專利名稱：Hmgb1在治療組織損傷和/或促進(jìn)組織修復(fù)中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
HMGB1(高遷移1組蛋白)既是一種核因子也是一種分泌蛋白質(zhì)。在細(xì)胞核中，它作為一種結(jié)構(gòu)染色質(zhì)結(jié)合因子，可以結(jié)合DNA并促進(jìn)特定DNA靶標(biāo)上的蛋白質(zhì)裝配(Bustin，Mol.Cell.Biol.，19，5237-5246，1999)。在細(xì)胞外，它與RAGE(高級糖基化終產(chǎn)物的受體)高親和力結(jié)合(Hori等人，J.Biol.Chem.270，25752-25761，1995)，是炎癥的一種有效介質(zhì)(Wang等人，Science 285，248-251，1999；Abraham等人，J.Immunol.，165，2950-2954，2000；Andersson等人，J.Exp.Med.，192，565-570，2000)。HMGB1由激活的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞主動(dòng)分泌(Wang等人，Science 285，248-251，1999)，由壞死或損傷的細(xì)胞被動(dòng)分泌(Degryse等人，J.Cell Biol.1521197-2006，2001；Müller等人EMBO J.，16，4337-4340，2001；Falciola等人，J.Cell Biol.137，19-26，1997)。
Wang等人(Science，285，248-251，1999)確定HMGB1是小鼠內(nèi)毒素致死的一種晚期介質(zhì)。他們證實(shí)LPS、TNF或IL-1刺激的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞分泌HMGB1，作為一種遲發(fā)型應(yīng)答。在小鼠中，施用抗HMGB1抗體可緩解LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥；相反，注射HMGB1導(dǎo)致中毒性休克。而且，膿毒癥患者顯示血清HMGB1水平升高，它與感染的嚴(yán)重程度相關(guān)(US 6,303,321；WO 00/47104)。
隨后，當(dāng)氣管內(nèi)施用HMGB1時(shí)，表明它也能夠引起急性肺炎癥(Abraham等人，J.Immunol.，165，2950-2954，2000)。抗HMGB1抗體減少肺水腫和嗜中性粒細(xì)胞遷移，而它們不能降低其它促炎細(xì)胞因子TNFα、IL-1β或巨噬細(xì)胞-炎癥-蛋白-2(MIP2)的水平。在免疫與神經(jīng)內(nèi)分泌s-系統(tǒng)之間建立重要聯(lián)系的垂體細(xì)胞，響應(yīng)特定刺激(如TNFα和IL-1β)釋放HMGB1，提示HMGB1也參與神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)和對炎癥過程的免疫應(yīng)答(Wang等人，Surgery，126，389-392，1999)。然而，大多數(shù)細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞、腎上腺細(xì)胞或腎細(xì)胞)不能分泌HMGB1。
Wang和Andersson的研究小組研究的現(xiàn)象來自于特定細(xì)胞主動(dòng)(如果未常規(guī))分泌HMGB1，該細(xì)胞對促炎細(xì)胞因子的特異性刺激起反應(yīng)。HMGB1分泌需要在細(xì)胞刺激后至少16個(gè)小時(shí)，因此是炎癥中的一個(gè)晚期事件。因此分泌的HMGB1的作用在于加強(qiáng)及延長由其它一些事件啟動(dòng)的炎癥。
相反，作者現(xiàn)在證明壞死細(xì)胞釋放的HMGB1可以是炎癥應(yīng)答的初始觸發(fā)劑，釋放的HMGB1本身能夠激活炎癥細(xì)胞。HMGB1釋放和擴(kuò)散能夠在大約數(shù)秒或數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生，因此是炎癥中的一個(gè)極早期事件。因此某些細(xì)胞型未死亡時(shí)即可分泌HMGB1的能力肯定是一種類型的分子模擬這些細(xì)胞已形成了分泌相同分子的能力，該分子的細(xì)胞外存在發(fā)出組織損傷的信號。
本發(fā)明的作者報(bào)告，Hmgb1-/-壞死細(xì)胞促進(jìn)炎癥的能力大大降低，證明HMGB1的釋放能夠?qū)⒁粋€(gè)細(xì)胞死亡的信號傳送給它的鄰居，并且將組織損傷的信號傳送給該生物的其它部分。而且，凋亡細(xì)胞不釋放HMGB1，甚至在經(jīng)歷二次壞死和部分自溶后仍然如此，因此，即使不被吞噬細(xì)胞快速清除，也不能促進(jìn)炎癥。在凋亡細(xì)胞中，由于普遍的染色質(zhì)修飾，HMGB1與染色質(zhì)緊密結(jié)合，如果染色質(zhì)脫乙酰作用被阻止，則釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中(促進(jìn)炎癥)。因此，經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞被編程(programmed)，阻止由于損傷而被破壞或殺死的細(xì)胞的信號傳播。因此，盡管HMGB1是染色質(zhì)中的一種富含成分，但是它也具有作為一種可溶性細(xì)胞外蛋白質(zhì)的作用。
可以設(shè)想以下的事件順序壞死→初步HMGB1釋放→炎癥細(xì)胞激活→細(xì)胞因子分泌→炎癥細(xì)胞的進(jìn)一步激活和募集(recruitment)→炎癥細(xì)胞分泌HMGB1→繼續(xù)分泌細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞進(jìn)一步激活和募集的循環(huán)。
這種循環(huán)產(chǎn)生正反饋，以及強(qiáng)烈的炎癥應(yīng)答。這種循環(huán)必須在某一點(diǎn)被打破，以中斷炎癥應(yīng)答。
除了觸發(fā)炎癥以外，HMGB1還激活組織保護(hù)或修復(fù)的另外一些系統(tǒng)。在本發(fā)明中證實(shí)，HMGB1能夠促進(jìn)功能在于修復(fù)組織損傷的細(xì)胞的遷移和增殖。這些細(xì)胞中最重要的是干細(xì)胞。作為干細(xì)胞募集和增殖的一個(gè)例子，作者已經(jīng)證明了對血管結(jié)合干細(xì)胞中胚層成血管細(xì)胞(mesoangioblast)的體外和體內(nèi)作用。
HMGB1作為組織損傷信號的直接實(shí)際應(yīng)用的一個(gè)例子是，作者們研究了心臟梗死后心肌組織的再生和功能恢復(fù)。
HMGB1有利地促進(jìn)梗死心臟的再生和功能恢復(fù)。心肌梗死導(dǎo)致組織損失和心功效減弱?，F(xiàn)代心臟病學(xué)的主要治療目標(biāo)之一是設(shè)計(jì)旨在最小化心肌壞死和在心肌梗死后優(yōu)化心臟修復(fù)的策略。盡管骨髓細(xì)胞向梗死區(qū)移植和轉(zhuǎn)移已經(jīng)獲得有希望的結(jié)果(Orlic等人，Circ Res.27，1092-1102，2002)，但是調(diào)節(jié)干細(xì)胞向組織損傷區(qū)歸巢(homing)的信號至今尚未很好地表征。
WO02/074337公開了HMGB1可能在結(jié)締組織再生中起作用。結(jié)締組織細(xì)胞與本發(fā)明的靶細(xì)胞在胚胎學(xué)上無關(guān)。
WO00/47104要求專利保護(hù)一種藥物組合物，其用于治療特征在于炎癥細(xì)胞因子級聯(lián)激活的疾病，如膿毒癥和肥胖癥，該組合物包含有效量的HMG-1的拮抗劑或抑制劑。
發(fā)明描述因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是一種組合物，其含有有效量的HMGB1蛋白或其功能部分，或表達(dá)HMGB1的載體，用于治療組織損傷和/或促進(jìn)組織修復(fù)和再生。優(yōu)選地，組織再生取決于與損傷細(xì)胞相同類型的細(xì)胞的生長，因此不包括結(jié)締組織生長替換損失的組織。更優(yōu)選地，該組織是心肌或骨骼肌。
在本發(fā)明的一個(gè)具體方面，組織修復(fù)和/或再生包括壞死區(qū)，優(yōu)選地創(chuàng)傷部位、缺血部位，包括梗死的心臟、燒傷部位的修復(fù)和/或再生。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，該組合物還包含有效量的抗炎劑。本領(lǐng)域?qū)＜覍⑦x擇最合適的抗炎劑。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，該組合物還包含稀釋劑和/或佐劑，用于在組織修復(fù)部位灌注。此外，該組合物還包含稀釋劑和/或佐劑和/或載體，用于肌肉內(nèi)注射。
在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的方面，該組合物與干細(xì)胞，優(yōu)選地與中胚層成血管細(xì)胞結(jié)合。
本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案是一種組合物，其包含有效量的HMGB1蛋白的拮抗劑，用于治療壞死組織誘導(dǎo)的不良反應(yīng)，如骨髓細(xì)胞的募集和激活，內(nèi)皮屏障功能的喪失，水腫。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，壞死組織是指腸梗阻、急性胰腺炎和大面積創(chuàng)傷。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，壞死組織誘導(dǎo)的不良反應(yīng)包括壞死的長期效應(yīng)，如膿毒癥和多器官衰竭。
本領(lǐng)域?qū)＜艺J(rèn)為，術(shù)語“HMGB1拮抗劑”包括但不限于HMGB1抗體及其功能重組或合成部分、干擾RNA、反義RNA、合成或天然調(diào)節(jié)劑。
