氮用于切斷供給線且干燥旋轉(zhuǎn)15分鐘。沉淀物II(7,420g)從離心盤轉(zhuǎn)入焦油化的不銹鋼罐中，在-22.1℃下貯存。該物質(zhì)在病毒清除過程中按照共同轉(zhuǎn)讓給VanHolten等的在2000.8.1公布的美國專利No.6,096,872的方法使用。
實施例2-從實施例1來的朊病毒的洗脫和檢測用于過濾通過上述實施例1的方法獲得的上清液III的Cuno深度過濾器上收集的朊病毒用下面實施例3的方法洗脫、定量和檢測。
尤其是，實施例1中使用的Cuno深度過濾墊從濾器套中去除且置于含有45ml 1.0M NaCl(洗脫緩沖液)的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿置于旋轉(zhuǎn)振蕩器上且輕輕渦動約20-30分鐘。去除濾器且用45ml 2.0M NaCl(洗脫緩沖液)第二次洗滌20-30分鐘。
對洗脫物PrPsc的蛋白質(zhì)印跡分析用源于1.0M NaCl洗脫緩沖液的洗脫物進(jìn)行，且用源于2.0M NaCl洗脫緩沖液的洗脫物單獨進(jìn)行第二個蛋白質(zhì)印跡分析，均按照實施例3的蛋白質(zhì)印跡方法進(jìn)行。
實施例3-免疫球蛋白制備物中PrPsc的去除和定量含有抗-D的上清液III(SupIII)(190mL)從全部的(約450升)修飾的Cohn-Oncley分餾物(Ortho-Clinical Diagnostics，Raritan N.J)中獲得(參見上述實施例1)。SupIII在-70℃貯存而在加入瘙癢病腦組織勻漿前于25℃融解，然后在-5.5℃--7.5℃平衡。
腦組織勻漿瘙癢病腦組織勻漿(10％)用263K倉鼠適合制劑感染的倉鼠腦制備。冷凍的腦(約3-20，每腦0.5克)在冰上融解，然后在9倍體積pH8.0的Tris緩沖鹽溶液中勻漿。勻漿通過在2-8℃1200r.c.f.下離心20分鐘澄清。百分之一(1％)的溶血卵磷脂加入上清液中至終濃度0.1％(w/v)。該物質(zhì)貯存于-70℃?zhèn)溆?。使用前，SBH在室溫水浴融解，然后用角質(zhì)杯進(jìn)行超聲波處理(Misonix Sonicator XL2020)(Heat Systems，F(xiàn)armingdale，N.Y.)約每毫升2分鐘直至溶液由渾濁變?yōu)榘胪该?。處理的勻漿隨后系列通過Millex25mm PVDF注射器驅(qū)動的過濾單元，(Millipore公司)0.45/0.22/0.1微米過濾器連續(xù)過濾，其進(jìn)一步使物質(zhì)澄清。從Cohn分餾過程來的上清液III(SupIII)(200mL)中摻入已過濾的SBH(1∶51稀釋)。第二組在深度過濾開始前經(jīng)過0.22微米濾器的過濾以去除任何可能在混合物中形成的凝集物(參見實施例5)。SHB樣品在處理前和超聲波處理及過濾后抽樣用于蛋白質(zhì)印跡評估。
過濾47mm CUNO Zeta Plus 90SP濾墊(Cuno公司，Meridan Conn.)置于其不銹鋼過濾套中。蠕動移液泵用于控制過濾的流量至約1ml/min的速率。整個濾器套置于隔離的氯化鈉冰浴中冷卻濾器至約-5.5℃至-7.5℃。醋酸鈉-甲醇緩沖液(80ml 0.01N醋酸鈉甲醇緩沖液，22.7％MeOH)在-5.5℃至-7.5℃用于洗滌濾器。SBH摻入的SupIII(180ml)在-5.5℃至-7.5℃以1.0ml/min的流速經(jīng)過CUNO濾器過濾。在過濾起始(75ml)、中間(75ml)和結(jié)束(30ml)等分收集濾液。在整個過濾時系統(tǒng)壓力得到監(jiān)控且為約2psi。