在一個(gè)具體方面，該組合物最好在壞死事件發(fā)生后16小時(shí)內(nèi)施用。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面是促進(jìn)干細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中或在體內(nèi)遷移和/或增殖的一種方法，該方法包括使這些細(xì)胞暴露于有效量的HMGB1蛋白或其功能部分的步驟。優(yōu)選地，干細(xì)胞是定居(resident)的心臟或循環(huán)干細(xì)胞。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面是促進(jìn)心肌細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中或在體內(nèi)增殖的一種方法，該方法包括使這些細(xì)胞暴露于有效量的HMGB1蛋白或其功能部分的步驟。
發(fā)明詳述作者證實(shí)HMGB1由壞死細(xì)胞釋放，但是凋亡細(xì)胞不釋放。這樣，HMGB1能夠發(fā)出組織損傷的信號，因?yàn)榻M織損傷產(chǎn)生非編程細(xì)胞死亡(壞死)。
壞死細(xì)胞(在大約數(shù)秒或數(shù)分鐘內(nèi))釋放的HMGB1的第一個(gè)效應(yīng)是附近細(xì)胞的激活，內(nèi)皮屏障功能的喪失，骨髓細(xì)胞的募集和激活，和炎癥的觸發(fā)。作為一種更遲發(fā)的應(yīng)答，(壞死細(xì)胞直接釋放的，或者激活的炎癥細(xì)胞主動(dòng)分泌的)HMGB1將促進(jìn)某些細(xì)胞型，包括干細(xì)胞，向組織損傷部位遷移，以及它們的增殖。
具體而言，當(dāng)用HMGB1刺激時(shí)，成年和胚胎血管相關(guān)干細(xì)胞(中胚層成血管細(xì)胞)增殖。HMGB1也能夠誘導(dǎo)中胚層成血管細(xì)胞遷移，以及通過內(nèi)皮屏障移行(transmigration)。在體內(nèi)，含有注射到脛骨肌內(nèi)的HMGB1的肝素珠能夠吸引攜帶注射到股動(dòng)脈內(nèi)的核lacZ的中胚層成血管細(xì)胞。
體內(nèi)數(shù)據(jù)表明，HMGB1促進(jìn)梗死心臟的再生。實(shí)際上，HMGB1誘導(dǎo)新形成的肌細(xì)胞進(jìn)入梗死的心臟。新形成的組織通過蘇木精和伊紅染色可見，表達(dá)心臟分子標(biāo)記物，如α-肌節(jié)肌動(dòng)蛋白、間隙連接蛋白4、MEF2等。新形成的組織高度增生，如Ki67的表達(dá)所見。因此HMGB1誘導(dǎo)梗死心臟中心肌細(xì)胞的增殖和分化。而且，如根據(jù)超聲心動(dòng)圖和血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)檢驗(yàn)的，HMGB1處理的心臟的心肌功能增強(qiáng)。
HMGB1對缺血心臟恢復(fù)的影響可能是由于心臟中存在的定居心臟干細(xì)胞的募集/增殖，和/或循環(huán)干細(xì)胞的募集/增殖，和/或心肌細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)。
HMGB1誘導(dǎo)的心臟組織再生及其對心肌功能恢復(fù)的影響與直接注射到心臟內(nèi)的造血干細(xì)胞(HSC)移植后觀察到的相當(dāng)(Orlic等人，Nature，410，701-705，2001)。本發(fā)明顯示了在治療心肌梗死中使用的一種可能的新方法。
HMGB1可以單獨(dú)(或者與細(xì)胞治療聯(lián)合)用于所有類型的組織再生。與基于干細(xì)胞的再生方法相比，這是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，基于干細(xì)胞的再生方法需要GMP提取和擴(kuò)增，經(jīng)歷移植排斥/免疫應(yīng)答，需要生物倫理學(xué)批準(zhǔn)，不易包裝到工業(yè)產(chǎn)品內(nèi)。
HMGB1可具有誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖的獨(dú)特能力，因而對于幾種心臟疾病具有治療用途。
HMGB1可以作為一種重組蛋白施用，該重組蛋白注射到鄰近梗死的收縮壁中或脛骨肌的肝素珠中。然而，由于蛋白質(zhì)的平均壽命較短，施用方案可能需要高劑量或重復(fù)劑量才能達(dá)到治療效果。因此，方便地能夠使用一種基因治療方法。編碼HMGB1的核酸可以被適當(dāng)?shù)妮d體(質(zhì)粒、病毒)攜帶到細(xì)胞內(nèi)。
劑量也是要嚴(yán)格控制的一個(gè)因素，因?yàn)镠MGB1是一種炎癥分子。在當(dāng)前關(guān)于局部缺血的研究中，將200ng蛋白質(zhì)注射到鄰近梗死的活心肌的前面和后面。該劑量比全身炎癥所需的劑量低大約2000倍。
圖例現(xiàn)在將參照下列附圖描述本發(fā)明

圖1活和死亡HeLa細(xì)胞中HMGB1的染色質(zhì)結(jié)合。培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基(S)與細(xì)胞(P)一起通過SDS-PAGE分析。組蛋白通過考馬斯藍(lán)染色顯示，HMGB1通過免疫印跡顯示或者用抗HMGB1抗體免疫染色，DNA用DAPI染色。定標(biāo)線條，7.5μm。a，表達(dá)HMGB1-GFP的活細(xì)胞，通過鑒別干涉相差并且在綠色熒光中成像。b，分裂間期細(xì)胞，透化之后。c，壞死細(xì)胞，未透化。培養(yǎng)基中HMGB1的含量與壞死細(xì)胞的數(shù)量成比例(約50％)。d，凋亡細(xì)胞，透化。e，經(jīng)歷凋亡和二次壞死的細(xì)胞釋放HMGB1和乳酸脫氫酶(LDH)的動(dòng)力學(xué)。
圖2活和凋亡細(xì)胞中的HMGB1動(dòng)力學(xué)。定標(biāo)線條，2.3μm(a，b)和3.7μm(e，f)。分裂間期細(xì)胞中HMGB1-GFP的FLIP成像(a)和定量(c)。圓形所示的區(qū)域反復(fù)漂白，細(xì)胞在漂白脈沖之間成像。鄰近的細(xì)胞核未受影響。有絲分裂細(xì)胞的FLIP成像(b)和定量(d)。在細(xì)胞質(zhì)(圓形)中進(jìn)行漂白，對細(xì)胞質(zhì)中的不同斑點(diǎn)或者對凝聚染色體上的斑點(diǎn)進(jìn)行定量。凋亡細(xì)胞中(e)以及在200ng/ml TSA存在下經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞中(f)的FLIP成像，以及它們的定量(g)。h，活和凋亡細(xì)胞中GFP-HMGN2的FLIP定量。
圖3凋亡中發(fā)生的染色質(zhì)改變產(chǎn)生HMGB1的結(jié)合底物。定標(biāo)線條，9.5μm。a，b細(xì)菌產(chǎn)生的HMGB1(用Cy5標(biāo)記的，a，或者未標(biāo)記的，b)結(jié)合凋亡Hmgb1-/-成纖維細(xì)胞的染色質(zhì)，而不結(jié)合非凋亡成纖維細(xì)胞的染色質(zhì)，如通過顯微鏡檢查(a)或Western印跡(b)所顯示的。組蛋白通過考馬斯藍(lán)染色顯示。c，DNA斷裂不會引起HMGB1與凋亡核結(jié)合。誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞(表達(dá)ICAD的一種標(biāo)記形式，或者對照)凋亡(凋亡的，第2、4道)或者模擬處理(活的，第1、3道)。凋亡中的ICAD被胱天肽酶(caspase)酶切，并且丟失FLAG標(biāo)簽(Western，抗FLAG抗體；第4道)。瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)凋亡的野生型細(xì)胞中染色體DNA的核小體間切割(第2道)，及其在表達(dá)ICAD的凋亡細(xì)胞中的抑制(第4道)。透化表達(dá)ICAD的凋亡細(xì)胞，固定，對DNA、HMGB1和TUNEL染色。當(dāng)所有細(xì)胞都是TUNEL陰性時(shí)，HMGB1穩(wěn)定地保留在顯示染色質(zhì)凝聚的細(xì)胞核內(nèi)(右上角)。d，來自約500萬個(gè)活和凋亡HeLa細(xì)胞的總提取物進(jìn)行二維電泳，并用抗HMGB1抗體進(jìn)行免疫印跡?？梢奌MGB1的多種乙酰化形式，但是在兩種樣品之間檢測不到差異。e，凋亡細(xì)胞中的組蛋白H4被低乙酰化(hypoacetylated)。用R10抗體(H4的乙?；问教禺惖?進(jìn)行免疫印跡。
圖4 HMGB1釋放促進(jìn)免疫應(yīng)答。a，缺乏HMGB1的壞死細(xì)胞不引發(fā)單核細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子TNF-α。線條代表標(biāo)準(zhǔn)差(n＝3)。b，經(jīng)歷二次壞死和部分自溶的凋亡細(xì)胞不促進(jìn)炎癥應(yīng)答，除非通過TSA處理固定HMGB1。該實(shí)驗(yàn)一式兩份重復(fù)3次，用2種不同含量的凋亡細(xì)胞確保TNF-α產(chǎn)生的線性。對于用0.2×105凋亡細(xì)胞攻擊后添加的TNF-α的量，將數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化為數(shù)值1。c，抗HMGB1抗體減少撲熱息痛(AAP)超劑量損傷的肝臟的炎癥。9個(gè)小時(shí)后估計(jì)肝損傷(血清中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性)和炎癥細(xì)胞募集(總肝臟提取物中的髓過氧化物酶活性)。MPO/ALT比表示對肝損傷標(biāo)準(zhǔn)化的炎癥。每個(gè)點(diǎn)代表一只小鼠，線條代表平均值，灰色陰影代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)所含的面積。小鼠組之間的成對比較(Mann-Whitney檢驗(yàn))用箭頭表示。
圖5對雄蕊(staminal)細(xì)胞的HMGB1趨化性測定。趨化性測定使用改良Boyden室進(jìn)行。數(shù)值1對應(yīng)于在沒有任選刺激劑的情況下遷移(隨機(jī)細(xì)胞遷移)的細(xì)胞數(shù)量。數(shù)據(jù)表示平均值±SE。在ANOVA模型中，結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性為P＜0.0001。用HMGB1+抗HMGB1處理獲得與未刺激的對照在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有不同的結(jié)果。單獨(dú)用抗HMG1抗體或者用一種非特異性抗體處理D18細(xì)胞與未刺激的對照也難以區(qū)別。
圖6在HMGB1存在下雄蕊細(xì)胞的生長曲線。將5×104D18細(xì)胞平板接種于3cm孔中，在補(bǔ)充20％胎牛血清(FBS)的RPMI中培養(yǎng)，37℃5％CO224小時(shí)。然后將培養(yǎng)基替換為RPMI(無血清)，16小時(shí)。隨后將培養(yǎng)基替換為只含RPMI、含有RPMI+20％FBS和RPMI+指定濃度HMGB1(無血清)的新鮮培養(yǎng)基。在指定時(shí)間(第1、2、3天)收集細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。單獨(dú)RPMI中的細(xì)胞不分裂，而RPMI+HMGB1中的細(xì)胞活躍分裂至少24小時(shí)，然后由于養(yǎng)分耗盡較緩慢地分裂。但是在第3天，通過顯微鏡檢查估計(jì)，含有HMGB1(所有濃度)刺激的D18細(xì)胞的所有平板均含有一些分裂的細(xì)胞。
圖7 HMGB1對胚胎中胚層成血管細(xì)胞增殖的影響。(A)D16細(xì)胞在未添加、含有指定濃度的HMGB1或20％FCS的RPMI培養(yǎng)基中生長。HMGB1在檢測的所有濃度下均誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，但是細(xì)胞數(shù)量在48小時(shí)后達(dá)到平臺。每個(gè)點(diǎn)都代表平均值±SD(n＝3)。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(B)D16細(xì)胞分裂通過FACS分析在30ng/ml HMGB1存在下6個(gè)小時(shí)后，DNA含量增加，但是在24小時(shí)后回復(fù)到正常的二倍體含量。星號表示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.001)。(C)在HMGB1存在下，3T3成纖維細(xì)胞(如圖A中的D16細(xì)胞一樣處理)不分裂。
圖8 HMGB1再刺激延長中胚層成血管細(xì)胞增殖。在時(shí)間0時(shí)將D16細(xì)胞置于含有30ng/ml HMGB1的RPMI培養(yǎng)基中；也在三角形表示的時(shí)間加入類似含量的HMGB1。多次刺激的D16細(xì)胞保持生長。每個(gè)點(diǎn)都代表一式兩份進(jìn)行的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。插圖實(shí)驗(yàn)開始48小時(shí)后，培養(yǎng)D16細(xì)胞的培養(yǎng)基中HMGB1的Western印跡。HMGB1在再刺激細(xì)胞的培養(yǎng)基中仍然存在，但是在時(shí)間0時(shí)刺激一次的培養(yǎng)基中不存在。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，獲得相似的結(jié)果。
圖9 HMGB1對胚胎中胚層成血管細(xì)胞具有趨化活性。(A)D16細(xì)胞在含有10、50或100ng/ml HMGB1的Boyden裝置中進(jìn)行趨化性測定。數(shù)據(jù)代表一式兩份進(jìn)行的4次實(shí)驗(yàn)的平均值±SD；升高的HMGB1濃度的影響非常顯著(在ANOVA分析中p＜0.001)。加入識別肽166-181的抗HMGB1抗體顯著降低了趨化應(yīng)答(與不含抗體的樣品相比，p＜0.05)，而加入抗A盒單克隆抗體沒有影響。(B)多種HMGB1片段(均為10ng/ml)對D16細(xì)胞的趨化活性。全長HMGB1，A盒和B盒，二結(jié)構(gòu)域AB，無尾HMGB1(ABbt)，在(C)中顯示。ABbt具有與全長HMGB1相當(dāng)?shù)内吇饔?蛋白質(zhì)對單獨(dú)的培養(yǎng)基，p＜0.05)。相反，A盒和B盒以及AB二結(jié)構(gòu)域沒有顯著的趨化活性。線條代表一式兩份進(jìn)行的三次實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。(D)使用抗RAGE抗體對總D16細(xì)胞提取物進(jìn)行的Western印跡。
圖10 HMGB1誘導(dǎo)中胚層成血管細(xì)胞通過內(nèi)皮單層轉(zhuǎn)運(yùn)。(A)在蓋玻片上生長到匯合的牛初級內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)暴露于HMGB1或VEGF，用FITC-標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色，顯示肌動(dòng)蛋白纖維。這兩種處理都決定應(yīng)力纖維的形成，和細(xì)胞的彼此分離。(B)將胚胎中胚層成血管細(xì)胞置于Boyden裝置的上層區(qū)室中；下層區(qū)室含有單獨(dú)的RPMI(培養(yǎng)基)、RPMI+100ng/ml HMGB1或RPMI+10ng/ml VEGF；這些區(qū)室被聚碳酸酯濾膜上生長的匯合的內(nèi)皮細(xì)胞單層分開。HMGB1顯著刺激D16移行(p＜0.01)。線條代表一式兩份進(jìn)行的三次實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。條圖之上的圖顯示在向單獨(dú)的培養(yǎng)基或RPMI+HMGB1遷移后，姬姆薩染色的D16細(xì)胞。
圖11 HMGB1在體內(nèi)吸引中胚層成血管細(xì)胞。D16細(xì)胞首先用編碼核LacZ的一種慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后通過小鼠的股動(dòng)脈注射，該小鼠已經(jīng)在脛骨前肌中注射了肝素珠(荷載HMGB1或者未荷載)。然后在24小時(shí)后殺死小鼠。(A)注射荷載HMGB1的和對照珠的脛骨前肌。(B，C，D)用對照肝素珠(B)或HMGB1包被的肝素珠(C，D)處理的肌肉的冷凍切片(Criosection)。箭頭所指為珠。切片用X-gal染色，中胚層成血管細(xì)胞(箭頭)顯藍(lán)色。在注射HMGB1包被珠的肌肉中只發(fā)現(xiàn)為大的聚簇(C)或分離細(xì)胞(D)的中胚層成血管細(xì)胞。
圖12 HMGB1對成年中胚層成血管細(xì)胞的影響。(A)從小鼠骨髓中獲得的G1克隆的中胚層成血管細(xì)胞在含有1、10或30ng/ml HMGB1的RPMI培養(yǎng)基中生長。為了比較，G1細(xì)胞也在單獨(dú)的RPMI培養(yǎng)基中或者在RPMI+20％FCS中生長。(B)G1細(xì)胞向含有RPMI(培養(yǎng)基)或RPMI+10ng/ml HMGB1(HMGB1)的Boyden裝置的下層室中遷移。在“遷移”實(shí)驗(yàn)中，這些室用一張濾膜隔開，在“移行”實(shí)驗(yàn)中，這些室用一張覆蓋內(nèi)皮細(xì)胞單層的濾膜隔開。每個(gè)線條代表三次實(shí)驗(yàn)的平均值±SD，結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(p＜0.05)。(C)G1細(xì)胞用DiI標(biāo)記，然后通過小鼠的股動(dòng)脈注射，該小鼠已經(jīng)在脛骨前肌中注射了肝素珠(荷載HMGB1或者不荷載)。上圖，相差；下圖，熒光。G1細(xì)胞(紅色熒光)在荷載HMGB1的細(xì)胞附近遷移；在對照珠附近未檢測到G1細(xì)胞。
圖13 HMGB1在體內(nèi)誘導(dǎo)新心肌細(xì)胞的形成(A)GST和HMGB-1處理的心臟中梗死區(qū)的蘇木精和伊紅染色。在注射HMGB1的心臟中觀察到組織結(jié)構(gòu)顯著變化。(B)KI67免疫染色(綠色熒光)顯示在注射HMGB1的心臟中有大量陽性細(xì)胞。(C)α-肌節(jié)肌動(dòng)蛋白免疫染色(紅色熒光)。藍(lán)色熒光，核的煙酸己可堿(hoechst)標(biāo)記。在HMGB1處理的心臟中檢測到表達(dá)α-肌節(jié)肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞。(D)MEF-2的免疫染色(綠色亮熒光)。
圖14 HMGB1處理提高心肌功能超聲心動(dòng)圖研究。對照(未梗死的)和梗死小鼠(左圖)的典型超聲心動(dòng)圖。射血分?jǐn)?shù)(EF)根據(jù)超聲心動(dòng)圖計(jì)算(右圖)。結(jié)果是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。HMGB1對GST，*P＜0.05。
圖15 HMGB1處理提高心肌功能血液動(dòng)力學(xué)研究。心肌梗死(MI)對左心室舒張壓(LVDP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)、LV+dP/dt(壓力升高率)和LV-dP/dt(壓力下降率)的影響。結(jié)果來自假手術(shù)(假)的小鼠和未處理以及用GST或HMGB-1處理的梗死小鼠。結(jié)果是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。星號表示在Student′s t檢驗(yàn)中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.05)。
實(shí)施例1材料與方法命名高遷移組蛋白最近已經(jīng)更名。HMGB1以前的/備選的名稱是高遷移1組、HMG1、HMG-1、amphoterin和p30。