從濾器洗脫PrPsc過濾后，濾墊從濾器套去除，粗面向上，置于燒杯中且用45mL1.0MNaCl洗脫緩沖液通過在旋轉(zhuǎn)振蕩器上輕輕的渦動而洗滌20-30分鐘。去除濾器且用45ml 2.0M NaCl通過在旋轉(zhuǎn)振蕩器上輕輕的渦動而第二次洗滌20-30分鐘。通過在4℃下，100,000×g離心約1小時進(jìn)一步濃縮PrPsc是可能的，然而這不是必要的，因其已得到足夠的濃縮可用于蛋白質(zhì)印跡分析，如表1所示。
除了摻入SBH的SupIII首先經(jīng)過了Millex0.22微米濾器預(yù)過濾之外，第二組與第一組完全相同。
執(zhí)行對照組，冷卻過濾裝置至0℃且用80mLTBS洗滌深度濾墊。用已過濾的SBH(1∶51稀釋)摻入的TBS(180mL)在與前述相同的流速下過濾，隨后濾器被洗滌。參見實施例4。
對洗脫物PrPsc的蛋白質(zhì)印跡分析用源于1.0M NaCl洗脫緩沖液的洗脫物進(jìn)行，且用源于2.0M NaCl洗脫緩沖液的洗脫物單獨進(jìn)行第二個蛋白質(zhì)印跡分析，均按照下述蛋白質(zhì)印跡方法進(jìn)行。
參見表1，數(shù)據(jù)顯示，其中兩次洗脫后PrPsc顯示已從濾器上洗脫。蛋白質(zhì)印跡樣品制備樣品制備和測定方法按照Lee等.，J Virol Methods 2000；8477-89進(jìn)行。樣品用蛋白酶K消化步驟處理，其用于區(qū)分PrPsc和PrPc。蛋白酶K處理后，樣品在4℃ 20,000r.c.f.下離心1小時。沉淀物重懸于10μl每份2×十二烷基硫酸鈉(SDS)樣品緩沖液中且在100℃加熱5分鐘。在加入到凝膠用蛋白質(zhì)印跡法檢測PrPsc前制備半-對數(shù)連續(xù)稀釋液，所有的按照Lee等。(上述)測定按照上述Lee等的方法測定樣品。每個樣品在12％SDS-Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠上以125伏恒定電壓電泳60分鐘。凝膠在125mA恒定電流下向硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移60分鐘，隨后浸于TBS及在5％脫脂奶粉中封閉60分鐘。轉(zhuǎn)移和封閉后，膜在3F4單抗中孵育。洗滌后，膜暴露于堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗-鼠IgG二抗中。印跡隨后浸于CDP-Starplus NitroBlock II中，然后曝光在Kodak XAR-2膠片上。有效的測試通過在33kDa分子標(biāo)記處顯示條帶的陽性對照確定。一般，兩條小于33kDa的稍弱的條帶也可觀察到。三條帶一般為PrPRES的蛋白質(zhì)印跡圖像(上述，Lee等)。
結(jié)果超聲波處理和依次的膜過濾從SBH中去除了所有的渾濁物。隨后摻入SBH的免疫球蛋白制備物的深度過濾降低了濾液中PrPsc的濃度至低于蛋白質(zhì)印跡測定法的檢測限(表1)。大量PrPsc通過用高鹽溶液洗脫從濾墊回收。深度過濾前摻入SBH的SupIII經(jīng)過0.22微米濾器的過濾去除PrPsc至不可檢測的水平。摻入SBH的緩沖液對照的深度過濾很少或沒有去除PrPsc。
此處實施例3中，超聲波處理的SBH的膜過濾在SBH摻入的SupIII的深度過濾前進(jìn)行以確保深度過濾看到的顆粒大小不大于0.1微米。這對深度過濾將提出最大的挑戰(zhàn)且允許對PrPsc的去除機(jī)制進(jìn)行表征。SBH首先經(jīng)超聲波處理打碎PrPsc凝集物而促進(jìn)膜過濾。盡管有超聲波處理，還是有必要通過一系列逐漸變小的過濾器(0.45和0.22微米)連續(xù)過濾SBH而將0.1微米濾器的堵塞減到最小。