HMGB1蛋白和片段的克隆、表達(dá)和純化質(zhì)粒HMGB1及其片段已經(jīng)描述(Müller等人，Biochemistry，40，10254-10261，2001)。蛋白質(zhì)濃度利用Gill和yon Hippel(Analyt.Biochem.，182，319-326，1989)的方法光譜測定。天然蛋白質(zhì)使用下列消光系數(shù)A盒A280＝9.98103M-2cm-1，B盒A280＝1.15104M-1cm-1，AB、ABbt和全長HMGB1A280＝2.14104M-1cm-1。
構(gòu)建體和細(xì)胞質(zhì)粒pEGFP-HMGB1如下產(chǎn)生利用EcoRI和SacII限制酶切位點(diǎn)，將大鼠HMGB1的cDNA的編碼序列插入pEGFP-N1(Clontech)內(nèi)。pEGFP-H1c、pEGFP-NF1、pEGFP-HMGN2和pEF-flag-mICAD由A.Gunjan，N.Bhattacharyya，R.Hock，M.Bustin和S.Nagata(Phair和Misteli，Nature，404，604-609，2000；Misteli等人，Nature408，877-881，2000；Enari等人，Nature391，43-50，1998)惠贈。HeLa細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(VA1系，Hmgb1+/+，和C1系，Hmgb1-/-)如上所述生長(Calogero等人，Nature Genet.22，276-280，1999)。HeLa細(xì)胞用pEGFP-HMGB1電穿孔，18小時(shí)后觀察。細(xì)胞群體中HMGB1-GFP的平均量為HMGB1的1-3％(用抗HMGB1抗體免疫印跡)。在單細(xì)胞水平上，不同細(xì)胞之間的HMGB1-GFP量最多有10倍不同；務(wù)必一直用中等熒光水平分析細(xì)胞。
通過用2ng/ml人TNF-α和35μM環(huán)己酰亞胺處理細(xì)胞16小時(shí)誘導(dǎo)凋亡。通過用5μM離子霉素和20μM CCCP，或6mM脫氧葡萄糖和10mM疊氮鈉處理16小時(shí)，或者通過三個(gè)凍融循環(huán)，誘導(dǎo)壞死。
用pEF-flag-mICAD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的三種不同的HeLa細(xì)胞克隆用TUNEL(凋亡檢測系統(tǒng)，Promega)染色，提取它們的染色體DNA，在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳。
間接免疫熒光如述進(jìn)行(Degryse等人，J.Cell Biol.152，1197-2006，2001)，其中使用1∶1600稀釋的抗HMGB1多克隆抗體(Pharmingen)，和1∶300稀釋的FITC-或TRIC-偶聯(lián)的抗兔抗體(Boehringer)。
體內(nèi)顯微鏡檢查和FLIP將細(xì)胞平板接種于LabTek II室(Nalgene)中，用Axiovert 135M顯微鏡(Zeiss)觀察。用Leica TCS-SP共聚焦顯微鏡進(jìn)行FLIP實(shí)驗(yàn)，其中如述(Phair和Misteli，Nature，404，604-609，2000)使用Ar激光的488nm的激發(fā)光線，在500-575nm下檢測。漂白細(xì)胞(半徑1μm的斑點(diǎn)，20mW額定輸出功率，200-500ms)，以6秒的間隔成像(0.2mW額定輸出功率)。
重組HMGB1與染色質(zhì)的結(jié)合Hmgb1-/-成纖維細(xì)胞用2ng/ml hTNF-α和35μM環(huán)己酰亞胺處理。16小時(shí)后輕輕沖洗平皿，回收凋亡細(xì)胞。將1千萬個(gè)凋亡Hmgb1-/-成纖維細(xì)胞和對照非凋亡細(xì)胞群體重懸浮于50μl PBS中，其中含有0.32M蔗糖、0.5％NP-40和1μM細(xì)菌產(chǎn)生的HMGB1，后者用Cy5(Pharmacia)熒光標(biāo)記或者不標(biāo)記。平均標(biāo)記是每個(gè)HMGB1分子2.3個(gè)Cy5分子。在室溫下30分鐘后，混合樣品細(xì)胞，使用含有1.5μg/ml DAPI的Vectashield(Vector Laboratories)將其固定于載玻片上，用配有TRITC濾光片的Axiophot顯微鏡(Carl Zeiss)觀察。與未標(biāo)記的HMGB1溫育的兩組細(xì)胞在不連續(xù)梯度(溶于PBS的5ml 1.16M蔗糖以及溶于PBS的6ml 2M蔗糖墊形成)上分層，使用SW27 Beckman轉(zhuǎn)頭以30,000g離心90分鐘。從試管底部回收不含膜碎片的凋亡和非凋亡染色質(zhì)，加到12％SDS-PA凝膠上。使用1∶3000稀釋的一種抗HMGB1抗體(Pharmingen)，通過免疫印跡法測定與凋亡和非凋亡染色質(zhì)結(jié)合的重組HMGB1的量。凋亡和非凋亡染色質(zhì)等份也用抗乙酰組蛋白H4(R10，B.Turner惠贈)、抗乙酰組蛋白H3(Lys9，Biolabs)和抗乙酰賴氨酸抗體(Biolabs)探查。
炎癥測定。為了測定TNF-α的體外產(chǎn)生，從雌性C56B16小鼠的后腿收集骨髓，在Optimem中稀釋為5×106細(xì)胞/ml，分配到96孔微量滴定板中(每孔120μl)。向孔中加入壞死細(xì)胞(通過3個(gè)凍融循環(huán)裂解)或凋亡細(xì)胞至指定終濃度，37℃溫育18小時(shí)。上清液中的TNF-α通過ELISA測定(Quantikine M，R&D Systems)。在指明時(shí)，與TNF-α一起加入200ng/ml TSA，在凋亡細(xì)胞與骨髓細(xì)胞混合之前洗去。
為了測定體內(nèi)炎癥，一天大的小鼠(體重1.1±0.1克)腹膜內(nèi)注射20μl PBS，其中含有320μg撲熱息痛(Sigma)，指明時(shí)含有320μg抗體(Pharmingen BD)。9小時(shí)后用GP-轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(Sigma)分析小鼠的血清ALT活性，并且如述分析肝臟提取物中的MPO活性(Kato等人，Am.J.Pathol.157297-302，2000)。用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)對MPO/ALT比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對配對的小鼠的MPO水平進(jìn)行t檢驗(yàn)，獲得類似的結(jié)果，以最小化ALT水平的差異。
結(jié)果HMGB1與分裂間期和有絲分裂細(xì)胞的染色質(zhì)松散結(jié)合，當(dāng)透化或壞死細(xì)胞中的膜完整性遭到破壞后快速釋放到培養(yǎng)基中(Degryse等人，J.Cell Biol.1521197-2006，2001；Müller等人，EMBO J.，16，4337-4340，2001；Falciola等人，J.Cell Biol.137，19-26，1997)。這些結(jié)果提示，在活細(xì)胞中，HMGB1與染色質(zhì)快速結(jié)合及解離。為了證明這一點(diǎn)，HMGB1在其C端用GFP標(biāo)記，形成一種嵌合蛋白，它在轉(zhuǎn)染測定中提高HOXD9-反應(yīng)性報(bào)道基因的表達(dá)方面與未干擾的HMGB1相當(dāng)(Zappavigna等人，EMBO J.，15，4981-4991，1996)。根據(jù)核的均勻綠色熒光可以容易地檢測表達(dá)該融合蛋白的HeLa細(xì)胞。經(jīng)歷有絲分裂的細(xì)胞顯示彌散的細(xì)胞質(zhì)熒光，以及HMGB1-GFP與凝聚染色體的不同結(jié)合，這持續(xù)整個(gè)M期(圖1a)。當(dāng)HMGB1-GFP轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞用NP-40透化時(shí)，大多數(shù)在數(shù)秒鐘后失去熒光，證實(shí)HMGB1與染色質(zhì)松散結(jié)合。然而，少數(shù)細(xì)胞保持亮熒光。根據(jù)它們的核特有的斷裂表現(xiàn)，這些細(xì)胞表現(xiàn)凋亡。然后用TNF-α和環(huán)己酰亞胺處理使HeLa細(xì)胞經(jīng)歷凋亡，透化，對未修飾的內(nèi)源HMGB1免疫染色。而對照非凋亡細(xì)胞將所有HMGB1釋放到培養(yǎng)基中(圖1b，d)，該蛋白質(zhì)保持在凋亡細(xì)胞的核內(nèi)(圖1d)。當(dāng)可溶性細(xì)胞質(zhì)蛋白，如乳酸脫氫酶(LDH)，釋放到細(xì)胞外培養(yǎng)基內(nèi)時(shí)，HMGB1大部分與核殘留物結(jié)合，甚至在延長溫育和凋亡細(xì)胞部分自溶后仍然如此(圖1e)。在通過表鬼臼毒吡喃葡糖苷或H2O2處理誘導(dǎo)凋亡，或者在未干擾的培養(yǎng)物中自發(fā)凋亡的HeLa和3T3細(xì)胞中，HMGB1和HMGB1-GFP也與染色質(zhì)緊密結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。相反，HMGB1與壞死細(xì)胞的染色質(zhì)解離，釋放到細(xì)胞外培養(yǎng)基中(圖1c)。
為了定量單細(xì)胞內(nèi)HMGB1-GFP的動(dòng)力學(xué)特性，使用一種被稱為光漂白中的熒光損失(FLIP)的技術(shù)(Phair和Misteli，Nature，404，604-609，2000)。同一區(qū)域的重復(fù)漂白導(dǎo)致核的其余部分熒光損失，其動(dòng)力學(xué)取決于熒光蛋白的總遷移率。如果蛋白質(zhì)組的一種級分在指定的任何時(shí)間與染色質(zhì)結(jié)合，熒光的損失將減緩?？焖佾@得總核HMGB1-GFP的漂白(圖2a)；相反，在表達(dá)GFP與染色質(zhì)蛋白HMGN1和HMGN2或轉(zhuǎn)錄因子NF1的融合蛋白的HeLa細(xì)胞中，熒光損失顯著降低，在表達(dá)GFP-組蛋白H1c融合蛋白的細(xì)胞中，熒光損失非常有限(圖2c)。
作者也評價(jià)了在有絲分裂期間與活HeLa細(xì)胞的凝聚染色體結(jié)合的HMGB1-GFP的擴(kuò)散率。細(xì)胞質(zhì)HMGB1-GFP的重復(fù)漂白導(dǎo)致凝聚染色體和細(xì)胞質(zhì)快速、平行地?fù)p失熒光(圖2b，d)，這清楚地證明HMGB1在染色質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)與可溶性狀態(tài)之間快速轉(zhuǎn)換。