在摻入SBH的SupIII過濾后以及用1.0M和2.0MNacl溶液洗脫前的深度過濾器的檢查顯示少量物質(zhì)存在于深度過濾器表面。其被認(rèn)為是當(dāng)SBH加入SupIII時形成的沉淀物，由SupIII中存在的甲醇引起。為確定沉淀物是否包含PrPsc，執(zhí)行第二組，其中SBH摻入的SupIII在深度過濾前首先通過0.22微米濾器的預(yù)過濾。參見實施例6。預(yù)過濾去除PrPsc至不可檢測的水平，表明在前組中PrPsc是通過沉淀和機(jī)械過濾去除的，而不是通過吸附到深度濾器上。
表1通過蛋白質(zhì)印跡測定法測定摻入瘙癢病腦組織勻漿(SBH)的免疫球蛋白制備物中的PrPsc
*Log10降低系數(shù)為相對于過濾中在摻入量II中PrPRES的區(qū)別。
摻入加樣II為SBH摻入的免疫球蛋白(即.摻入加樣I)，其經(jīng)過0.22μm過濾以去除任何潛在的通過加入SBH至IgG形成的凝集物。
“＜”表明最大值；在任何濾液樣品中無PrPRES被檢測到。
實施例4-對照為確定在沉淀物醇缺乏時深度過濾是否去除了PrPsc，執(zhí)行一對照組，其中PrPsc摻入到水樣緩沖液且隨后被深度過濾。
實施例3的材料和方法重復(fù)進(jìn)行，其中同濃度和體積(3.6ml)的SBH摻入到180ml 0.1MTris緩沖鹽溶液(TBS)中。緩沖液對照中PrPsc去除的缺乏表明深度過濾沒有通過機(jī)械過濾的方式(因為PrPsc之前已通過0.1微米濾器)或靜電吸附保留蛋白。參見表1。
這些數(shù)據(jù)表明深度過濾去除PrPsc有效性的先前報道可能是誤導(dǎo)的。事實上，深度過濾確實去除PrPsc，但不是通過通常與深度過濾相關(guān)的吸附機(jī)制，而是通過沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)械過濾。這些研究結(jié)果表明單獨的深度過濾在去除PrPsc方面是無效的。然而，當(dāng)與在前的沉淀步驟聯(lián)合使用時，深度過濾或膜過濾對于從血漿分餾物中去除異常朊病毒蛋白是有效的機(jī)制。
實施例5-從濾器洗脫PrPsc實施例3中使用的濾墊從濾器套中去除且置于帶有45ml 1.0MNaCl(洗脫緩沖液)的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿置于旋轉(zhuǎn)振蕩器上且輕輕渦動約20-30分鐘。去除濾器且用45ml 2.0M NaCl(洗脫緩沖液)第二次洗滌20-30分鐘。
對洗脫物PrPsc的蛋白質(zhì)印跡分析用源于1.0M NaCl洗脫緩沖液的洗脫物進(jìn)行，且用源于2.0M NaCl洗脫緩沖液的洗脫物單獨進(jìn)行第二個蛋白質(zhì)印跡分析，均按照實施例3的蛋白質(zhì)印跡方法進(jìn)行。參見表1，數(shù)據(jù)顯示，其中兩次洗脫后PrPsc顯示已從濾器上洗脫。
實施例6-SBH在0.22微米濾器中的預(yù)過濾為確定實施例3的深度過濾步驟前濾器上觀察到的沉淀物是否包含PrPsc，執(zhí)行第二組，其中SBH摻入的SupIII在深度過濾前首先通過0.22微米濾器的預(yù)過濾。實施例3的材料和方法重復(fù)進(jìn)行，其中SBH摻入的SupIII在深度過濾前經(jīng)過0.22微米濾器的預(yù)過濾。參見表1，表明預(yù)過濾去除PrPsc至不可檢測的水平，表明在前組中PrPsc是通過沉淀和機(jī)械過濾去除的，而不是通過靜電吸附到深度濾器上。
實施例7-PrPsc從濾器的洗脫實施例6中使用的濾墊從濾器套中去除且置于帶有45ml 1.0MNaCl(洗脫緩沖液)的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿置于旋轉(zhuǎn)振蕩器上且輕輕渦動約20-30分鐘。去除濾器且用45ml 2.0M NaCl(洗脫緩沖液)第二次洗滌20-30分鐘。