到另一個(gè)極端，HMGB1-GFP幾乎固定在凋亡細(xì)胞中(圖2e，g)。HMGB1的阻斷是特異的，因?yàn)榕c活細(xì)胞不同，在凋亡細(xì)胞中GFP-HMGN1、GFP-HMGN2、GFP-NF1和單獨(dú)的GFP的遷移率不降低(圖2h，結(jié)果未顯示)。因此，凋亡過程中的染色質(zhì)凝聚通常不影響蛋白質(zhì)的遷移率。
Hmgb1-/-細(xì)胞為我們提供了機(jī)會，用來檢驗(yàn)HMGB1與凋亡染色質(zhì)的結(jié)合是否是由于HMGB1或經(jīng)歷凋亡的核的改變。從Hmgb1-/-和Hmgb1+/+小鼠獲得的胚胎成纖維細(xì)胞(Calogero等人，Nature Genet.，22，276-280，1999)對凋亡同樣敏感(未顯示)，表明染色質(zhì)上HMGB1的冷凍是凋亡的結(jié)果，而不是必要條件。Hmgb1-/-成纖維細(xì)胞用TNF-α和環(huán)己酰亞胺處理，通過輕輕沖洗從搖瓶中回收凋亡細(xì)胞。該細(xì)胞群體，和對照非凋亡Hmgb1-/-成纖維細(xì)胞群體，用去污劑透化，并暴露于細(xì)菌產(chǎn)生的Cy5標(biāo)記的HMGB1。HMGB1與凋亡的核結(jié)合，而不與未凋亡的核結(jié)合(圖3a)。該結(jié)果在生物化學(xué)上得到證實(shí)(圖3b)透化的凋亡和非凋亡Hmgb1-/-成纖維細(xì)胞與細(xì)菌產(chǎn)生的HMGB1一起溫育，通過不連續(xù)蔗糖梯度分級分離。另外，HMGB1也與來自凋亡細(xì)胞的核結(jié)合，而不與來自非凋亡細(xì)胞的核結(jié)合。上述實(shí)驗(yàn)表明，一旦凋亡，染色質(zhì)經(jīng)歷某些化學(xué)或結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，使之對HMGB1結(jié)合敏感。HMGB1本身的性質(zhì)，是內(nèi)源的還是細(xì)菌產(chǎn)生的，用熒光團(tuán)標(biāo)記還是與GFP融合，均無關(guān)。
作者隨后研究了可使HMGB1穩(wěn)定結(jié)合的染色質(zhì)修飾的性質(zhì)。由于HMGB1與體外重建的單核小體緊密結(jié)合(Falciola等人，J.Cell Biol.，137，19-26，1997)，作者檢驗(yàn)了在凋亡后期發(fā)生的染色質(zhì)斷裂為寡核小體和單核小體是否提供穩(wěn)定的HMGB1結(jié)合位點(diǎn)。HeLa細(xì)胞用一種表達(dá)ICAD的構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，ICAD是凋亡期間斷裂DNA的CAD核酸酶的抑制劑。過量表達(dá)ICAD的HeLa細(xì)胞經(jīng)歷凋亡，但是它們的DNA即使有斷裂也顯著極少凋亡(Enari等人，Nature，391，43-50，1998)(圖3c)。HMGB1與表達(dá)ICAD的未斷裂染色質(zhì)以及與斷裂的染色質(zhì)同樣穩(wěn)定地結(jié)合(圖3c)。因此DNA斷裂不能說明凋亡中穩(wěn)定的HMGB1結(jié)合。
然后檢測了染色質(zhì)乙?；癄顟B(tài)的改變。在誘導(dǎo)凋亡之前立即向HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入TSA，一種常用脫乙酰酶抑制劑在此情況下，HMGB1向染色質(zhì)上的冷凍遭到抑制(圖2f，g)。該結(jié)果提示，在凋亡期間發(fā)生一種或多種染色質(zhì)成分的低乙?；欣贖MGB1的結(jié)合。凋亡和非凋亡細(xì)胞中存在的HMGB1的pI或分子量模式未見差異(圖3d)，表明凋亡不改變HMGB1本身的乙酰化狀態(tài)。相反，與非凋亡的染色質(zhì)相比，來自凋亡染色質(zhì)的組蛋白H4明顯低乙酰化，而凋亡中的H4低乙酰化被TSA抑制(圖3e)。
作者因此證明，HMGB1與染色質(zhì)的結(jié)合取決于細(xì)胞的生存力，并且明確地區(qū)分開壞死細(xì)胞與凋亡細(xì)胞?？梢岳肏MGB1的不同釋放作為鄰近細(xì)胞激活對非編程和編程細(xì)胞死亡的適當(dāng)應(yīng)答的信號。非編程死亡通常是創(chuàng)傷、中毒或感染的結(jié)果，所有事件都需要快速反應(yīng)和涉及損傷和/或修復(fù)。炎癥是哺乳動(dòng)物中的主要組織損傷應(yīng)答，已經(jīng)報(bào)告HMGB1是炎癥的一種介質(zhì)(Wang等人，Science，285，248-251，1999；Abraham等人J.Immunol.，165，2950-2954，2000；Andersson等人，J.Exp.Med.192，565-570，2000)。為了直接檢驗(yàn)壞死細(xì)胞釋放HMGB1是否能夠直接觸發(fā)炎癥應(yīng)答，作者用Hmgb1-/-或野生型(+/+)死亡成纖維細(xì)胞攻擊野生型骨髓細(xì)胞。如預(yù)期的，野生型壞死細(xì)胞觸發(fā)促炎細(xì)胞因子TNF-α的產(chǎn)生，而野生型凋亡細(xì)胞有效性更低(圖4a)。值得注意的是，Hmgb1-/-壞死細(xì)胞在激活單核細(xì)胞方面也無效。在該測定中，純化的HMGB1也引發(fā)TNF-α的產(chǎn)生(Andersson等人，J.Exp.Med.192，565-570，2000)。因此，該實(shí)驗(yàn)表明，HMGB1是壞死的主要擴(kuò)散信號之一。另一方面，不能檢測凋亡細(xì)胞是否因?yàn)楸Ａ袅薍MGB1而逃脫炎癥監(jiān)視凋亡細(xì)胞只在數(shù)小時(shí)后開始釋放細(xì)胞成分，在體內(nèi)，它們通常在可能發(fā)生該過程(被稱為二次壞死)之前被吞噬細(xì)胞很好地清除。但是作者能夠檢測經(jīng)歷凋亡后二次壞死的細(xì)胞是否能夠促進(jìn)單核細(xì)胞的炎癥應(yīng)答。野生型凋亡成纖維細(xì)胞溫育72小時(shí)，直到大多數(shù)LDH釋放到細(xì)胞外培養(yǎng)基中；凋亡后的細(xì)胞殘留物不會促進(jìn)單核細(xì)胞的強(qiáng)免疫應(yīng)答(圖4b)。然而，用TSA處理而經(jīng)歷凋亡的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生二次壞死的細(xì)胞殘留物，它們與凍融殺死的初級壞死細(xì)胞一樣強(qiáng)烈地促進(jìn)炎癥。
作者無法檢測Hmgb1-/-小鼠在組織壞死后炎癥應(yīng)答是否降低，因?yàn)檫@些小鼠在出生后只存活數(shù)小時(shí)(Calogero等人，Nature Genet.，22，276-280，1999)。為了在動(dòng)物模型上提供HMGB1釋放的顯著性的證據(jù)，在野生型小鼠中誘導(dǎo)大量肝細(xì)胞壞死，并且測定炎癥應(yīng)答。在人和嚙齒類動(dòng)物中，超劑量的鎮(zhèn)痛藥撲熱息痛(AAP，也被稱為對乙酰氨基酚)產(chǎn)生大面積肝壞死，伴局部炎癥、枯否細(xì)胞激活和嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向損傷組織中的募集和匯集(Lawson等人，Toxicol Sci.，54，509-516，2000；Thomas，Pharmacol.Ther.，60，91-120，1993)。肝損傷和嗜中性粒細(xì)胞匯集水平嚴(yán)格成比例，直到在AAP中毒后12-24小時(shí)，大多數(shù)肝細(xì)胞壞死(Lawson等人，Toxicol Sci.，54，509-516，2000)。作者通過一次腹膜內(nèi)流向?qū)δ贻p小鼠施用了300mg/kg AAP，9小時(shí)后通過測定血清中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性，估計(jì)肝損傷，并且通過測定總肝提取物中的髓過氧化物酶(MPO)活性，估計(jì)炎癥細(xì)胞匯集。一組小鼠(n＝8)不接受AAP，一組(n＝10)只接受AAP，另一組(n＝6)接受AAP和親和純化的抗-HMGB1抗體(300mg/kg)，以最后一組(n＝8)接受AAP和無關(guān)兔抗體(300mg/kg)。與假處理的對照相比，注射AAP的所有3組ALT水平均升高，但是3個(gè)處理組之間的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。因此，抗體不能針對肝損傷進(jìn)行保護(hù)，至少在炎癥應(yīng)答開始時(shí)如此。作者然后使用MPO/ALT比比較炎癥細(xì)胞募集，對肝損傷水平標(biāo)準(zhǔn)化(圖4c)?？笻MGB1抗體在減少AAP誘導(dǎo)肝壞死后的炎癥方面有效與只注射AAP的小鼠相比(2.7+0.3；p＜0.05)，以及與注射AAP和免疫前兔IgG的小鼠相比(2.4±0.3；p＜0.05)，這些小鼠都顯示MPO/ALT比顯著降低(1.5±0.3)。在我們的實(shí)驗(yàn)中，激活的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都不能產(chǎn)生HMGB1，因?yàn)檠装Y細(xì)胞分泌HMGB1至少需要16小時(shí)(Wang等人，Science，285，248-251，1999；Abraham等人，J.Immunol.，165，2950-2954，2000；Andersson等人，J.Exp.Med.192，565-570，2000)。因此，HMGB1作為炎癥的一種直接觸發(fā)劑，以及炎癥的一種晚期介質(zhì)，如前所述(Wang等人，Science，285，248-251，1999)。