對洗脫物PrPsc的蛋白質(zhì)印跡分析用源于1.0M NaCl洗脫緩沖液的洗脫物進(jìn)行，且用源于2.0M NaCl洗脫緩沖液的洗脫物單獨進(jìn)行第二個蛋白質(zhì)印跡分析，均按照實施例3的蛋白質(zhì)印跡方法進(jìn)行。
參見表1，數(shù)據(jù)顯示，其中兩次洗脫后PrPsc顯示已從濾器上洗脫。
實施例8-朊病毒從血樣品的清除牛全血(250ml)在100×g離心以去除紅細(xì)胞。得到的血漿與75ml 22.7％的甲醇混合以凝集朊病毒物質(zhì)?；旌衔镌谛D(zhuǎn)混合器上輕輕渦動5分鐘。混合物流經(jīng)由上述實施例3準(zhǔn)備的47mm Cuno ZetaPlus 90S濾器。隨后該物質(zhì)通過在5ml 1.0M NaCl-15mg/mL甘氨酸溶液中洗滌濾墊而洗脫用于蛋白質(zhì)印跡分析。隨著按照Lee等的提取和濃縮，0.5ml該物質(zhì)通過按照實施例3方法的蛋白質(zhì)印跡法得到分析。
上述方法導(dǎo)致測定法的檢測限提高超過100倍，目前達(dá)到傳染性測定法的檢測限。用現(xiàn)有技術(shù)中已有的方法，傳染性測定法需要數(shù)月才得到結(jié)果，其依賴于所研究的種類。本發(fā)明人還表明測定法可通過不需要G17洗脫而檢測膜上異常朊病毒的存在來簡化。
實施例9-朊病毒從尿樣品的清除人尿樣品(200ml)在3000rpm沉淀5分鐘以棄去偶爾的細(xì)胞碎片。尿樣與75ml 22.7％的甲醇混合以凝集朊病毒物質(zhì)?；旌衔镌谛D(zhuǎn)混合器上輕輕渦動5分鐘?；旌衔锪鹘?jīng)由上述實施例3準(zhǔn)備的47mm CunoZeta Plus 90S濾器。隨后該物質(zhì)通過在5ml 1.0M NaCl-15mg/mL甘氨酸溶液中洗滌濾墊而洗脫用于蛋白質(zhì)印跡分析。隨著按照Lee等的提取和濃縮，0.5ml該物質(zhì)通過按照實施例3方法的蛋白質(zhì)印跡法得到分析。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解前面的描述和實施例對實現(xiàn)本發(fā)明是例證性的，絕非限制性的。在不違背本發(fā)明范圍和精神下可以作出對此處所呈現(xiàn)細(xì)節(jié)的變動。
權(quán)利要求
1.從含有生物或食品制品的水樣液體中去除朊病毒的方法，其包括(a)使水樣液體和一種或多種凝集作用輔助劑混合；和(b)通過濾器過濾步驟(a)的混合物由此去除朊病毒蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，其中朊病毒蛋白為正常朊病毒蛋白、異常感染性朊病毒蛋白，或正常和異常感染性朊病毒蛋白的混合物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中生物制品選自全血，血液組分，尿，CSF，包含白蛋白、免疫球蛋白及其片段的液體，凝血因子如因子IX、凝血酶、纖連蛋白、纖維蛋白原、因子VIII、II、VII、IX、X、XI、XIII，血紅素，α-2-巨球蛋白，半抗原球蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，載脂蛋白，蛋白C，蛋白S，C-1-酯酶抑制劑，酶，間-α-胰蛋白酶抑制劑，生長激素和馮·威利布蘭德因子。
4.權(quán)利要求1的方法，其中食品包含食物和飲料。
5.權(quán)利要求3的方法，其中血液組分包含血清和血漿。