總之，作者證明，被動(dòng)釋放一種富含的染色質(zhì)成分能夠作為非編程死亡的一種擴(kuò)散信號，它能夠作為給鄰近細(xì)胞的信號。核心組蛋白盡管更富含，但是可能不是壞死的良好信號，因?yàn)樗鼈儽３峙c壞死細(xì)胞的不可溶染色質(zhì)錨定。凋亡細(xì)胞不是存在的直接危險(xiǎn)的結(jié)果，在生理?xiàng)l件下不觸發(fā)炎癥。它們保留核成分，直到被巨噬細(xì)胞或作為半專業(yè)吞噬細(xì)胞的鄰近細(xì)胞清除，它們通過顯示“吞噬我”信號吸引并激活(Ren和Savill，Cell Death Different.，5，563-568，1998)。然而，逃脫快速清除的凋亡細(xì)胞經(jīng)歷二次壞死，致使核自身抗體水平升高(Scott等人，Nature，211，201-211，2001)，已經(jīng)提出它們在自身免疫病(如狼瘡)中起重要的致病作用(Herrmann等人，ArthritisReum.，41，1241-1250，1998)。因此，經(jīng)歷二次壞死的凋亡細(xì)胞保留HMGB1另外確保不會混淆壞死細(xì)胞與凋亡細(xì)胞。
實(shí)施例2作者也證明HMGB1對來源于胎主動(dòng)脈細(xì)胞的D18小鼠中胚層成血管細(xì)胞具有趨化活性(Minasi等人，Development，129，2773-83，2002)。中胚層成血管細(xì)胞干細(xì)胞可能來源于小鼠胎主動(dòng)脈細(xì)胞，也可能來源于出生后小鼠的臍帶細(xì)胞、外周血管和骨髓ckit+細(xì)胞。一旦利用一種專利方法(Minasi等人，Development，129，2773-83，2002描述)由這些原始細(xì)胞群體產(chǎn)生，中胚層成血管細(xì)胞細(xì)胞即“自然”無限增殖化(它們無限生長)，D18是它的一個(gè)例子。D18細(xì)胞作為下列中胚層組織類型的前體骨、軟骨、骨骼平滑肌和心肌、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成骨細(xì)胞。它們也能夠產(chǎn)生肝細(xì)胞和神經(jīng)元?？寺18根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于CBA，Centro BiotecnologieAvanzate，Genova，意大利，N.P D02005)。使用改良Boyden室進(jìn)行趨化性測定。數(shù)值1對應(yīng)于在不含任何刺激劑的情況下遷移(隨機(jī)細(xì)胞遷移)的細(xì)胞數(shù)量。
數(shù)據(jù)代表平均值±SE。在ANOVA模型中，結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性是P＜0.0001。用HMGB1+抗HMGB1處理產(chǎn)生與未刺激的對照在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有不同的結(jié)果。用單獨(dú)的抗HMGB1抗體或一種非特異性抗體處理D18細(xì)胞也無法與未刺激的對照相區(qū)別。
預(yù)期干細(xì)胞在肯定發(fā)生組織修復(fù)的部位增殖。作者然后檢測了HMGB1是否也能夠刺激干細(xì)胞增殖。不含血清的RPMI中的干細(xì)胞不分裂，而不含血清但是存在HMGB1的RPMI中的細(xì)胞活躍分裂至少24小時(shí)，然后由于養(yǎng)分耗盡較緩慢地分裂。但是在第3天，通過顯微鏡檢查估計(jì)，含有用HMGB1(所有濃度)刺激的D18細(xì)胞的所有平板都含有一些分裂的細(xì)胞。
單獨(dú)RPMI中的細(xì)胞不分裂，而RPMI+HMGB1中的細(xì)胞活躍分裂至少24小時(shí)，然后由于養(yǎng)分耗盡較緩慢地分裂。但是在第3天，通過顯微鏡檢查估計(jì)，含有用HMGB1(所有濃度)刺激的D18細(xì)胞的所有平板都含有一些分裂的細(xì)胞(圖6)。
該實(shí)驗(yàn)已經(jīng)用來源于成年小鼠毛細(xì)血管的中胚層成血管細(xì)胞(來自成年小鼠的干細(xì)胞)重復(fù)，顯示相同的增殖誘導(dǎo)作用。
以上所述的所有實(shí)驗(yàn)也用另外一種干細(xì)胞克隆(被稱為D16)重復(fù)，獲得類似的結(jié)果，如以下實(shí)施例3所述。
實(shí)施例3細(xì)胞外HMGB1，一種組織損傷信號，誘導(dǎo)中胚層成血管細(xì)胞遷移和增殖材料與方法細(xì)胞牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)如(Palumbo等人，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.，22，405-11，2002)所述從新屠宰的牛的胸主動(dòng)脈切片中分離。中胚層成血管細(xì)胞如前所述(De Angelis等人，J.Cell Biol.147，869-78，1999)從小鼠胚胎的背主動(dòng)脈和幼稚動(dòng)脈中分離?？寺『?，細(xì)胞在絲裂霉素C處理的STO成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層上擴(kuò)增。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)使用顯示中胚層成血管細(xì)胞基因表達(dá)模式的克隆(存在CD34、Kit、Flk1和MEF2D)。胚胎中胚層成血管細(xì)胞(克隆D16)用一種編碼核LacZ的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，而成熟中胚層成血管細(xì)胞(克隆G1)用DiI標(biāo)記，然后注射到小鼠的股動(dòng)脈內(nèi)。
HMGB1和抗體全長HMGB1蛋白及其片段的表達(dá)與純化如前所述進(jìn)行(Müller等人，Biochemistry，40，10254-10261，2001)。通過Detoxy-Gel柱(Pierce)除去內(nèi)毒素。
針對肽166-181的兔多克隆抗HMGB1抗體來自于Pharmingen BD，抗A盒的多克隆抗體來自于MBL?？筊AGE山羊抗體來自于Chemikon。如(Degryse等人，J.Cell Biol.152，1197-2006，2001)所述進(jìn)行Western印跡。
增殖測定將細(xì)胞接種于6孔板中(1×105細(xì)胞/孔)，在補(bǔ)充20％FCS的RPMI中生長。24小時(shí)后，將培養(yǎng)基替換為不含血清的RPMI，16小時(shí)。隨后用單獨(dú)的培養(yǎng)基或添加20％FCS或濃度為1、3、10、30ng/ml的HMGB1的培養(yǎng)基培養(yǎng)這些細(xì)胞。1、2、3天后計(jì)數(shù)細(xì)胞，利用臺盼藍(lán)染料排除法作為細(xì)胞生存力的指示。所有實(shí)驗(yàn)均一式兩份進(jìn)行三次。
趨化性測定細(xì)胞遷移用Boyden室測定(Degryse等人，J.Cell Biol.152，1197-2006，2001)。簡言之，孔徑為8μm的不含PVP的聚碳酸酯濾膜(Costar)用5μg/ml豬皮明膠(Sigma)包被。將無血清RPMI(陰性對照)、含有10、50或100ng/ml HMGB1的RPMI和含有20％血清的RPMI(陽性對照)置于下層室中。D16細(xì)胞在RPMI+10％FCS中生長，饑餓過夜，用PBS洗滌兩次除去所有漂浮的細(xì)胞，用胰蛋白酶收獲。將重懸浮于200μl RPMI中的5萬個(gè)細(xì)胞置于上層室中，在37℃、5％CO2下溫育16小時(shí)。機(jī)械除去保留在濾膜上表面的細(xì)胞，用乙醇固定已經(jīng)遷移到下表面的細(xì)胞，用改良的姆薩染液(Sigma)染色，在400倍放大倍數(shù)下計(jì)數(shù)每個(gè)濾膜10個(gè)隨機(jī)視野。一式三份進(jìn)行測定，并且在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中重復(fù)三次。
移行測定BAEC細(xì)胞在聚碳酸酯transwell插件(3μm孔；Costar)上在DMEM+10％FCS中生長5天，直到它們形成單層。然后將該插件置于Boyden裝置的室之間，通過測定室間BSA的擴(kuò)散檢查單層的緊密性。將中胚層成血管細(xì)胞(105個(gè)細(xì)胞，在100μl RPMI中)置于上層區(qū)室，將含有HMGB1或VEGF(在大腸桿菌中表達(dá)的人VEGF的成熟的121氨基酸變體，來自R&D Systems)的RPMI置于下層室中(500μl)。37℃8小時(shí)后，取出濾膜，如趨化性測定所述評價(jià)結(jié)果。這些實(shí)驗(yàn)以一式兩份進(jìn)行三次。
流式細(xì)胞分析饑餓過夜的中胚層成血管細(xì)胞在單獨(dú)的RPMI培養(yǎng)基、RPMI+20％FCS或RPMI+100ng/ml HMGB1中生長6、12、24或48小時(shí)。洗滌細(xì)胞，在70％乙醇中固定，用溶于PBS+50μg/ml RNase A的50μg/ml碘化丙錠(PI)染色，在室溫下溫育30分鐘。使用標(biāo)準(zhǔn)CellQuest軟件，通過流式細(xì)胞分析(FACScan；Becton-Dickinson)測定DNA含量。
細(xì)胞分裂數(shù)量的估計(jì)將1千萬個(gè)胚胎或成年中胚層成血管細(xì)胞接種于100mm平皿中的補(bǔ)充20％FCS的RPMI中。24小時(shí)后細(xì)胞在單獨(dú)的RPMI中饑餓過夜。然后用PBS洗滌細(xì)胞，加入CFDASE(Molecular Probes)至終濃度為2.5μM，在室溫下8分鐘。加入10％FCS猝滅染色，并用RPMI洗滌細(xì)胞。熒光標(biāo)記的細(xì)胞然后在單獨(dú)的RPMI、RPMI+100ng/ml HMGB1或RPMI+20％FCS中生長，在48小時(shí)后收集。然后用FACScan分析細(xì)胞。
細(xì)胞骨架顯示BAEC細(xì)胞在蓋玻片上生長，直到完全匯合。如本文所述處理后，用PBS洗滌細(xì)胞，用4％低聚甲醛在室溫下固定10分鐘。然后如述(Degryse等人，J.Cell Biol.，152，1197-2006，2001)用FITC偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽(Sigma)染色細(xì)胞，顯示肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。
荷載HMGB1的珠的制備從HiTrap Heparin HP柱(Pharmacia)上回收肝素珠(直徑34μm)，并用PBS充分洗滌。珠(20μl堆積體積)然后與60μg HMGB1在4℃下溫育1小時(shí)，離心收集，用PBS洗滌兩次，重懸浮于PBS中。進(jìn)行SDS-PAGE，檢查珠上HMGB1的量。
小鼠中胚層成血管細(xì)胞的動(dòng)脈內(nèi)輸送荷載或未荷載HMGB1的肝素珠(在20μl PBS中含有3μg珠的漿液)用胰島素注射器注射到6周齡雌性CD-1小鼠(每組3只)的脛骨前肌中。1小時(shí)后，如前所述(Torrente等人，J.Cell Biol.，152，335-48，2001)，通過股動(dòng)脈注射中胚層成血管細(xì)胞(4×105細(xì)胞/動(dòng)物)；24小時(shí)后殺死動(dòng)物。為進(jìn)行組織化學(xué)分析，將脛骨前肌標(biāo)本冷凍于液氮冷卻的異戊烷中，并且恒冷切片。對于使用LacZ標(biāo)記的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，10μm厚的系列肌肉切片用X-gal染色(Totsugawa等人，CellTransplant.，11，481-8，2002)，或者對于使用DiI的實(shí)驗(yàn)，直接顯示。DiI來自Molecular Probes。
結(jié)果HMGB1刺激血管結(jié)合的胚胎干細(xì)胞的增殖從小鼠E9.5胚胎背主動(dòng)脈中分離的干細(xì)胞(中胚層成血管細(xì)胞)在體外培養(yǎng)，檢測CD34、Kit、Flk1和MEF2D細(xì)胞標(biāo)記物的存在(Minasi等人，Development，129，2773-2783，2002)。作者使用這些克隆之一(被稱為D16)估計(jì)HMGB1是否能夠作為一種促分裂原。
將D16細(xì)胞接種于含有20％FCS的RPMI培養(yǎng)基中，然后在不含血清的情況下饑餓16小時(shí)，使細(xì)胞群體同步。然后向不含血清的培養(yǎng)基中加入濃度逐漸升高的HMGB1，在1、2、3天后計(jì)數(shù)細(xì)胞。圖7A顯示用HMGB1刺激達(dá)2天后，D16中胚層成血管細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，而在第2天與第3天之間只發(fā)生輕微的增殖。檢測的所有濃度具有類似的作用。HMGB1刺激的D16細(xì)胞具有正常的形態(tài)學(xué)，排除臺盼藍(lán)直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，而不含HMGB1的對照培養(yǎng)物中的細(xì)胞死亡(未顯示)。HMGB1對3T3成纖維細(xì)胞沒有促有絲分裂作用(圖7C)。
作者更詳細(xì)地研究了D16細(xì)胞對HMGB1的增殖應(yīng)答細(xì)胞暴露于單獨(dú)的RPMI培養(yǎng)基(陰性對照)或含有30ng/ml HMGB1或20％FCS的培養(yǎng)基6、12、24小時(shí)，在碘化丙錠染色后通過FACS分析DNA含量。用HMGB1刺激6小時(shí)后，大多數(shù)中胚層成血管細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期；24小時(shí)后，大多數(shù)細(xì)胞顯示含有二倍體DNA內(nèi)容物，因此處于G1或G0期(圖7B)。作者通過在時(shí)間0時(shí)用熒光染料CFDASE染色細(xì)胞膜(Colombetti等人，J.Immunol.，169，6178-86，2002)6，評價(jià)了HMGB1誘導(dǎo)的細(xì)胞周期數(shù)量；48小時(shí)后大多數(shù)細(xì)胞含有染料初始量的一半(因此經(jīng)歷一次分裂)，少數(shù)細(xì)胞含有四分之一(經(jīng)歷兩次分裂)。通過比較，在20％FCS中培養(yǎng)的所有細(xì)胞都至少分裂兩次(數(shù)據(jù)未顯示)。
這些數(shù)據(jù)表明，HMGB1誘導(dǎo)數(shù)量有限的細(xì)胞分裂。這可能是由于中胚層成血管細(xì)胞的一種具體程序，或者是由于培養(yǎng)基中HMGB1的消耗。因此作者在時(shí)間0時(shí)加入30ng/ml HMGB1，在12、36、60小時(shí)時(shí)另外加入HMGB1。持續(xù)暴露于HMGB1的中胚層成血管細(xì)胞不斷分裂(圖8)。48小時(shí)后，通過Western印跡在刺激一次的細(xì)胞的培養(yǎng)基中檢測不到HMGB1，而在多次暴露的細(xì)胞的培養(yǎng)基中保留相當(dāng)于約40ng/ml的HMGB1(參見插8)?？傊?，這些結(jié)果表明HMGB1作為D16細(xì)胞的一種生長因子，但是被快速消耗。
HMGB1誘導(dǎo)中胚層成血管細(xì)胞遷移作者以前證實(shí)，HMGB1是大鼠平滑肌細(xì)胞(RSMC)的一種化學(xué)引誘物(Degryse等人，J.Cell Biol.，152，1197-2006，2001)。他們隨后研究了HMGB1是否也是D16細(xì)胞的一種化學(xué)引誘物。在使用改良Boyden室的趨化性測定中，HMGB1以濃度依賴的方式刺激D16細(xì)胞的遷移(圖9A)。針對HMGB1的氨基酸166-181的多克隆抗體(抗166-181，圖7A)顯著降低遷移應(yīng)答。然而，遷移應(yīng)答不受識別A盒的抗HMGB1單克隆抗體影響。
作者也檢測了HMGB1各個(gè)結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)D16細(xì)胞遷移的能力(圖9B)。單獨(dú)的A盒和B盒都不能誘導(dǎo)明顯的遷移。二結(jié)構(gòu)域片段(含有A盒和B盒)具有不明顯的作用，而只缺乏酸性尾的ABbt片段(圖9C)與全長蛋白質(zhì)一樣有效。
Huttunen等人(Cancer Res.，62，4805-4811，2002)已經(jīng)確定殘基150-183是可與RAGE相互作用的HMGB1片段。值得注意的是，阻斷D16遷移的抗HMGB1抗體(圖9A)與殘基166-181之間的氨基酸片段特異性相互作用(圖9C)，因此占據(jù)與RAGE相互作用的表面。識別A盒的單克隆抗體不能阻止與RAGE的相互作用。因此我們的數(shù)據(jù)表明HMGB1是D16細(xì)胞的一種有力的化學(xué)引誘物，并且提示RAGE是其受體。D16細(xì)胞的RNA譜(未顯示)表明，它們表達(dá)RAGE，通過Western印跡在D16細(xì)胞中可以檢測到RAGE蛋白(圖9D)。
HMGB1誘導(dǎo)中胚層成血管細(xì)胞通過內(nèi)皮單層遷移中胚層成血管細(xì)胞是血管結(jié)合的干細(xì)胞，能夠通過全身循環(huán)遷移到損傷組織中(sampaolesi等人，未發(fā)表的數(shù)據(jù))，具有通過內(nèi)皮屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。作者然后檢測了HMGB1是否也能夠促進(jìn)干細(xì)胞通過在Boyden裝置的室間隔膜上生長的內(nèi)皮單層移行。當(dāng)作者向下層室的培養(yǎng)基中加入100ng/ml HMGB1時(shí)，與沒有任何添加的培養(yǎng)基相比，通過單層的D16細(xì)胞的數(shù)量提高8倍(圖10B)。HMGB1比血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)有更高的效能，VEGF是已知促進(jìn)細(xì)胞通過內(nèi)皮屏障遷移的一種信號分子。VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的重大細(xì)胞骨架重構(gòu)，其特征在于跨細(xì)胞質(zhì)應(yīng)力纖維的形成和粘附連接的分解，這對于保持內(nèi)皮屏障功能至關(guān)重要(Rousseau等人，J.Biol.Chem.，275，10661-72，2000；Esser等人，J.Cell Sci.，111，1853-65，1998)。因此，作者比較了HMGB1與VEGF對內(nèi)皮細(xì)胞的作用。
用HMGB1刺激5-30分鐘后，固定內(nèi)皮細(xì)胞，用熒光素偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記，通過免疫熒光檢測。HMGB1和VEGF都導(dǎo)致應(yīng)力纖維形成和內(nèi)皮細(xì)胞的解聚，提示HMGB1能夠顯著提高血管內(nèi)皮里層的通透性(圖10A)。
HMGB1引導(dǎo)中胚層成血管細(xì)胞的體內(nèi)歸巢作者最后評價(jià)了HMGB1控制中胚層成血管細(xì)胞體內(nèi)遷移的能力。肝素珠荷載濃度為3μg/ml的HMGB1，然后用一個(gè)細(xì)針頭注射到小鼠的脛骨前肌內(nèi)。30分鐘后通過近端股動(dòng)脈注射用一種導(dǎo)致核LacZ表達(dá)的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的D16細(xì)胞(參見材料與方法)。24小時(shí)后殺死小鼠，取出脛骨前肌，切片，通過免疫組化分析。與假注射的肌肉(數(shù)據(jù)未顯示)和注射未荷載的肝素珠(圖11A)相比，注射荷載HMGB1的珠的肌肉顯示相當(dāng)?shù)呐蛎?，提示HMGB1引起相當(dāng)嚴(yán)重的肌肉炎癥。這與HMGB1作為促炎細(xì)胞因子的作用一致。
肌肉切片用X-gal染色，用計(jì)算機(jī)輔助成像技術(shù)對藍(lán)色細(xì)胞評分(圖11)。在荷載HMGB1的珠附近發(fā)現(xiàn)大組藍(lán)色細(xì)胞(圖C)；少數(shù)切片顯示散布于整個(gè)肌肉中的藍(lán)色細(xì)胞(圖D)。注射未荷載的珠的肌肉切片根本沒有藍(lán)色細(xì)胞(圖B)。
這些發(fā)現(xiàn)清楚地提示，HMGB1能夠在體內(nèi)募集中胚層成血管細(xì)胞。
HMGB1對成年中胚層成血管細(xì)胞的生物學(xué)作用這些發(fā)現(xiàn)確定了細(xì)胞外HMGB1——一種促炎細(xì)胞因子對胚胎中胚層成血管細(xì)胞遷移和增殖的作用。然而，甚至在組織損傷情況下，胚胎中也沒有炎癥。作者然后檢測了HMGB1對成年中胚層成血管細(xì)胞是否也有作用。