6.權(quán)利要求3的方法，其中免疫球蛋白為多克隆的或單克隆的。
7.權(quán)利要求6的方法，其中免疫球蛋白為IgG。
8.權(quán)利要求7的方法，其中IgG免疫球蛋白為IgG抗-D免疫球蛋白。
9.權(quán)利要求8的方法，其中權(quán)利要求8的IgG免疫球蛋白在包含約4.0％至6.0％重量比的免疫球蛋白和約80至200ppm聚山梨酯80的藥物組合物中。
10.權(quán)利要求3的方法，其中一種或多種凝集作用輔助劑混合在一起或依次使用。
11.權(quán)利要求10的方法，其中一種或多種凝集作用輔助劑包含低介電常數(shù)的有機(jī)溶劑。
12.權(quán)利要求11的方法，其中有機(jī)溶劑選自丙酮和水易溶的醇。
13.權(quán)利要求11的方法，其中有機(jī)溶劑選自乙醇、甲醇、異丙基、異丙醇、n-丙醇、異丙醚、酮和醛。
14.權(quán)利要求13的方法，其中醇為濃度為約2％至約100％的乙醇或甲醇。
15.權(quán)利要求10的方法，其中一種或多種凝集作用輔助劑選自硫酸胺、辛酸、三氯乙酸(TCA)、雙醛、雜多酸、乳酸鹽單水合物(C18H21N3O4H2O)，以及金屬離子Cu2+、Ni、Zn和Ag。
16.權(quán)利要求10的方法，其中當(dāng)朊病毒蛋白包含異常朊病毒蛋白時，一種或多種凝集作用輔助劑為復(fù)合劑。
17.權(quán)利要求16的方法，其中復(fù)合劑選自雜多鉬酸鹽、雜多鎢酸鹽、磷酸鎢酸鈉(NaPTA)、抗體、酶和肽。
18.權(quán)利要求10的方法，其中濾器為膜或深度過濾器。
19.權(quán)利要求18的方法，其中濾器為深度過濾器。
20.權(quán)利要求18的方法，其中濾器具有的孔徑能使小于約6μm的產(chǎn)生滯留。
21.權(quán)利要求20的方法，其中濾器具有的孔徑能使約0.6至約1.5微米的產(chǎn)生滯留。
22.權(quán)利要求19的方法，其中深度濾器具有的孔徑能使小于約0.6μm的產(chǎn)生滯留。
23.權(quán)利要求22的方法，其中生物蛋白從其起始生物狀態(tài)的回收基本上維持至少超過約50％的水平。
24.權(quán)利要求22的方法，其中異常感染性朊病毒蛋白可達(dá)到至少約102.5的程度。
25.基本上純的藥物組合物，其包含按照權(quán)利要求24的方法制備的用于注射的異常感染性朊病毒清除的免疫球蛋白。
26.權(quán)利要求25的基本上純的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白為IgG抗-D免疫球蛋白。
27.權(quán)利要求26的基本上純的IgG抗-D免疫球蛋白，其中IgG抗-D免疫球蛋白在包含約4.0％至6.0％重量比的免疫球蛋白和約80至200ppm聚山梨酯80的藥物組合物中。
28.從全血中去除朊病毒蛋白的方法，其包括(a)臨床離心血液以由此分離紅細(xì)胞和血小板；(b)從紅細(xì)胞和血小板傾析出步驟(a)離心的上清液；(c)使上清液和一種或多種凝集作用輔助劑混合；(d)通過膜或深度過濾器過濾步驟(c)的混合物，由此從濾液中去除朊病毒蛋白；和(e)將步驟(a)分離的紅細(xì)胞和血小板加回濾液中。
29.權(quán)利要求28的方法，其中凝集作用輔助劑混合在一起或依次使用。
30.權(quán)利要求29的方法，其中一種或多種凝集作用輔助劑包含低介電常數(shù)的有機(jī)溶劑。
31.權(quán)利要求30的方法，其中有機(jī)溶劑選自丙酮和水易溶的醇。
32.權(quán)利要求30的方法，其中有機(jī)溶劑選自乙醇、甲醇、異丙基、異丙醇、n-丙醇、異丙醚、酮和醛。
33.權(quán)利要求32的方法，其中醇為濃度為約2％至約100％的乙醇或甲醇。