作者對從骨髓中分離的成年中胚層成血管細(xì)胞(G1克隆，參見材料與方法)重復(fù)了上述實(shí)驗(yàn)。圖12總結(jié)了我們的發(fā)現(xiàn)。HMGB1導(dǎo)致干細(xì)胞增殖(圖A)、趨化性和移行(圖B)。最后，象胚胎中胚層成血管細(xì)胞一樣，HMGB1能夠?qū)⒊赡曛信邔映裳芗?xì)胞募集到脛骨前肌內(nèi)(圖12C)。
在使用來自8周齡小鼠主動(dòng)脈的不同成年中胚層成血管細(xì)胞的其它實(shí)驗(yàn)中也觀察到類似的作用(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例4材料與方法免疫組化分析距梗死1周時(shí)使心臟停止在心舒張期，向后灌注10％(vol/vol)甲醛，包埋于石蠟中，以4μm切片。切片用蘇木精和伊紅染色(H&E)進(jìn)行組織學(xué)檢查，或者處理進(jìn)行免疫組化分析，以鑒定新形成的心細(xì)胞。利用下列抗體評價(jià)心臟分化兔多克隆間隙連接蛋白43抗體(Sigma St.Louis，MO，USA)，小鼠單克隆抗α-肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(克隆5C5；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)，兔多克隆抗MEF-2(C-21；Santa Cruz)。使用小鼠單克隆抗體Ki67(克隆MIB5，Novocastra Laboratories，UK)檢測Ki67。FITC偶聯(lián)的山羊抗兔抗體和TRITC偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體(Sigma)作為第二抗體。
心肌功能的評價(jià)使用裝備13-MHz線性傳感器的Sequoia 256c儀器在清醒的小鼠中進(jìn)行超聲心動(dòng)圖顯象。由胸骨旁短軸切面在乳頭肌水平上記錄二維圖像和M模式示蹤。根據(jù)M模式示蹤，獲得心舒期和心縮期的解剖學(xué)參數(shù)(Orlic等人，Nature，98，10344-10349，2001)。對于血液動(dòng)力學(xué)研究，小鼠用水合氯醛麻醉(400mg/kg體重)，右側(cè)頸動(dòng)脈插入一個(gè)microtip壓力傳感器(Millar 1.4F)，測量左心室壓(LV，LV+和-dP/dt)。
結(jié)果HMGB1促進(jìn)梗死心臟中新肌細(xì)胞的形成通過在麻醉下結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈(Li等人，J.Clin.Invest.，100，1991-1999，1997)，在C57BL/6小鼠中誘發(fā)心肌梗死。4小時(shí)后對動(dòng)物再次手術(shù)，在左心室的梗死周圍區(qū)施用200ng純化的HMGB1。對照動(dòng)物包括注射200ng無關(guān)蛋白質(zhì)(GST)的梗死小鼠。
向梗死周圍左心室注射HMGB1導(dǎo)致形成一種致密組織，其特征在于排列的細(xì)胞占據(jù)了大多數(shù)損傷區(qū)，如蘇木精-伊紅染色所示(圖13A)。新形成的組織從更加緊密且組織的邊緣區(qū)延伸到損傷區(qū)的內(nèi)部。當(dāng)類似實(shí)驗(yàn)使用一種對照蛋白質(zhì)(GST)時(shí)，觀察不到由排列細(xì)胞組成的新組織。
為了表征新形成的組織，作者探查了α-肌節(jié)肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，該蛋白質(zhì)是心臟分化的一個(gè)特異性標(biāo)記。免疫組化分析顯示，注射HMGB1的心臟(n＝8)中的組織由α-肌節(jié)肌動(dòng)蛋白陽性細(xì)胞組成(圖13C)。而且，某些細(xì)胞表達(dá)間隙連接蛋白43，后者是心肌細(xì)胞之間間隙連接的一種成分(未顯示)。令人感興趣的是，表達(dá)α-肌節(jié)肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞也是MEF2陽性的，MEF2是參與幾種心臟結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子激活的一種轉(zhuǎn)錄因子(圖13D)。相反，在GST處理的心臟(n＝6)中只觀察到浸潤的細(xì)胞。作者也通過分析Ki67的表達(dá)，評價(jià)了HMGB1處理的心臟中細(xì)胞的生長階段，Ki67是在G1、S、G2和有絲分裂早期存在的一種蛋白質(zhì)。Ki67在某些新形成的細(xì)胞中表達(dá)，定位于梗死組織內(nèi)(圖13B)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，HMGB1促進(jìn)梗死心臟中新肌細(xì)胞的形成。
HMGB1提高梗死后的心肌功能梗死一周后，作者研究了存活小鼠的超聲心動(dòng)圖和血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)。與假手術(shù)的小鼠相比，用HMGB1處理或未處理的梗死動(dòng)物顯示心力衰竭的指標(biāo)。然而，與梗死但未處理的小鼠相比，用HMGB1處理的小鼠顯示心功效明顯恢復(fù)。在HMGB1處理的小鼠中，射血分?jǐn)?shù)(EF)比GST處理的小鼠高51％(圖14)。在GST處理的小鼠中，LV舒張末期壓(LVEDP)低39％，達(dá)到與假手術(shù)小鼠類似的水平(圖15)。在HMGB1處理的小鼠中LV舒張壓(LVDP)的改變和+和-dP/dT也提高，表明分別比對照提高34％、39％和45％。
因此，通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞形成，HMGB1提高梗死心臟的左心室功效。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其含有有效量的HMGB1蛋白或其功能部分，或表達(dá)HMGB1的載體，用于治療組織損傷和/或促進(jìn)組織修復(fù)和再生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中組織再生取決于與損傷細(xì)胞相同類型的細(xì)胞的生長，不包括結(jié)締組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中所述組織是心肌或骨骼肌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中組織修復(fù)和/或再生包括壞死區(qū)的修復(fù)和/或再生。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中壞死區(qū)包括創(chuàng)傷部位、包括梗死的心臟的缺血部位、燒傷部位。
6.根據(jù)上述任何權(quán)利要求的組合物，它還包含有效量的抗炎劑。
7.根據(jù)上述任何權(quán)利要求的組合物，它還包含稀釋劑和/或佐劑，用于在組織修復(fù)部位灌注。
8.根據(jù)上述任何權(quán)利要求的組合物，它還包含稀釋劑和/或佐劑和/或載體，用于肌肉內(nèi)注射。
9.根據(jù)上述任何權(quán)利要求的組合物，它還與干細(xì)胞結(jié)合。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中所述干細(xì)胞是中胚層成血管細(xì)胞。
11.一種組合物，其含有有效量的HMGB1蛋白的拮抗劑，用于治療壞死組織誘導(dǎo)的不良反應(yīng)，如附近存活細(xì)胞的激活，骨髓細(xì)胞的募集和激活，內(nèi)皮屏障功能的喪失，水腫。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其中壞死組織是指腸梗阻、急性胰腺炎和大面積創(chuàng)傷。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中壞死組織誘導(dǎo)的不良反應(yīng)包括壞死的長期影響，如膿毒癥和多器官衰竭。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13的組合物，其中HMGB1拮抗劑包括HMGB1抗體及其功能重組或合成部分、干擾RNA、反義RNA、合成或天然調(diào)節(jié)劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求11-14的組合物，其中所述組合物在壞死事件16小時(shí)內(nèi)施用。
16.促進(jìn)干細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中或在體內(nèi)遷移和/或增殖的方法，包括使這些細(xì)胞暴露于有效量的HMGB1蛋白或其功能部分的步驟。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述干細(xì)胞是定居的心臟或循環(huán)干細(xì)胞。
18.促進(jìn)心肌細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中或在體內(nèi)增殖的方法，包括使這些細(xì)胞暴露于有效量的HMGB1蛋白或其功能部分的步驟。
全文摘要
描述了一種組合物，其含有有效量的HMGB1蛋白或其功能部分，或表達(dá)HMGB1的載體，用于治療組織損傷和/或促進(jìn)組織修復(fù)和再生。進(jìn)一步描述了一種組合物，其含有有效量的HMGB1蛋白的一種拮抗劑，用于治療壞死組織誘導(dǎo)的不良反應(yīng)，如骨髓細(xì)胞的募集和激活，內(nèi)皮屏障功能的喪失，水腫。
文檔編號A61K38/00GK1671742SQ03817879
公開日2005年9月21日 申請日期2003年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月3日
發(fā)明者M·E·比安基, R·帕倫博, M·科洛涅西卡波格羅西, F·利馬納, A·杰爾馬尼 申請人:塔博爾山圣拉弗爾基金中心, 意大利教省圣母純潔成胎之子－圣母瑪, 利亞皮膚病學(xué)會－Irccs, 心臟病學(xué)中心蒙齊諾股份公司－Irccs