34.權(quán)利要求29的方法，其中一種或多種凝集作用輔助劑選自硫酸胺、辛酸、三氯乙酸(TCA)、雙醛、雜多酸、乳酸鹽單水合物(C18H21N3O4H2O)，以及金屬離子Cu2+、Ni、Zn和Ag。
35.權(quán)利要求28的方法，其中當(dāng)朊病毒蛋白包含異常朊病毒蛋白時，一種或多種凝集作用輔助劑為復(fù)合劑。
36.權(quán)利要求35的方法，其中復(fù)合劑選自雜多鉬酸鹽、雜多鎢酸鹽、磷酸鎢酸鈉(NaPTA)、抗體、酶和肽。
37.權(quán)利要求28的方法，其中濾器為膜或深度過濾器。
38.權(quán)利要求37的方法，其中濾器為深度過濾器。
39.權(quán)利要求38的方法，其中濾器具有的孔徑能使小于約6μm的產(chǎn)生滯留。
40.權(quán)利要求39的方法，其中濾器具有的孔徑能使約0.6至約1.5微米的產(chǎn)生滯留。
41.權(quán)利要求38的方法，其中深度過濾使用具有的孔徑能使小于約0.6μm的產(chǎn)生滯留的深度濾器進(jìn)行。
42.一種用于生物或食品制品的水樣液體中與TSEs相關(guān)的異常感染性朊病毒蛋白的捕獲、洗脫、濃縮和定量的方法，其包括(a)使水樣液體和一種或多種凝集作用輔助劑混合；(b)通過濾器過濾步驟(a)的混合物由此去除朊病毒蛋白；(c)從濾器洗脫朊病毒；和(d)用測定法定量異常朊病毒蛋白。
43.權(quán)利要求42的方法，其中生物制品選自全血，血液組分，尿，CSF，包含白蛋白、免疫球蛋白及其片段的液體，凝血因子如因子IX、凝血酶、纖連蛋白、纖維蛋白原、因子VIII、II、VII、IX、X、XI、XIII，血紅素，α-2-巨球蛋白，半抗原球蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，載脂蛋白，蛋白C，蛋白S，C-1-酯酶抑制劑，酶，間-α-胰蛋白酶抑制劑，生長激素和馮·威利布蘭德因子。
44.權(quán)利要求42的方法，其中食品包含食物和飲料。
45.權(quán)利要求43的方法，其中血液組分包含血清和血漿。
46.權(quán)利要求43的方法，其中免疫球蛋白為多克隆的或單克隆的。
47.權(quán)利要求46的方法，其中免疫球蛋白為IgG。
48.權(quán)利要求47的方法，其中IgG免疫球蛋白為IgG抗-D免疫球蛋白。
49.權(quán)利要求48的方法，其中權(quán)利要求48的IgG抗-d免疫球蛋白在包含約4.0％至6.0％重量比的免疫球蛋白和約80至200ppm聚山梨酯80的藥物組合物中。
50.權(quán)利要求42的方法，其中一種或多種凝集作用輔助劑混合在一起或依次使用。
51.權(quán)利要求50的方法，其中一種或多種凝集作用輔助劑包含低介電常數(shù)的有機(jī)溶劑。
52.權(quán)利要求51的方法，其中有機(jī)溶劑選自丙酮和水易溶的醇。
53.權(quán)利要求51的方法，其中有機(jī)溶劑選自乙醇、甲醇、異丙基、異丙醇、n-丙醇、異丙醚、酮和醛。
54.權(quán)利要求53的方法，其中醇為濃度為約2％至約100％的乙醇或甲醇。
55.權(quán)利要求50的方法，其中一種或多種凝集作用輔助劑選自硫酸胺、辛酸、三氯乙酸(TCA)、雙醛、雜多酸、乳酸鹽單水合物(C18H21N3O4H2O)，以及金屬離子Cu2+、Ni、Zn和Ag。
56.權(quán)利要求50的方法，其中當(dāng)朊病毒蛋白包含異常朊病毒蛋白時，一種或多種凝集作用輔助劑為復(fù)合劑。
57.權(quán)利要求56的方法，其中復(fù)合劑選自雜多鉬酸鹽、雜多鎢酸鹽、磷酸鎢酸鈉(NaPTA)、抗體、酶和肽。
58.權(quán)利要求50的方法，其中濾器為膜或深度過濾器。
59.權(quán)利要求58的方法，其中濾器為深度過濾器。
60.權(quán)利要求58的方法，其中濾器具有的孔徑能使小于約6μm的產(chǎn)生滯留。
61.權(quán)利要求60的方法，其中濾器具有的孔徑能使約0.6至約1.5微米的產(chǎn)生滯留。
62.權(quán)利要求59的方法，其中深度濾器具有的孔徑能使小于0.6μm的產(chǎn)生滯留。
63.權(quán)利要求62的方法，其中生物蛋白從其起始生物狀態(tài)的回收基本上維持至少超過約50％的水平。
64.權(quán)利要求62的方法，其中異常感染性朊病毒蛋白可達(dá)到至少102.5的程度。
65.權(quán)利要求42的方法，其中洗脫包含用洗脫緩沖液對濾器的溫和洗滌。
66.權(quán)利要求65的方法，其中洗脫緩沖液包含高滲溶液。
67.權(quán)利要求66的方法，其中高滲溶液包含高滲鹽溶液。
68.權(quán)利要求67的方法，其中高滲鹽溶液選自1.0-2.0M NaCl緩沖液，和濃度為約1.0M至約2.0M的醋酸鈉-甲醇緩沖液。
69.權(quán)利要求42的方法，其另外在步驟(c)和(d)之間包含一附加步驟，其包括濃縮洗脫緩沖液中的朊病毒至適于用已有的測定法定量的數(shù)量。
70.權(quán)利要求69的方法，其中步驟(c)和(d)之間的濃縮步驟包含離心洗脫緩沖液中的朊病毒。
71.權(quán)利要求42的方法，其中定量步驟(d)包含使用有效的測定法，其選自ELISA、SDS-Page、蛋白質(zhì)印跡法、EG&G Wallac、DELFIA、Prionics測定法、Enfer ELC ELISA、CEA ELISA、構(gòu)象依賴的測定法、DELFIA和毛細(xì)管電泳。
72.權(quán)利要求42的方法，其中定量步驟(d)包含使用抗體測定法，其使用朊病毒抗體6H4、3F4、16A18或12A5。
73.從包含IgG抗-D免疫球蛋白的水樣藥物組合物中去除朊病毒蛋白的方法，其中藥物組合物包含約4.0％至6.0％重量比的免疫球蛋白，和約80至200ppm的聚山梨酯80，其包括(a)使水樣組合物和約2％至約10％的甲醇混合；和(b)通過具有的孔徑能使小于約0.6μm的產(chǎn)生滯留的深度濾器過濾步驟(a)的混合物，由此去除朊病毒蛋白，其中生物蛋白從其起始生物狀態(tài)的回收基本上維持至少超過約50％的水平，且其中異常感染性朊病毒蛋白可達(dá)到至少約102.5的程度。
74.基本上純的藥物組合物，其包含按照權(quán)利要求73的方法制備的用于注射的異常感染性朊病毒清除的免疫球蛋白。
75.從全血去除朊病毒蛋白的方法，其包括(a)臨床離心血液以由此分離紅細(xì)胞和血小板；(b)從紅細(xì)胞和血小板傾析出步驟(a)離心的上清液；(c)使上清液和甲醇混合；(d)通過具有的孔徑能使約0.6至約1.5微米的產(chǎn)生滯留的深度過濾器過濾步驟(c)的混合物，由此從濾液中去除朊病毒蛋白；和(e)將步驟(a)分離的紅細(xì)胞和血小板加回濾液中。
全文摘要
用于制備生物溶液如基本上無異常朊病毒蛋白的免疫球蛋白和尤其是由此獲得的抗－D免疫球蛋白的方法。特別提供用于朊病毒凝集和生物溶液深度過濾以捕獲和去除異常以及如果需要，正常朊病毒蛋白的方法。朊病毒蛋白可隨后從深度過濾器和濾器洗滌物中洗脫以及濃縮至足以達(dá)到已有測定法能檢測的程度。
文檔編號A61L2/00GK1671293SQ03817437
公開日2005年9月21日 申請日期2003年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月23日
發(fā)明者R·W·范霍爾滕, S·M·奧滕里思 申請人:奧索臨床診斷有限公司